本發(fā)明涉及一種人工金蟬花的菌種篩選、制備及生產(chǎn)培養(yǎng)方法，屬于藥食兩用真菌的人工生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蟬花(CordycepsciecadaeShing)也稱蟬菌蟬蛹草，屬于真菌界、子囊菌門、盤菌亞門、糞殼菌綱、肉座菌目、蟲草科、棒束孢屬，是一種具有動物和植物特征的奇妙生物根是蟬蛹或山蟬的幼蟲體，花是從單個或是2-3個蟬幼蟲頭部生長出來的，約一寸多長，從頂端開花分枝。據(jù)有關(guān)的研究提出，蟬花屬于生物病態(tài)現(xiàn)象，是一種蟲菌相依的組合體。秋季來臨，蟬鉆入土中，逐漸變成蟬蛹，在羽化前被冬蟲夏草菌類寄生，當生活備件適宜時，就開始萌發(fā)成菌絲體，吸收蟲體的營養(yǎng)，最終蟲體被菌絲體完全占有而只剩下一個軀殼。萬物復(fù)蘇時節(jié)，菌絲體又從營養(yǎng)階段轉(zhuǎn)化為有性階段，漸漸從頂端開花分枝，故而得名蟬花。

目前市場的野生金蟬花，有三個特點比較鮮明：一是由于其是蟲草的一種，和傳統(tǒng)冬蟲夏草有一定的類比性，價格基本按照冬蟲夏草的價格規(guī)律正在進行，最終有可能會成為第二個冬蟲夏草，大部分消費者將無法承受價格的昂貴；二是隨著開發(fā)的升溫，野生金蟬花資源會大量減少，將極大限制使用范圍；三是隨著國家山地的承包制，竹制品的生產(chǎn)以及土壤等環(huán)境污染，導(dǎo)致野生金蟬花農(nóng)藥殘留與重金屬的污染的幾率大大增加。為滿足市場的需求，為人類健康服務(wù)，人工培養(yǎng)金蟬花將具有重要的價值和現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的就是提供一種人工金蟬花的菌種篩選、制備及生產(chǎn)培養(yǎng)方法，該方法具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短的特點。

為了實現(xiàn)上述的個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種人工金蟬花的菌種篩選、制備及生產(chǎn)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1）菌種從莫干山野生金蟬花子實體上取白色孢子粉，顯微鑒別長橢圓形或圓形，單胞，壁光滑，無色，透明，多對稱，少數(shù)彎曲直徑3-10微米，常見1-3個油滴，經(jīng)過2-5次的接種純化及培養(yǎng)，得到菌株作為菌種，所選取的菌株編號為HZXC0001號；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆150-250g、糖15-25g、瓊脂粉15-25g、純化水700-900g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30-60分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥或大米：純化水為0.8-1.0:1.3-1.5，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30-60分鐘，根據(jù)小麥蒸煮后的狀態(tài)適當調(diào)整料水比，以小麥局部爆開、含水量適度為準，避免蒸煮后小麥為純顆粒狀；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4天；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前液體菌種經(jīng)過0.5-2分鐘磁化處理，菌種液按照小麥量的8-12%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)；

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h；

9）烘干：溫度控制在60-80℃，時間控制在15-30h，水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中。

作為優(yōu)選方案，菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，通過2-5次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用4℃保存或永久性保存于液氮罐中。

作為優(yōu)選方案，液體菌種培養(yǎng)基配方：土豆150-250g、糖15-25g、瓊脂粉15-25g、純化水700-900g；處理方法：進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30-60分鐘，當液體培養(yǎng)基的溫度冷卻到室溫后，在無菌環(huán)境下，按照1-3%的量接入母種，在20-22℃下，搖床培養(yǎng)3-5天，待菌絲轉(zhuǎn)成微紅棕色后作為液體菌種也備用。

作為優(yōu)選方案，液體菌種培養(yǎng)基接種前經(jīng)過0.5-2分鐘磁化處理。

作為優(yōu)選方案，固體培養(yǎng)基配方：按照剝殼小麥或大米：純化水為0.8-1.0:1.3-1.5，處理方法：進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30-60分鐘，根據(jù)小麥蒸煮后的狀態(tài)適當調(diào)整料水比，以小麥局部爆開、含水量適度為準，避免蒸煮后小麥為純顆粒狀。

