一種麥角固醇類化合物的制備方法和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種如式I所示的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羥基,(3β,22E)麥角固醇的制備方法，其包括下列步驟：將鐮刀菌(Fusarium)的種子液接種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；其中，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為144～240h；發(fā)酵培養(yǎng)基包括20～40g/L葡萄糖、10～30g/L(NH4)SO4、5～15g/L酵母提取物、0.5～2g/LMgSO4·7H2O和0～1g/LFeSO4·7H2O。本發(fā)明的制備方法和純化方法均工藝簡(jiǎn)單、條件溫和環(huán)境友好、成本低、生產(chǎn)周期短、可在人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、利于工業(yè)化。本發(fā)明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90％以上的目標(biāo)化合物，純度高。
【專利說(shuō)明】
一種麥角固醇類化合物的制備方法和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種麥角固醇類化合物的制備方法和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥角固醇及其衍生物具有抗病毒與抗心律不齊等藥理功效。5, 8_(14)，22-三 烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22E)麥角固醇又名H1-A，是冬蟲(chóng)夏草（Cordyc印s sinensis (Brek) Sacc，Cs)特有的麥角固醇衍生物，能夠抑制已活化的人腎絲球腎膈細(xì)胞， 并能改善A型免疫球蛋白腎病（US005582828A)。
[0003] 冬蟲(chóng)夏草為麥角菌科冬蟲(chóng)夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上所形成的子座及幼 蟲(chóng)尸體的復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材之一。目前，H1-A的制備主要是先從Cs子實(shí)體 中分離其無(wú)性世代菌株，接種培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培養(yǎng)每隔4~6個(gè)月移植至新鮮PDA斜面試 管中培養(yǎng)，以此進(jìn)行菌種的培養(yǎng)與保存。H1-A的固體發(fā)酵同樣需要對(duì)菌種進(jìn)行活化、搖瓶 預(yù)培養(yǎng)、放大培養(yǎng)等，操作繁瑣（具體參見(jiàn)美國(guó)專利US006558943B1)。H1-A液體發(fā)酵過(guò)程 則需低轉(zhuǎn)速80r/min，低溫15°C下，搖瓶振蕩培養(yǎng)2個(gè)月后，這樣一種制備方法菌株的培養(yǎng) 條件苛刻，周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率慢，成本高，具體可參見(jiàn)文獻(xiàn)[高效液相色譜與液相色譜-質(zhì)譜 分析冬蟲(chóng)夏草相關(guān)產(chǎn)品之麥角固醇及其衍生物，陳林諍等，分析化學(xué)研究報(bào)告，第9期第39 卷，第1380-1386頁(yè)，【公開(kāi)日】2011年9月]。
[0004] 微生物能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是藥物先導(dǎo)化合物的重要 來(lái)源。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物歷來(lái)是天然藥物的重要來(lái)源，天然產(chǎn)物具有獨(dú)特的生物活性機(jī) 制，同時(shí)天然產(chǎn)物具有立體構(gòu)型的優(yōu)勢(shì)微生物藥物來(lái)源豐富、化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，因此篩選新的 菌株合成生物體原本難以合成的化合物機(jī)率較大，并且微生物發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分離純化過(guò) 程具有條件溫和、環(huán)境友好、成本低、可在人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但是 微生物代謝產(chǎn)物通常較為復(fù)雜，想要利用微生物來(lái)制備天然藥物，需要付出很多的勞動(dòng)。
[0005] 因此，發(fā)展一種利用工藝簡(jiǎn)單、條件溫和環(huán)境友好、成本低、生產(chǎn)周期短、可在 人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、利于工業(yè)化的5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥 基，（3 0，22E)麥角固醇的制備方法、純化方法是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22E)麥 角固醇的制備工藝復(fù)雜、操作繁瑣、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、條件苛刻、生產(chǎn)效率慢、原材料昂貴、成本 高、過(guò)程可控性差等缺陷，而提供了一種麥角固醇類化合物的制備方法和純化方法。本發(fā)明 的制備方法和純化方法均工藝簡(jiǎn)單、條件溫和環(huán)境友好、成本低、生產(chǎn)周期短、可在人工控 制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、利于工業(yè)化。本發(fā)明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90%以 上的目標(biāo)化合物，純度高。
[0007] 本發(fā)明主要是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)難題的。
