本發(fā)明涉及一種制備形成胚狀體時使用的胚狀體形成用容器的方法。

本申請請求通過參照而被引用于此的日本申請?zhí)卦?014-224752號的優(yōu)先權(quán)。

背景技術(shù)：

胚胎干細胞及成體干細胞等干細胞具有在試管內(nèi)分化為各種細胞的能力。作為使干細胞在試管內(nèi)分化的方法，利用以下方法：通過對干細胞進行懸浮培養(yǎng)，以形成被稱為胚狀體的疑似胚體的方法；共同培養(yǎng)像基質(zhì)細胞那樣支持分化與增殖的細胞和干細胞的方法。其中，懸浮培養(yǎng)為在使干細胞在試管內(nèi)分化時最廣泛使用的方法。例如，鼠胚胎干細胞通過在不加入lif(白血病抑制因子：leukemiainhibitoryfactor)的情況下，在培養(yǎng)皿等培養(yǎng)容器中，以不粘合的方式懸浮培養(yǎng)而形成細胞團塊(細胞塊)。懸浮培養(yǎng)中所形成的細胞團塊被稱為胚狀體(eb)。已知所得到的細胞團塊之后分化為各種種類的細胞。

胚狀體(eb)具有由兩層細胞層構(gòu)成的如球狀的結(jié)構(gòu)，外層相當于近端內(nèi)胚層、內(nèi)層相當于胚體外胚層。兩個胚層通過基底膜而被隔開。胚狀體的結(jié)構(gòu)與作為鼠的6日胚胎的圓筒胚非常相似，在其極限內(nèi)接近于胚胎的正常的發(fā)育階段。在胚狀體中，也會導(dǎo)致中胚層的誘導(dǎo)，還會發(fā)育心肌細胞、血液細胞，進一步會發(fā)育原始的血管網(wǎng)。此外，若使胚狀體附著于培養(yǎng)皿，繼續(xù)進行培養(yǎng)，則分化為各種種類的細胞。例如，包括神經(jīng)細胞、角蛋白細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。經(jīng)過胚狀體的形成而分化的細胞，不限于體細胞，最近確認到還會發(fā)生向生殖細胞譜系的分化。為了利用干細胞的多分化能，最好形成胚狀體。

通常，作為形成細胞團塊的技術(shù)，已知有在垂下的液滴中培養(yǎng)細胞的懸滴(hangingdrop)法、非專利文獻1中記載的回轉(zhuǎn)培養(yǎng)法及離心法。然而，這些方法的培養(yǎng)條件的設(shè)定較為煩雜。

專利文獻1中，作為用于形成細胞團塊的容器，公開了一種利用聚甲基丙烯酸羥乙酯或乙烯-乙烯醇共聚物等而形成的培養(yǎng)容器。

此外，專利文獻2中，公開了一種對作為干細胞的一種的es細胞進行懸浮培養(yǎng)而形成胚狀體的方法。在專利文獻2的形成胚狀體的方法中，使用了以具有磷酸膽堿類似基團的聚合物包覆的胚狀體形成用容器。專利文獻2中雖然公開了一種用于通過該聚合物包覆胚狀體形成用容器的方法，但并未進行詳細的研究。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：特開平6-327462號公報

專利文獻2：國際公開第2005/001019號手冊

非專利文獻

非專利文獻1：biotechnol.j.2008,3,1172-1184

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題

以具有磷酸膽堿類似基團的聚合物包覆的胚狀體形成用容器，存在由于涂布斑點導(dǎo)致細胞粘合性產(chǎn)生偏差的問題；或涂布膜厚較高時，在容器上產(chǎn)生涂布膜的圖案，導(dǎo)致在確認胚狀體的形成等的顯微鏡觀察時，背景中拍攝到圖案的問題。即，在以具有磷酸膽堿類似基團的聚合物包覆的胚狀體形成用容器中，在胚狀體形成及從胚狀體分化的細胞的光學(xué)觀察時存在問題。本發(fā)明的目的在于，解決該以往的胚狀體形成用容器的問題。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種胚狀體的形成性優(yōu)異的、適合光學(xué)觀察的胚狀體形成用容器的制備方法。

