本發(fā)明涉及磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的表達被破壞的球蟲寄生蟲，涉及包含編碼磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的核苷酸序列的多核苷酸，涉及磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)，并且涉及磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)脂質(zhì)。具有如本文所述的被破壞的pts表達的球蟲寄生蟲，作為疫苗是有用的。磷脂酰蘇氨酸合酶及編碼其序列的核苷酸以及磷脂酰蘇氨酸磷脂能夠用于診斷方法和診斷試劑盒或用于疫苗和藥物開發(fā)應用。球蟲寄生蟲例如弓形蟲(toxoplasma)種、艾美耳球蟲(eimeria)種和新孢子蟲(neospora)種是單細胞病原體，其在全世界造成重大的社會經(jīng)濟負擔。弓形體(例如，剛地弓形蟲)是廣泛的寄生蟲，其感染人類以及幾乎所有其他恒溫生物體。寄生蟲對有食用和經(jīng)濟價值的家畜(例如，羊和豬)以及人類健康是重大威脅。寄生蟲在免疫抑制個體和新生兒中引起腦弓形體病和眼弓形體病。它也可以造成人類和動物的先天性疾病，導致自然流產(chǎn)和胎兒異常。類似地，艾美耳球蟲(例如，柔嫩艾美耳球蟲(eimeriatenella))和新孢子蟲(例如，犬新孢子蟲(neosporacaninum))分別是家禽業(yè)(引起例如雞腹瀉)和養(yǎng)牛業(yè)(引起例如母牛流產(chǎn))的主要關注點。類似于弓形蟲，新孢子蟲寄生蟲也在神經(jīng)系統(tǒng)中形成組織囊腫，其不能通過可用藥物治愈，因而在受感染的宿主的整個生命中持續(xù)存在。這些囊腫可以在免疫應答下降時，例如由hiv-aids感染導致的或器官移植期間的或僅僅由老年人群中的老齡化導致的，恢復活性而引起潛在的致命性急性感染。因此，顯然需要用于處理球蟲寄生蟲感染的預防方法，特別是尚不能治愈的囊腫(慢性)感染?？色@得一種商業(yè)抗弓形蟲的活疫苗(toxovax),其包括活的弱毒剛地弓形蟲s48菌株(buxton,d.(1993),toxoplasmosis:thefirstcommercialvaccine(弓形蟲病:第一種商業(yè)疫苗),parasitologytoday(personaled.),9(9),335–7(review)；vermar.andkhannap.(2013)developmentoftoxoplasmagondiivaccine:aglobalchallenge(剛地弓形蟲疫苗的發(fā)展：全球挑戰(zhàn)),humvaccinimmunother.,2013feb；9(2):291-3(review))。這種疫苗用于獸醫(yī)用途。然而，它具有若干缺點：昂貴，引起副作用，具有短的儲存期，并且基因無特征(geneticallyuncharacterized)。此外，因為它易感而回復其致病毒性，因而不適合人類使用。發(fā)明人已經(jīng)確定了一種在球蟲寄生蟲中表達的新型酶(磷脂酰蘇氨酸合酶，pts)，該球蟲寄生蟲在所有哺乳動物宿主中都不存在，并且產(chǎn)生一種被稱為磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)的獨有膜脂質(zhì)。值得注意的是，ptdthr先前被報道為在某些哺乳動物細胞和選定的原核生物中罕見的且特別小的ptdser類似物(j.mitoma,t.kasama,s.furuya,y.hirabayashi,occurrenceofanunusualphospholipid,phosphatidyl-l-threonine,inculturedhippocampalneurons.exogenousl-serineisrequiredforthesynthesisofneuronalphosphatidyl-l-serineandsphingolipids.(培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)不常見的磷脂——磷脂酰-l-蘇氨酸。外源l-絲氨酸是合成磷脂酰-l-絲氨酸和鞘脂所需要的),thejournalofbiologicalchemistry273,19363–19366(1998)；p.t.ivanova,s.b.milne,h.a.brown,identificationofatypicalether-linkedglycerophospholipidspeciesinmacrophagesbymassspectrometry.(通過質(zhì)譜分析法鑒定巨噬細胞中的非典型的醚鏈連接的甘油磷脂),journaloflipidresearch51,1581–1590(2010)；f.d.müller,s.beck,e.strauch,m.w.linscheid,bacterialpredatorspossessuniquemembranelipidstructures.(細菌捕食者擁有獨特的膜脂質(zhì)結(jié)構),lipids46,1129–40(2011)；l.heikinheimo,p.somerharju,translocationofphosphatidylthreonineand-serinetomitochondriadiminishesexponentiallywithincreasingmolecularhydrophobicity.(磷脂酰蘇氨酸和磷脂酰絲氨酸向線粒體的轉(zhuǎn)運隨著分子疏水性的增加而指數(shù)地減少),traffic3,367–77(2002))，偶爾對細胞生理學有相當有害的影響(j.mitoma,t.kasama,s.furuya,y.hirabayashi,occurrenceofanunusualphospholipid,phosphatidyl-l-threonine,inculturedhippocampalneurons.exogenousl-serineisrequiredforthesynthesisofneuronalphosphatidyl-l-serineandsphingolipids.,thejournalofbiologicalchemistry273,19363–19366(1998))。