[0008] 本發(fā)明提供了一種如式I所示的5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 e，22E) 麥角固醇的制備方法，其包括下列步驟：
[0009]
[0010] 將鐮刀菌（Fusarium)的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得含式I化 合物的發(fā)酵液，即可；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為144~240h ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括 20 ~40g/L 葡萄糖、10 ~30g/L(NH4) S04、5 ~15g/L 酵母提取物、0? 5 ~2g/L MgS04 ? 7H20 和0~lg/L FeS04 ? 7H20 ;每升發(fā)酵培養(yǎng)基用水進(jìn)行定容；g/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的 質(zhì)量體積比。
[0011] 所述的鐮刀菌可為本領(lǐng)域各種常規(guī)鐮刀菌，較佳地為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)。所述的尖孢鐮刀菌較佳地購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)保 藏的菌株編號(hào)為CICC41029的尖孢鐮孢或中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（CGMCC)保藏的菌株編號(hào)為3. 3638,分離號(hào)為M138-N470的尖孢鐮孢。按照本領(lǐng)域常識(shí)， 所述尖孢鐮孢和本發(fā)明中所述尖孢鐮刀菌含義相同，所指菌種一致。上述鐮刀菌均可在上 述保藏中心購(gòu)買得到，其網(wǎng)上購(gòu)買相關(guān)的網(wǎng)頁(yè)說(shuō)明和信息具體見(jiàn)附件1和附件2。
[0012] 較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為150h~220h ;更佳地為168h~216h。
[0013] 較佳地，所述的葡萄糖的用量為25~30g/L。較佳地，所述的（NH4) 304的用量為 15~20g/L。較佳地，所述的酵母提取物的用量為8~10g/L。較佳地，所述的MgS0 4 *7H20 的用量為〇. 8~lg/L。較佳地，所述的FeS04 ? 7H20的用量為0. 05~0. 08g/L。
[0014] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值可為本領(lǐng)域發(fā)酵培養(yǎng)基常規(guī)的pH值，較佳地為5~ 7. 5,更佳地為5. 5~6. 5。
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度可為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)溫度，較佳地為25~37°C ;更佳地為 30~35°C。較佳地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的振蕩速度為150~250r/min ;更佳地為220~240r/ min。較佳地，所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:100~1:250 ;更佳地為 1:200 ~1:220〇
[0016] 所述鐮刀菌的種子液的制備方法可為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，比如，將所述的鐮刀 菌接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，制得所述鐮刀菌的種子液。
[0017] 所述的鐮刀菌可以鐮刀菌孢子粉的形式或以鐮刀菌甘油水溶液的形式接種到種 子培養(yǎng)基中，本發(fā)明優(yōu)選以鐮刀菌甘油水溶液形式添加到種子培養(yǎng)基中。所述的鐮刀菌甘 油水溶液中，所述的甘油水溶液的濃度可為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為15 %~50 %，更 佳地為20%~40%，所述的百分比（％)是指甘油的體積占甘油水溶液的總體積的體積百 分比，即20%的甘油水溶液一般是指100mL甘油水溶液中含有20mL甘油。所述的鐮刀菌 甘油水溶液中，所述的鐮刀菌的活菌數(shù)較佳地為1 x 10s~5X 10 7mL。所述的鐮刀菌甘油 水溶液與種子培養(yǎng)基的體積比可為本領(lǐng)域常規(guī)的體積比，較佳地為1:50~1:250 ;更佳地 為1:100。所述的種子培養(yǎng)的溫度較佳地為30°C。所述的種子培養(yǎng)的振蕩速度較佳地為 200~250r/min，更佳地為220r/min。所述的種子培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為48h。
[0018] 所述種子培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域常規(guī)種子培養(yǎng)基。較佳地，所述種子培養(yǎng)基包括5~ 15g/L酵母提取物（更佳地為5g/L)、10~30g/L葡萄糖（更佳地為20g/L)、5~15g/L蛋 白胨（更佳地為l〇g/L) ;g/L是指各組分與種子培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比。每升種子培養(yǎng)基用 水進(jìn)行定容。所述種子培養(yǎng)基的pH值為本領(lǐng)域常規(guī)的pH值，較佳地為5~7. 5,更佳地為 pH 5. 5〇