作為優(yōu)選方案，接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，培養(yǎng)環(huán)境為C級無菌區(qū)或者為開啟紫外線的普通潔凈管理區(qū)。

作為優(yōu)選方案，采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行50-70℃烘干，子實體在C級無菌區(qū)抽風(fēng)柜下進行分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm。

作為優(yōu)選方案，除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，開啟紫外滅菌燈，控制環(huán)境濕度30-40%，除濕機散熱口安裝于除濕間外部，控制房間溫度不高于28℃，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h。

作為優(yōu)選方案，烘干：開啟烘箱排風(fēng)，烘箱溫度控制在60-80℃，時間控制在15-30h，水分小于8%為止，孢子粉收集后直接烘干，子實體與菌質(zhì)除濕后再進行烘干，烘干完成在負壓罩下裝袋，密封保存于陰涼干燥環(huán)境中。

在中國專利201110122468.4中提出了一種蟬擬青霉人工培養(yǎng)的方法及其培養(yǎng)物產(chǎn)物的應(yīng)用，本發(fā)明與其不同之處及優(yōu)勢在于：1）所采取的菌種為莫干山野生金蟬優(yōu)選出的菌株，公司編號為HZXC0001號；2）明確了母種與生產(chǎn)菌種液培養(yǎng)基的配方；在201110122468.4中未注明母種培養(yǎng)基的配方3）培養(yǎng)基小麥為脫皮小麥，更有利于菌種的生長；4）本發(fā)明明確了采收、除濕、烘干、保存的方法；5）本發(fā)明的液體菌種液接種前經(jīng)過磁化處理，可提高子實體產(chǎn)量10-17%。

據(jù)文獻報道，人工生產(chǎn)的金蟬花與野生的金蟬花成分含量基本一致。本發(fā)明的人工金蟬花生產(chǎn)方法技術(shù)參數(shù)和培養(yǎng)基條件等經(jīng)過多年優(yōu)化而得，生產(chǎn)要求比較嚴格，硬件、軟件操作要求很高，本發(fā)明經(jīng)過試驗驗證，生產(chǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)并能獲取高質(zhì)量的人工培養(yǎng)物。

本發(fā)明采用莫干山野生蟬花菌種，采用經(jīng)過驗證的生產(chǎn)工藝，培養(yǎng)天數(shù)較短，產(chǎn)量高，培養(yǎng)基為市場上常見的大米、小麥或者為小麥、大米的混合物，價格成本較低，可大量進行工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)解決方案做進一步說明，這些實施例不能理解為對技術(shù)方案的限制。

實施例1

1）菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，以端午節(jié)后兩周的時間最佳，得到的孢子粉通過3次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用或保存于液氮罐中；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆削皮切片150g，用等量的水煮沸30分鐘后，過濾，取濾液、糖15g、瓊脂粉15g、純化水820g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥（或大米）：純化水水1.0:1.3，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30分鐘；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下按照1%的量接入液體培養(yǎng)基中，在20-22℃搖床培養(yǎng)2-4天，以液體搖瓶轉(zhuǎn)色為準；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前磁化處理0.5分鐘，菌種液按照小麥量的8%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，當子實體為黃色略有孢子粉時收獲；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)。

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h，以子實體水分小于15%，菌質(zhì)水分小于20%時轉(zhuǎn)入下一步驟；

9）烘干：溫度控制在60℃，時間控制在15-30h，當水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中，陰涼干燥處保存。

實施例2

1）菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，以端午節(jié)后兩周的時間最佳，得到的孢子粉通過4次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用或保存于液氮罐中；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆削皮切片200g，用等量的水煮沸30分鐘后，過濾，取濾液、糖20g、瓊脂粉20g、純化水760g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥（或大米）：純化水水1.0:1.2，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間40分鐘；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下按照2%的量接入液體培養(yǎng)基中，在20-22℃搖床培養(yǎng)2-4天，以液體搖瓶轉(zhuǎn)色為準；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前磁化處理1.0分鐘，菌種液按照小麥量的10%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，當子實體為黃色略有孢子粉時收獲；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)。

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h，以子實體水分小于15%，菌質(zhì)水分小于20%時轉(zhuǎn)入下一步驟；

9）烘干：溫度控制在70℃，時間控制在15-30h，當水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中，陰涼干燥處保存。

