專利名稱：用于預(yù)防雞球蟲病的免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種具有預(yù)防雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)子孢子抗原基因TA4和雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)。并在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶特異性水解序列。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要寄生蟲病，全世界每年因球蟲所造成的經(jīng)濟(jì)損失約為20億英鎊。該病由艾美耳屬7種球蟲引起，其中以柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)造成的危害最大。目前藥物防治雞球蟲病已帶來一系列的問題。如耐藥性的產(chǎn)生，藥物殘留對(duì)環(huán)境造成的危害等等。這些問題已經(jīng)引起了人們的日益關(guān)注。人們迫切希望能找到一種行之有效的辦法來防治雞球蟲病。
使用強(qiáng)毒苗和致弱球蟲苗接種預(yù)防不失為一種手段，但強(qiáng)毒苗僅適用于種雞，不完全適用于蛋雞和肉雞，肉雞雖可用弱毒球蟲苗，但又存在穩(wěn)定性差，接種量難于控制，費(fèi)用高等問題，使這些球蟲苗不能得到很好的開發(fā)和利用。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，人們迫切希望通過基因工程手段來研制新型基因工程疫苗，為雞蟲病的防治提供新的手段。
雞對(duì)球蟲病的免疫是機(jī)體對(duì)病原體的綜合性防御表現(xiàn)，既有非特異性免疫又有特異性獲得性免疫—體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫應(yīng)答主要通過依賴腔上囊的B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞免疫應(yīng)答主要通過依賴胸腺的T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雞球蟲病的免疫力可因摘除胸腺而受到抑制，而摘除腔上囊則無影響。說明球蟲的保護(hù)性免疫中抗體的作用較小。但通過繼承性免疫淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果已經(jīng)證明，T細(xì)胞免疫反應(yīng)在球蟲免疫應(yīng)答中處于核心地位。
核酸疫苗是近幾年發(fā)展起來的一種新型疫苗，因其操作簡便，既具有重組亞單位疫苗的安全性，又具有減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效、持續(xù)性的優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今疫苗研究的熱點(diǎn)之一。近年來，在抗寄生蟲感染方面，核酸疫苗研究已展開了積極的探索。
TA4基因是由Files等(1987)首次克隆，該基因具有典型的信號(hào)肽序列，在蛋白合成時(shí)引導(dǎo)多肽跨膜運(yùn)動(dòng)。該基因長約648bp，其編碼的抗原由兩條17KD和8KD的多肽連通過二硫鍵連接而成，是一種子孢子表面蛋白，能刺激感染雞的T淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)感染雞具有較好的保護(hù)作用。
細(xì)胞因子是體內(nèi)免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有廣泛生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用。IL-2的主要作用是促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分化增殖，維護(hù)T細(xì)胞生長，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK)和B細(xì)胞功能。故又叫T細(xì)胞生長因子(TCGF)?，F(xiàn)已證實(shí)chIL-2在抗E.tenella和抗E.acervulina感染中的作用。Gaarter等(Caarter LL.et al.，Regulation of T cell subsetsfronm native to memory.J Immunol.1998，21(3)181-187)報(bào)道在感染第3天和第5天給雞注射chIL-2可使卵囊排出量降低。李祥瑞等(李祥瑞，金紅，盧景良.雞白細(xì)胞介素-2cDNA的克隆.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(2)80-84)已克隆和表達(dá)了雞的IL-2基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。
本發(fā)明提供了一種制備具有預(yù)防和治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。
另外，本發(fā)明還提供了所述DNA疫苗的用途。
本發(fā)明是部分地建立在本發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)之上含有柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)子孢子抗原基因TA4的真核質(zhì)粒載體能夠?yàn)殡u提供針對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的有效免疫保護(hù)；含有chIL-2可提高柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)感染雞盲腸扁桃體和脾臟淋轉(zhuǎn)水平及chIL-2的誘生，并可降低球蟲感染的病變記分和糞便中的卵囊數(shù)；在制備DNA疫苗時(shí)，將雞白介素-2基因與球蟲保護(hù)性基因(子孢子抗原基因TA4)一起引入真核質(zhì)粒，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)所述球蟲保護(hù)基因的免疫保護(hù)效果。
