本發(fā)明涉及改進(jìn)纖維素水解酶和/或半纖維素水解酶的生產(chǎn)，特別是在由纖維素或木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)乙醇的情形內(nèi)。

后者這些由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)，且就對(duì)用于生產(chǎn)生物燃料的農(nóng)業(yè)用地的使用而言，相比于基于甘蔗、玉米、小麥、甜菜等的所謂的第一代產(chǎn)品造成較少的與食品生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題。

各種技術(shù)-經(jīng)濟(jì)研究論證了降低纖維素酶的成本是用于起始于木質(zhì)纖維素原材料來(lái)生物生產(chǎn)乙醇的方法的關(guān)鍵因素之一。

當(dāng)前，工業(yè)纖維素酶主要由絲狀真菌，里氏木霉（trichodermareesei）來(lái)生產(chǎn)，這是由于其高分泌能力。在用于生產(chǎn)纖維素酶的常規(guī)方法中，經(jīng)由若干分離步驟在培養(yǎng)上清液中將其回收。

真菌漿（fungalmust）（過(guò)濾后回收的固體部分）未被再利用。其被視為廢料。

此外，由里氏木酶的高產(chǎn)菌株（hyper-producingstrain）生產(chǎn)的酶雞尾酒（enzymaticcocktail）在β-葡糖苷酶活性方面是不足的。

專利已經(jīng)提出了以若干種方式改進(jìn)生產(chǎn)菌株（producingstrain）的方法：通過(guò)過(guò)表達(dá)基因（例如關(guān)于β-葡糖苷酶的過(guò)表達(dá)的專利申請(qǐng)ep2082054），或通過(guò)克隆源自其它微生物的更有效的β-葡糖苷酶（例如專利申請(qǐng)wo2013115305，其描述了對(duì)里氏木酶中的曲霉屬的β-葡糖苷酶基因的克?。嗷蛲ㄟ^(guò)由β-葡糖苷酶的不同基因生成更有效的新基因（例如專利申請(qǐng)wo2010029259，其描述了通過(guò)l-shuffling來(lái)生產(chǎn)具有改進(jìn)活性的β-葡糖苷酶的變體）。

還從專利申請(qǐng)wo11079048已知，在ssf方法（同步水解和發(fā)酵）中，β-木糖苷酶活性的增加對(duì)酶促水解具有有益作用，這是因?yàn)槠涫沟每梢越档褪褂玫拿傅膭┝俊Ｆ溥€使得可以水解烷基木糖苷。

本發(fā)明提出了用于生產(chǎn)酶雞尾酒的方法和適合于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法的設(shè)備，使得可以顯著地、或甚至劇烈地增加β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性的雞尾酒。

令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法的執(zhí)行帶來(lái)β-葡糖苷酶、濾紙酶（fpase）和β-木糖苷酶的比活性的顯著改進(jìn)。β-葡糖苷酶活性可為在普通條件下在酶生產(chǎn)結(jié)束時(shí)測(cè)量的活性的3至10倍；β-木糖苷酶的活性為3倍。

因此在常規(guī)酶生產(chǎn)步驟過(guò)程中與酶分離的真菌漿被再利用。該漿（must）相對(duì)于培養(yǎng)物的總質(zhì)量占10-20質(zhì)量%。

更為準(zhǔn)確地，本發(fā)明涉及用于由生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的纖維素水解微生物生產(chǎn)酶雞尾酒的方法，所述方法包括：

-用于生產(chǎn)酶的步驟，其中獲得含有酶和微生物漿的培養(yǎng)基；將所述漿與含有所述酶的液體分離或不分離，

-冷卻所述漿至包括在4至20℃之間的溫度的步驟，所述溫度是低于酶生產(chǎn)步驟溫度的溫度，持續(xù)一定時(shí)間使得：

-源自冷卻步驟的液體的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶濃度大于源自酶生產(chǎn)步驟的液體的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶濃度，