[0019] 所述的得含式I化合物的發(fā)酵液后，還可進(jìn)一步包括后處理的操作。所述的后處 理的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，較佳地包括下列步驟：將得到的含式I化 合物的發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，得到的沉淀與溶劑混合，超聲，再進(jìn)行離心處理，得到上清液， 除去溶劑，即得式I化合物粗品；所述的溶劑為酮類溶劑和/或醇類溶劑。其中，所述的離 心的速度較佳地為3500~5000r/min ;更佳地為4000r/min。所述的離心的時(shí)間較佳地為 20~40min ;更佳地為30min。所述的超聲的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，較 佳地為在40~70kHZ (優(yōu)選42kHZ)處理10~60min (優(yōu)選40min)。所述的超聲的次數(shù)不 作具體限定，一般為2~3次。所述的酮類溶劑可為本領(lǐng)域常規(guī)的酮類溶劑，較佳地為丙酮。 所述的醇類溶劑可為本領(lǐng)域常規(guī)的醇類溶劑，較佳地為甲醇和/或乙醇。所述的溶劑的用 量不作具體限定，所述的溶劑與含式I化合物的發(fā)酵液的體積比較佳地為1:1~1:3,更佳 地為1:2。所述的除去溶劑的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地為減壓濃縮。所述的減壓 濃縮的溫度較佳地為40~55°C。所述的減壓濃縮的真空度較佳地為700~800mmHg更佳 地為 758mmHg。
[0020] 所述的后處理結(jié)束后，還可進(jìn)一步包含純化的操作。所述的純化的方法和條件可 為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，本發(fā)明優(yōu)選包含如下步驟：
[0021] (1)將所述的式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫的方法為 梯度洗脫；洗脫液為〇~100%的甲醇-水混合液，所述的百分比（％ )是指甲醇的體積占 甲醇-水混合液總體積的體積百分比；收集100%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃 縮物A;
[0022] (2)將所述的濃縮物A采用正相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；收集含式I化合物的 洗脫液，濃縮，得濃縮物B ;
[0023] (3)將所述的濃縮物B采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；流動(dòng)相為90%的甲 醇-水混合液，所述的百分比（％)是指甲醇的體積占甲醇-水混合液總體積的體積百分 比；收集含式I化合物的洗脫液，濃縮，得式I化合物產(chǎn)品。
[0024] 步驟（1)中，所述的反相硅膠柱層析中的層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的層析柱，一般 根據(jù)含式I化合物的粗品的極性和質(zhì)量進(jìn)行常規(guī)選擇。其中，所述的層析柱的填充劑較佳 地為十八烷基硅烷鍵合硅膠（〇DS_C ls)。所述的十八烷基硅烷鍵合硅膠市售可得，較佳地為 YMC公司生產(chǎn)的0DS-Cls。所述的層析柱的填充劑與所述的式I化合物的粗品的質(zhì)量比可按 照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為1. 5:1~3. 5:1 ;更佳地為2. 85:1。較佳地，所述的反相 硅膠柱層析為制備級(jí)別。較佳地，所述的制備為中低壓制備。較佳地，所述的梯度洗脫中所 述的洗脫液依次為0 %、20 %、40 %、60 %、80 %或100 %的甲醇-水混合液。較佳地，所述的 0 %、20 %、40 %、60 %、80 %或100 %的甲醇-水混合液與所述的含式I化合物的粗品的體積 質(zhì)量比分別為35mL/g~80ml/g ;更佳地為70ml/g。較佳地，所述的反相硅膠柱層析在上樣 前，所述的含式I化合物的粗品用甲醇溶解，得樣品上樣液。所述樣品上樣液中，所述甲醇 與所述的含式I化合物的粗品的體積質(zhì)量比為2:1~10:7毫升/克。較佳地，所述的反相 硅膠柱層析中洗脫液流速為10~40ml/min ;更佳地為10ml/min。較佳地，所述的濃縮物A 在4°C保存。
[0025] 步驟（2)中，所述的正相硅膠柱層析中的層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的層析柱，一般 根據(jù)濃縮物A的極性和質(zhì)量進(jìn)行常規(guī)選擇。其中，所述的層析柱的填充劑優(yōu)選200~300 目硅膠。所述的200~300目硅膠市售可得，較佳地為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的 200~300目硅膠。所述的層析柱的填充劑與所述的濃縮物A的質(zhì)量比可按照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn) 行選擇，較佳地為1:10~1:30 ;更佳地為1:20。較佳地，所述的正相硅膠柱層析中的洗脫液 為石油醚-乙酸乙酯混合液、氯仿-甲醇混合液或石油醚-丙酮混合液，更佳地為氯仿-甲 醇混合液。較佳地，所述的氯仿-甲醇混合液中氯仿和甲醇的體積比為100:1~1:10 ;更佳 地為50:1。較佳地，所述的正相硅膠柱層析中的洗脫速度為5~15ml/min ;較佳地為8ml/ min。所述的正相硅膠柱層析在上樣前，所述的濃縮物A用無(wú)水乙醇溶解，并用硅膠拌樣，得 上樣樣品。較佳地，所述的上樣樣品中的硅膠為200~300目硅膠。所述的上樣樣品中，所 述的200~300目硅膠市售可得，較佳地為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的200~300 目硅膠。
[0026] 步驟（3)中，所述的反相硅膠柱層析中的層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的層析柱，一般 根據(jù)濃縮物B的極性和質(zhì)量進(jìn)行常規(guī)選擇。較佳地，所述的反相硅膠柱層析為制備柱級(jí)別。 其中，所述的層析柱較佳地為AQ-C 1S反相層析柱。所述的層析柱市售可得，較佳地為YMC公 司生產(chǎn)的批號(hào)為9955的AQ-C1S反相層析柱。較佳地，所述的AQ-C 18反相層析柱的填充劑 的粒徑為l〇ym。較佳地，所述的AQ-C1S反相層析柱的直徑為14mm。較佳地，所述的AQ-C 1S 反相層析柱的長(zhǎng)度為150~250mm ;更佳地為250mm。較佳地，所述的流動(dòng)相與所述的濃縮 物B的體積質(zhì)量比為0. 05~0. 5ml/g ;更佳地為0. lml/g。較佳地，所述的流動(dòng)相的流速為 2~4ml/min ;更佳地為4ml/min。較佳地，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。較佳地，所述的反相硅膠柱 層析在上樣前，所述的濃縮物B用甲醇溶解，得樣品上樣液。較佳地，所述的反相硅膠柱層 析中洗脫液流速為4ml/min。較佳地，所述的反相硅膠柱層析中柱溫為40°C。