一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)子孢子抗原基因TA4的真核質(zhì)粒載體。
本發(fā)明所述DNA疫苗使用真核質(zhì)粒表達(dá)載體作為結(jié)構(gòu)框架，所述真核質(zhì)粒載體除具有表達(dá)載體基本元件，在限制性酶切位點(diǎn)處插入了目的基因。本領(lǐng)域已知的任一種真核質(zhì)粒載體都可用于本發(fā)明，例如，包括但不限于pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX 1.0和pcDNA4/His Max。在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA4/His Max(購自美國Invitrogen公司)。
本發(fā)明使用的具有免疫原性的TA4基因，該基因具有典型的信號(hào)肽序列，在蛋白合成時(shí)引導(dǎo)多肽跨膜運(yùn)動(dòng)。該基因長約648bp，其編碼的抗原由兩條17KD和8KD的多肽連通過二硫鍵連接而成，是一種子孢子表面蛋白，能刺激感染雞的T淋巴細(xì)胞增殖，對(duì)感染雞具有較好的保護(hù)作用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗進(jìn)一步還包含與所述基因TA4連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)，以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。本發(fā)明人成功克隆和表達(dá)了雞的IL-2基因(chIL-2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1中第667-1089位所示。本發(fā)明人進(jìn)一步研究了雞IL-2對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲病細(xì)胞免疫水平的影響。簡而言之，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、不同劑量卵囊感染組和不同劑量卵囊感染加白細(xì)胞介素-2(IL-2)組，在首次感染的基礎(chǔ)上攻蟲，對(duì)首次感染后和攻蟲后不同時(shí)間的盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞的淋轉(zhuǎn)水平進(jìn)行檢測，同時(shí)結(jié)合盲腸病變記分和糞便卵囊記數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，首次感染后，單純感染組盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞淋轉(zhuǎn)水平持續(xù)受抑制；各卵囊感染組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平在第4天均下降。感染的同時(shí)注射IL-2使1、2、5萬卵囊感染組盲腸扁桃體淋轉(zhuǎn)水平分別在第4、6、9天高于單純感染組；1、2萬卵囊感染組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平明顯升高。攻蟲后不同感染組盲腸扁桃體和脾淋轉(zhuǎn)水平均出現(xiàn)下降趨勢。加IL-2后能提高盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，但不顯示劑量的差異性；脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平高于單純感染組，第9天高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明1)加入重組雞IL-2可以使首次感染和攻蟲后1萬、2萬卵囊感染組的病變記分和糞便中卵囊排出量明顯降低；2)球蟲感染雛雞后引起脾和盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞免疫抑制，隨感染劑量的加大，免疫抑制程度加深；3)重組IL-2能提高首次感染雞盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，從而改善球蟲首次感染引起的脾和盲腸扁桃體免疫抑制；4)重組IL-2能提高攻蟲后盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，對(duì)攻蟲有免疫保護(hù)作用。
基于上述發(fā)現(xiàn)，因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明所述的DNA疫苗中引入與所述基因TA4連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗的免疫保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗還包含在所述的基因TA4與基因chIL-2之間插入一段蛋白酶凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列GAATTCCCTACCCTCGAT。在球蟲保護(hù)性基因和chIL-2之間插入蛋白酶特異性水解序列編碼核苷酸序列，這樣就可使得本發(fā)明所述DNA疫苗在肌肉細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)的球蟲保護(hù)性抗原與chIL-2的融合蛋白中含有了蛋白酶特異性位點(diǎn)。因而，可確保蛋白酶能夠在蛋白酶特異性位點(diǎn)水解該融合蛋白，得到球蟲抗原和chIL-2蛋白，從而使得這兩種蛋白能獨(dú)自形成高級(jí)結(jié)構(gòu)并發(fā)揮相應(yīng)的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，通過在chIL-2基因的5’端引入蛋白酶凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列GAATTCCCTACCCTCGAT(如SEQ ID NO1中第649-666位核苷酸所示)，從而制備出一種插入真核質(zhì)粒載體中的融合基因TA4-Xa-chIL-2(按從5’到3’的方向)，該融合基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。