和/或

-固體體積/總體積比率小于酶生產(chǎn)步驟的所述比率，

-和在冷卻步驟結(jié)束時(shí)獲得酶雞尾酒。

有利地，冷卻步驟的溫度包括在4至20℃之間，且優(yōu)選在4℃至18℃之間。

優(yōu)選地，冷卻步驟在包括在3.5至5.5之間，且優(yōu)選大于4的ph下進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的方式中，冷卻步驟在貧氧氣氛中，優(yōu)選在無(wú)氧氣氛中進(jìn)行。

通常，注入中性氣體，例如氮?dú)饣蚨趸肌?/p>

優(yōu)選地，所述微生物屬于木霉屬，特別是里氏木霉，且優(yōu)選為菌株cl847。

在冷卻步驟之后，分離源自漿的酶雞尾酒且獲得殘留的漿。

通常，分離借助至少一個(gè)離心或過(guò)濾/擠壓或微濾進(jìn)行，任選之前進(jìn)行沉降。

可濃縮經(jīng)分離的液體中的酶，例如通過(guò)超濾。

使用的微生物選自纖維素水解真菌或其它改性微生物。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，纖維素水解微生物屬于木霉屬、曲霉屬、青霉屬和裂褶菌屬，其特別產(chǎn)生適合于纖維素和半纖維素完全水解（totalhydrolysis）的纖維素酶和半纖維素酶。

在一個(gè)優(yōu)選的方式中，使用的工業(yè)菌種屬于里氏木霉物種；真菌通常已經(jīng)被改性以改進(jìn)通過(guò)誘變選育法（隨機(jī)突變）來(lái)生產(chǎn)纖維素水解酶和/或半纖維素水解酶，例如為菌株ifpcl847（法國(guó)專利fr-b-2555803）。這些菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

根據(jù)本發(fā)明的方法包括酶生產(chǎn)步驟，其中獲得含有酶和微生物漿的培養(yǎng)基，和其中任選將所述漿與含有酶的液體分離。

菌株在被攪拌和充氣的發(fā)酵罐中在與它們的生長(zhǎng)和酶的生產(chǎn)相適應(yīng)的條件下培養(yǎng)；這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。引入用于生長(zhǎng)的碳源和用于生產(chǎn)酶的誘導(dǎo)（inductive）源。碳源可為工業(yè)可溶性糖，例如葡萄糖、乳糖或木糖，或來(lái)自源自經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的單體形式的半纖維素級(jí)分的提取物。誘導(dǎo)碳源可選自乳糖、纖維二糖、槐糖和纖維素。水解殘留物或經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料也可用作用于微生物生長(zhǎng)和表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)的碳源。后者的碳源也可被基因上改進(jìn)的菌株且特別是重組菌株所用。

在酶生產(chǎn)步驟結(jié)束時(shí)，漿與液體分離或未與液體分離亦或可分離僅部分的漿。漿對(duì)應(yīng)于真菌，對(duì)應(yīng)于固體部分。液體含有酶。經(jīng)分離的漿可被稀釋（全部或部分）。經(jīng)分離的漿優(yōu)選被水稀釋。

可對(duì)分離進(jìn)行調(diào)整，特別是根據(jù)所需的活性。

分離可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段進(jìn)行。優(yōu)選地，可提及至少一個(gè)離心或一個(gè)過(guò)濾/擠壓（壓濾器）或微濾。離心之前任選進(jìn)行沉降。可設(shè)想濃縮酶（例如通過(guò)超濾）的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的方法繼續(xù)進(jìn)行將所述漿（經(jīng)分離或未經(jīng)分離）冷卻至低于酶生產(chǎn)步驟溫度的溫度的步驟并持續(xù)特定的一段時(shí)間。

冷卻步驟的溫度有利地包括在4至20℃之間，且優(yōu)選在4℃至18℃之間。

優(yōu)選地，冷卻步驟在包括在3.5至5.5之間，且優(yōu)選大于4的ph下進(jìn)行。將ph區(qū)間限定在β-葡糖苷酶開(kāi)始失活的ph3和真菌的可能的孢子形成的ph6之間。

優(yōu)選地，冷卻步驟在貧氧氣氛中，優(yōu)選在無(wú)氧氣氛中進(jìn)行。通常，注入中性氣體，例如氮?dú)饣蚨趸肌Ｔ谪氀鯕夥罩幸呀?jīng)觀察到改進(jìn)的產(chǎn)率，且最佳產(chǎn)率在無(wú)氧氣氛中。在氧氣的存在下，真菌可再次消耗酶。

