本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，一種提高絲狀真菌生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶或其它蛋白的方法，涉及5個基因（五個轉(zhuǎn)錄因子基因分別為NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994、NCU05051），特別是提供脈孢菌屬、毀絲霉屬宿主。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素是自然界中存在最廣泛、最豐富的碳水化合物。隨著地球資源的快速消耗、環(huán)境污染和能源危機的日益加劇，纖維素作為潛力巨大、環(huán)境友好的可再生能源成為研究的重點。作為地球上數(shù)量最大的可再生資源，纖維素的利用效率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于社會發(fā)展的要求，若能將其高效地轉(zhuǎn)化為可利用的能源、食料和化學(xué)原料等，勢必將會對人類社會的健康發(fā)展起到關(guān)鍵作用。要利用這些儲量巨大的生物質(zhì)資源，需要糖化和發(fā)酵兩個基本步驟。其中，糖化過程中所需要的木質(zhì)纖維素水解酶（纖維素酶、半纖維素酶等）的生產(chǎn)成本過高已成為制約整個生物煉制產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心問題，如何高效、廉價的生產(chǎn)這些酶制劑或是如何低成本的將生物質(zhì)高效地降解為可發(fā)酵的單體化合物（葡萄糖、木糖等）、低聚化合物（纖維寡糖、木寡糖等）已成迫切需要解決的問題。

在自然界中，多種微生物都具有降解、利用纖維素的能力，特別是子囊菌和擔(dān)子菌等絲狀真菌可以分泌多種木質(zhì)纖維素水解酶，與其它微生物相比，其具有完整的纖維素酶系，這種特性使其成為研究纖維素利用和纖維素酶生產(chǎn)過程中的熱點。在提高生物質(zhì)降解效率的研究中，傳統(tǒng)誘變技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)步。盡管纖維素水解酶的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到100 g/L以上水平，但在整個工藝成本中占有極大比重，不符合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的基本要求。近年來，研究表明絲狀真菌木質(zhì)纖維素水解酶的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)。通過對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平的調(diào)控可以大幅提高水解酶的表達(dá)水平。此外，絲狀真菌是工業(yè)蛋白質(zhì)最主要的生產(chǎn)宿主之一，其具有強大的分泌能力和高等真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)修飾功能，而且具有發(fā)酵工藝簡單經(jīng)濟等特點。因此，高分泌型宿主和眾多強啟動子（如纖維素酶CBH I啟動子等）使得絲狀真菌宿主在生產(chǎn)其它蛋白質(zhì)具有很大的潛力。專利WO2011151515提供了一種在里氏木霉中通過過表達(dá)調(diào)節(jié)因子來達(dá)到提高纖維素酶表達(dá)水平的方法。參與木質(zhì)纖維素水解酶基因表達(dá)的這一途徑的基因眾多，然而目前為止僅有數(shù)十個相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被克隆、鑒定。因此，本領(lǐng)域迫切需要鑒定這一途徑中其它關(guān)鍵調(diào)控因子，從而開發(fā)能夠提高纖維素酶等蛋白質(zhì)生產(chǎn)的技術(shù)和方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高木質(zhì)纖維素降解及纖維素酶、半纖維素酶表達(dá)的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面，提供了一種提高絲狀真菌纖維素酶和/或半纖維酶的表達(dá)、和/或提高絲狀真菌的纖維素降解活性的方法，包括步驟：

強化絲狀真菌的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子或其基因的表達(dá)和/或活性，從而提高絲狀真菌纖維素和/或半纖維酶的表達(dá)、和/或提高絲狀真菌的纖維素降解活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌包括：脈孢菌（Neurospora）、或側(cè)孢霉（Sporotrichum）。

在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌還包括曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、鐮刀霉（Fusarium）、或毀絲酶(Myceliophthora)。

在另一優(yōu)選例中，所述纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括：

(a)SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。

在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子還包括：

(b)與SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列同源性為50%以上，較佳地為60%以上，更佳地為65%以上的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子。

在另一優(yōu)選例中，所述強化包括過表達(dá)和/或上調(diào)所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和/或活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子至少包括SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。