簡而言之，其技術(shù)路線如下1.P CR擴(kuò)增制備球蟲保護(hù)性抗原基因TA4和雞白介素2基因(chIL-2)通過PCR擴(kuò)增手段，克隆得到基因TA4和chIL-2。其中在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過引物設(shè)計(jì)手段，在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列GAA TTC CCT ACC CTCGAT；2.DNA疫苗重組真核質(zhì)粒及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建利用分子生物學(xué)常規(guī)的重組方法，制備出含TA4或含TA4-(Xa)-chIL-2的重組真核質(zhì)粒，然后用其轉(zhuǎn)化宿主菌，在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述宿主菌為大腸桿菌JM109，篩選后獲得重組基因工程菌；3.基因工程菌的發(fā)酵及DNA疫苗重組真核質(zhì)粒的大規(guī)模分離純化。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面是本發(fā)明所述的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的用途。用純化的含TA4或含TA4-(Xa)-chIL-2的重組DNA疫苗直接免疫動(dòng)物后，通過每克糞便指數(shù)、卵囊減少率、盲腸病變記分和抗球蟲指數(shù)等多項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，這兩者都具有很好的免疫保護(hù)效果(其中后者保護(hù)效果更為顯著)。因此，本發(fā)明所述的DNA疫苗可用于制備預(yù)防和治療雞球蟲病的藥物制劑。


圖1為本發(fā)明柔嫩艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的編碼雞白細(xì)胞介素2的重組質(zhì)粒pBV220-chIL-2的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為重組質(zhì)粒pMD18-T-TA4的構(gòu)建流程圖。
圖4為重組質(zhì)粒pET-chIL-2的構(gòu)建流程圖。
圖5為重組質(zhì)粒pcDNA4/His Max-TA4的構(gòu)建流程圖。
圖6為重組質(zhì)粒pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2的構(gòu)建流程圖。
圖7為RT-PCR檢測pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2 DNA疫苗在在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況，RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。A1為DL2000 Marker；A2為pcDNA4/His Max-TA4重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿部)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；A3為pcDNA4/His Max-TA4重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。B1為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000；B2為pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用TA4引物擴(kuò)增)；B3為pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用TA4引物擴(kuò)增)。B4為pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿肌)的RT-P CR擴(kuò)增產(chǎn)物(用chIL-2引物擴(kuò)增)；B5為pcDNA4/HisMax-TA4-Xα-chIL2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用chIL-2引物擴(kuò)增)。
圖8為Western-印跡檢測pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL-2DNA疫苗在肌肉中的表達(dá)圖。
A、B分別為Western-印跡檢測pcDNA4/His Max-TA4-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL-2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的蛋白表達(dá)結(jié)果。
圖9為重組質(zhì)粒pET-TA4-Xa-chIL-2的構(gòu)建流程圖。
圖10為重組質(zhì)粒pET-TA4-Xa-chIL-2的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖。
1.為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；4.為pET28b空載體質(zhì)粒表達(dá)1小時(shí)的結(jié)果；2、3、5、6和7分別為誘導(dǎo)表達(dá)后第0、1、2、3和4小時(shí)的結(jié)果。