通常，冷卻持續(xù)最多120小時(shí)，優(yōu)選12小時(shí)至90小時(shí)，優(yōu)選地24至72小時(shí)是足夠的，且通常為大約48小時(shí)。

在該冷卻步驟過(guò)程中，建立了存在于漿中的真菌的自溶反應(yīng)，自溶由酶產(chǎn)生。后者存在于未經(jīng)分離的漿的液體中或它們?yōu)槿员槐３衷诮?jīng)分離的漿之內(nèi)，且未能被分離的那些。

在實(shí)驗(yàn)上注意到，在根據(jù)本發(fā)明的方法的條件下，β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性非常顯著地增加且生物質(zhì)丸粒減少。

為了優(yōu)化酶雞尾酒的產(chǎn)率，可預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中確定冷卻時(shí)間。

有利地，在執(zhí)行該方法的過(guò)程中控制冷卻時(shí)間，通過(guò)取樣來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。

冷卻時(shí)間使得

-源自冷卻步驟的液體的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶活性大于源自酶生產(chǎn)步驟的液體的β-葡糖苷酶或β-木糖苷酶活性，

和/或

-固體體積/總體積（生物質(zhì)丸粒）比率小于酶生產(chǎn)步驟的所述比率。

為確定β-葡糖苷酶或芳基β-葡糖苷酶活性所使用的基質(zhì)為對(duì)硝基苯基-?-d-吡喃葡糖苷(pnpg)。其被β-葡糖苷酶所分割，釋放對(duì)硝基苯酚。

芳基β-葡糖苷酶活性的一種單位定義為每分鐘由pnpg產(chǎn)生1μmol的對(duì)硝基苯酚所需的酶的量，且以iu/ml表達(dá)。

為確定β-木糖苷酶活性所使用的基質(zhì)為對(duì)硝基苯基-?-d-吡喃木糖苷，根據(jù)相同的原理。

這些參數(shù)由測(cè)量確定。

已經(jīng)觀察到，在該方法過(guò)程中，β-葡糖苷酶的濃度增加，達(dá)到最大然后降低。同時(shí)，已經(jīng)觀察到生物質(zhì)丸粒減少。

舉例而言，已經(jīng)注意到通常釋放的液體的量相當(dāng)于經(jīng)分離的漿的原始重量的至少10%，且最經(jīng)常為30-40%，且關(guān)于β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性測(cè)量的蛋白質(zhì)的濃度增至3倍。

基于該信息確定冷卻時(shí)間在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

在冷卻步驟之后，可將酶雞尾酒（液體部分）與殘留固體分離或不分離；優(yōu)選將其分離。

分離手段是之前描述的那些。

已經(jīng)注意到，當(dāng)在培養(yǎng)剛結(jié)束時(shí)未分離漿時(shí)，該分離更為困難、更需謹(jǐn)慎處理。

此外，在一個(gè)非常優(yōu)選的方式中，漿的分離在冷卻步驟之前進(jìn)行，優(yōu)選使用壓濾器。優(yōu)選地，至少95%的漿被分離且在還更優(yōu)選的方式中全部的漿與液體分離。在此將“全部”理解為與所使用的分離方法有關(guān)。

優(yōu)選地，將源自冷卻步驟的所述酶雞尾酒與源自酶生產(chǎn)步驟的酶混合，所述雞尾酒以全部或部分混合。

所述雞尾酒（經(jīng)混合或未經(jīng)混合）用于酶促水解中。

殘留的漿可經(jīng)受新的冷卻步驟，任選但優(yōu)選地，隨后分離新的酶雞尾酒。

這些步驟的條件為之前描述的那些。

在此說(shuō)明一個(gè)附加的冷卻步驟，但其數(shù)量不受限制。

因此，本發(fā)明還涉及執(zhí)行前述步驟的方法，其中所述殘留的漿經(jīng)受冷卻步驟，且在冷卻步驟結(jié)束時(shí)獲得與殘留的漿分離或未分離的酶雞尾酒。優(yōu)選地，所述雞尾酒與在所述冷卻步驟結(jié)束時(shí)獲得的殘留的漿分離。