在另一優(yōu)選例中，所述的絲狀真菌為脈胞菌，較佳地，為粗糙脈胞菌。

在另一方面，本發(fā)明提供降低一組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的方法，所述蛋白質(zhì)為分泌蛋白質(zhì)，達(dá)到在生產(chǎn)例如異源蛋白質(zhì)時降低不期望得到的副產(chǎn)品的生產(chǎn)。

本發(fā)明第二方面，提供了一種用于降解纖維素的工程菌，所述工程菌中纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子被強化表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌中纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和/或活性得到提高。

在另一優(yōu)選例中，所述的“強化表達(dá)”指的是與野生型菌株相比，所述工程菌纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量至少提高了10%，較佳地，至少提高了20-90%，更佳地，至少提高了100-600%。

在另一優(yōu)選例中，與野生型菌株相比，所述工程菌纖維素酶和/或半纖維素酶的表達(dá)量和/或活性至少提高了20%，較佳地，至少提高了50-80%，更佳地，至少提高了100-500%。

在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。

在另一優(yōu)選例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脈孢菌（Neurospora）、或側(cè)孢霉（Sporotrichum）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、鐮刀霉（Fusarium）、或毀絲酶(Myceliophthora)。

本發(fā)明第三方面，提供了一種生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的方法，在纖維素原料的存在下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面所述的工程菌，并從培養(yǎng)物中分離提純所述的纖維素酶和/或半纖維素酶。

在另一優(yōu)選例中，所述的誘導(dǎo)物即纖維素原料包括木質(zhì)纖維素、結(jié)晶纖維素、木聚糖、木質(zhì)纖維素水解物、木寡糖、纖維寡糖、木糖、或阿拉伯糖。

本發(fā)明第四方面，提供了一種降解纖維素并獲得纖維素降解產(chǎn)物的方法，在木質(zhì)素原料的存在下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面所述的工程菌，從而降解木質(zhì)素并獲得木質(zhì)素降解產(chǎn)物。

本發(fā)明第五方面，提供了本發(fā)明第三方面所述工程菌的用途，用于制備纖維素酶和/或半纖維素酶、和/或用于提高纖維素的降解。

該方法是利用強化鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的微生物菌株降解木質(zhì)纖維素或是生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶的方法，所述微生物為脈孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、鐮刀霉（Fusarium）或側(cè)孢霉（Sporotrichum）。

所述鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因包括NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994和NCU05051，過表達(dá)其中的任意轉(zhuǎn)錄因子，或突變?nèi)我庖粋€轉(zhuǎn)錄因子的部分堿基提高其活性。

所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU10006的核苷酸序列如序列表中序列2所示，編碼序列表中序列1所示蛋白；所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU06487的核苷酸序列如序列表中序列4所示，編碼序列表中序列3所示蛋白；所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU05383的核苷酸序列如序列表中序列6所示，編碼序列表中序列5所示蛋白。所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU05994的核苷酸序列如序列表中序列8所示，編碼序列表中序列7所示蛋白。所述鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU05051的核苷酸序列如序列表中序列10所示，編碼序列表中序列9所示蛋白。

具體的，該方法利用以下任一菌株：以脈孢菌（Neurospora）為出發(fā)菌株構(gòu)建過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NCU10006基因的菌株；以脈孢菌（Neurospora）為出發(fā)菌株構(gòu)建過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NCU06487基因的菌株；以脈孢菌（Neurospora）為出發(fā)菌株構(gòu)建過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NCU05383基因的菌株；以脈孢菌（Neurospora）為出發(fā)菌株構(gòu)建過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NCU05994基因的菌株；以脈孢菌（Neurospora）為出發(fā)菌株構(gòu)建過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子NCU05051基因的菌株。

本發(fā)明提供的提高木質(zhì)纖維素降解和纖維素酶、半纖維素酶表達(dá)的方法，是以微生物為出發(fā)菌株，過表達(dá)其中鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因而得到，或是提高任意鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子的活性而得到。所述微生物為脈孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、鐮刀霉（Fusarium）或側(cè)孢霉（Sporotrichum）。所述過表達(dá)基因是針對鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子基因NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994和NCU05051。

