專利名稱：一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體3e1,其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1，還涉及該單克隆抗體的制備方法以及在制備蓖麻毒素疫苗和蓖麻毒素檢測、診斷、治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蓖麻毒素(Ricin)是一種核糖體失活蛋白，它幾乎可以和所有真核細胞結(jié)合，呈細胞毒作用。一分子蓖麻毒素進入細胞內(nèi)，就足以使整個細胞蛋白質(zhì)合成停止而死亡。其毒性是氰化物的6000倍。蓖麻毒素氣溶膠進入體內(nèi)，可引起嚴重的肺泡炎癥和肺水腫，最后因肺阻塞缺氧而導(dǎo)致死亡(1.GriffithsGD，Lindsay CD，Allenby AC，et al.Protection against inhalation toxicity ofricin and abrin by immunisation.Hum Exp Toxicol 1995；14155-64.2.BrownRFR.White DE.Ultrastructure of rat lung following inhalation of ricin aerosol.IntJ Exp Pathol 1997；78267-76.)。靜脈給藥每公斤體重3-5微克即可致命。迄今為止，國內(nèi)外還沒有適用于人的、針對蓖麻毒素中毒的專用特效藥。蓖麻毒素生產(chǎn)原料蓖麻籽來源廣泛，提取制備方法簡便，很容易被恐怖分子利用，因此研究其拮抗劑具有重要的現(xiàn)實意義。
抗體自19世紀末報道可以用來治療疾病以來，一直用于治療毒蛇、毒蝎咬傷，具有良好的療效。大量研究表明用蓖麻毒素的中和抗體治療突發(fā)性蓖麻毒素中毒效果良好。Furukawa-Stofferdeng等報道給小鼠腹腔注射含蓖麻毒素中和抗體的培養(yǎng)上清并同時注射0.5g蓖麻毒素(致死劑量)，可保護受試小鼠抵抗毒素攻擊(T.Furukawa-Stoffer，D.C.W.Mah，J.Cherwonogrodzkyet al.A novel biological-based assay for the screening of neutralizing antibodies toricin.Hybridoma，1999，18(6)505-511)?？贵w治療的成敗依賴于蓖麻毒素被吸收的多少和進入體內(nèi)的路徑(B.M.J.Foxwell，S.I.Detre，T.A.Donovan.et al.The useof anti-ricin antibotied to protect mice intoxicated with ricin.Toxicology，1985，3479-8834.)。在針對蓖麻毒素活性鏈的單克隆抗體與毒素的分子比為4∶1時，抗體在體外可中和蓖麻毒素對EL-4淋巴瘤細胞的細胞毒作用。甘露醇具有增加大分子物質(zhì)通過血腦屏障的功能，使用甘露醇后蓖麻毒素的毒性作用比靜脈注射增加兩倍，針對Ricin的神經(jīng)中毒，顱內(nèi)注射抗體后具有和靜脈注射同樣的保護效果。
目前，國內(nèi)外針對蓖麻毒素單克隆抗體的報道，主要為檢測用的單克隆抗體和具有中和活性的兩類。具有中和活性單克隆抗體的報道主要為抗蓖麻毒素A鏈、B鏈和A、B鏈三種形式(1.P.V.Lemley，P.Amanatides，D.C.Wright.Identification and characterization of a monoclonal antibody thatneutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo.Hybridoma，1994，13(5)417-421.2.Maddaloni M，Cooke C，Wilkinson R，Stout AV，Eng L，Pincus SH.Immunological characteristics associated with the protective efficacy of antibodiesto ricin.J Immunol.2004，15；172(10)6221-8.)。我國對蓖麻毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護等研究領(lǐng)域剛剛起步(1.宋云揚，劉娟，應(yīng)天翼，等.夾心免疫PCR方法檢測蓖麻毒素.免疫學(xué)雜志，2002，18(3)229-231.2.郝蘭群，郭勝清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素單克隆抗體的制備及應(yīng)用.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2003，19(5)517-518)，針對蓖麻毒素的恐怖襲擊尚無配套診斷試劑和有效免疫治療和防護手段，因此迫切需要建立和發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的以抗體為基礎(chǔ)的檢測和防護用品。針對蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點的單克隆抗體，目前尚無類似的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了提供一種蓖麻毒素中毒的檢測或治療手段，本發(fā)明公開了一種抗蓖麻毒素的單克隆抗體3E1。