優(yōu)選地，將源自冷卻步驟的酶雞尾酒混合。優(yōu)選地，將它們與源自酶生產(chǎn)步驟的酶混合。

通常，可將各雞尾酒彼此混合和/或與源自酶生產(chǎn)步驟的酶混合?；旌衔锏母鹘M分的比例根據(jù)所述混合物的用途來(lái)確定。優(yōu)選地，雞尾酒和酶以它們的全部混合。

至少一種雞尾酒（經(jīng)混合或未經(jīng)混合）用于酶促水解中。

從圖1至6將更好地理解本發(fā)明。圖7至13關(guān)于實(shí)施例。

圖1描述了在酶生產(chǎn)步驟和冷卻步驟之間具有分離步驟的優(yōu)選實(shí)施方案。圖2是對(duì)不具有漿的分離的表述。在圖3和圖4中，將附加的冷卻步驟分別添加到圖1和圖2中。

圖5顯示了合并存在或不存在分離的一個(gè)實(shí)施方案。

圖6顯示了在冷卻步驟之前和/或之后的漿分離步驟的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。

根據(jù)圖1，將碳源和誘導(dǎo)源（管道1），以及產(chǎn)生纖維素酶和/或半纖維素酶的纖維素水解微生物（管道3）和所需的營(yíng)養(yǎng)物（管道4）引入酶生產(chǎn)步驟（酶生產(chǎn)區(qū)域2）。

將獲得的產(chǎn)物分離（分離區(qū)域5）成含有酶的液體（管道6）并回收含有真菌和其中保持的酶的漿（管道7）。

使?jié){經(jīng)受冷卻步驟（冷卻區(qū)域8）。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將液體從酶生產(chǎn)區(qū)域（反應(yīng)器）抽出，且漿保留在所述區(qū)域中，在其中所述漿被冷卻。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將培養(yǎng)基從酶生產(chǎn)區(qū)域抽出，并以分離手段（過(guò)濾/擠壓，離心等）分離，優(yōu)選在沉降并抽出液體之后，以獲得漿。將該漿引入冷卻區(qū)域，其可為酶生產(chǎn)區(qū)域的反應(yīng)器（在非連續(xù)過(guò)程的情況下）或另一反應(yīng)器（在連續(xù)過(guò)程的情況下）。

將經(jīng)冷卻的漿（管道9）分離（區(qū)域10）成含有酶雞尾酒的液體（管道11）和為殘留的漿的固體（管道12）。

將管道6和11的流中的酶混合并送至（管道13）酶促水解區(qū)域(14)。

圖3重復(fù)了該圖示，增加了冷卻步驟。

使殘留的漿（漿12）經(jīng)受附加的冷卻步驟（冷卻區(qū)域15）。

以與之前相同的方式，送入附加的冷卻步驟（區(qū)域15）的漿在第一冷卻步驟（區(qū)域8）之后可能未在區(qū)域10中分離。

將經(jīng)冷卻的漿（管道16）分離（區(qū)域17）成含有酶雞尾酒的液體（管道19）和為殘留的漿的固體（管道18）。

將管道19的流中的酶與源自酶生產(chǎn)步驟（管道6）、第一冷卻步驟（管道11）的流的酶混合并送至（管道20）酶促水解區(qū)域(14)。

圖1的附圖標(biāo)記將在圖2中得到識(shí)別。將酶生產(chǎn)步驟之后的分離步驟（區(qū)域5）省略。

上述情況也適用于基于圖2的圖4，且圖4包括附加的冷卻步驟，關(guān)于該增加的附圖標(biāo)記取自圖3。

還可將存在一個(gè)分離且不存在其它分離合并于一個(gè)圖示中。這例如在圖5中得到例示。其顯示了在酶生產(chǎn)步驟結(jié)束時(shí)存在分離（區(qū)域5），在第一冷卻步驟（區(qū)域8）結(jié)束時(shí)和在附加的冷卻步驟之前不存在分離，以及在附加的冷卻步驟之后存在分離（區(qū)域17）。