本發(fā)明方法的應(yīng)用是廣泛的，其為高效表達(dá)生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶或其它蛋白質(zhì)。其中：

生產(chǎn)纖維素酶的方法，是以木質(zhì)纖維素、結(jié)晶纖維素、經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維素、纖維寡糖為誘導(dǎo)物，發(fā)酵所述的方法得到纖維素酶。

生產(chǎn)半纖維素酶的方法，是以木質(zhì)纖維素、木聚糖、經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維素、阿拉伯糖、木寡糖、木糖為誘導(dǎo)物，發(fā)酵所述方法得到半纖維素酶。

生產(chǎn)其它蛋白的方法，包括將編碼蛋白功能片段的基因?qū)胨鍪荏w菌中形成工程菌，再發(fā)酵該工程菌生產(chǎn)蛋白的過程。

因此，本發(fā)明還涉及這些轉(zhuǎn)錄因子基因在構(gòu)建功能性工程菌中的應(yīng)用。該應(yīng)用是將編碼蛋白功能片段的基因?qū)胨龅某霭l(fā)菌株中形成的工程菌。

由此形成的高效表達(dá)蛋白的工程菌也屬于本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1：NCU10006和NCU06487過表達(dá)菌株在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，取發(fā)酵液上清液，測量蛋白濃度、木聚糖酶活和纖維素內(nèi)切酶酶活。

圖2：NCU10006和NCU06487過表達(dá)菌株在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，發(fā)酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析（1和4為出發(fā)菌株，2為TCG-10006，3為TCG-6487）。

圖3：NCU05383和NCU05994過表達(dá)菌株在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，取發(fā)酵液上清液，測量蛋白濃度、木聚糖酶活和纖維素內(nèi)切酶酶活。

圖4：NCU05383過表達(dá)菌株在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，發(fā)酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。

圖5：NCU05994過表達(dá)菌株在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，發(fā)酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。

圖6： NCU05051在2%微晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，取發(fā)酵液上清液，測量蛋白濃度、纖維素內(nèi)切酶酶活以及木聚糖酶活。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌中存在一系列與纖維素降解酶表達(dá)調(diào)控相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。實驗證明，當(dāng)這些鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)提高時，絲狀真菌中的纖維素酶或半纖維素酶的表達(dá)量會上升，從而能夠提高菌株對木質(zhì)纖維素的利用，并增強木質(zhì)纖維素的降解。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子

如本文所用，術(shù)語“纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子”、“本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子”、“本發(fā)明鋅指蛋白”均指在絲狀真菌中屬于鋅指家族且具有調(diào)控(半)纖維素酶表達(dá)或活性從而與纖維素降解相關(guān)的蛋白或其編碼基因。

實驗證明，當(dāng)過表達(dá)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子后，能夠有效地提高絲狀真菌中(半)纖維素酶的表達(dá)，并進(jìn)一步提高絲狀真菌對木質(zhì)纖維素的利用從而加強其降解。

優(yōu)選地，本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子指的是在脈胞菌中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，例如，如SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列的一種或多種。編碼這些轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 2、4、6、8、或10所示。

此外，本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子還包括來自多種絲狀真菌的鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子。例如，所述的絲狀真菌包括曲霉、木霉、青霉、鐮刀霉或毀絲酶。在這些絲狀真菌的轉(zhuǎn)錄因子中，可以找到與本發(fā)明SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列具有一定同源性的轉(zhuǎn)錄因子。優(yōu)選地，這些轉(zhuǎn)錄因子中與本發(fā)明SEQ ID NO: 1、3、5、7、或9所示序列同源性大于30%，較佳地大于50%，更佳地大于65%的轉(zhuǎn)錄因子與纖維素降解有密切的相關(guān)性。

同時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明在其他絲狀真菌中找到同源性較高且與纖維素降解相關(guān)的鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子。

過表達(dá)基因

通過向真菌宿主中引入另一份或多份拷貝的目標(biāo)基因，或通過另一個啟動子使所述基因的表達(dá)增加，或?qū)⑺拗鬟M(jìn)行遺傳操作使基因表達(dá)水平更高或基因產(chǎn)物的活性提高。

