專利名稱：一種從冬蟲(chóng)夏草菌絲體中提取蟲(chóng)草多糖和腺苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到微生物菌絲體的分離技術(shù)，特別涉及到從微生物菌絲體中分離蟲(chóng)草多糖與腺苷的方法。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps inensis)為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的珍品，具有抗腫瘤、抗病毒、止血化痰、潤(rùn)肺補(bǔ)腎等功效，與人參、鹿茸并稱為中藥三大補(bǔ)品。目前，蟲(chóng)草菌絲體主要通過(guò)天然采摘和經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得兩條途徑獲得，其中經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體，由于其主要成分、藥理作用及臨床效果上與天然冬蟲(chóng)夏草基本相似，因此受到了廣泛的重視。目前蟲(chóng)草菌絲體中的藥物活性成分主要包含多糖，腺苷與蟲(chóng)草酸等。其中，蟲(chóng)草多糖具有提高免疫功能、抗放療和抗腫瘤的作用；腺苷具有神經(jīng)保護(hù)、減慢心率、抗驚厥、抗輻射等功能，因此分離純化蟲(chóng)草的多種藥理成分一直是研究的熱點(diǎn)之一。目前從蟲(chóng)草菌絲體中分離純化藥物活性成分，多采用高速離心、膜過(guò)濾、萃取、醇沉、柱層析、離子交換樹(shù)脂或分子篩吸附和減壓蒸餾等多步方法將某種藥理成分分離。Rongmin Yu等用醇沉、Sevag法除蛋白、醇洗以及娃膠柱層析的方法純化蟲(chóng)草多糖(Fitoterapia，2004，75(7-8):662 - 666)，但最終僅得到多糖產(chǎn)品，并且收率較低。Jian Ya Ling等研究了超臨界萃取法(Separation and PurificationTechnology, 2009, 66(3):625 - 629)自菌絲體中分離腺苷，但回收率僅為6.56%，并且需要40MPa的高壓，不但能耗巨大，而且容易破壞其他活性成分?，F(xiàn)有針對(duì)蟲(chóng)草菌絲體中有效成分的分離多需要幾步甚至十幾步的分離工藝，工藝復(fù)雜，操作條件不易控制，并且不能同時(shí)兼顧多種有效成分的分離，導(dǎo)致整個(gè)分離過(guò)程存在收率低、成本高等問(wèn)題，因此急需新的工藝以提高其分離效率。雙水相萃取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，雙水相現(xiàn)象是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于水中并達(dá)到 一定濃度時(shí)，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的分子空間阻礙作用，無(wú)法相互滲透，從而形成不互溶的兩相，稱為雙水相。由于該方法具有條件溫和，容易放大，可連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，因此在蛋白質(zhì)、核酸和病毒等生物產(chǎn)品的分離和純化中，受到了廣泛的重視，但由于水溶性高聚物大多黏度大，難揮發(fā)，使工業(yè)化應(yīng)用受到限制。事實(shí)上，在適當(dāng)條件下，如果親水性有機(jī)溶劑，例如甲醇、乙醇、丙酮等，與水和無(wú)機(jī)鹽在適當(dāng)濃度下混合時(shí)，會(huì)出現(xiàn)液液分相現(xiàn)象，從而形成一種新型的雙水相萃取體系。其分相更清晰，成本更低，萃取相可通過(guò)精餾或蒸餾的方式加以回收。盡管這方面研究在國(guó)內(nèi)外剛剛起步，但已表現(xiàn)出良好的分離性能，如蛋白、金屬離子以及生物小分子上均得到相當(dāng)滿意的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前從蟲(chóng)草菌絲體存在的分離工藝復(fù)雜，分離能力小，總體收率低，成本高等問(wèn)題，提供了一種采用雙水相萃取的方法從蟲(chóng)草菌絲體中分離多糖和腺苷的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):—種從冬蟲(chóng)夏草菌絲體中提取蟲(chóng)草多糖和腺苷的方法，包含以下步驟:(I)將蟲(chóng)草菌絲體或其提取液加水配置成菌絲體的混合液，其中菌絲體的含量范圍為 l-700g/L ；(2)在步驟(I)的菌絲體混合液中加入10_700g/L可溶性無(wú)機(jī)鹽，以及10_600g/L醇類或酮類親水性有機(jī)物，得到的多相混合液靜置分相，上相為富含腺苷的溶劑相，下相為富含多糖的富鹽相；(3)從上相中分離得到腺苷，從下相中分離得到蟲(chóng)草多糖。 優(yōu)選地，所述親水性有機(jī)物為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇和丙酮中的一種或多種。 優(yōu)選地，所述親水性有機(jī)物選擇甲醇時(shí)，菌絲體混合液中添加的可溶性無(wú)機(jī)鹽的陰離子為三價(jià)。