本發(fā)明公開的抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子，其氨基酸序列分別如序列表中序列3、序列4所示，其編碼基因分別如序列表中序列1、序列2所示。該單克隆抗體的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的氨基酸序列分別如序列表中序列5、序列6所示。該單克隆抗體的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中序列7、序列8、序列9所示。該單克隆抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11、序列12所示。
本發(fā)明還公開了上述單克隆抗體3E1的制備方法，主要內(nèi)容如下1.抗蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體雜交瘤細胞株的構(gòu)建首先對蓖麻毒素用甲醛進行減毒處理，然后免疫Balb/c小鼠，常規(guī)方法進行細胞融合。用間接ELISA法篩選，陽性細胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養(yǎng)上清檢測為100％陽性。對雜交瘤細胞3E1進行了染色體核型分析，雜交瘤細胞3E1染色體平均數(shù)目為106條，用雙相瓊脂擴散實驗證明3E1雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
2.抗蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選和鑒定用MTT法，就蓖麻毒素對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行了細胞毒實驗，結(jié)果算出蓖麻毒素對Sp2/0細胞的半數(shù)致死劑量IC50＝0.31ng/ml。依照IC50，篩選出中和性抗體3E1，Western-blotting對特異性作了評價。結(jié)果顯示3E1為蓖麻毒素中和性抗體，可在體外實驗中，中和蓖麻毒素對SP2/0細胞的毒性作用，中和性單克隆抗體3E1可特異性識別蓖麻毒素的B鏈線性表位。
3.單克隆抗體3E1對BALB/C小鼠的保護作用親和柱純化Balb/c小鼠雜交瘤細胞腹水，紫外分光光度計測量，計算蛋白質(zhì)含量。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，計算半數(shù)致死劑量LD50。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，不同時間段后，注射中和性單克隆抗體3E1記錄生長情況。結(jié)果顯示蓖麻毒素對小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1在小鼠注射10倍致死計量的蓖麻毒素20分鐘后仍對小鼠具有保護作用。
4.雜交瘤細胞3E1輕、重鏈基因的釣取提取中和性單克隆抗體3E1細胞RNA，經(jīng)RT-PCR，用兩對特異性引物釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)后挑取單個菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進行DNA測序分析。
通過本部分實驗，構(gòu)建了含有蓖麻毒素中和抗體3E1輕、重鏈基因的載體，經(jīng)序列分析、比對，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1和序列2)。
5.單克隆抗體3E1輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定用www.expasy.org在線軟件將編碼蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體3E1輕、重鏈氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(ElvinA.Kabat.《Sequences of Proteins of Immunological Interest》.1991)確定輕鏈可變區(qū)序列如序列表中序列5所示和重鏈可變區(qū)序列如序列表中序列6所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列7、序列8和序列9所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11和序列12所示。
本發(fā)明應(yīng)用一套設(shè)計的引物成功地從培養(yǎng)的蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點中和性單克隆抗體3E1雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點和中和性單克隆抗體3E1輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為免疫用蓖麻毒素SDS-PAGE結(jié)果圖譜，其中泳道1為純化的非還原態(tài)蓖麻毒素；泳道2為經(jīng)甲醛脫毒處理的非還原態(tài)蓖麻毒素；泳道3為純化的還原態(tài)蓖麻毒素；泳道4為經(jīng)甲醛脫毒處理的還原態(tài)蓖麻毒素；泳道5為蛋白質(zhì)Marker。
圖2為雜交瘤細胞染色體核型分析結(jié)果圖。
