本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藥用植物春砂仁內(nèi)生真菌腐質(zhì)霉Humicola sp.A695及從該菌株的發(fā)酵液中制備的提取物和該提取物在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)，但不對植物組織引起明顯病害癥狀的真菌(Tan RX and Zou WX,2001)。內(nèi)生真菌具有豐富的物種物種多樣性和遺傳多樣性，迄今已從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)了不少新的或稀有的真菌物種，已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。植物內(nèi)生真菌生長于植物內(nèi)部的特殊環(huán)境中，其產(chǎn)生活性化合物遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其植物代謝產(chǎn)物的范圍，能夠產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)類型獨(dú)特、具有潛在應(yīng)用前景的活性物質(zhì)，已成為發(fā)現(xiàn)新的天然活性物質(zhì)的重要資源。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株內(nèi)生真菌腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695，其于2016年3月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏編號為：GDMCC No：60025。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有抗細(xì)菌作用的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物，其特征在于，以腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695作為發(fā)酵菌株，液體發(fā)酵獲得發(fā)酵培養(yǎng)物，分離菌絲體和發(fā)酵液，取發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)濃縮后即得腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695發(fā)酵提取物。
所述的液體發(fā)酵是將腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、120r/min液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，每升是通過以下方法制備：用500mL蒸餾水煮200g馬鈴薯20min，過濾得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.75g、維生素B1 10mg，用水補(bǔ)足至1L，pH自然，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
利用本發(fā)明的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)每片濾紙片(直徑為6mm)含提取物為250μg時(shí)對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為19.5、16.25mm。選擇5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078mg/mL 7個(gè)濃度下進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC值)的測定，確定腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC值分別為0.321mg/mL、0.625mg/mL。
因此，本發(fā)明的第三個(gè)目的是腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。
一種抗細(xì)菌藥物，包含上述腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物作為活性成分。
所述的抗細(xì)菌藥物為抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的藥物。
本發(fā)明的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物具有明顯的抗細(xì)菌活性，表明該提取物具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景，因此本發(fā)明為研究與開發(fā)新的抗菌藥物提供了基礎(chǔ)，為開發(fā)利用植物內(nèi)生真菌來源的天然活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。
腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695于2016年3月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏編號為：GDMCC No：60025。
附圖說明：
圖1為本發(fā)明的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中A695代表腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695。
具體實(shí)施方式：
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695的分離、純化及鑒定
(1)菌株的分離、純化：
將采自廣東省陽春市合水鎮(zhèn)的春砂仁根用自來水沖洗干凈，置于濾紙上自然風(fēng)干。放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的升汞溶液中浸泡5～7min后用無菌水漂洗4次，再放入體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇水溶液中浸泡3～5min后用無菌水漂洗3次。用剪刀剪掉頭尾部分，將中間部位剪成約1cm長的小段。置于分離培養(yǎng)基(含20μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL氨芐青霉素)中，28℃恒溫箱培養(yǎng)3～7d后挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮分離培養(yǎng)基上，繼續(xù)純化直至獲得純菌株，即得本發(fā)明的菌株A695。
所述的分離培養(yǎng)基是通過以下方法獲得：用500mL蒸餾水煮200g馬鈴薯20min，過濾得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.75g、維生素B1 10mg，瓊脂20g，用水補(bǔ)足至1L，pH自然，滅菌備用。
(2)菌株的鑒定：
將所述的菌株A695采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向)擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20μL反應(yīng)體系，通過Ex Taq(TaKa-Ra)進(jìn)行。反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性3min；93℃變性45s，55℃復(fù)性45s，72℃延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，其序列如SEQ ID NO.1所示。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索，下載相關(guān)序列，運(yùn)用MEGA 5軟件通過鄰接法(Neighbor-Joining)，Bootstrap設(shè)置為1000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。菌株A695ITS區(qū)的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。將測序獲得的序列信息進(jìn)行BLAST，BLAST結(jié)果顯示，菌株A695與Humicola sp.(KF472159)的相似度為99.3％。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹看，菌株A695與5條Humicola sp.序列聚為高度自展支持的一支，彼此間遺傳距離極小(圖1)。因此，通過分子系統(tǒng)學(xué)分析確定該菌株為腐質(zhì)霉(Humicola sp.)，命名為腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695。
該腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695于2016年3月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏編號為：GDMCC No：60025。
實(shí)施例2：腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695的活化、發(fā)酵培養(yǎng)及提取物制備
(1)將實(shí)施例1得到的純菌株腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695接種于斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)5d，得到活化后的菌種。所述斜面培養(yǎng)基通過以下方法獲得：用500mL蒸餾水煮200g馬鈴薯20min，過濾得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.75g、維生素B1 10mg，瓊脂20g，用水補(bǔ)足至1L，pH自然，滅菌備用。
(2)將步驟(1)活化培養(yǎng)后的菌株接種至種子培養(yǎng)基中，于28℃、120r/min振蕩條件下培養(yǎng)7d，得到種子液，所述種子培養(yǎng)基通過以下方法獲得：用500mL蒸餾水煮200g馬鈴薯20min，過濾得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 0.75g、維生素B1 10mg，用水補(bǔ)足至1L，pH自然，滅菌備用。
(3)將步驟(2)所得種子液以10％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、120r/min培養(yǎng)7d，得到發(fā)酵培養(yǎng)物。所述發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同。
(4)提取物制備：將步驟(3)所得的發(fā)酵培養(yǎng)物除菌絲體后得到的濾液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液經(jīng)減壓濃縮后即為本發(fā)明的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物。
實(shí)施例3：腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物的抗菌活性測定
采用濾紙片法測定腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的抗菌活性。
將實(shí)施例2獲得的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物用DMSO溶解，并稀釋至濃度為500μg/mL。
將液體發(fā)酵獲得的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的菌液分別用生理鹽水分別稀釋至濃度為106CFU/mL，吸取濃度為106CFU/mL的菌液1mL放入平板中，倒入已冷卻至合適溫度的LB培養(yǎng)基，混合均勻。用無菌鑷子夾取厚度為1.5mm、直徑為6mm的濾紙片置于含菌平板上，同時(shí)在濾紙片上分別滴加腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物稀釋液5μL為樣品組，以DMSO代替腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物稀釋液作為空白對照組，以濃度為200μg/mL的氨芐青霉素作陽性對照組，將平板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，用十字測量法測量抑菌圈直徑的大小，重復(fù)三次，計(jì)算抑菌圈直徑的平均值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：
表1腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對細(xì)菌的抑制作用(n＝3)
實(shí)施例4：腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度測定
采用濾紙片法測定腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度。
用DMSO將實(shí)施例2的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物分別稀釋至5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078mg/mL。分別吸取濃度為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液1mL放入培養(yǎng)皿中，倒入已冷卻至合適溫度的LB培養(yǎng)基，混合均勻。用無菌鑷子夾取厚度為1.5mm、直徑為6mm的濾紙片置于含菌平板上，同時(shí)在濾紙片上分別滴加上述濃度的腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物稀釋液5μL，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈，以濾紙片周圍有抑菌圈的濾紙片所含樣品的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC值)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：
表2：腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對細(xì)菌的最低抑制濃度(MIC值)(n＝3)
注：“+”表示有抑菌圈，“-”表示無抑菌圈
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，腐質(zhì)霉(Humicola sp.)A695提取物對金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌具有明顯的抗細(xì)菌作用，可應(yīng)用于制備抗細(xì)菌藥物。因此，本發(fā)明為研究與開發(fā)新的抗菌藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)利用植物內(nèi)生真菌來源的天然活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。