實(shí)施例基礎(chǔ)材料含柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原基因TA4的重組質(zhì)粒pUC18-TA4(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；含雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)的重組質(zhì)粒pBV220-chIL-2(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，結(jié)構(gòu)見附圖2)；真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMax(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)；pMD18-T(大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美國Novagen公司產(chǎn)品)。
實(shí)施例1.TA4基因的制備1.合成引物P1、P2根據(jù)TA4基因的公開的核苷酸序列設(shè)計(jì)下列引物P15’-GGATCCGATGAACAAGCTGA-3′P25’-GAATTCAAAGAGAGCGAAAGCGGA-3’其中下劃線部分分別為引入的酶切位點(diǎn)BamHI和EcoR I。
2.TA4基因的PCR擴(kuò)增在薄壁PCR管中加入下列成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pUC18-TA4(50ng/μl) 1.0μl2.5mmol/L dNTP4.0μlP1(50pmol)1.0μlP2(50pmol)1.0μl10×PCR buffer5.0μl25mmol/L MgCL223.0μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μlddH2O34.5μl總計(jì) 50.0μl
將上述成分離心混勻后，于PCR儀上95℃變性5分鐘；94℃60秒，58℃60秒，72℃60秒，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸15分鐘。
經(jīng)測序表明，擴(kuò)增得到的TA4基因具有如SEQ ID NO1中第1-648位所示的核苷酸序列。
實(shí)施例2.chIL-2基因的制備1.合成引物P3、P4，序列分別為P35’-CTAGAATTCCCTACCCTCGAT TGCAAAGTACTGATCT-3’P45’-TTAGTCGACTTGCAGATATCTCACAAAGTT-3’其中下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)EcoR I和SalI；方框部分為起始密碼子；斜體字母部分為凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列(如SEQID NO1中第649-666位所示的核苷酸序列)。
2.chIL-2基因的PCR擴(kuò)增在薄壁PCR管中加入下列成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pBV220-chIL-2(50ng/μl) 1.0μl2.5mmol/L dNTP 4.0μlP3(50pmol) 1.0μlP4(50pmol) 1.0μl10×PCR buffer 5.0μl25mmol/L MgCL223.0μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μlddH2O 34.5μl總計(jì)50.0μl將上述成分離心混勻后，于PCR儀上94℃變性5分鐘；94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10分鐘。
由于使用P3和P4作為引物，所以得到的chIL-2基因的5’端含有凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列(即，Xa-chIL-2)。
經(jīng)測序表明，擴(kuò)增得到的chIL-2基因具有如SEQ ID NO1中第667-1089位所示的核苷酸序列。
實(shí)施例3.DNA疫苗的構(gòu)建1.重組質(zhì)粒pMD 18-T-TA4的構(gòu)建(見圖3)取實(shí)施例1中獲得的PCR產(chǎn)物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物 4.0μlpMD18-T vector 1.0μlLigation solution I 5.0μl總體積 10.0μl將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切及測序等鑒定，確定為pMD18-T-TA4。
2.重組質(zhì)粒pET-Xa-chIL-2的構(gòu)建(見圖4)取實(shí)施例2中獲得的PCR產(chǎn)物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)，分別用EcoRI和SalI雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。然后將兩種純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物/EcoR I+SalI(20ng/μl) 5.0μlpET-28a(+)/EcoRI+SalI(25ng/μl)2.0μl5×T4連接buffer2.0μlT4DNA連接酶(2U/μl)1.0μl總體積 10.0μl
將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用EcoRI和SalI雙酶切及測序等鑒定，確定為pET-Xa-chIL-2。
3.重組質(zhì)粒pcDNA-TA4的構(gòu)建(見圖5)分別用BamHI和EcoRI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD 18-T-TA4和pcDNA4/HisMax，回收TA4目的基因和pcDNA4/His Max大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，確定為pcDNA4/His Max-TA4DNA疫苗。