優(yōu)選地，所述陰離子為三價(jià)的無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀/鈉、磷酸鉀/鈉或其混合物。優(yōu)選地，所述可溶性無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸銨、碳酸鉀、碳酸鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的一種或多種。優(yōu)選地，所述可溶性無(wú)機(jī)鹽為固體或鹽溶液，加鹽后菌絲體溶液中鹽的飽和度達(dá)到 10% 100%O優(yōu)選地，步驟(3 )中分離腺苷是采用蒸餾或精餾法從溶劑相中萃取以回收溶劑，得到腺苷粗品；分離蟲(chóng)草多糖是采用超濾或透析將多糖和其他小分子分離，濃縮或經(jīng)吸附得到多糖粗品。萃取操作方式可以是間歇的，也可以是連續(xù)的；對(duì)于分配系數(shù)較小的體系可以采用多級(jí)萃取的方式。如果菌絲體未經(jīng)過(guò)濾或離心直接進(jìn)行萃取操作，這時(shí)往往在上下相之間形成一個(gè)富含菌體的固相層，有時(shí)也在下相底部形成固相層，這個(gè)系統(tǒng)可被稱為多相系統(tǒng)。萃取操作一般在低于溶劑易揮發(fā)的溫度下進(jìn)行。為了使腺苷盡可能多地分配到上相，多糖盡可能保留在下相，可以調(diào)節(jié)體系的pH值。優(yōu)選地，步驟(2)中所述多相混合液的pH值控制在3-13之間。蟲(chóng)草菌絲體可以來(lái)自天然冬蟲(chóng)夏草，也可以通過(guò)人工發(fā)酵產(chǎn)生。可用水提、醇提、超聲或微波破碎的方法進(jìn)行預(yù)處理，也可未經(jīng)預(yù)處理的蟲(chóng)草菌絲體。優(yōu)選地，所述蟲(chóng)草菌絲體混合液的制備方法如下:取蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min，后75°C水浴提取3h即可。本發(fā)明克服了目前從蟲(chóng)草菌絲體中分離多糖與腺苷工藝存在的諸多弊端，使工藝得以簡(jiǎn)化，分離時(shí)間短，成本降低，經(jīng)濟(jì)可行。具體表現(xiàn)在:親水性有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽形成的雙水相對(duì)多糖和腺苷均有較好的萃取分離效果，雙水相萃取可同步分離菌體和菌體碎片，免除了菌體分離步驟，并且可同步分離多糖和腺苷，解決了現(xiàn)有分離工藝復(fù)雜，收率低，成本聞等問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。本實(shí)施例中所用蟲(chóng)草菌種為蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)(提取自天然冬蟲(chóng)夏草)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。培養(yǎng)基中必須具備微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，如蔗糖或葡萄糖等碳源，豆柏粉或酵母粉等氮源，鈉、鉀、氨、鎂、鈣等陽(yáng)離子和磷酸根、硫酸根、氯離子等陰離子，以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼、和鑰等微量元素。實(shí)施例中的蟲(chóng)草菌絲體是采用蝙蝠蛾擬青霉批式發(fā)酵得到的，蟲(chóng)草菌絲體中多糖含量為5.89%，腺苷含量為3.119mg/g。實(shí)施例1取Ig蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入40mL水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min,后75°C水浴提取3h,取ImL蟲(chóng)草菌絲體混合液(25g/L),加入0.6g的碳酸鉀,再加入0.4g乙醇，混合、靜置、分相，得腺苷主要分配在上相，分配系數(shù)為29.5，回收率為93.7% ;多糖主要分配在下相，分配系數(shù)為0.07，回收率為85.6%。實(shí)施例2取Ig蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入40mL水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min，75°C水浴提取3h，取ImL蟲(chóng)草菌絲體混合液(25g/L)，加入0.3g的碳酸鈉，再加入0.4g乙醇，混合、靜置、分相，得腺苷主要分配在上相，分配系數(shù)為49.4，回收率為98.3% ;多糖主要分配在下相，分配系數(shù)分別為0.16，回收率分別為68.3%。實(shí)施例3取Ig蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入40mL水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min，75°C水浴提取3h，取ImL蟲(chóng)草菌絲體混合液(25g/L)，加入0.4g的硫酸銨，再加入0.4g乙醇，混合、靜置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系數(shù)為8.89，回收率為84.9% ;多糖主要分配在下相，分配系數(shù)分別為0.23，回收率分別為87.3%。實(shí)施例4