[0027] 步驟⑴~⑶中，所述的濃縮的方法和條件可為本領(lǐng)域濃縮常規(guī)的方法和條 件，只要能除去相應(yīng)地洗脫液，即可，較佳地為減壓濃縮。所述的減壓濃縮的溫度較佳地為 40°C~55°C。所述的減壓濃縮的真空度較佳地為700~800mmHg，更佳地為758mmHg。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種如式I所示的5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22E) 麥角固醇的純化方法，其包括如下步驟：
[0029] (1)將式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫的方法為梯度洗 脫；洗脫液為〇~100%的甲醇-水混合液，所述的百分比（％)是指甲醇的體積占甲醇-水 混合液總體積的體積百分比；收集100%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃縮物A ;
[0030] (2)將所述的濃縮物A采用正相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；收集含式I化合物的 洗脫液，濃縮，得濃縮物B ;
[0031] (3)將所述的濃縮物B采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；流動(dòng)相為90%的甲 醇-水混合液，所述的百分比（％)是指甲醇的體積占甲醇-水混合液總體積的體積百分 比；收集含式I化合物的洗脫液，濃縮，得式I化合物產(chǎn)品。
[0032] 所述的如式I所示的5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22E)麥角固醇的 純化方法的條件同前所述；其中，所述式I化合物粗品可為前述任一式I化合物粗品或本領(lǐng) 域其他制備方法所制得的式I化合物粗品。
[0033] 本發(fā)明中，所述的水是指純水，即去離子水。
[0034] 本發(fā)明中，室溫是指10~30°C。
[0035] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0036] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0037] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的制備方法和純化方法均工藝簡(jiǎn)單、條件溫 和環(huán)境友好、成本低、生產(chǎn)周期短、可在人工控制的條件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、利于工業(yè)化。本 發(fā)明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90%以上的目標(biāo)化合物，純度高。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為實(shí)施例1中含式I化合物制備的流程圖
[0039] 圖2為實(shí)施例2對(duì)含式I化合物的粗品進(jìn)行分離純化的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0041] 以下實(shí)施例1及對(duì)比實(shí)施例1中的尖孢鐮刀菌的來(lái)源：中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)保藏的菌株編號(hào)為3. 3638,分離號(hào)為M138-N470的尖孢鐮 孢。
[0042] 實(shí)施例1真菌的發(fā)酵：
[0043] 將保藏在甘油管（20%的甘油）中的尖孢鐮刀菌菌種接種至含50ml種子培養(yǎng)基的 250ml三角搖瓶中，30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。
[0044] 種子培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，實(shí)驗(yàn)用水，pH5. 5。
[0045] 接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶（含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30 °C，220r/ min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30L真菌發(fā)酵液。
[0046] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖 30g/L，（NH4) S0420g/L，酵母提取物 10g/L，MgS04 ? 7H20 lg/ L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 05g/L，實(shí)驗(yàn)用水，pH 5. 5。
[0047] 制備發(fā)酵粗產(chǎn)物：
[0048] 富集得到30L真菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上清，加入15L丙酮浸泡 菌體，輔以超聲（42kHz)處理40min。反復(fù)三次超聲處理。4000r/min離心30min，取上清， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40_45°C，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌體的丙酮萃取組分4004-E，共28g， 真菌發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)程如圖1所示。
[0049] 實(shí)施例2制備5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 f3，22E)麥角固醇
[0050] 1、產(chǎn)物分離純化：