結(jié)果表明，哺乳動物細胞中的堿性交換型磷脂酰絲氨酸合酶(pss)通常使用絲氨酸作為其主要底物，在絲氨酸缺失的條件下也可產(chǎn)生ptdthr作為副產(chǎn)物。在正常條件下，真核細胞不產(chǎn)生任何可檢測量的ptdthr。相反，發(fā)明人揭露了ptdthr在廣泛的真核病原體例如t.gondii(剛地弓形蟲)和e.tenella(柔嫩艾美耳球蟲)中出人意料地豐富和自然產(chǎn)生。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)pts的破壞消除了ptdthr的從頭合成，并且損害了球蟲寄生蟲例如t.gondii的無性繁殖生命周期。特別地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種修飾的寄生蟲是無毒的，并且給予針對寄生蟲引起的疾病的保護，例如小鼠的急性和慢性弓形蟲病。在哺乳動物細胞中不產(chǎn)生pts和ptdthr意味著pts被破壞的寄生蟲不能從宿主細胞獲得足夠的ptdthr來補償它們的ptdthr缺乏。這使得具有被破壞的pts表達的球蟲寄生蟲無毒并且作為疫苗有用，特別是對于經(jīng)常被t.gondii感染的農(nóng)場動物和食用動物有用。因此，本發(fā)明涉及一種選自弓形蟲種、新孢子蟲種和艾美耳球蟲種的球蟲寄生蟲，其中磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的表達被破壞從而減少或消除磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)的合成。合適的球蟲寄生蟲包括弓形蟲種、新孢子蟲種和艾美耳球蟲種。可能特別地提及剛地弓形蟲(也稱為t.gondii或tg)、犬新孢子蟲(也稱為n.canium或nc)和柔嫩艾美耳球蟲(也稱為e.tenella或et)。剛地弓形蟲可能具有特別的興趣(interest)。pts是在球蟲寄生蟲中表達的酶，其產(chǎn)生磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)。這種酶不同于密切相關的且更普遍存在的磷脂酰絲氨酸合酶(pss)，pss也存在于球蟲寄生蟲中。pss產(chǎn)生磷脂酰絲氨酸(ptdser)而不是磷脂酰蘇氨酸(pdtthr)。pts和pss共享序列ecwwd的相同催化位點，但在催化結(jié)構域中的許多其他殘基(residues)存在不同(圖1)。值得注意的事實是，不同的天冬酰胺、組氨酸和半胱氨酸殘基在所有pss直系同源物中是嚴格保守(conserved)的，包括在tgpss中，但不在tgpts中，tgpts在等效位置含有對谷氨酸、色氨酸和絲氨酸的取代(圖1)。編碼pts的基因序列，也稱為pts基因，被提供在剛地弓形蟲的seqidno.1中、犬新孢子蟲的seqidno.3和柔嫩艾美耳球蟲的seqidno.5中。相應的編碼的氨基酸序列被提供在剛地弓形蟲的seqidno.2中、犬新孢子蟲的seqidno.4中以及柔嫩艾美耳球蟲的seqidno.6中。ptdthr是甘油磷脂，其特征是通過蘇氨酸的oh基使蘇氨酸結(jié)合于磷脂?；?。通常，pts可以產(chǎn)生磷脂酰蘇氨酸脂質(zhì)類的混合物，其結(jié)構可以在連接到甘油的?；男再|(zhì)上有所差異。本文所描述的磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)的結(jié)構可以如式(i)所示：其中r1和r2獨立地選自具有8至46個碳原子的飽和?；?或具有8至46個碳原子的不飽和?；?，特別地是具有10至36個碳原子的飽和和/或不飽和酰基，更特別地是具有14至26個碳原子的飽和和/或不飽和?；?，甚至特別地是具有16至24個碳原子的飽和和/或不飽和酰基。不飽和的酰基可以具有至少一個碳碳雙鍵，特別是1-8個碳碳雙鍵，更特別是1-6個碳碳雙鍵，甚至更特別是1-4個碳碳雙鍵。在數(shù)個實施方案中，r1和r2可以獨立地選自具有1至4個碳碳雙鍵的且具有16至24個碳原子的不飽和酰基。在特別的實施例中，r1和r2可以獨立地選自c20:1?；蚦20:4?；貏e地，r1可以是式ch3-(ch2)7-(ch＝ch)-(ch2)9-co-的酰基，并且r2可以是式ch3-(ch2)4-(ch＝ch-ch2)4-(ch2)2-co-的?；Ｔ诒疚乃枋龅那蛳x寄生蟲中，磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的表達被破壞。如上所述，pts表達的破壞已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以減少或消除磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)的合成。pts的表達可以例如通過使用于編碼pts酶的基因失活或刪除該用于編碼pts酶的基因來被破壞。例如，如本文中所描述的球蟲寄生蟲可以進行基因修飾。因此，在幾個方面中，本發(fā)明指向一種用于制備基因修飾的球蟲寄生蟲的方法，其包括通過使pts編碼基因失活或刪除pts編碼基因來破壞磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)在選自弓形蟲種、新孢子蟲種和艾美耳球蟲種的球蟲寄生蟲中的表達。在本發(fā)明的上下文中，基因的失活或刪除可以是基因的修飾，該基因是編碼需要的多肽(即pts)的基因和/或編碼涉及通過寄生蟲生產(chǎn)的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的多肽的基因。原理上，減小或消除所編碼的蛋白質(zhì)的活性能夠通過編碼pts的基因的定向滅活來完成。