取Ig蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入40mL水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min, 75°C水浴提取3h，取ImL蟲(chóng)草菌絲體混合液(25g/L)，加入0.6g的磷酸氫二鉀，再加入0.4g乙醇，混合、靜置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系數(shù)為22.6，回收率為97.3% ；多糖主要分配在下相，分配系數(shù)分別為0.19，回收率分別為63.2%。實(shí)施例5取Ig蟲(chóng)草菌粉于試管中，加入40mL水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min，75°C水浴提取3h，取ImL蟲(chóng)草菌絲體混合液(25g/L)，加入0.3g的硫酸鈉，再加入
0.4g乙醇，混合、靜置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系數(shù)為6.5，回收率為91.1% ;多糖主要分配在下相，分配系數(shù)分別為0.19，回收率分別為52.8%。
權(quán)利要求
1.一種從冬蟲(chóng)夏草菌絲體中提取蟲(chóng)草多糖和腺苷的方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)將蟲(chóng)草菌絲體或其提取液加水配置成菌絲體的混合液，其中菌絲體的含量范圍為l-700g/L ； (2)在步驟(I)的菌絲體混合液中加入10-700g/L可溶性無(wú)機(jī)鹽，以及10-600g/L醇類或酮類親水性有機(jī)物，得到的多相混合液靜置分相，上相為富含腺苷的溶劑相，下相為富含多糖的富鹽相； (3 )從上相中分離得到腺苷，從下相中分離得到蟲(chóng)草多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述親水性有機(jī)物為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇和丙酮中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述親水性有機(jī)物選擇甲醇時(shí)，菌絲體混合液中添加的可溶性無(wú)機(jī)鹽的陰離子為三價(jià)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述陰離子為三價(jià)的無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀/鈉、磷酸鉀/鈉或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述可溶性無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸銨、碳酸鉀、碳酸鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述可溶性無(wú)機(jī)鹽為固體或鹽溶液，加鹽后菌絲體混合液中鹽的飽和度達(dá)到10% 100%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(3)中分離腺苷是采用蒸餾或精餾法從溶劑相中回收溶劑，得到腺苷粗品；分離蟲(chóng)草多糖是采用超濾或透析將多糖和其他小分子分離，濃縮或經(jīng)吸附得到多糖粗品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述多相混合液的pH值控制在3-13之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述菌絲體混合液的制備方法如下:取蟲(chóng)草菌粉于試管 中，加入水，混勻后，在33kHZ，冰浴條件下，超聲處理15min，后75°C水浴提取3h即可。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從冬蟲(chóng)夏草菌絲體中提取蟲(chóng)草多糖和腺苷的方法，包含以下步驟(1)將蟲(chóng)草菌絲體或其提取液加水配置成菌絲體的混合液，其中菌絲體的含量范圍為1-700g/L；(2)在步驟(1)的菌絲體混合液中加入10-700g/L可溶性無(wú)機(jī)鹽，以及10-600g/L醇類或酮類親水性有機(jī)物，得到的多相混合液靜置分相，上相為富含腺苷的溶劑相，下相為富含多糖的富鹽相；(3)從上相中分離得到腺苷，從下相中分離得到蟲(chóng)草多糖。本發(fā)明克服了目前從蟲(chóng)草菌絲體中分離多糖與腺苷工藝存在的諸多弊端，使工藝得以簡(jiǎn)化，分離時(shí)間短，成本降低，經(jīng)濟(jì)可行。
文檔編號(hào)C07H1/08GK103113442SQ20131006440
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者李志剛, 楊博, 王永華, 劉元元, 唐家毅 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)