4.重組質(zhì)粒pcDNA-TA4-Xa-chIL-2的構(gòu)建(見圖6)分別用EcoRI+NotI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pET-Xa-chIL-2和pcDNA4/HisMax-TA4，然后回收Xa-chIL-2目的基因和pcDNA4/His Max-TA4大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用EcoRI和NotI雙酶切鑒定，確定為pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2 DNA疫苗。
實(shí)施例4.免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗在雞體內(nèi)表達(dá)情況的檢測分別大量提取pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2重組質(zhì)粒，經(jīng)胸部肌肉注射14日齡雛雞100μg/只，7天后分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)1、RT-PCR檢測DNA疫苗的轉(zhuǎn)錄一步法提取肌肉總RNA，用RT-PCR法分別擴(kuò)增TA4基因和chIL-2基因。結(jié)果表明DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)錄(見圖7)。
2、Western-印跡檢測DNA疫苗的翻譯分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，麗春紅染色，洗滌后加入5％脫脂奶粉封閉無關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)，然后加入抗TA4重組蛋白免疫兔血清(一抗)作用1小時(shí)，洗滌緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)作用1小時(shí)，最后DAB顯色液顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了很好的表達(dá)(見圖8)3.重組質(zhì)粒pET-TA4-Xa-chIL-2的構(gòu)建(見圖9)分別用BamHI和EcoRI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-TA4和pET28b(+)，回收TA4目的基因和pET28b(+)大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，確定為pET-TA4重組載體。再用EcoRI和SalI雙酶切pET-TA4重組載體和pET-Xa-chIL-2，回收Xa-chIL-2目的基因和pET-TA4大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用BamHI和SalI雙酶切鑒定，確定為pET-TA4-Xa-chIL-2重組載體。
4.重組質(zhì)粒pET-TA4-Xa-chIL-2的誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化有pET-TA4-Xa-chIL-2質(zhì)粒的陽性克隆28℃振蕩培養(yǎng)過夜。將搖起的菌液以1∶50稀釋至含Kna+的LB培養(yǎng)液中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，然后用終濃度1mMol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)表達(dá)后第0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)和6小時(shí)的菌液，菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(見圖10)。
實(shí)施例5.本發(fā)明DNA疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果150羽1日齡雛雞，隨機(jī)分為5組，每組30羽。14日齡和21日齡時(shí)分別肌肉注射100μl PBS(第一組)、100μl PBS(第二組)、100μg pcDNA4/His Max-TA4(第三組)、100μg pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2(第四組)；TA4-Xa-chIL-2重組融合蛋白(第五組)。28日齡時(shí)分別經(jīng)口感染E.tenella孢子化卵囊0個(gè)(第一組)、105個(gè)(第二組)、105個(gè)(第三組)、105個(gè)(第四組)、105個(gè)(第五組)。對(duì)免疫保護(hù)效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1、增重效果注射DNA疫苗前每組雞逐只稱重，然后在攻蟲前、攻蟲后第7天對(duì)對(duì)應(yīng)的雞再逐只稱重，觀察攻蟲前、攻蟲后雞的體重變化情況，然后計(jì)算平均增重和相對(duì)增重。平均增重1＝攻蟲時(shí)重-首免時(shí)重；平均增重2＝最后撲殺時(shí)重-攻蟲時(shí)重；相對(duì)增重＝(各試驗(yàn)組平均增重/非感染非免疫組平均增重)×100％。增重結(jié)果(見表1)表明，疫苗的注射對(duì)雞的增重?zé)o影響，即疫苗的毒副作用與PBS相當(dāng)。而攻蟲后pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗免疫組增重與非感染非免疫組差異不顯著，說明pcDNA4/HisMax-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗具有明顯的保護(hù)作用。
表1本發(fā)明DNA疫苗的增重效果

同一列中含相同字母表示差異不顯著，不含相同字母表示差異顯著，不同小寫字母代表差異顯著(p＜0.05)。
2.每克糞便卵囊數(shù)攻蟲后每天檢查糞便，第7天分別收集各組糞便，混勻后，每組各取10g，加入90mL蒸餾水制成10倍稀釋液，經(jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥陲@微鏡下用紅細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)每克糞便中的蟲卵數(shù)。