該基因能夠整個被移除。然而，作為可替換方案，該基因的部分的刪除也能夠?qū)е滤幋a的蛋白質(zhì)的活性的降低或消除。例如，用于編碼pts的催化位點的核苷酸可以被移除或例如被不同的核苷酸序列替代，該不同的核苷酸序列缺失編碼該pts的催化位點的核苷酸。所得的基因修飾的寄生蟲將使pts的表達被除去。因此，ptdthr的產(chǎn)生可以被減少或消除。pts的催化位點是高度保守的并且包含氨基酸序列ecwwd。特別地，該催化序列被發(fā)現(xiàn)在t.gondii的pts的氨基酸序列的位置342-346上、在e.tenella的pts的氨基酸序列的位置264-268上和n.caninum的pts的氨基酸序列的位置356-360上。側(cè)面相接編碼pts的催化位點的核苷酸序列的區(qū)域可以通過標準dna測序來進行鑒定?？商鎿Q地，或另外地，負責調(diào)節(jié)或表達pts的表達基因的核苷酸序列，例如啟動子、增強子和翻譯起始位點可以被修飾或去除。影響pts活性的另一種方式可以是需要時修飾轉(zhuǎn)運信號，或引入反義rna。染色體修飾是優(yōu)選的，因為染色體修飾將確保基因的功能在后代細胞上的穩(wěn)定分布。染色體中所需功能的缺失或破壞(例如編碼pts的序列或編碼pts的催化位點的序列的缺失或破壞)可以用非同源以及同源重組來進行。同源重組是優(yōu)選的，因為它開放了引入、去除或同時引入和去除所選功能的機會。特別地，表達pts的基因可以通過雙重同源重組被破壞。當打算進行同源重組時，轉(zhuǎn)染的dna構建體包含與待工程化的特定寄生蟲的基因組靶序列同源的dna序列。技術人員理解，不需要100％的一致性來獲得同源重組。80％的一致性百分比，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％、98％或99％的一致性百分比也足夠。通常地，通過同源重組被插入至染色體中的感興趣的dna序列通過具有足夠長度以能夠進行同源重組的同源序列來側(cè)接。這樣的長度在t.gondii中可以是至少約300bp，例如在300bp和3000bp之間，這取決于使用的寄生蟲菌株。對于本發(fā)明的目的，兩個氨基酸序列之間的一致性程度是指兩個序列之間相同的氨基酸的百分比。一致性程度使用altschul等人描述的blast算法來確定(journalofmolecularbiology,vol.215,pp.403-4101990)。用于執(zhí)行blast分析的軟件可通過國家生物技術信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。blastp算法參數(shù)的默認設置：期望閾值(expectthreshold)為10，字段長度(wordsize)為3，查詢范圍中的最大匹配(maxmatch)為0，矩陣(matrix)為blosum62，存在空位罰分(gapcostsexistence)為11且延伸空位罰分(gapcostsextension)為1，組成調(diào)整(compositionaladjustments)在條件組成計分矩陣調(diào)整(conditionalcompositionalscorematrixadjustment)。對于本發(fā)明的目的，兩個核苷酸序列之間的一致性程度是指兩個序列之間相同的核苷酸的百分比。一致性程度使用altschul等人描述的blast算法來確定(journalofmolecularbiology,vol.215,pp.403-4101990)。用于執(zhí)行blast分析的軟件可通過國家生物技術信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。blastn算法參數(shù)的默認設置：期望閾值為10，字段長度為28，查詢范圍中的最大匹配為0，匹配/失配計分為1和-2，空位罰分為線性。為了通過基因工程來修飾感興趣的基因，鑒別t.gondii、n.caninum和e.tenella中的pts基因的序列不需要100％相同。特別地，pts的表達可以通過滅活或刪除編碼seqidno.2(tgpts)、seqidno.4(ncpts)或seqidno.6(etpts)的氨基酸序列的或編碼(例如，來自其他的艾美耳種或新孢子蟲種的)顯示至少30％的一致性程度的同源氨基酸序列的核苷酸序列，特別地該同源氨基酸序列顯示至少50％的一致性，更特別地顯示至少75％的一致性，進一步特別地顯示至少90％的一致性，更進一步特別地顯示至少95％的一致性，還顯示至少99％的一致性。此外，來自其他種的有關寄生蟲中的序列或特殊的寄生蟲菌株中的序列可以偏離這些序列。然而，本領域技術人員能夠鑒別利用pts表達基因和具有相同功能的與這些基因同源的序列。相應的質(zhì)粒構建體可以被制備來用于在這些菌株中執(zhí)行同源重組。因此，即使與上述鑒別的基因的序列的偏差存在于一些菌株中，同源蛋白質(zhì)也可以使用標準計算和wet-lab方法來鑒別。例如，給定蛋白質(zhì)的pts活性可以如下所述進行確定。根據(jù)本發(fā)明的寄生蟲可以使用本領域已知的技術來制備。特別地，通過電穿孔(例如使用轉(zhuǎn)染儀)將dna引入寄生蟲中可以實現(xiàn)球蟲寄生蟲的轉(zhuǎn)化。電穿孔涉及例如穿過含有球蟲寄生蟲(例如弓形蟲種、新孢子蟲種或艾美耳球蟲種)以及包含考慮到針對該寄生蟲所需要的功能和/或同源dna序列的合適的質(zhì)粒dna的懸浮液進行高壓放電。如本文所描述的球蟲寄生蟲中的pts活性的破壞可通過與未被破壞的寄生蟲(也稱為野生型或親代菌株)相比時，鑒別被破壞的寄生蟲中ptdthr產(chǎn)生的減少或消除來測試。特別地，可以使用脂質(zhì)分析。例如，被破壞的菌株和野生型親代菌株可以在合適的宿主(例如在人包皮成纖維(hff)細胞中)生長。寄生蟲然后能夠(例如使用注射器或通過寄生蟲的天然宿主細胞裂解)從宿主中被釋放并且脂質(zhì)可以依照bligh-dyer從寄生蟲中進行提取(bligh,e.g.&dyer,w.j.