解決技術(shù)問題的技術(shù)方法

本發(fā)明的發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)，通過經(jīng)過以特定的量將側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物賦予于容器內(nèi)面，使其干燥，而形成涂布膜；之后，以特定的量使用處理液，將涂布膜流平，這樣的兩個工序，能夠制備有效地形成胚狀體、且光學(xué)觀察性優(yōu)異的胚狀體形成用容器，從而完成本發(fā)明。

即，本發(fā)明由以下內(nèi)容而組成。

1.一種制備胚狀體形成用容器的方法，該容器用于使干細胞懸浮培養(yǎng)，以形成胚狀體，其中，該方法包括：

對用于形成用于懸浮培養(yǎng)干細胞的區(qū)域的容器內(nèi)面，使用混合有側(cè)鏈上具有以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物的醇類介質(zhì)溶液，以側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量為0.1～10mg/cm²的方式進行涂布并干燥的工序(a)；以及

對通過工序(a)而制作的該容器內(nèi)面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm²添加水/醇類介質(zhì)溶液，使涂布膜溶脹后干燥的工序(b)。

[化學(xué)式1]

(式中，r¹、r²及r³為相同或不同的基團，表示氫原子、碳原子數(shù)為1～6的烷基或羥烷基；n為1～4的整數(shù)。)

2.根據(jù)上述1所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，進一步包括使用環(huán)氧乙烷氣體對該容器的內(nèi)面進行滅菌的工序(c)。

3.根據(jù)上述1或2所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為以式(2)所表示的含磷酸膽堿類似基團的單體(m)與其他單體的共聚物中的至少一種。

[化學(xué)式2]

(式中，r¹、r²及r³為相同或不同的基團，表示氫原子、碳原子數(shù)為1～6的烷基或羥烷基；r⁴表示碳原子數(shù)為1～6的烷基；r⁵表示氫原子或甲基；n為1～4的整數(shù)。)

4.根據(jù)上述3所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，其他單體包括(甲基)丙烯酸烷基酯或(甲基)丙烯酸縮水甘油酯。

5.根據(jù)上述1～4中任一項所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物。

6.根據(jù)上述1～5中任一項所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物。

7.根據(jù)上述6所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物的摩爾比為10～90:90～10。

8.根據(jù)上述1～5中任一項所述的制備胚狀體形成用容器的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物。

9.一種胚狀體形成用容器，其由上述1～8中任一項所述的制備胚狀體形成用容器的方法而被制備。

10.一種形成胚狀體的方法，其使用用于使干細胞懸浮培養(yǎng)、以形成胚狀體的胚狀體形成用容器，其中，該方法包括：

準備胚狀體形成用容器的工序(d)、以及在工序(d)的胚狀體形成用容器內(nèi)對胚胎干細胞進行懸浮培養(yǎng)的工序(e)，

所述胚狀體形成用容器通過以下工序形成：

對用于形成用于懸浮培養(yǎng)干細胞的區(qū)域的容器內(nèi)面，使用混合有側(cè)鏈上具有以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物的醇類介質(zhì)溶液，以側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量為0.1～10mg/cm²的方式進行涂布并干燥的工序(a)；以及

對通過工序(a)而制作的該容器內(nèi)面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm²添加水/醇類介質(zhì)溶液，使涂布膜溶脹后干燥的工序(b)。

[化學(xué)式3]

(式中，r¹、r²及r³為相同或不同的基團，表示氫原子、碳原子數(shù)為1～6的烷基或羥烷基；n為1～4的整數(shù)。)

11.根據(jù)上述10所述的形成胚狀體的方法，其中，其進一步包括在所述工序(b)之后，使用環(huán)氧乙烷氣體對所述容器的內(nèi)面進行滅菌的工序(c)。

12.根據(jù)上述10或11所述的形成胚狀體的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為以式(2)所表示的含磷酸膽堿類似基團的單體(m)與其他單體的共聚物中的至少一種。

[化學(xué)式4]

(式中，r¹、r²及r³為相同或不同的基團，表示氫原子、碳原子數(shù)為1～6的烷基或羥烷基、r⁴表示碳原子數(shù)為1～6的烷基，r⁵表示氫原子或甲基；n為1～4的整數(shù)。)