圖6顯示在冷卻步驟之前和/或之后的漿分離步驟的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。

參照?qǐng)D1，其為區(qū)域5和/或區(qū)域10的一個(gè)實(shí)施方案。

在酶生產(chǎn)區(qū)域2結(jié)束時(shí)，在沉降步驟（區(qū)域30）中將培養(yǎng)基分離，真菌位于沉降的淤渣中（管道31）并使獲得的渾濁液體（管道32）經(jīng)過(guò)離心步驟（離心區(qū)域33）。這產(chǎn)生含有真菌的膏狀物（管道34）和澄清液體（管道35）。為了實(shí)現(xiàn)分離，使澄清液體經(jīng)過(guò)微濾步驟（區(qū)域36），滲余物（管道37）含有真菌，且滲透物（管道38）含有酶。

可將含有真菌的不同的流（淤渣、膏狀物、滲余物）混合并構(gòu)成將送至冷卻步驟的漿或構(gòu)成將經(jīng)受或不經(jīng)受新的冷卻步驟的殘留的漿。

為了濃縮酶，使?jié)B透物經(jīng)過(guò)超濾步驟。然后獲得經(jīng)濃縮的酶的滲余物（管道40），以及可在方法中再利用的滲透物（管道41）。

將注意到全部沉降和離心步驟可被一個(gè)過(guò)濾/擠壓（壓濾器）替代。

實(shí)施例

實(shí)施例1：針對(duì)圖7至9

圖7是分離后和冷卻步驟前的里氏木霉cl847漿的照片。

圖8顯示培養(yǎng)上清液中蛋白質(zhì)濃度的變化。

圖9顯示在生產(chǎn)步驟結(jié)束時(shí)和在4℃下冷卻真菌72小時(shí)之后測(cè)量的β-葡糖苷酶活性。

纖維素酶的生產(chǎn)在機(jī)械攪拌下的20l生物反應(yīng)器（其12中l(wèi)可用）中進(jìn)行。礦物培養(yǎng)基具有以下組成：koh1.66g/l、h3po485%2ml/l、(nh4)2so42.8g/l、mgso4·7h2o0.6g/l、cacl20.6g/l、mnso43.2mg/l、znso4·7h2o2.8mg/l、cocl2104.0mg/l、feso4·7h2o10mg/l、玉米漿1.2g/l、消泡劑0.5ml/l。

將含有礦物培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器在120℃下消毒20分鐘，將葡萄糖含碳源在120℃下單獨(dú)消毒20分鐘，然后無(wú)菌添加至生物反應(yīng)器內(nèi)以具有30g/l的最終濃度。

在10%(v/v)下用里氏木霉cl847的菌株的預(yù)培養(yǎng)物來(lái)接種生物反應(yīng)器。預(yù)培養(yǎng)物的礦物培養(yǎng)基與生物反應(yīng)器的礦物培養(yǎng)基相同，除了以5g/l添加酞酸鉀以緩沖ph。真菌在預(yù)培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)使用在30g/l濃度下的葡萄糖作為含碳基質(zhì)進(jìn)行。接種物的生長(zhǎng)持續(xù)2至3天并在28℃下在攪拌的培育器中進(jìn)行。如果殘留的葡萄糖濃度小于15g/l，進(jìn)行轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器。

在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)階段：

-在27℃的溫度下和在4.8的ph下（用5.5m氨調(diào)節(jié)）在葡萄糖含碳基質(zhì)（初始濃度=30g/l）上的生長(zhǎng)階段。充氣在0.5vvm下且根據(jù)po2（溶解氧壓力）（保持其高于30%）攪拌在200和800rpm之間增強(qiáng)。

-酶生產(chǎn)階段。當(dāng)發(fā)酵器的原始基質(zhì)被耗盡時(shí)，在每克細(xì)胞和每小時(shí)35至45毫克的流量下連續(xù)注入250g/l下的乳糖溶液直至164小時(shí)。溫度降低至25℃且ph降低至4直到培養(yǎng)結(jié)束。通過(guò)添加5.5n氨溶液來(lái)調(diào)整ph，所述氨供應(yīng)合成分泌蛋白質(zhì)（excretedprotein）所需的氮。通過(guò)充氣和攪拌作用保持溶解氧含量高于15至20%。