[0051] 將實(shí)施例1所得的丙酮萃取組分4004-E用40ml甲醇溶解，采用反相硅膠柱層析 (80g，0DS-C ls) (YMC 公司，批號(hào)：9955)依次用 0%、20%、40%、60%、80%、100%甲醇-水 混合液洗脫，流速l〇ml/min，每個(gè)梯度用1L洗脫液洗脫，將100 %甲醇洗脫液減壓濃縮至 干，低溫（4°C )保存，備用，所述分離純化過(guò)程如圖2所示。產(chǎn)物的HPLC的色譜分析條件 如下：色譜柱：Ultimate AQ_Cls(5iim) (14X150mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：A)甲醇 B) 7jC，流速：lml/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣：10 y 1，洗脫濃度：90 %甲醇。所得產(chǎn)物的出峰時(shí)間： 11. 45min〇
[0052] 2. 4004-E 100%甲醇洗脫組分的分離純化
[0053] 將所得40044 100%洗脫組分0.58用5-101111無(wú)水乙醇溶解，38硅膠（200~300 目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）拌樣，采用正相硅膠柱層析（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司，批號(hào)：F20110913) (200~300目，50g)，用400ml氯仿：甲醇=50:1 (體積比）的洗脫液 洗脫。試管收集，流速8ml/min，每管收集15ml，TLC (薄層色譜法）檢測(cè)，收集Rf = 0. 35的 組分合并，合并液減壓濃縮至干得化合物粗品4004-8。
[0054] 3. 4004-8化合物粗品的分離純化
[0055] 將所得組分4004-8化合物粗品用10ml甲醇溶解，采用反相硅膠柱層析（10 y m， AQ-C1S)，制備用反相硅膠柱分離條件如下：層析柱：Ultimate公司，型號(hào)AQ-C 1S(10 ym) (14X250mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng)相：A)甲醇B)水，流速：4ml/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣： 400 y 1。洗脫濃度：90%甲醇。所得產(chǎn)物出峰時(shí)間：18. 5min。收集18. 5min出峰產(chǎn)物，合并 液減壓濃縮至干得單一化合物4004-8-3共6mg (是10ml甲醇溶解樣品后400 y 1*25次進(jìn) 樣所得），HPLC純度為94. 3% ;其理化性質(zhì)及核磁共振波譜數(shù)據(jù)如下：
[0056] 白色粉末，可溶于二甲基亞砜、甲醇等有機(jī)溶劑。ESI-MS m/z:411. 20[M+H] +
[0057] 匪R(400MHz，CDC13) ( S ) :6. 06(s，1H)，5. 19-5. 29(m，2H)，3. 64-3. 71 (m，1H ),2. 38-2. 64 (m, 5H), 2. 26-2. 37 (m, 1H), 2. 06-2. 13 (m, 3H), 1. 97-2. 00 (m, 1H), 1. 81-1. 91 (m, 2H), 1. 71-1. 80 (m, 3H), 1. 40-1. 56 (m, 4H), 1. 37-1. 41 (m, 4H), 1. 22-1. 35 (m, 3H), 1. 06-1. 08(m, 3H)0. 93-0. 95(d, 3H), 0? 84-0. 87(m, 6H), 0? 67(s, 3H) ;13C-匪R(100MHz， CDC13) ( S ): 12. 02, 17. 63, 19. 66, 19. 93, 21. 11，23. 69, 24. 61，24. 76, 29. 44, 30. 75, 3 3. 14, 34. 75, 35. 65, 40. 24, 41. 83, 42. 43, 42. 90, 48. 51, 53. 55, 71. 92, 126. 81, 132. 22 ，134. 10, 135. 49, 160. 84, 161.48, 186. 17。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，其質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)與專利 (1^〇〇5582828六）中的5,8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22￡)麥角固醇對(duì)比基本一 致，故化合物4004-8-3鑒定為5, 8-(14)，22-三烯-7-酮，3-羥基，（3 0，22E)麥角固醇。
[0058] 流程圖見(jiàn)圖2所示。
[0059] 實(shí)施例3
[0060] 將實(shí)施例1中的發(fā)酵培養(yǎng)基改為：葡萄糖20g/L，（NH4) S0410g/L，酵母提取物5g/ L，MgS04 ? 7H20 0. 5g/L實(shí)驗(yàn)用水定容至1升，pH 5. 5。，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例1 一致，按 照實(shí)施例2的分離步驟進(jìn)行分離，最終獲得單一化合物2. 8mg，HPLC純度為93. 5%，其理化 性質(zhì)及核磁共振波譜同實(shí)施例2。
[0061] 實(shí)施例4
[0062] 將實(shí)施例1中的發(fā)酵培養(yǎng)基改為：葡萄糖40g/L，（NH4) S0430g/L，酵母提取物15g/ L，MgS04,7H20 2g/L、FeS04,7H20 lg/L實(shí)驗(yàn)用水定容至1升，pH 5. 5。，其余培養(yǎng)條件與實(shí) 施例1 一致，按照實(shí)施例2的分離步驟進(jìn)行分離，最終獲得單一化合物5. 3mg，HPLC純度為 94. 3%，其理化性質(zhì)及核磁共振波譜同實(shí)施例2。
[0063] 實(shí)施例5
[0064] 將實(shí)施例1中的培養(yǎng)時(shí)間縮短為144h，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例1 一致，按照實(shí)施例 2的分離步驟進(jìn)行分離，最終獲得單一化合物3. 2mg，HPLC純度為92. 1 %，其理化性質(zhì)及核 磁共振波譜同實(shí)施例2。