13.根據(jù)上述12所述的形成胚狀體的方法，其中，其他單體包括(甲基)丙烯酸烷基酯或(甲基)丙烯酸縮水甘油酯。

14.根據(jù)上述10～13中任一項所述的形成胚狀體的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物。

15.根據(jù)上述10～14中任一項所述的形成胚狀體的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物。

16.根據(jù)上述15所述的形成胚狀體的方法，其中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物的摩爾比為10～90:90～10。

17.根據(jù)上述10～14中任一項所述的形成胚狀體的方法，其中，側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，為2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物。

發(fā)明效果

本發(fā)明的制備胚狀體形成用容器的方法，與以往的方法相比，能夠提供一種容器表面均質(zhì)的胚狀體形成用容器。通過本發(fā)明的制備方法而制作的胚狀體形成用容器，胚狀體形成效率優(yōu)異、且光學(xué)觀察性優(yōu)異，為有用的胚狀體形成用容器。

附圖說明

圖1為通過實施例3的胚狀體形成用容器而形成的胚狀體的相差顯微鏡照片的副本。

圖2為通過比較例3的胚狀體形成用容器而形成的胚狀體的相差顯微鏡照片的副本。

具體實施方式

本發(fā)明為制備一種用于使干細胞懸浮培養(yǎng)、以形成胚狀體的胚狀體形成用容器的方法。本發(fā)明中，干細胞是指：具有自我復(fù)制能力和分化為各種細胞的能力(多分化能)的細胞。作為干細胞，可列舉胚胎干細胞(es細胞)、成體干細胞、人工多能性干細胞(ips細胞)等。

本發(fā)明的制備胚狀體形成用容器的方法包括以下的工序(a)以及工序(b)。

工序(a)為：將混合(溶解)有側(cè)鏈上具有以以下式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物的醇類介質(zhì)溶液(以下簡稱為“含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液”)，以0.1～10mg/cm²的方式賦予并涂布在用于形成用于懸浮培養(yǎng)的區(qū)域的容器內(nèi)面(內(nèi)表面)上，進行干燥的工序。

[化學(xué)式5]

所述式(1)中，r¹、r²及r³為相同或不同的基團，表示氫原子、碳原子數(shù)為1～6的、烷基或羥烷基；n為1～4的整數(shù)。

作為所述碳原子數(shù)為1～6的烷基，可列舉例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、環(huán)己基、苯基等。作為所述碳原子數(shù)為1～6的羥烷基，可列舉例如羥甲基、2-羥乙基、3-羥丙基、4-羥丁基、5-羥戊基、6-羥己基等。

通過上述工序(a)，能夠在所需的容器內(nèi)面上形成含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的涂布膜(賦予包覆層)，能夠?qū)⒃撊萜鲀?nèi)面制作成具有磷酸膽堿類似基團的表面。

在工序(a)中，在將含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液賦予并涂布在所希望的容器內(nèi)面上之后，即，在所希望的容器內(nèi)面上形成由該溶液形成的溶液層之后，使該溶液層干燥。作為將含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液涂布在所希望的容器內(nèi)面上的方法，可列舉以下方法，例如，在含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液中對容器進行浸漬處理、打撈的方法；將含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液添加或注入到所希望的容器內(nèi)面的方法；或?qū)⒑辛姿崮憠A類似基團的化合物的溶液噴在所希望的容器內(nèi)面上的方法。將含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液添加或注入到所希望的容器內(nèi)面的方法，能夠?qū)?cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物可靠地賦予于所希望的容器內(nèi)面，且能夠調(diào)整該溶液的涂布量，因而優(yōu)選。此外，使容器內(nèi)面干燥的方法，只要不損害本發(fā)明的目的，可使用任何方法。