表2.每克糞便卵囊數(shù)

3、卵囊減少率卵囊減少率是判斷疫苗保護(hù)效果的另外一個(gè)指標(biāo)，其計(jì)算公式如下卵囊減少率＝[(感染非免疫組糞便卵囊排出數(shù)-試驗(yàn)組糞便卵囊排出數(shù))/感染非免疫組糞便卵囊排出數(shù)]×100％。
表3卵囊減少率

4、盲腸病變記分攻蟲后第7天，每組取10只雞剖殺，觀察盲腸病變。按Johnson方法進(jìn)行盲腸病變記分。也就是將盲腸病變分為0～+4五個(gè)等級(jí)。0分表示正常，無肉眼病變；+1分盲腸壁有很少量散在的淤點(diǎn)，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常；+2分病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁稍增厚，內(nèi)容物正常；+3分盲腸內(nèi)有多量血液或盲腸芯(血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物)，盲腸壁肥厚明顯，盲腸中糞便含量少；+4分因充滿大量血液或腸芯而盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含，死亡雞只也記+4分。兩側(cè)盲腸病變不一致時(shí)，以嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)。相對(duì)病變記分＝(實(shí)驗(yàn)組病變記分/感染非免疫組病變記分)×100％。
表4.盲腸病變記分

同一列中含相同字母表示差異不顯著，不含相同字母表示差異顯著，不同小寫字母代表差異顯著(p＜0.05)。
5.抗球蟲指數(shù)(ACI)ACI是包括存活率、增重、病變、卵囊產(chǎn)量等多項(xiàng)參數(shù)，綜合評(píng)定后作為判定球蟲耐藥性或藥物效力的指標(biāo)，也可用于球蟲疫苗保護(hù)效果檢測的指標(biāo)。ACI判定公式ACI＝(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)。(ACI≥180為保護(hù)效果明顯，ACI＝160～179為保護(hù)效果一般，ACI＜160為無保護(hù)效果。)結(jié)果如表，本發(fā)明的pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗ACI達(dá)到192.33，具有很好的免疫保護(hù)效果。
表5抗球蟲指數(shù)(ACI)

序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>用于預(yù)防雞球蟲病的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1089<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>融合基因<220>
<221>CDS(子孢子抗原基因TA4)<222>(1)..(648)<223>
<220>
<221>CDS(雞白介素-2基因)<222>(667)..(1089)<223>
<220>
<221>蛋白酶凝血因子Xa特異性水解序列的編碼序列<222>(649)..(666)
<223>
<400>1atg aac aag ctg aga aaa gca gca gga ctt cct gca ttc gaa gat gct 48Met Asn Lys Leu Arg Lys Ala Ala Gly Leu Pro Ala Phe Glu Asp Ala1 5 10 15gtg gga gac aca ttt gtt cta cca gca tac tcg cat gaa gag tct agg 96Val Gly Asp Thr Phe Val Leu Pro Ala Tyr Ser His Glu Glu Ser Arg20 25 30gcg gca cca gta gct gaa act ctc tgg aag acg gag ata tgc ccc aaa144Ala Ala Pro Val Ala Glu Thr Leu Trp Lys Thr Glu Ile Cys Pro Lys35 40 45gtc tta gga ggc gga agg tcc agg aac gtt act gaa gct gtc aag tta192Val Leu Gly Gly Gly Arg Ser Arg Ash Val Thr Glu Ala Val Lys Leu50 55 60act ggc aat ttt gcc tac tac ccc gtc aca gac ggc aaa aag gag tgc240Thr Gly Asn Phe Ala Tyr Tyr Pro Val Thr Asp Gly Lys Lys Glu Cys65 70 75 80ggc gat gct gtg gag tac tgg aaa ggc gga ctt tct cag ttc aac gac288Gly Asp Ala Val Glu Tyr Trp Lys Gly Gly Leu Ser Gln Phe Asn Asp85 90 95aca att ccc cca acg ttc caa gcg ttg aac gac ccc gtt gtg tac aat336Thr Ile Pro Pro Thr Phe Gln Ala Leu Asn Asp Pro Val Val Tyr Asn100 105 110