[0065] 實(shí)施例6
[0066] 將實(shí)施例1中的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)為216h，其余培養(yǎng)條件與實(shí)施例1 一致，按照實(shí)施例 2分離步驟進(jìn)行分離，最終獲得單一化合物10mg，HPLC純度為92. 7%，其理化性質(zhì)及核磁共 振波譜同實(shí)施例4。
[0067] 實(shí)施例5和6說(shuō)明，在本發(fā)明限定的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的最終 收率影響較大，培養(yǎng)時(shí)間增加有利于產(chǎn)物的收率提高。
[0068] 對(duì)比實(shí)施例1
[0069] 將保藏在甘油管（20%的甘油）中的尖孢鐮刀菌菌種接種至含50ml種子培養(yǎng)基的 250ml三角搖瓶中，30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。
[0070] 種子培養(yǎng)基：酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L。
[0071] 接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶（含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30°C，220r/ min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30L真菌發(fā)酵液。
[0072] 發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl lg/L，K2HP04lg/L，可溶性淀粉 10g/L，蛋白胨 2g/L，CaC032g/L， (NH4)S04,無(wú)機(jī)鹽溶液 lmL/L，MgS04 ? 7H20 2g，水，pH 7. 2。
[0073] 無(wú)機(jī)鹽溶液配方為：FeS04 ? 7H20 lg/L，ZnS04 ? 7H20 lg/L，MgCl2 ? 6H201g/L，水，pH 7. 2。
[0074] 富集得到10L真菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上清，加入5L丙酮浸泡 菌體，輔以超聲（42kHz)處理40min。反復(fù)三次超聲處理。4000r/min離心30min，取上清， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40_45°C，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌體的丙酮萃取組分，共5.8g。HPLC 的色譜分析條件如下：色譜柱：Ultimate AQ-Cls(5iim) (14X150mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流 動(dòng)相：A)甲醇B) 7jC，流速柱溫：40°C，進(jìn)樣：10yl，洗脫濃度：90%甲醇。液相檢 測(cè)時(shí)在目標(biāo)峰產(chǎn)物出峰時(shí)間11. 45min未檢測(cè)到任何物質(zhì)。
[0075] 由本例可以看出，將尖孢鐮刀菌采用本發(fā)明以外的發(fā)酵培養(yǎng)方法，不能代謝出式I 化合物。
[0076] 對(duì)比實(shí)施例2
[0077] 鏈霉菌的發(fā)酵：
[0078] 將保藏在甘油管（20 %的甘油）中的鏈霉菌菌種灰產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes)LMG 19891接種至含50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30 °C， 220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。
[0079] 種子培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，實(shí)驗(yàn)用水，pH5. 5。
[0080] 接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶（含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30 °C，220r/ min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30L真菌發(fā)酵液。
[0081] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖 30g/L，（NH4) S0420g/L，酵母提取物 10g/L，MgS04 ? 7H20 lg/ L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 0? 05g/L，實(shí)驗(yàn)用水，pH 5. 5。
[0082] 富集得到10L真菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上清，加入5L丙酮浸泡 菌體，輔以超聲（42kHz)處理40min。反復(fù)三次超聲處理。4000r/min離心30min，取上清， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40_45°C，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌體的丙酮萃取組分，共8g。HPLC的 色譜分析條件如下：色譜柱：Ultimate AQ-Cls(5iim) (14X150mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流動(dòng) 相：A)甲醇B) 7jC，流速柱溫：40°C，進(jìn)樣：10yl，洗脫濃度：90%甲醇。液相檢測(cè) 時(shí)在目標(biāo)峰產(chǎn)物出峰時(shí)間11. 45min未檢測(cè)到任何物質(zhì)。
[0083] 由本例可以看出，將鏈霉菌菌種灰產(chǎn)色鏈霉菌采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法，不能 代謝出式I化合物。
[0084] 對(duì)比實(shí)施例3