作為將含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的溶液涂布在所希望的容器內(nèi)面上的條件，以使側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量為每1cm²容器內(nèi)面為0.1～10mg(0.1～10mg/cm²)、優(yōu)選為0.15～1mg的方式而賦予。若側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量小于0.1mg/cm²，則涂布變得不均勻，細胞粘合在容器內(nèi)面上，胚狀體形成變得不充分。此外，若側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量高于10mg/cm²，則會較大地產(chǎn)生涂布斑點，顯微鏡下的觀察性差。進一步，通過在工序(a)之后進行的流平處理無法消除，導(dǎo)致表面產(chǎn)生圖案。此外，由于原料成本也變大，因此缺乏實用性。

側(cè)鏈上具有以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物，優(yōu)選為以式(1)所表示的具有磷酸膽堿類似基團的聚合物，只要是具有磷酸膽堿類似基團的聚合物即可。側(cè)鏈上具有以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物，例如優(yōu)選為以式(2)所表示的含磷酸膽堿類似基團的單體(m)的均聚物、及該單體(m)與其他單體的共聚物中的至少一種，更優(yōu)選為該單體(m)與其他單體的共聚物中的至少一種。

[化學(xué)式6]

上述式(2)中，r¹、r²、r³及n與式(1)相同，r⁴表示碳原子數(shù)為1～6的烷基，r⁵表示氫原子或甲基。碳原子數(shù)為1～6的烷基的定義與式(1)相同。

作為以式(2)所表示的單體(m)，可列舉例如，2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、3-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、4-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、5-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、6-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三乙基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三丙基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三丁基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三環(huán)己基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三苯基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯等。

作為以式(2)所表示的單體(m)，其中，優(yōu)選2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯，進一步，2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基銨基)乙基磷酸酯(也稱作2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿。以下簡記為mpc)從獲得性、以及防止干細胞向容器的粘合，表達胚狀體形成能的方面出發(fā)而優(yōu)選。

作為用于得到所述共聚物的其他單體，可列舉疏水性單體、(甲基)丙烯酸-2-羥乙酯、(甲基)丙烯酸-2-羥丁酯、(甲基)丙烯酸-4-羥丁酯等含羥基的(甲基)丙烯酸酯；丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸、(甲基)丙烯酰氧基膦酸、2-羥基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙基三甲基氯化銨等含離子性基團的單體；(甲基)丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二甲氨基乙酯等含氮單體；聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯或這些的兩種以上的混合物等。

作為所述疏水性單體，例如可列舉出，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸-2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸十八酯等直鏈或支鏈(甲基)丙烯酸烷基酯；(甲基)丙烯酸環(huán)己酯等環(huán)狀(甲基)丙烯酸烷基酯；(甲基)丙烯酸芐酯、(甲基)丙烯酸苯氧基乙酯等芳香族(甲基)丙烯酸酯；聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯等疏水性聚亞烷基二醇(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯、甲基苯乙烯、氯甲基苯乙烯等苯乙烯類單體；甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚等乙烯基醚類單體；乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯酯類單體或這些的兩種以上的混合物等。

所述共聚物中，來自單體(m)的結(jié)構(gòu)單元，在共聚物的結(jié)構(gòu)單元中為10摩爾％以上且為90摩爾％以下，優(yōu)選為30摩爾％以上且為80摩爾％以下。若來自單體(m)的結(jié)構(gòu)單元為10摩爾％以上且為90摩爾％以下，則能通過以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團包覆容器表面，充分發(fā)揮包覆效果。

在所述共聚物中含有來自作為其他單體的疏水性單體的結(jié)構(gòu)單元時，來自疏水性單體的結(jié)構(gòu)單元在共聚物的結(jié)構(gòu)單元中優(yōu)選為90摩爾％以下，特別優(yōu)選為20～90摩爾％。具有來自疏水性單體的結(jié)構(gòu)單元的共聚物，雖耐溶出性得以提高，但若來自疏水性單體的結(jié)構(gòu)單元超過90摩爾％，則容器表面上的以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的包覆量變少，可能導(dǎo)致不能充分發(fā)揮包覆效果，因而不優(yōu)選。