“arapidmethodoftotallipidextractionandpurification”(總脂快速提取和純化的方法),canadianjournalofbiochemistryandphysiologyvol.37,pp.911–917,1959)。所提取的脂質(zhì)組分能夠例如通過高效液相色譜法(hplc)進行分離，并且每種脂質(zhì)組分能夠例如使用與質(zhì)樸儀結(jié)合的hplc(hplc-ms)進行分析和表征，從而鑒別ptdthr的存在或缺失。此外，ptdthr和其他脂質(zhì)的量可以通過例如執(zhí)行二維薄層色譜法(2d-tlc)和如rouser等人描述的2d-tlc上的斑點的磷分析來進行定量(twodimensionalthinlayerchromatographicseparationofpolarlipidsanddeterminationofphospholipidsbyphosphorusanalysisofspots(二維薄層色譜分離極性脂質(zhì)和通過磷分析測定磷脂),lipids,vol.5,pp.494–496,1970)。通常地，當與未被破壞的寄生蟲所產(chǎn)生的ptdthr的量(通過2d-tlc的磷定量測得)相比，本文所描述的被破壞的球蟲寄生蟲中所產(chǎn)生的ptdthr的總量的減少可以高達50wt.％，特別是高達25wt.％，更特別是高達15wt.％，進一步特別是高達5wt.％，更進一步特別是高達1wt.％或還高達0.1wt.％。在數(shù)個實施例中，如本文中所描述的被破壞的球蟲寄生蟲不產(chǎn)生ptdthr，或所產(chǎn)生的ptdthr的量通過hplc或2d-tlc磷分析不能測得。如本文所描述的pts被破壞的球蟲寄生蟲適合用作疫苗。他們可以通過(例如腹腔內(nèi)注射)給予動物或人以球蟲寄生蟲來用于給動物或人接種疫苗。如本文所描述的寄生蟲可以優(yōu)選地用于給選自羊、豬、家禽和牛的動物接種疫苗。t.gondii可以特別地是羊和豬疫苗接種所選的寄生蟲，e.tenella可以特別是家禽疫苗接種所選的寄生蟲，n.caninum可以特別是牛接種疫苗所選的寄生蟲。需要注意的事實是，沒有可用的化學療法和人類疫苗來治療慢性弓形蟲病。因此，通過給農(nóng)場和食用動物接種疫苗來防止動物傳染病的傳播可能是減少和/或根除人類種群中的弓形蟲病負擔的最佳方式。在數(shù)個方面中，本發(fā)明還涉及一種包含編碼磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的核苷酸序列的多核苷酸。編碼pts的多核苷酸可以來源于，例如選自弓形蟲種、新孢子蟲種和艾美耳球蟲種的球蟲寄生蟲，或選自剛地弓形蟲、犬新孢子蟲和柔嫩艾美耳球蟲的球蟲寄生蟲。球蟲寄生蟲可優(yōu)選是剛地弓形蟲。例如，球蟲寄生蟲可以在合適的培養(yǎng)基中生長來分離編碼pts的多核苷酸，該多核苷酸可以通過本領域已知的方法在適合的用于異源表達的載體中進行克隆。適合的載體包括，例如用于在大腸桿菌(escherichiacoli,e.coli)中表達的pqe60或在釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中表達的pesc-ura，能夠用于隨后的pts表達。作為示例的模式，可以使用在e.coli中用于過表達(overexpressing)tgpts的pqe60載體。本文所描述的多核苷酸還可以通過本領域已知的方法合成產(chǎn)生。在數(shù)個實施例中，本文所描述的多核苷酸可以包含編碼具有用于tgpts的seqidno.2氨基酸序列、用于ncpts的seqidno.4氨基酸序列或用于etpts的seqidno.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或同源物(homologues)，該同源物編碼顯示與所指示的序列有至少30％的一致性的氨基酸序列，特別地與所指示的序列有至少50％的一致性，進一步特別地有至少75％的一致性，更進一步特別地有至少90％的一致性，甚至特別地有至少95％的一致性，還甚至有至少99％的一致性。這種同源序列可以包括由于天然或菌株內(nèi)變異而可能存在于來自不同群體的或在群體內(nèi)的細胞中的多態(tài)性。同源物還可以來源于除了指定的dna或氨基酸序列起源的物種之外的物種，或者可以是人工設計和合成的。指定為seqidno.2、seqidno.4和seqidno.6的pts蛋白質(zhì)分別由剛地弓形蟲(seqidno.1)、犬新孢子蟲(seqidno.3)和柔嫩艾美耳球蟲(seqidno.5)的pts多核苷酸來編碼。通過例如t.gondiipts基因或同源序列編碼的蛋白質(zhì)的pts活性，可以通過基因在合適的宿主中(例如在大腸桿菌或酵母或哺乳動物細胞中)的過表達和隨后通過例如有機體的脂質(zhì)組分的分離及其分析以通過例如薄層色譜法(tlc)或高效液相色譜法(hplc)和質(zhì)譜法鑒定ptdthr的存在來進行證明，或使用本領域已知的其它方法來進行證明。例如，pts的過表達能夠通過在pqe60載體中被克隆然后通過e.coli的轉(zhuǎn)化來完成。包含編碼磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)的核苷酸序列的多核苷酸可以在診斷方法和診斷試劑盒的開發(fā)中或在疫苗和藥物的開發(fā)中有用。例如，如本文所描述的多核苷酸序列可以用于表達pts，pts反過來可以用于產(chǎn)生ptdthr。例如，在來自感染的患者或動物的樣本中檢測ptdthr可以用于診斷寄生蟲感染。此外，pts和ptdthr的可得性可以例如通過酶底物蘇氨酸的修飾或具有抑制性能的產(chǎn)物ptdthr的修飾以及在改性化學品存在下評估pts活性來幫助靶向藥物的開發(fā)。因此，在數(shù)個方面，本發(fā)明還涉及一種由上述核苷酸序列編碼的磷脂酰蘇氨酸合酶(pts)，以及一種如上所述的磷脂酰蘇氨酸(ptdthr)脂質(zhì)。本發(fā)明通過以下示例進一步進行說明，但不限于此。