纖維素、纖維素酶、半纖維素酶

纖維素是自然界中存在最廣泛、最豐富的碳水化合物。多種微生物都具有降解、利用纖維素的能力，其可以分泌多種纖維素水解酶。

纖維素酶是一種多酶體系，由多種組份組成。按底物特異性可將纖維素酶分為以下組分：（1）外切β-1,4-葡萄糖酶（exo-beta-1,4-glucanase，EC.3.2.1.91）簡稱為外切酶，又稱為纖維二糖水解酶（cellobiohydrolases）。纖維二糖水解酶可以水解纖維素結(jié)晶區(qū)，從纖維素鏈的非還原端/還原端開始水解并釋放纖維二糖。（2）內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶（endo-beta-1,4-glucanase，EC3.2.1.74）簡稱內(nèi)切酶。纖維素內(nèi)切酶能夠在纖維素多糖鏈上無定形部分隨機切斷糖苷鍵，產(chǎn)生新的糖鏈末端和長度不一的纖維寡糖。（3）β-1,4-葡萄糖苷酶（beta-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21）簡稱纖維二糖酶。纖維二糖水解酶水解可溶性的纖維糊精和纖維二糖生成葡萄糖。（4）其它組分，除了以上三大組分外還有纖維二糖脫氫酶、纖維二糖醌氧化還原酶、磷酸化酶、纖維素酶小體等都會參與纖維素降解過程。

半纖維素具有與纖維素一樣的負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)，其降解需要多種半纖維素酶的共同作用。其中主要有兩種：β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者從半纖維素主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，分解成低聚木糖，后者作用于低聚木糖的末端，釋放出單糖。除此之外，降解半纖維素還需要多種側(cè)鏈裂解酶的共同作用，主要有乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶等。

宿主菌

本發(fā)明“宿主菌”、“突變體”可互換使用，均是指將出發(fā)菌株中纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)后獲得的具有(增強的)降解纖維素活性的工程菌株。其中，本發(fā)明宿主菌在改造后，纖維素降解相關(guān)鋅指轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)顯著提高。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，當(dāng)獲得了鋅指轉(zhuǎn)錄因子的序列后，可以通過多種常規(guī)技術(shù)使某出發(fā)菌株中的鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)得到提高。通常，可采用隨機整合的方法，采用某標(biāo)記(或抗性)基因?qū)\指轉(zhuǎn)錄因子基因整合至出發(fā)菌株基因組中一個或多個位點上。

應(yīng)用

通過過表達(dá)本發(fā)明鋅指蛋白，可以人為地提高絲狀真菌中(半)纖維素酶的表達(dá)量和/或活性，從而增加菌株對纖維素(尤其是木質(zhì)纖維素)的利用。

例如，當(dāng)獲得了本發(fā)明的工程菌后，可以通過加入纖維素原料的誘導(dǎo)，對所述的工程菌進(jìn)行培養(yǎng)。此時，所述的菌株會分泌纖維素酶和半纖維素酶，對其進(jìn)行分離并提純后，就可以獲得較純的纖維素酶和半纖維素酶。

由于產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶的過程中，纖維素原料受其降解，形成降解產(chǎn)物。因此當(dāng)進(jìn)一步對培養(yǎng)物進(jìn)行分離時，就可以獲得纖維素的多種降解產(chǎn)物，例如多種單體化合物：葡萄糖、木糖等。

本發(fā)明有益效果

本發(fā)明通過改造絲狀真菌在纖維素降解的調(diào)控因子及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，增強了絲狀真菌對纖維素的利用，提高了生物質(zhì)降解，從而成為能量利用中的新途徑。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人， 分子克隆：實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

本發(fā)明所采用的原始出發(fā)菌株商購于美國Fungal Genetics Stock Center（FGSC），其余所用材料均為商購。

實施例1 NCU10006和NCU06487過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以粗糙脈胞菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(FGSC #6103)(購自FGSC)出發(fā)，根據(jù)同源重組的原理，將NCU10006的整個開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）整合至his-3位點。

開放閱讀框特異性引物:

NCU10006F: TCTAGAATGCTGAGCTCACAGAACCCG (SEQ ID NO: 11);