作為其他單體，若共聚物中含有來自除上述疏水性單體以外的單體的結(jié)構(gòu)單元時，則耐溶出性得到提高，在培養(yǎng)基等中能夠使用表面活性劑、有機溶劑，因而優(yōu)選。例如，作為除疏水性單體以外的其他單體，使用了(甲基)丙烯酸縮水甘油酯的共聚物，能夠與容器表面的氨基、羧基等進行反應(yīng)，能夠使該共聚物化學(xué)結(jié)合于所希望的表面上。所述共聚物中，來自除疏水性單體以外的其他單體的結(jié)構(gòu)單元的比例優(yōu)選為70摩爾％以下。

以式(2)所表示的含磷酸膽堿類似基團的單體(m)的均聚物、或該單體(m)與其他單體的共聚物的分子量，以重均分子量計通常為5,000～5,000,000，從能夠有效地防止干細胞對容器的粘合，表現(xiàn)出胚狀體形成能，提高聚合物的耐溶出性的方面出發(fā)，優(yōu)選為10,000～2,000,000。重均分子量可以通過后述的實施例中所記載的方法而測定。

含有側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的醇類介質(zhì)溶液，只要是將側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物混合溶解于醇類溶劑中而成的溶液，可以為任意的溶液。作為醇類溶劑，優(yōu)選低級醇，可列舉例如，甲醇、乙醇、丙醇等或它們的混合物。

側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物，雖優(yōu)選為以下列舉的化合物，但無特別限定。

2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物

2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物

2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與甲基丙烯酸丁酯的共聚物、摩爾比為10～90:90～10的共聚物

2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物

本發(fā)明的制備胚狀體形成用容器的方法，在經(jīng)過工序(a)之后，還包含在形成于容器內(nèi)面的、具有凹凸及斑點的涂布膜上，賦予水/醇類介質(zhì)溶液，使涂布膜溶脹，對涂布膜進行干燥的工序(b)。在工序(b)中，通過在使用水/醇類介質(zhì)溶液使通過工序(a)而形成的涂布膜溶脹之后，再次使其干燥，來進行流平處理。流平處理是指進行處理，使得涂布膜的露出表面平滑化并均質(zhì)化，以使涂布膜為均勻的膜厚，而不形成凹凸或斑點。工序(b)中，通過使用水/醇類介質(zhì)溶液，通過降低水/醇類介質(zhì)溶液的蒸騰速度，進行流平處理。通常的流平處理中添加有諸如增稠劑或消泡劑的添加劑，但這些添加劑不具有本發(fā)明的效果。

在該容器內(nèi)面的涂布膜上所添加的水/醇類介質(zhì)溶液的量為15mg～250mg/cm²，優(yōu)選為30～190mg/cm²。溶液的量只要在30mg～190mg/cm²的范圍內(nèi)，則溶液能夠均勻地遍及涂布膜上，能夠使涂布膜充分溶脹，進行流平處理。

工序(b)中的水/醇類介質(zhì)溶液，只要能對工序(a)中所形成的涂布膜進行流平處理，可以為任意的水/醇類介質(zhì)溶液。水/醇類介質(zhì)溶液中所含有的醇類溶劑，優(yōu)選為低級醇。水/醇類介質(zhì)溶液可列舉例如，水和甲醇、水和乙醇、水和2‐丙醇、或組合這些混合液而成的混合溶劑。水和醇類溶劑的比例，只要能夠進行使通過工序(a)所得到的涂布膜的流平處理即可，但從蒸騰速度的關(guān)系出發(fā)，優(yōu)選水為10～50重量％、醇類溶劑為50～90重量％。

本發(fā)明的制備胚狀體形成用容器的方法，在經(jīng)過工序(a)以及工序(b)之后，還優(yōu)選包括對具有經(jīng)均質(zhì)化的涂布膜的容器內(nèi)面進行滅菌的工序(c)。作為滅菌方法，只要不損害本發(fā)明的目的，則可使用任何滅菌方法。例如，可列舉通過環(huán)氧乙烷氣體(eog)進行的滅菌處理、通過γ射線進行的滅菌處理、通過電子束進行的滅菌處理等，但通過eog進行的滅菌處理與其他滅菌處理相比較，在抑制細胞粘合的方面優(yōu)選。