酶生產(chǎn)之后進(jìn)行在分離菌絲體（通過(guò)過(guò)濾）或形成的細(xì)胞后的通過(guò)lowry法和bsa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的細(xì)胞外蛋白質(zhì)的測(cè)定。獲得的蛋白質(zhì)的最終濃度等于45g/l。

該生產(chǎn)步驟之后進(jìn)行將真菌漿與培養(yǎng)上清液分離。擠壓該漿以提取最大量的上清液（圖7）并稱重。將后者置于4℃下的密閉容器中72小時(shí)。

每24小時(shí)取在真菌的自溶后釋放的上清液樣品直至72小時(shí)。

在72小時(shí)后確定液體重量。其相當(dāng)于漿重量的30%。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定示于圖8中?？梢钥吹较鄬?duì)于酶生產(chǎn)結(jié)束時(shí)濃度以及β-葡糖苷酶活性增至3倍（圖9）。

實(shí)施例2：針對(duì)圖10至13

圖10顯示在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)和在4℃和20℃下真菌自溶72小時(shí)后測(cè)量的β-葡糖苷酶活性。

圖11顯示在兩個(gè)分離系列之后獲得的β-葡糖苷酶比活性(iu/mg)。

圖12顯示在兩個(gè)分離系列之后獲得的濾紙酶比活性(iu/mg)。

圖13對(duì)應(yīng)于在分離步驟中對(duì)酶的確認(rèn)。

該方法在6m³試驗(yàn)裝置中執(zhí)行。將真菌里氏木霉cl847在與實(shí)施例1中描述的相同條件下培養(yǎng)。在生產(chǎn)階段結(jié)束時(shí)，以4個(gè)步驟將酶分離：沉降步驟，離心步驟，微濾步驟和超濾步驟。

該四個(gè)步驟圖示顯示于圖6中。頭三個(gè)步驟用于去除真菌且最后一個(gè)步驟（超濾）用于濃縮所生產(chǎn)的酶。

將回收的全部真菌級(jí)分（沉降器淤渣，離心機(jī)膏狀物和微濾滲余物）置于生物反應(yīng)器中，在8℃下冷卻72小時(shí)并用水稀釋至等于4m³的最終體積。漿經(jīng)歷第二分離系列：離心機(jī)，微濾和超濾。

在第二分離系列結(jié)束時(shí)回收的酶的量類似于在第一分離系列結(jié)束時(shí)獲得的量，即在第一分離系列之后為大約70kg蛋白質(zhì)且在第二分離系列之后為64kg。

相比之下，令人關(guān)注的是注意到針對(duì)獲得的酶雞尾酒的β-葡糖苷酶活性（圖11）和濾紙酶活性（圖12）在冷卻步驟（真菌自溶）之后大20%?；厥盏拿鸽u尾酒因此有效得多。

進(jìn)行雙向電泳以觀察在分離步驟過(guò)程中是否存在對(duì)酶雞尾酒的組成的顯著更改。起始于使用fplc[快速蛋白質(zhì)液體色譜]預(yù)先脫鹽的樣品，在2d凝膠上200μg沉積物以及考馬斯亮藍(lán)染色的情況下，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和它們的等電點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行分離。

經(jīng)掃描的凝膠示于圖13中；圖13a對(duì)應(yīng)于膏狀物且圖13b對(duì)應(yīng)于澄清液體。

在離心步驟中在澄清液體和膏狀物中確認(rèn)主要的酶。注意到凝膠特征（profile）的顯著不同。離心膏狀物顯示β-木糖苷酶。在pnp-木糖上測(cè)量該活性以用于確認(rèn)，且發(fā)現(xiàn)在膏狀物中的比活性為在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)獲得的酶雞尾酒中的比活性的大約3倍（在膏狀物中為1.2iu/mg，且在來(lái)自發(fā)酵器的最終樣品中為0.4iu/mg）。