示例1——ptdthr的鑒定和表征ptdthr通過在t.gondii寄生蟲中產(chǎn)生的作為主要脂質(zhì)峰的脂質(zhì)的hplc分離來進行鑒定。ptdthr的酰基鏈組成通過使用如下面詳細描述的質(zhì)譜法對hplc獲得的組分的脂質(zhì)(lipidomic)分析來進行確定。結(jié)果示于圖2中。ptdthr的結(jié)構如圖2(c)中所示。以類似的方式，ptdthr使用層析法和質(zhì)譜法在e.tenella中進行鑒定(圖8(a)和圖(b)，其中ptdthr在圖8(a)中稱為pt)。寄生蟲和宿主細胞培養(yǎng)t.gondii的δku80(i型)菌株由vernb.carruthers(密歇根大學，usa)(huynhmh,carruthersvb,aggingofendogenousgenesinatoxoplasmagondiistrainlackingku80(在缺乏ku80的剛地弓形蟲菌株中標記內(nèi)源基因),eukaryotcell.2009apr；8(4):530-9)提供。t.gondii的δku80菌株的速殖子在潮濕培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中使用含有胎牛血清(10％)、谷氨酰胺(2mm)、極限必需培養(yǎng)基(mem)非必需氨基酸(100μm，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、絲氨酸)、丙酮酸鈉(1mm)、青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeaglemedium,dmem)在人包皮成纖維細胞(hff)(獲自atcc，美國標準菌庫(americantypeculturecollection))中進行繁殖。寄生蟲以每2-3天感染復數(shù)(moi)為3進行常規(guī)培養(yǎng)，除非另有說明。hff通過胰蛋白酶消化來獲得，并且根據(jù)實驗要求在新燒瓶、盤或板中生長至匯合以進行感染試驗。脂質(zhì)提取寄生蟲從感染的hff(moi為3；感染42-48小時)中通過注射器釋放出來并且兩次穿過23g針和27g針。宿主碎片通過5μm過濾器(merckmillipore,德國)過濾寄生蟲懸浮液來去除。細胞沉淀(cellpellets)被再懸浮在0.4ml的pbs中并且脂質(zhì)根據(jù)bligh-dyer(bligh,e.g.&dyer,w.j.“arapidmethodoftotallipidextractionandpurification”,canadianjournalofbiochemistryandphysiologyvol.37,pp.911-917,1959)來提取。簡單地說，將0.5ml氯仿和1ml甲醇加入到樣品中，渦旋，靜置30分鐘，然后離心(2000g，5分鐘)。將上清液轉(zhuǎn)移到玻璃管中，然后加入氯仿和0.9％kcl(各1ml)。樣品進行混合，離心，并且將下層的含有脂質(zhì)的氯仿相轉(zhuǎn)移到錐形玻璃管中。樣品在-20℃下儲存在用氮氣吹掃的氣密玻璃管中，直到進一步使用。脂質(zhì)組學分析總脂(totallipid)在氯仿平衡的二氧化硅60柱上進行分離。中性脂通過丙酮柱洗滌進行洗脫。磷脂通過1個柱體積(column-volume)的氯仿/甲醇/水(1:9:1)洗滌5次(5x)進行純化。各種脂質(zhì)組分被收集，在30℃下氮氣流下進行干燥，并且-20℃下存儲用于下游試驗。脂質(zhì)組學使用自動hplc電噴霧或大氣壓力離子化串聯(lián)質(zhì)譜來執(zhí)行。內(nèi)部標準ptdcho(44:2)與所提取的脂質(zhì)被混合以校正主要脂質(zhì)的回收率。磷脂提取物在氯仿和甲醇(1:1)中的10-20μl等分試樣以1ml/min的流速引入hilic柱(kinetex,2.6μm)來分離磷脂類。ms數(shù)據(jù)使用4000qtrap(absciex,concord)質(zhì)譜儀或ltq-xl(thermoscientific,hampton)質(zhì)譜儀進行收集。數(shù)據(jù)使用各儀器制造商的專有軟件進行處理。t.gondii速殖子的主要脂質(zhì)組學結(jié)果如圖2中所示。圖2(a)示出了從細胞外寄生蟲(107)中分離的磷脂的具有保留時間和相對豐度的hplc洗脫曲線。在3.5-3.8分鐘之間洗脫的x1代表被鑒定為ptdthr的脂質(zhì)。圖2(b)示出了x1組分的ms分析，其展現(xiàn)了ptdthr、ptdser和磷酸乙醇胺-神經(jīng)酰胺(petn-cer)種類。單項磷脂通過其在負離子化模式中的裂解規(guī)律和m/z比率來進行鑒定。圖2(c)示出了來自圖2(b)的x1衍生(x1-derived)峰(m/z850)的ms/ms譜。請注意，101da(850.5-749.5躍遷)的中性丟失對應于極性頭基團蘇氨酸的丟失。酰基鏈通過其質(zhì)量來鑒定。sn-1位的酰基鏈被鑒定為?；?0:1，而sn-2位的?；昏b定為酰基20:4。sn-1和sn-2指的是給定的磷脂中甘油主鏈的第一個碳和第二個碳。第三個碳含有極性頭基團，例如ptdthr中的蘇氨酸。示例2——pts的鑒定和表征ptdthr的基因來源通過在寄生蟲數(shù)據(jù)庫弓形蟲基因組學資源數(shù)據(jù)庫(toxodb)中基于蘇氨酸與絲氨酸的結(jié)構相似性搜索相關酶的表達來確定。兩個推定的ptdser合酶被發(fā)現(xiàn)，并且其完全開放閱讀框(readingframes)隨后被克隆(toxodb參考編號為tggt1_273540和tggt1_261480)。它們被發(fā)現(xiàn)分別編碼614個氨基酸殘基和540個氨基酸殘基。通過與哺乳動物酶的序列比對，它們被暫時鑒定為堿基交換型ptdser合酶(pss)的相近同源物。比對的結(jié)果呈現(xiàn)于圖1中?