本發(fā)明的胚狀體形成用容器的形狀，只要是可形成用于懸浮培養(yǎng)干細胞的區(qū)域的形狀即可。作為胚狀體形成用容器的形狀，可使用平底、漏斗狀的v底、半球狀的圓底等容器，但優(yōu)選為平底。作為本發(fā)明的胚狀體形成用容器，可列舉細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)用多盤(multidisc)、細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)培養(yǎng)袋、細胞培養(yǎng)燒瓶等現(xiàn)有的塑料制細胞培養(yǎng)容器。為了得到適度大小的胚狀體，優(yōu)選為細胞培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板。胚狀體形成用容器的材質(zhì)，可列舉聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、丙烯酸樹脂。

在使用本發(fā)明的、用于使干細胞懸浮培養(yǎng)以形成胚狀體的胚狀體形成用容器的、形成胚狀體的方法中，至少具備以下的工序(d)及(e)。

準備胚狀體形成用容器的工序(d)，所述胚狀體形成用容器通過以下工序形成：對用于形成用于懸浮培養(yǎng)干細胞的區(qū)域的容器內(nèi)面，使用混合有側(cè)鏈上具有以式(1)所表示的磷酸膽堿類似基團的化合物的醇類介質(zhì)溶液，以側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的量為0.1～10mg/cm²的方式進行涂布、干燥的工序(a)；以及對通過工序(a)而制作的該容器內(nèi)面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm²添加水/醇類介質(zhì)溶液，使涂布膜溶脹，進行干燥的工序(b)；

在工序(d)的胚狀體形成用容器內(nèi)對胚胎干細胞進行懸浮培養(yǎng)的工序(e)。

對于使用本發(fā)明的胚狀體形成用容器來對干細胞進行懸浮培養(yǎng)，可以使用公知的培養(yǎng)方法。例如，可通過將在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)的未分化狀態(tài)的干細胞，在所述胚狀體形成用容器內(nèi)按照公知的方法及條件等進行懸浮培養(yǎng)而進行。此時，胚狀體形成用容器內(nèi)的培養(yǎng)液可為靜置狀態(tài)，也可緩慢地進行振動。

作為構(gòu)成所述培養(yǎng)液的培養(yǎng)基，可為加有以往的懸滴法等中所使用的胎牛血清及各種成長因子的培養(yǎng)基。例如，可使用添加有20體積％胎牛血清和各種成長因子的iscove'smodifieddulbecco'smedium(imdm培養(yǎng)基)或添加有10體積％胎牛血清和各種成長因子的dulbecco'smodifiedeaglemedium(dmem培養(yǎng)基)等。

所述培養(yǎng)液中的干細胞的濃度，因準備的胚狀體形成用容器的大小及形態(tài)等而不同，但通常為1.0×10²～1.0×10⁶個細胞/ml。特別是，作為胚狀體形成用容器，使用96孔板時的所述干細胞的濃度為1.0×10³～1.0×10⁵個細胞/ml，能夠再現(xiàn)性良好地形成胚狀體，因此優(yōu)選。

實施例

以下，通過實施例及比較例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不限定于此。

首先，以下的合成例1～4中，示出作為側(cè)鏈上具有磷酸膽堿類似基團的化合物的共聚物(1)～(4)的合成例。

(合成例1)

將35.7gmpc及4.3g甲基丙烯酸正丁酯(bma)(mpc/bma＝80/20(摩爾比))溶解于160g乙醇中，放入四口燒瓶，在吹入30分鐘氮氣之后，在60℃下加入0.82g偶氮二異丁腈，使其進行8小時聚合反應(yīng)。一邊攪拌一邊將聚合液滴入3l的二乙醚中，過濾所析出的沉淀，在室溫下進行真空干燥48小時，得到29.6g粉末。通過以下所示條件的gpc而測定的重均分子量為153000。通過¹h-nmr進行組成分析，結(jié)果為mpc/bma＝80/20(摩爾比)。以此作為含磷酸膽堿類似基團的單體(m)的共聚物(1)。

<gpc的測定條件＞

(1)樣品：在0.5重量％的含有溴化鋰的氯仿/甲醇(6/4(體積比))混合溶劑中溶解樣品，配制0.5重量％的聚合物溶液。樣品溶液的使用量為20l。

(2)柱：通過plgel5μmmixed-c、兩根串聯(lián)(polymerlaboratoriesltd.制造)、柱溫度為40℃、tosohcorporation制造的積分器內(nèi)藏分子量計算程序(sc-8020用gpc程序)而配制。