[0085] 鏈霉菌的發(fā)酵：
[0086] 將保藏在甘油管（20 %的甘油）中的鏈霉菌菌種灰產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes)LMG 19891接種至含50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，30 °C， 220r/min振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。
[0087] 種子培養(yǎng)基：酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L。
[0088] 接種1ml的種子液至750ml的三角搖瓶（含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30 °C，220r/ min的條件下培養(yǎng)168h。共富集30L真菌發(fā)酵液。
[0089] 發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl lg/L，K2HP04lg/L，可溶性淀粉 10g/L，蛋白胨 2g/L，CaC032g/L， (NH4)S04,無(wú)機(jī)鹽溶液 lmL/L，MgS04 ? 7H20 2g，水，pH 7. 2。
[0090] 無(wú)機(jī)鹽溶液配方為：FeS04 ? 7H20 lg/L，ZnS04 ? 7H20 lg/L，MgCl2 ? 6H201g/L，水，pH 7. 2。
[0091] 富集得到10L真菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上清，加入5L丙酮浸泡 菌體，輔以超聲（42kHz)處理40min。反復(fù)三次超聲處理。4000r/min離心30min，取上清， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40_45°C，真空度758mmHg)至干，得到真菌菌體的丙酮萃取組分，共5.8g。HPLC 的色譜分析條件如下：色譜柱：Ultimate AQ-Cls(5iim) (14X150mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，流 動(dòng)相：A)甲醇B) 7jC，流速柱溫：40°C，進(jìn)樣：10yl，洗脫濃度：90%甲醇。液相檢 測(cè)時(shí)在目標(biāo)峰產(chǎn)物出峰時(shí)間11. 45min未檢測(cè)到任何物質(zhì)。
[0092] 由本例可以看出，將鏈霉菌菌種灰產(chǎn)色鏈霉菌采用本發(fā)明以外的發(fā)酵培養(yǎng)方法， 也不能代謝出式I化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種如式I所示的5, 8- (14)，22- S締-7-酬，3-徑基，（3 e，22巧麥角固醇的制備 方法，其特征在于，其包括下列步驟：將鑲刀菌（Fusarium)的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得含式I化合物 的發(fā)酵液，即可；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為144~24化；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括20~ 40g/L 葡萄糖、10 ~30g/L(NH4) S04、5 ~15g/L 酵母提取物、0. 5 ~2g/L M拆〇4.7&0 和 0 ~ Ig/L FeS〇4 ? 7&0 ;每升發(fā)酵培養(yǎng)基用水進(jìn)行定容；g/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體 積比。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的鑲刀菌為尖抱鑲刀菌(J'usarium oxysporum)。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的尖抱鑲刀菌為購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微 生物菌種保藏管理中屯、保藏的菌株編號(hào)為CICC41029的尖抱鑲抱或中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中屯、保藏的菌株編號(hào)為3. 3638,分離號(hào)為M138-N470的尖抱鑲抱。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為15化~ 220h ;和/或，所述的葡萄糖的用量為25~30g/L ;和/或，所述的（畑4) S〇4的用量為15~ 20g/L ;和/或，所述的酵母提取物的用量為8~lOg/L ;和/或，所述的M拆〇4 'THsO的用量 為0. 8~Ig/L ;和/或，所述的FeS〇4 ? 7&0的用量為0. 05~0. 08g/L。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的抑值為5~7. 5 ; 和/或，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25~37°C;和/或，所述發(fā)酵培養(yǎng)的振蕩速度為150~25化/ min ;和/或，所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:100~1:250 ;和/或，所述 鑲刀菌的種子液的制備方法為將所述的鑲刀菌接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，制得所 述鑲刀菌的種子液。6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于： 所述的鑲刀菌W鑲刀菌抱子粉的形式或W鑲刀菌甘油水溶液的形式接種到種子培養(yǎng) 基中訊/或，所述的種子培養(yǎng)的溫度為30°C;和/或，所述的種子培養(yǎng)的振蕩速度為200~ 25化/min ;和/或，所述的種子培養(yǎng)的時(shí)間為4她；和/或，所述種子培養(yǎng)基包括5~15g/L 酵母提取物、10~30g/L葡萄糖、5~15g/L蛋白腺；g/L是指各組分與種子培養(yǎng)基的質(zhì)量 體積比；每升種子培養(yǎng)基用水進(jìn)行定容；所述種子培養(yǎng)基的抑值為5~7. 