；诒疚乃龅挠嬎銠C分析(insilicoanalyses)和wet-lab結(jié)果，兩種合酶被命名為tgpss(剛地弓形蟲磷脂酰絲氨酸合酶)和tgpts(剛地弓形蟲磷脂酰蘇氨酸合酶)。與整個門上出現(xiàn)的pss不同，pts的同源物可以僅在選擇的寄生的(新孢子蟲、艾美爾球蟲、疫霉(phytophtora))和獨立生存的(帕金蟲(perkinsus))囊泡藻界(chromalveolates)生物體中發(fā)現(xiàn)。值得注意的事實是，不同的天冬酰胺、組氨酸和半胱氨酸殘基在所有pss直系同源物包括在tgpss中，但不在tgpts中，是嚴格保守的，tgpts在等效位置含有對谷氨酸、色氨酸和絲氨酸的取代(圖1)。t.gondiipts的分子克隆寄生蟲如示例1中所描述的從感染的hff細胞中通過注射器釋放。寄生蟲rna使用基于試劑盒的方法(invitrogen)進行分離并且隨后被反轉(zhuǎn)錄至第一鏈cdna中。使用pfuultraiifusion聚合酶(agilenttechnologies)對tgpss和tgpts的開放閱讀框從第一鏈cdna進行擴增。用于該開放閱讀框的擴增的引物列于表1中(seqidnos.7-10)。開放閱讀框遵循允許dna序列擴增的制造商協(xié)議被克隆成商用pdrive載體(qiagen,德國)。表1—用于tgpss和tgpts開放閱讀框的注釋pcr引物seqidnumber引物名稱核苷酸序列7tgpts-orf-f5’-atgcaactcccttcaaga-3’8tgpts-orf-r5’-tcactgacttcgttccattttcacg-3’9tgpss-orf-f5’-atgtgtcggggaccgccgct-3’10tgpss-orf-r5’-tcactcgtctttttggccttc-3’示例3—t.gondii中pts的基因切除t.gondii的pts基因(tgpts)通過雙同源交換被破壞。敲除(knockout)質(zhì)粒被構建，其包含如圖3(a)中所示的側(cè)接次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hxgprt)標記物的tgpts的5’交叉序列(crossoversequence,cos)和3’交叉序列。hxgprt標記物被用于允許霉酚酸(mpa)和黃嘌呤(xa)的轉(zhuǎn)基因選擇(donald,etal.“insertionaltagging,cloning,andexpressionofthetoxoplasmagondiihypoxanthine-xanthine-guaninephosphoribosyltransferasegene.useasaselectablemarkerforstabletransformation”(剛地弓形蟲次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達、插入標記和克隆。用作穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的選擇性標記),thejournalofbiologicalchemistry,vol.271,pp.14010-14019,1996)。敲除載體構建體tgpts的5’交叉序列和3’交叉序列(5’cos,3’cos)使用從新鮮的細胞外速殖子分離的基因組dna和使用表2的引物(seqidnos.11-14)來進行擴增。5’cos(0.9kb)和3’cos(0.8kb)分別在ptko-hxgprt載體的no-ti/ecori位點和hpai/hpai位點處進行克隆。所得的敲除載體包含側(cè)接次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hxgprt)選擇標記物的tgpts基因的5'’cos和3’cos(ptko-5’cos-hxgprt-3’cos)。表2—用于所得tgpts敲除載體中的tgpts-5’cos和tgpts-3’cos的克隆的pcr引物t.gondii的基因修飾敲除質(zhì)粒構建(也稱為敲除載體)使用btx儀(btxharvardapparatus,usa)采用以下條件被轉(zhuǎn)染到懸浮在cytomix(120mmkcl,0.15mmcacl2,10mmk2hpo4/kh2po4ph7.6,25mmhepesph7.6,2mmegta,56mmmgcl2)中的新鮮速殖子(δku80)中：50μgdna，約107個寄生蟲，2kv，50ω，25μf和250μs。該敲除載體(ptko-5'cos-hxgprt-3’cos)允許tgpts基因的破壞以通過霉酚酸(25μg/ml)和黃嘌呤(50μg/ml)選擇來生成δtgpts突變體。單(克隆)耐藥突變體寄生蟲通過有限稀釋方法來進行分離。所分離的pts基因被破壞的寄生蟲(即，缺失保守催化(ecwwd)位點的寄生蟲，也稱為δtgpts突變體或δtgpts菌株)，使用篩選引物5’scr-f/r和3’scr-f/r(表3,seqidnos.15-18)、pdrive載體(qiagen,德國)，通過pcr在tgpts基因位點(genelocus)處進行5’和3’交叉方式篩選用于標準克隆和dna測序。表3—用于δtgpts突變體的5'和3'重組篩選的pcr引物seqidnumber引物名稱核苷酸序列15tgpts-ko-5'scr-f5’-cgattccttgagagcaactg-3’16tgpts-ko-5'scr-r5’-gacgcagatgtgcgtgtatc-3’17tgpts-ko-3'scr-f5’-actgccgtgtggtaaaatgaa-3’18tgpts-ko-3'scr-r5’-gccatagagttcattgcggactc-3’該篩選的結(jié)果呈現(xiàn)在圖3(b)中，其示出了通過5'和3'篩選顯示3-kb和2.4-kb處的長dna帶的特異性擴增的代表性的克隆的δtgpts菌株的pcr圖。親代gdna和敲除質(zhì)粒分別被包含在陰性對照中。δtgpts突變體寄生蟲通過使用表1(seqidnos.7-10)的引物tgpts-orf-f和tgpts-orf-r的prf特異性pcr在tgpts位點成功插入選擇標記物(hxgprt)被證實。