(3)溶出溶劑：0.5重量％的含有溴化鋰的氯仿/甲醇(6/4(體積％))混合溶劑，流速為1.0ml/分鐘。

(4)檢測：示差折光儀。

(5)標準物質(zhì)：聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)(polymerlaboratoriesltd.制造)。

(合成例2)

將23.5gmpc及26.5g甲基丙烯酸正丁酯(bma)(mpc/bma＝30/70(摩爾比))溶解于75g乙醇中，放入四口燒瓶內(nèi)，在吹入30分鐘氮氣之后，在55℃下加入0.41g偶氮二異丁腈，使其進行24小時聚合反應(yīng)。一邊攪拌一邊將聚合液滴入3l的二乙醚中，過濾所析出的沉淀，在室溫下進行真空干燥48小時，得到32.0g粉末。以與合成例1相同的方式通過gpc而測定的重均分子量為353,000。通過¹h-nmr進行組成分析，結(jié)果為mpc/bma＝30/70(摩爾比)。將其作為共聚物(2)。

(合成例3)

將38.0gmpc及2.0g甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)(mpc/gma＝90/10(摩爾比))溶解于358g異丙醇中，放入四口燒瓶內(nèi)，在吹入30分鐘氮氣之后，在60℃下加入20重量％的過氧化新戊酸叔丁酯的甲苯溶液2.18g，使其進行5小時聚合反應(yīng)。一邊攪拌一邊將聚合液滴入3l的二乙醚中，過濾所析出的沉淀，在室溫下進行真空干燥4.8小時，得到28.4g粉末。通過¹h-nmr進行組成分析，其結(jié)果，mpc/gma為90/10(摩爾比)。以與合成例1相同的方式通過gpc而測定的重均分子量為53000。將其作為共聚物(3)。

(合成例4)

將25.9gmpc、16.6gbma及7.5g甲基丙烯酸(ma)(mpc/bma/ma＝30/40/30(摩爾比))溶解于75g正丙醇中，放入四口燒瓶內(nèi)，在吹入30分鐘氮氣之后，在50℃下加入20重量％的過氧化新戊酸叔丁酯的甲苯溶液2.18g，使其進行5小時聚合反應(yīng)。一邊攪拌一邊將聚合液滴入3l的二乙醚中，過濾所析出的沉淀，在室溫下進行真空干燥48小時，得到28.4g粉末。通過¹h-nmr進行組成分析，結(jié)果為mpc/bma/gma＝30/40/30(摩爾比)。以與合成例1相同的方式通過gpc而測定的重均分子量為108,000。將其作為共聚物(4)。

(實施例1)胚狀體形成用容器的制作

將0.5g合成例1中合成的共聚物(1)溶解于100ml乙醇中，配制共聚物溶液。在向組織培養(yǎng)用f底聚苯乙烯制96孔板(nunc社制造)的各孔(每孔的面積約為0.33cm²)中加入0.03ml所述共聚物溶液之后，在室溫下使其干燥一晚。接著，在加入水/乙醇混合溶劑(重量比：70/30)作為流平用的后處理液之后，在室溫干燥一晚。將所得到的f底聚苯乙烯制造的96孔板放入滅菌袋中之后，以滿足基于iso11135-1的滅菌基準的方式(sal<10^-6)對容器進行環(huán)氧乙烷氣體滅菌(eog滅菌)，制作胚狀體形成用容器。

(實施例2～6、比較例1～6)胚狀體形成用容器的制作

除將以下的條件變更為如表1以及表2所記載的內(nèi)容以外，以與實施例1相同的方式，制作胚狀體形成用容器。

首先，改變共聚物的種類，稱量0.5g，加入100ml乙醇，配制共聚物溶液。改變共聚物溶液的添加量，在注入組織培養(yǎng)用f底聚苯乙烯制96孔板的各孔之后，使其干燥。進一步改變流平用的后處理液的種類，在室溫下使其干燥一晚。此外，在不添加流平用的后處理液的狀態(tài)下進行胚狀體形成用容器的制作(比較例3)。此外，除了通過eog滅菌之外，通過γ射線滅菌、或電子束滅菌來實施滅菌。