ggc agg gct gtt tcc ttt gtc gcc cta tac aac ccc aaa acc agc ccc384Gly Arg Ala Val Ser Phe Val Ala Leu Tyr Asn Pro Lys Thr Ser Pro115 120 125gtt gtc agt tgc gtg ctc ctc cag tgc cct aat gca ggt gtt ggt gga432Val Val Ser Cys Val Leu Leu Gln Cys Pro Asn Ala Gly Val Gly Gly130 135 140cgc agg ctt gcg gca ggc acg aca gac gct gtc att tgc ttg aca aat480Arg Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Asp Ala Val Ile Cys Leu Thr Asn145 150 155 160ccg gct cct ttg gaa gca agg tca caa cca ttc gac gac gag caa tgg528Pro Ala Pro Leu Glu Ala Arg Ser Gln Pro Phe Asp Asp Glu Gln Trp165 170 175aag aaa att ggt gac tct cta tct ctc tct gag gaa gaa gaa gag aag576Lys Lys Ile Gly Asp Ser Leu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Lys180 185 190ggc gga gtt tct cca gtc gtc cct tca gta gcc ctc atc tct gcg gcg624Gly Gly Val Ser Pro Val Val Pro Ser Val Ala Leu Ile Ser Ala Ala195 200 205gtc atc tcc gct ttc gct ctc ttt gaattcccta ccctcgat atg tgc aaa675Val Ile Ser Ala Phe Ala Leu Phe Met Cys Lys210 215gta ctg atc ttt ggc tgt att tcg gta gca acg cta atg act aca gct723Val Leu Ile Phe Gly Cys Ile Ser Val Ala Thr Leu Met Thr Thr Ala220 225 230 235
tat gga gca tct cta tca tca gca aaa agg aaa cct ctt caa aca tta771Tyr Gly Ala Ser Leu Ser Ser Ala Lys Arg Lys Pro Leu Gln Thr Leu240 245 250ata aag gat tta gaa ata ttg gaa aat atc aag aac aag att cat ctc819Ile Lys Asp Leu Glu Ile Leu Glu Asn Ile Lys Asn Lys Ile His Leu255 260 265gag ctc tac aca cca act gag acc cag gag tgc acc cag caa act ctg867Glu Leu Tyr Thr Pro Thr Glu Thr Gln Glu Cys Thr Gln Gln Thr Leu270 275 280cag tgt tac ctg gga gaa gtg gtt act ctg aag aaa gaa act gaa gat915Gln Cys Tyr Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp285 290 295gac act gaa att aaa gaa gaa ttt gta act gct att caa aat atc gaa963Asp Thr Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Thr Ala Ile Gln Asn Ile Glu300 305 310 315aag aac ctc aag agt ctt acg ggt cta aat cac acc gga agt gaa tgc 1011Lys Asn Leu Lys Ser Leu Thr Gly Leu Asn His Thr Gly Ser Glu Cys320 325 330aag atc tgt gaa gct aac aac aag aaa aaa ttt cct gat ttt ctc cat 1059Lys Ile Cys Glu Ala Asn Asn Lys Lys Lys Phe Pro Asp Phe Leu His335 340 345gaa ctg acc aac ttt gtg aga tat ctg caa 1089Glu Leu Thr Asn Phe Val Arg Tyr Leu Gln
權(quán)利要求
1.一種柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球蟲子孢子抗原基因TA4的真核質(zhì)粒載體。
2.權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中進(jìn)一步還包含與所述基因TA4連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因。
3.按權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其中進(jìn)一步還包含在所述的基因TA4與基因chIL-2之間插入一段蛋白酶凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列GAA TTC CCT ACC CTCGAT，組成一融合基因TA4-Xa-chIL-2。
4.權(quán)利要求3所述的DNA疫苗，其中所述的融合基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA4/His Max。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗在制備預(yù)防和治療雞球蟲病的藥物制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)子孢子抗原基因TA4和雞白細(xì)胞介素－2基因，并在chIL－2基因的5’端引入了一段蛋白酶特異性水解序列。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件，能夠有效地預(yù)防和治療雞的球蟲病。
文檔編號(hào)A61K39/012GK1803194SQ200510124048
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者李祥瑞, 徐前明, 嚴(yán)若峰, 徐立新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)