該結(jié)果呈現(xiàn)在圖3(c)中，其示出了所產(chǎn)生的確認選擇標記物在pts基因中的成功插入的ofr特異性pcr。與親代cdna中1.8-kb處的擴增以及質(zhì)粒dna中沒有條帶相反，δtgptscdna示出了預期的4.2-kb處的擴增，這證實了選擇標記物的靶向插入以及預測的催化位點(342ecwwd346)的刪除。所有pcr擴增子的鑒定通過測序來確認，其通過采用標準dna測序方法的基因組學公司lgc有限(德國)來完成。示例4—t.gondii中pts切除對ptdthr產(chǎn)生的影響δtgpts和親代菌株的磷脂組成通過薄層色譜法(tlc)、脂質(zhì)磷測定和脂質(zhì)組學分析來研究。總脂如上示例1所說明的從寄生蟲中分離。薄層色譜法和磷定量脂質(zhì)使用氯仿/甲醇/氫氧化銨(65:35:5)和氯仿/乙酸/甲醇/水(75:25:5:2.2)作為溶劑在二氧化硅60板(merck,德國)上通過二維tlc來分辨。它們通過用碘蒸氣和/或茚三酮噴霧染色而可視化，并且基于它們與真實標準(avantilipids)的共遷移來鑒定。主要的碘染色的磷脂帶從tlc板上被刮下，并且通過如他處描述的磷測定進行定量(rouseretal.,“twodimensionalthinlayerchromatographicseparationofpolarlipidsanddeterminationofphospholipidsbyphosphorusanalysisofspots”(二維薄層色譜分離極性脂質(zhì)并通過斑點磷分析測定磷脂),lipids,vol.5,pp.494–496,1970)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖4中。圖4(a)示出了通過二維tlc指示的菌株的脂質(zhì)分布?？傊?0.8-1×108個寄生蟲)通過碘蒸氣染色來分辨和檢測。注意到，pdtthr帶不存在于δtgpts突變體中并且還可以觀察到ptdser產(chǎn)生的增加。圖4(b)示出了來自圖4(a)的示出δtgpts突變體中pdtthr的缺乏和ptdser的誘導(induction)的tlc板的條帶的脂質(zhì)磷測量。該結(jié)果的重復性在四個獨立生物實驗(n＝4)被確認。如預期的，親代寄生蟲含有顯著量的ptdthr(圖4a和圖4b)。ptdthr的合成在δtgpts菌株中被完全阻斷。同時地，觀察到ptdser的三倍增加，而其他脂質(zhì)基本上保持不受影響(圖4b)。具有功能性tgpts的突變體的遺傳互補重新獲得ptdthr，并將ptdser含量反轉(zhuǎn)至正常水平。脂質(zhì)組學分析脂質(zhì)組學分析使用如上示例1所描述的hplc/ms。結(jié)果呈現(xiàn)于圖5中。脂質(zhì)組學結(jié)果確認了突變體中不存在所有ptdthr衍生物。特別地，圖5(a)示出了來自親代和δtgpts菌株(各～107個寄生蟲)的hplc分辨的脂質(zhì)(保留時間，3.5-3.8min)的代表性ms圖譜，其證實了親代寄生蟲中主要的ptdthr變種(m/z850.5,40:5)和兩個次要的(m/z824.5,38:4；m/z878.5,42:5)ptdthr變種，其完全不存在于突變體中。注意到，ptdser峰在δtgpts樣品中更強，這與通過tlc和化學磷測定的脂質(zhì)分析(圖4)一致?？傊?，這些結(jié)果顯示了ptdthr通過tgpts酶的自主合成，以及在其功能性切除后t.gondii中ptdthr脂質(zhì)的丟失。示例5—t.gondii中pts切除對t.gondii的滑行運動(glidingmotility)和毒力的影響滑行運動測定寄生蟲(如上所述的從感染hff中通過注射器釋放)在37℃下在bsa(0.01％)涂覆的蓋玻片上在漢克平衡鹽溶液(hanksbalancedsaltsolution,hbss)中溫育15分鐘。樣品固定在4％多聚甲醛和0.05％戊二醛中(10分鐘)，并且用抗6tgsag1初級抗體(捐贈自jean-franoisdubremetz，蒙彼利埃大學，法國)和alexa488偶聯(lián)的二級抗體(lifetechnologies，德國)染色。運動部分和軌跡長度使用imagej軟件(國家衛(wèi)生研究院(nationalinstituteofhealth)，usa)來定量。結(jié)果示于圖6(圖6a和6b)。圖6(a)示出不同菌株在bsa涂覆的玻璃蓋玻片上的運動部分。總計，來自6個獨立測定的500-1000個寄生蟲對存在或不存在運動軌跡(用抗tgsag1抗體進行免疫染色)進行計分，以計算每個菌株的能動部分。圖6(b)示出了通過tgsag1染色的軌跡的長度來推導的單個寄生蟲菌株的運動性。圖6(a和b)的誤差條表示平均值±sem。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。如圖6(a和b)中所示，在與親代相比時，δtgpts菌株示出了在運動部分和軌跡長度上的顯著減少。用pts活性補充的菌株顯示與親代菌株相似的回復變異表型(revertedphenotype)，確定了觀察的特異性。這種減少的寄生蟲運動性最終導致δtgpts突變體對hff宿主細胞的入侵和從hff宿主細胞逃逸較弱。運動性、入侵和逃逸的總體缺陷削弱δtgpts突變體的裂解周期和毒力。用于毒力試驗的體內(nèi)寄生蟲感染c57bl/6小鼠(獲取自janvierlabs,saintberthevin,法國)用δku80(親代)或δtgpts菌株的速殖子進行感染。用于體內(nèi)感染的寄生蟲在hff細胞中進行繁殖；新鮮的無宿主速殖子在感染40小時后被釋放并且如上所述的進行過濾(5μm)。它們通過腹膜內(nèi)途徑注入(50個親代菌株寄生蟲以及5×102個或5×103個δtgpts菌株寄生蟲)。12只動物在4周的時間內(nèi)每天被監(jiān)測死亡率和發(fā)病率。50個親代速殖子的接種物用于攻擊δtgpts感染的存活動物，額外監(jiān)測4周。