將通過下述的鼠干細胞的懸濁液的配制法而配制的5×10³個細胞/ml的鼠干細胞的懸濁液，以各孔0.2ml依次接種于實施例1～6以及比較例1～6中制作的胚狀體形成用容器中。在37℃、5％co2的條件下進行5天培養(yǎng)之后，使用相差顯微鏡觀察胚狀體形成狀態(tài)。

結(jié)果示于表1以及表2。此外，關(guān)于使用實施例3的胚狀體形成用容器而培養(yǎng)的胚狀體的相差顯微鏡照片的副本示于圖1。此外，使用比較例3的胚狀體形成用容器而形成的胚狀體的相差顯微鏡照片的副本示于圖2。

此外，表1以及表2中的細胞粘合性的評價，對去除懸浮細胞后的殘留在孔中的細胞，通過使用了mtt試劑的甲臜(formazan)產(chǎn)生量而進行定量評價。細胞粘合率若小于5％則為合格，若在其以上則為不合格。

此外，對于表1以及表2中的胚狀體形成的評價，將形成分化充分大的胚狀體的情況記為a；將雖形成了胚狀體，但大小或形狀不充分的情況記為b；將未形成胚狀體的情況記為c。

如實施例1～6中所示可知，通過組合：控制共聚物的添加量的工序(a)和進行流平處理的工序(b)，形成了分化充分大的胚狀體，而在全部的孔中細胞均未粘合，進一步，實現(xiàn)了良好的顯微鏡下的觀察性。

[表1]

[表2]

<鼠干細胞的懸濁液的配制法＞

(1)飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)

使用sim鼠的成纖維細胞(以下簡記為sto細胞)作為飼養(yǎng)細胞。sto細胞使用添加有100units/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及10體積％滅活處理的胎牛血清(fcs)的dulbecco'smodifiedeagle'smedium(以下簡記為dmem培養(yǎng)基，gibco社制造)而進行培養(yǎng)。對培養(yǎng)后的sto細胞以10μg/ml的絲裂霉素c溶液(sigma社制造)進行3小時處理之后，設(shè)作細胞懸濁液。將sto細胞的懸濁液以每孔5×10⁵個細胞的方式接種于組織培養(yǎng)用6孔多盤中。在37℃、5％co2的條件下進行16小時以上培養(yǎng)，配制飼養(yǎng)細胞。

(2)鼠干細胞的培養(yǎng)

使用129sv鼠es細胞作為干細胞。干細胞的培養(yǎng)基為含有15％knockout(注冊商標)血清替代品(serumreplacement)(ksr：gibco社制造)、1mm丙酮酸鈉(gibco社制造)、0.1mmmem非必需氨基酸(non-essentialaminoacids)(gibco社制造)、0.1mm2-巰基乙醇(sigma社制造)、100units/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及1000units/ml的小鼠白血病抑制因子(murineleukemiainhibitoryfactor)(mlif：chemicon社制造)的dmem培養(yǎng)基(以下簡記為干培養(yǎng)基)。在所述(1)中配制的飼養(yǎng)細胞上以2×10⁵個細胞/孔接種干細胞。在37℃、5％co2的條件下進行3天的鼠干細胞的培養(yǎng)。

將在所述(2)中培養(yǎng)的鼠干細胞以0.1％胰蛋白酶-edta通過常規(guī)方法進行剝離后，懸浮于含有15％胎牛血清(gibco社制造)、0.1mm2-巰基乙醇(sigma社制造)、100units/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的imdm培養(yǎng)基(gibco社制造，不含mlif)中，配制5×10³個細胞/毫升的鼠干細胞的懸濁液。

工業(yè)實用性

本發(fā)明的胚狀體形成用容器的制備方法，與以往的胚狀體形成用容器相比，能夠提供一種具有均勻化的容器表面、胚狀體形成效率優(yōu)異且光學(xué)觀察性優(yōu)異的容器。