NCU10006R: TTAATTAACGAAGCCAATCGCGCC (SEQ ID NO: 12)

NCU06487F：TCTAGAATGAGTACGACGGCCGCTT (SEQ ID NO: 13)

NCU06487R：TTAATTAAGCTTGGCCCACCTCTTCGT (SEQ ID NO: 14)

擴增NCU10006和NCU06487的開放閱讀框；然后分別通過酶切插入質(zhì)粒pMF272中Xba I和Pac I酶切位點間，得到質(zhì)粒pMF272-10006和pMF272-6487。將10 μg pMF272-10006電擊轉(zhuǎn)化至組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（FGSC #6103，A），通過平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以其為模板，利用引物Pccg1-F和NCU10006R或進(jìn)行擴增，如果可以擴增得到目的片段，則說明目標(biāo)基因的開放閱讀框已整合到基因組中。引物如下所示：

Pccg1-F：GTCCTCCCACCTCCCCAAT (SEQ ID NO: 15)

將10 μg pMF272-6487電擊轉(zhuǎn)化至組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（FGSC #6103，A），通過平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以其為模板，利用引物Pccg1-F和NCU06487R或進(jìn)行擴增，如果可以擴增得到目的片段，則說明目標(biāo)基因的開放閱讀框已整合到基因組中。

將上述所獲得的轉(zhuǎn)化子與野生型菌株雜交（FGSC #4200，a），將雜交得到的子囊孢子熱激（60℃, 45min）后，稀釋涂布在平板上，萌發(fā)后挑至斜面上，生長7天后，提取基因組，利用PCR進(jìn)行鑒定，從而獲得過表達(dá)菌株的純合子TCG-10006和TCG-6487。

實施例2 NCU05383和NCU05994過表達(dá)菌株的構(gòu)建

NCBI Database搜索粗糙脈胞菌全基因組序列，設(shè)計引物擴增組成型強啟動子tef片段，以及擴增NCU05383和NCU05994開放閱讀框所需引物，引物如下所示：

NCU05383F：GCTCTAGAATGTCCAATCATCATGAGAATCCTG (SEQ ID NO: 16)

NCU05383R：GGACTAGTAACGGGTGCGAAAACCGCAG (SEQ ID NO: 17)

NCU05994F：GCTCTAGAATGTCCGTTCCCAGTGCCGTC (SEQ ID NO: 18)

NCU05994R：GGACTAGTGTCCGCCAGCCCAGCCATTC (SEQ ID NO: 19)

tef-F：GAATGCGGCCGCTCATCAACAGTCGCTTGTCCAC (SEQ ID NO: 20)

tef-R：TGCTCTAGATTTGACGGTTGATGTGCTGACTG (SEQ ID NO: 21)

利用引物tef-F和tef-R擴增粗糙脈孢菌tef啟動子片段，將其插入至質(zhì)粒pMF272的Xba I和Not I酶切位點之間，替換原有ccg-1啟動子片段，得到質(zhì)粒pMF272-tef。擴增NCU05383和NCU05994的開放閱讀框；然后分別通過酶切插入質(zhì)粒pMF272-tef中Xba I和Pac I酶切位點間，得到質(zhì)粒pMF272-tef-5383和pMF272-tef-5994。

將10 μg 質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（FGSC #6103，A），通過平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以其為模板，利用引物tef-F /NCU05383R和tef-F /NCU05994R進(jìn)行擴增，如果可以擴增得到目的片段，則說明目標(biāo)基因的開放閱讀框已整合到基因組中。引物如下所示：

將上述所獲得的轉(zhuǎn)化子與野生型菌株雜交（FGSC #4200，a），將雜交得到的子囊孢子熱激（60℃, 45min）后，稀釋涂布在平板上，萌發(fā)后挑至斜面上，生長7天后，提取基因組，利用PCR進(jìn)行鑒定，從而獲得過表達(dá)菌株的純合子TCG-5383和TCG-5994。

實施例3 NCU05051過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以粗糙脈胞菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(FGSC #6103)(購自FGSC)出發(fā)，根據(jù)同源重組的原理，將NCU05051的整個開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）整合至his-3位點。