空白小鼠(mice)(n＝4)的對照組也用相同的親代接種物來感染。結(jié)果示于圖6(c)中。小鼠腦中t.gondii的定量如他處所描述的，t.gondii的me49菌株的囊(cysts)從在5至6個月前向腹腔內(nèi)用t.gondii囊感染的雌nmri小鼠的腦中收獲(agrawal,g.g.vandooren,w.l.beatty,b.striepen,geneticevidencethatanendosymbiont-derivedendoplasmicreticulum-associatedproteindegradation(erad)systemfunctionsinimportofapicoplastproteins(內(nèi)共生體衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白質(zhì)降解(erad)系統(tǒng)作用于頂質(zhì)體蛋白質(zhì)的導入的基因證據(jù)),thejournalofbiologicalchemistry284,33683-91(2009))。δtgpts接種的小鼠(500個寄生蟲)在接種后用me49t.gondii菌株(200μl中3個囊)寄生蟲攻擊4周。也包括空白動物的對照組。小鼠腦中的寄生蟲負荷在用me49t.gondii菌株再感染4周后感染通過計數(shù)囊和半定量實時pcr來預估。腦組織在1ml無菌磷酸鹽緩沖鹽水中進行機械勻漿，并且囊使用光學顯微鏡來計數(shù)。對于定量pcr(qpcr)，灌注的腦組織樣品被快速冷凍并且于-80℃儲存。30mg組織被用來純化核酸(qiagen，德國)。將faststartessentialdnagreenmaster(roche,德國)與基因組dna(90ng)以一式三份反應方式進行混合，其在480instrumentii(roche，德國)中顯影。寄生蟲負荷(靶：tgb1基因)通過估計靶-參照比(480軟件v1.5.0)相對于小鼠(參考：精氨琥珀酸裂解酶(mmasl))進行分析。用于擴增tgb1基因和mmasl基因的引物列于表4(seqidnos.19-22)中。表4—用于擴增tgb1基因和mmasl基因的pcr引物seqidnumber引物名稱核苷酸序列19tgb1-f5’-tcccctctgctggcgaaaagt-3’20tgb1-r5’-agcgttcgtggtcaactatcgattg-3’21mmasl-f5’-tcttcgttagctggcaactcacct-3’22mmasl-r5’-atgacccagcagctaagcagatca-3’所有體內(nèi)測定都符合德國landesverwaltungsamtsachsen-anhalt指導的德國動物保護法。結(jié)果示于圖7中。在小鼠模型中的毒力檢查證明與明顯致死的親代菌株相反，幾乎所有被δtgpts突變體感染的動物都存活(圖6c)。重要地，所有承受突變體感染的小鼠對隨后的通過t.gondii的引起急性弓形蟲病的高毒性δku80菌株的致死攻擊(i型感染)具有絕對抗性(圖6c)。為了進一步擴展我們的菌株作為針對慢性感染的潛在疫苗的效用，δtgpts感染的動物用形成囊的me49t.gondii進行攻擊(ii型感染)。令人驚奇的是，與空白動物相比，突變體接種的小鼠在其腦組織中沒有顯示出慢性期囊腫的跡象(圖7a-7b)。一致地，與受感染的空白對照小鼠不同，在δtgpts免疫的動物的皮質(zhì)或腦膜中沒有觀察到炎癥病變。簡言之，這些結(jié)果證明了對于寄生蟲毒力ptdthr的體內(nèi)需求，并且說明了代謝致弱的全細胞“疫苗”對急性弓形蟲病以及慢性弓形蟲病的預防潛力。sequencelisting<110>柏林洪堡大學；烏得勒支大學控股有限公司<120>作為疫苗有用的經(jīng)基因修飾的球蟲寄生蟲<130>20864<160>40<170>patentinversion3.5<210>1<211>1845<212>dna<213>剛地弓形蟲<220><221>cds<222>(1)..(1845)<400>1atgcaactcccttcaagaaaggagtccggaacccccaacaatgcggcg48metglnleuproserarglysgluserglythrproasnasnalaala151015tcaccaggcagcctaaagtcagcgagaaccacacgcgcttcgagtccc96serproglyserleulysseralaargthrthrargalaserserpro202530tcgatggccgagtgttcgcctcgagtgcttgtcaactgcggtgtcgct144sermetalaglucysserproargvalleuvalasncysglyvalala354045ccgactgagcaaggggcccatggtgagcataaaagcttggaagtctcc192prothrgluglnglyalahisglygluhislysserleugluvalser505560actgacaactcagcttgcaaggaaccccggcgcatgctctggggttca240thraspasnseralacyslysgluproargargmetleutrpglyser65707580attctcatcctgagtttactgcttctcgggttctgggaccagctgttt288ileleuileleuserleuleuleuleuglyphetrpaspglnleuphe859095ccgccttcccagatgaaagatgtcgtgcgctctgtccacgaaggtgcc336proproserglnmetlysaspvalvalargservalhisgluglyala100105110gggaaacctggcgatgttgctggttctgcagagcttcctgcagaaagg384glylysproglyaspvalalaglyseralagluleuproalagl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