5 ; 當(dāng)所述的鑲刀菌W鑲刀菌甘油水溶液的形式接種到種子培養(yǎng)基中時(shí)，所述的鑲刀菌甘 油水溶液中，所述的甘油水溶液的濃度為15%~50%，所述的百分比是指甘油的體積占甘 油水溶液的總體積的體積百分比，即20%的甘油水溶液是指IOOmL甘油水溶液中含有20mL 甘油；和/或，所述的鑲刀菌甘油水溶液中，所述的鑲刀菌的活菌數(shù)為1 X IO8~5 X 10 7mL ; 和/或，所述的鑲刀菌甘油水溶液與種子培養(yǎng)基的體積比為1:50~1:250。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的得含式I化合物的發(fā)酵液后，還 進(jìn)一步包括后處理的操作；所述的后處理包括下列步驟：將得到的含式I化合物的發(fā)酵液 進(jìn)行離屯、處理，得到的沉淀與溶劑混合，超聲，再進(jìn)行離屯、處理，得到上清液，除去溶劑，即 得式I化合物粗品；所述的溶劑為酬類溶劑和/或醇類溶劑。8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的后處理結(jié)束后，還進(jìn)一步包含純 化的操作；所述的純化的方法包含如下步驟： (1) 將所述的式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫的方法為梯度 洗脫；洗脫液為0~100%的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的體積占甲醇-水混 合液的總體積的體積百分比；收集100%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃縮物A ; (2) 將所述的濃縮物A采用正相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；收集含式I化合物的洗脫 液，濃縮，得濃縮物B ; (3) 將所述的濃縮物B采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；流動(dòng)相為90%的甲醇-水 混合液，所述的百分比是指甲醇的體積占甲醇-水混合液的總體積的體積百分比；收集含 式I化合物的洗脫液，濃縮，得式I化合物產(chǎn)品。9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中，所述的反相硅膠柱層析中的層析柱的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠； 和/或，所述的反相硅膠柱層析中的層析柱的填充劑與所述的式I化合物的粗品的質(zhì)量比 為1. 5:1~3. 5:1 ;和/或，所述的反相硅膠柱層析為制備級(jí)別；和/或，所述的梯度洗脫中 所述的洗脫液依次為0 %、20 %、40 %、60 %、80 %或100 %的甲醇-水混合液，所述的0 %、 20 %、40 %、60 %、80 %或100 %的甲醇-水混合液與所述的含式I化合物的粗品的體積質(zhì)量 比分別為35mL/g~80ml/g ;和/或，所述的反相硅膠柱層析在上樣前，所述的含式I化合 物的粗品用甲醇溶解，得樣品上樣液；和/或，所述的反相硅膠柱層析中洗脫液流速為10~ 40ml/min ;和/或，所述的濃縮物A在4°C保存； 和/或，步驟（2)中，所述的正相硅膠柱層析中的層析柱的填充劑為200~300目硅膠； 和/或，所述的正相硅膠柱層析中的層析柱的填充劑與所述的濃縮物A的質(zhì)量比為1:10~ 1:30 ;和/或，所述的正相硅膠柱層析中的洗脫液為石油酸-乙酸乙醋混合液、氯仿-甲醇 混合液或石油酸-丙酬混合液；和/或，所述的正相硅膠柱層析中的洗脫速度為5~15ml/ min ;和/或，所述的正相硅膠柱層析在上樣前，所述的濃縮物A用無(wú)水乙醇溶解，并用硅膠 拌樣，得上樣樣品； 和/或，步驟（3)中，所述的反相硅膠柱層析中的層析柱為制備柱級(jí)別；和/或，所述的 反相硅膠柱層析中的層析柱為AQ-Cis反相層析柱；和/或，所述的流動(dòng)相與所述的濃縮物B 的體積質(zhì)量比為0. 05~0. 5ml/g ;和/或，所述的流動(dòng)相的流速為2~4ml/min ;和/或，檢 測(cè)波長(zhǎng)為210nm ;和/或，所述的反相硅膠柱層析在上樣前，所述的濃縮物B用甲醇溶解，得 樣品上樣液；和/或，所述的反相硅膠柱層析中洗脫液流速為4ml/min ;和/或，所述的反相 硅膠柱層析中柱溫為40°C ; 和/或，步驟（1)~（3)中，所述的濃縮的方法為減壓濃縮。10. -種如式I所示的5, 8-(14)，22- S締-7-酬，3-徑基，（3 e，22巧麥角固醇的純 化方法，其特征在于，其包括如下步驟：(1) 將式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫的方法為梯度洗脫；洗 脫液為0~100%的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的體積占甲醇-水混合液的總 體積的體積百分比；收集100%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃縮物A ; (2) 將所述的濃縮物A采用正相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；收集含式I化合物的洗脫 液，濃縮，得濃縮物B ; (3) 將所述的濃縮物B采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；流動(dòng)相為90%的甲醇-水 混合液，所述的百分比是指甲醇的體積占甲醇-水混合液的總體積的體積百分比；收集含 式I化合物的洗脫液，濃縮，得式I化合物產(chǎn)品； 所述的如式I所示的5, 8- (14)，22- S締-7-酬，3-徑基，（3 0，22巧麥角固醇的純化 方法的條件同權(quán)利要求8或9所述；其中，所述式I化合物粗品為權(quán)利要求8或9中所述式 I化合物粗品或本領(lǐng)域其他制備方法所制得的式I化合物粗品。
【文檔編號(hào)】C12P33/00GK106032547SQ201510104892
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日
【發(fā)明人】朱寶泉, 楊麗鴛, 林軍, 胡海峰, 周斌
【申請(qǐng)人】上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院