開放閱讀框特異性引物:

NCU05051F: TCTAGAATGCTGAGCTCACAGAACCCG (SEQ ID NO: 22);

NCU05051R: CCTTAATTAATTGATAGCCTGGCATCTGAGGGTTG (SEQ ID NO: 23)

擴增NCU05051的開放閱讀框；然后分別通過酶切插入質(zhì)粒pMF272中Xba I和Pac I酶切位點間，得到質(zhì)粒pMF272-5051。將10 μg pMF272-5051電擊轉(zhuǎn)化至組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（FGSC #6103，A），通過平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以其為模板，利用引物Pccg1-F和NCU05051R或進(jìn)行擴增，如果可以擴增得到目的片段，則說明目標(biāo)基因的開放閱讀框已整合到基因組中。引物如下所示：

Pccg1-F：GTCCTCCCACCTCCCCAAT (SEQ ID NO: 15)

將上述所獲得的轉(zhuǎn)化子與野生型菌株雜交（FGSC #4200，a），將雜交得到的子囊孢子熱激（60 ℃，45 min）后，稀釋涂布在平板上，萌發(fā)后挑至斜面上，生長7天后，提取基因組，利用PCR進(jìn)行鑒定，從而獲得過表達(dá)菌株的純合子TCG-5051。

實施例4過表達(dá)菌株產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶實驗

轉(zhuǎn)錄因子工程菌和野生型粗糙脈孢菌分別在2%結(jié)晶纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，取培養(yǎng)基上清，離心后進(jìn)行一系列驗證試驗。

4.1 方法：

4.1.1 蛋白濃度測定：

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：于1 mL去離子水中加入10 mg牛血清蛋白，得到10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)貯液。以標(biāo)準(zhǔn)貯液稀釋濃度為0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取20 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于1 mL Bradford 溶液中，混勻，室溫靜置5 min，測其OD₅₉₅，得到縱坐標(biāo)值，作為橫坐標(biāo)值為BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度，以此制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 待測蛋白溶液準(zhǔn)備：吸取絲狀真菌發(fā)酵不同時間的發(fā)酵液于1.5 mL離心管，14000 rpm離心5 min，取上清置于新離心管中。

3. 蛋白濃度測定：1 mL Bradford中加入上述20 μL發(fā)酵液，對照為1 mL Bradford加入20 μL超純水。上下顛倒混勻后靜置反應(yīng)5 min，在OD₅₉₅條件下測定吸光度值。

4.1.2 CMCase（內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶）酶活測定方法：

1. 反應(yīng)酶液準(zhǔn)備：根據(jù)蛋白濃度測定值，待測定發(fā)酵酶液以0.1 M pH 4.6醋酸鈉緩沖液稀釋至合適范圍。

2. 酶液與底物反應(yīng)：0.2 mL稀釋的發(fā)酵液酶液與0.2 mL AZO-CMC底物分別于45 ℃預(yù)熱5 min。

3. 酶液與AZO-CMC底物混勻，45 ℃條件下水浴10 min，取1 mL沉淀劑，劇烈震蕩10 s終止酶和底物的反應(yīng)，常溫靜置10 min，振蕩混勻，常溫下1000 g離心10 min。

4. 取上清于比色皿中OD₅₉₀測定吸光度值A(chǔ)bs。空白對照采用滅活的發(fā)酵酶液。

5. 內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶酶活（U/mL）計算公式: Units/mL=milli U/assay=(412.5×Abs-6)×2×1/1000×N

4.1.3 XYLANase(木聚糖酶)酶活測定方法：

1. 反應(yīng)酶液準(zhǔn)備：根據(jù)蛋白濃度測定值，待測定發(fā)酵酶液以0.1 M pH 4.6醋酸鈉緩沖液稀釋至合適范圍。

2. 酶液與底物反應(yīng)：0.2 mL稀釋的發(fā)酵液酶液與0.2 mL AZO-XYLAN底物分別于45 ℃預(yù)熱5 min，酶液與AZO-XYLAN底物混勻，45 ℃溫度下反應(yīng)10 min。