實施例3

1）菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，以端午節(jié)后兩周的時間最佳，得到的孢子粉通過4次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用或保存于液氮罐中；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆削皮切片250g，用等量的水煮沸30分鐘后，過濾，取濾液、糖25g、瓊脂粉25g、純化水700g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥（或大米）：純化水水1.0:1.5，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間45分鐘；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下按照3%的量接入液體培養(yǎng)基中，在20-22℃搖床培養(yǎng)2-4天，以液體搖瓶轉(zhuǎn)色為準；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前磁化處理1.5分鐘，菌種液按照小麥量的10%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，當子實體為黃色略有孢子粉時收獲；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)。

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h，以子實體水分小于15%，菌質(zhì)水分小于20%時轉(zhuǎn)入下一步驟；

9）烘干：溫度控制在80℃，時間控制在15-30h，當水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中，陰涼干燥處保存。

實施例4

1）菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，以端午節(jié)后兩周的時間最佳，得到的孢子粉通過5次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用或保存于液氮罐中；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆削皮切片150g，用等量的水煮沸30分鐘后，過濾，取濾液、糖25g、瓊脂粉25g、純化水800g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間30分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥（或大米）：純化水水1.0:1.3，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間40分鐘；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下按照1%的量接入液體培養(yǎng)基中，在20-22℃搖床培養(yǎng)2-4天，以液體搖瓶轉(zhuǎn)色為準；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前磁化處理0.5分鐘，菌種液按照小麥量的9%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，當子實體為黃色略有孢子粉時收獲；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)。

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h，以子實體水分小于15%，菌質(zhì)水分小于20%時轉(zhuǎn)入下一步驟；

9）烘干：溫度控制在60℃，時間控制在15-30h，當水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中，陰涼干燥處保存。

實施例5

1）菌種從莫干山野生金蟬花孢子粉中選取，以端午節(jié)后兩周的時間最佳，得到的孢子粉通過5次的純化及培養(yǎng)實驗，確定優(yōu)質(zhì)的菌種，將挑選出的菌株置于滅菌的薩式培養(yǎng)基斜面上，20-22℃下培養(yǎng)2-4天，待白色菌落長滿試管后，作為母種備用或保存于液氮罐中；

2）液體菌種培養(yǎng)基配方及處理：土豆削皮切片200g，用等量的水煮沸30分鐘后，過濾，取濾液、糖15g、瓊脂粉25g、純化水760g；進行121℃高溫滅菌，滅菌時間35分鐘；

3）固體培養(yǎng)基配方及處理：按照剝殼小麥（或大米）：純化水水0.8:1.0，進行121℃高溫滅菌，滅菌時間50分鐘；

4）液體菌種制備：將母種在無菌條件下按照2%的量接入液體培養(yǎng)基中，在20-22℃搖床培養(yǎng)2-4天，以液體搖瓶轉(zhuǎn)色為準；

5）接種：將培養(yǎng)后的液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，接種前磁化處理1.0分鐘，菌種液按照小麥量的8%的比例接種；

6）培養(yǎng)：接種后暗培養(yǎng)溫度控制在15-20℃，光培養(yǎng)控制溫度在20-25℃，控制濕度在65-85%，控制培養(yǎng)環(huán)境二氧化碳濃度小于1000ppm，光照強度100-300Lx，培養(yǎng)時間為20-30天，當子實體為黃色略有孢子粉時收獲；

7）采收：孢子粉用旋風(fēng)除塵器進行收集，收集后直接進行烘干即可，子實體分割后裝盤，菌質(zhì)掰碎后轉(zhuǎn)盤，菌質(zhì)大小控制2-5cm，培養(yǎng)物的收集即為人工金蟬花獲取物，含：孢子粉、子實體、菌質(zhì)。

8）除濕：將收獲后的子實體、菌質(zhì)放入除濕間，控制濕度30-40%，子實體時間控制在20-48h，培養(yǎng)基及菌絲體控制時間在50-72h，以子實體水分小于15%，菌質(zhì)水分小于20%時轉(zhuǎn)入下一步驟；

9）烘干：溫度控制在65℃，時間控制在15-30h，當水分小于8%為止；

10）裝袋：將烘干后的子實體裝入密封袋中，陰涼干燥處保存。