3. 取1 mL無水乙醇于上述離心管，劇烈振蕩10 s終止酶和底物的反應(yīng)，室溫靜置5 min，振蕩混勻，常溫下1500 g離心10 min。

4. 取上清于比色皿中OD₅₉₀測定吸光度值A(chǔ)bs?？瞻讓φ詹捎脺缁畹陌l(fā)酵酶液。

5. 木聚糖酶酶活（U/mL）計算公式: Units/ml= milli U/assay=(66.6×Abs²+105×Abs+3.9)×2×1/1000×N。

4.1.4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE實驗:

實驗中所用的蛋白預(yù)制膠均購自Life technologies公司，樣品制備操作如下：等體積上樣量(60 μL體系)蛋白電泳中所有樣品都取相同體積，NuPAGE RLDS Sample Buffer添加15 μL，NuPAGE Reducing Agent添加6 μL，剩余體積用超純水補齊?；靹蚝蟮牡鞍咨蠘右后w置于70 ℃條件下10 min。

1×SDS Runing Buffer電泳緩沖液配置如下：取50 mL NuPAGERMES Running Buffer 于950 mL超純水中混合均勻，向電泳槽中加入600 mL電泳緩沖液，取200 mL電泳緩沖液中加入500 μL NuPAGERAntioxidant，混合均勻后加入上層電泳槽中。上樣完成后采用電壓200V，電泳45 min。

上述使用蛋白膠快速染色液考馬斯亮藍(lán)購自Solarbio公司，具體染色方法如下：

（1）溶液B 100 mL，與溶液A 2 mL充分混勻，染色液制備完成。

（2）將電泳完成后的蛋白膠置于容器中，加入100 mL超純水微波加熱至沸騰1 min，脫色搖床放振蕩5 min，棄液體。

（3）用雙蒸水輕輕沖洗兩次，加入適量染色液，微波至沸騰后持續(xù)1 min，脫色搖床振蕩5 min。棄染色液。

（4）雙蒸水沖洗兩次，加入50 mL雙蒸水加熱至沸騰1 min，置脫色搖床上振蕩10 min，棄液體，用雙蒸水沖洗兩次，再加入雙蒸水，置脫色搖床上振蕩過夜。

（5）蛋白膠置于凝膠成像儀中白光觀察，拍照。

4.2 結(jié)果：

在2%結(jié)晶纖維素條件下培養(yǎng)7天，Pc-10006過表達(dá)菌株TCG-10006培養(yǎng)基上清液中的蛋白濃度、纖維素酶酶活以及木聚糖酶酶活顯著提高，分別為出發(fā)菌株的2.4倍、1.5倍和1.7倍（圖1）。而Pc-6487過表達(dá)菌株TCG-6487培養(yǎng)基上清液中的蛋白濃度、纖維素酶酶活及木聚糖酶活也顯著升高，分別為出發(fā)菌株的1.8倍、1.2倍和1.7倍（圖1）。SDS-PAGE分析顯示，過表達(dá)菌株與出發(fā)菌株相比，蛋白條帶有所加深，尤其是72 kDa左右的纖維素酶CBH I和CBH II條帶變化最為明顯（圖2）。

NCU05383過表達(dá)菌株TCG-5383和NCU05994過表達(dá)菌株TCG-5994的搖瓶發(fā)酵實驗表明，在以2%結(jié)晶纖維素為碳源的條件下發(fā)酵4天后，其發(fā)酵液中蛋白含量分別提高了85%和120%。與出發(fā)菌株相比，TCG-5383和TCG-5994的纖維素酶酶活分別提高了90%和105%，并且其木聚糖酶活分別提高了150%和200%（圖3）。SDS-PAGE分析也證實了這一現(xiàn)象，與出發(fā)菌株相比，過表達(dá)菌株在72 KD處外切纖維素酶CBH I和CBH II的條帶加深（圖4-圖5）。

另外，在2%結(jié)晶纖維素條件下培養(yǎng)7天，與出發(fā)菌株相比較，NCU05051過表達(dá)菌株TCG-5051培養(yǎng)基上清液中的蛋白濃度和纖維素酶酶活分別提高了20%和80%，而木聚糖酶酶活顯則無明顯差異（圖6）。

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