圖3為蓖麻毒素對Sp2/0細胞的細胞毒作用圖，其中橫坐標(biāo)為蓖麻毒素的濃度縱坐標(biāo)為蓖麻毒素Sp2/0細胞的殺傷率，依照此結(jié)果算出蓖麻毒素對Sp2/0細胞的IC50＝0.31ng/ml。
圖4為單克隆抗體3E1抵抗蓖麻毒素對Sp2/0細胞的細胞毒作用圖，其中橫坐標(biāo)為單克隆抗體的種類，縱坐標(biāo)為加入單克隆抗體3E1后，蓖麻毒素對Sp2/0細胞的細胞毒作用，用細胞的存活率表示。
圖5為中和性單克隆抗體3E1的結(jié)合特性鑒定圖，其中泳道1為蓖麻毒素的SDS-PAGE結(jié)果，上面的為B鏈，下面的為A鏈；泳道2為蛋白質(zhì)Marker，泳道3為中和性單克隆抗體3E1的Western-blot結(jié)果。結(jié)果顯示中和性單克隆抗體3E1可識別蓖麻毒素B鏈(半乳糖結(jié)合位點)線性表位。
圖6為中和性單克隆抗體3E1經(jīng)Protein A純化的層析結(jié)果圖，其中峰1為上樣峰，峰2為純化的抗體峰。
圖7為單克隆抗體3E1經(jīng)Protein A純化后的SDS-PAGE結(jié)果圖譜其中泳道1、2、3為經(jīng)Protein A純化的中和性單克隆抗體3E1，泳道4為蛋白質(zhì)Marker，A為重鏈，B為輕鏈。
圖8為蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1雜交瘤細胞RNA提取結(jié)果圖譜。
圖9為蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1雜交瘤細胞輕重鏈基因的PCR結(jié)果圖，其中泳道1為輕鏈基因；泳道2為DL2000；泳道3為重鏈基因?；虼笮〈蠹s為660bp。
具體實施例方式
通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實施例只是為進一步說明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
實施例一抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構(gòu)建一、材料福氏完全佐劑及不完全佐劑，TMBSigma公司產(chǎn)品20％胎牛血清北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品無血清RPMI 1640Gibco公司產(chǎn)品SP2/0細胞ATCC引進，本實驗室保存。
Balb/c小鼠軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供其余試劑均為市購。
二、方法結(jié)果1.蓖麻毒素的減毒處理在純化后的蓖麻毒素(Nicolson，G.L.，Blaustein，J.，1972.The interaction of Ricinus com-munis agglutininwith normal and tumor cell surfaces.Biochim.Biophys.Acta 266，543-547.)2mg/ml中加入終濃度為1％的甲醛，37℃處理72h，PH7.20.01M PBS透析72h，SDS-PAGE檢測(圖1)。
2.Balb/c小鼠免疫 選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，用100μgricin腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑，第2針加福氏不完全佐劑，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA檢測抗體產(chǎn)生情況，融合前3天，以100μg ricin腹腔加強免疫一次，第3天融合。
3.細胞融合 將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細胞，按常規(guī)方法進行細胞融合。具體方法①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75％酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網(wǎng)研磨單個細胞懸液，無血清RPMI 1640洗兩次并記數(shù)；②收集對數(shù)生長期的SP2/0細胞，用無血清RPMI 1640洗兩次并記數(shù)；③按SP2/0細胞∶脾細胞＝1∶5的比例混合兩種細胞，用RPMI 1640洗1次，棄盡上清，輕輕將細胞打散；④在1min時間里緩慢加入1ml 50％PEG(Mw 1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、2min、5min時間內(nèi)加無血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min離心7min，棄上清，盡可能輕輕將細胞懸起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為2×106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養(yǎng)細胞(1×104細胞/孔)96孔培養(yǎng)板(Gibco)中，100μl/孔，37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
4.間接ELISA篩選抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞(1)用10μg/mlricin包被ELISA板，于4℃過夜并封閉。依次加入待測細胞培養(yǎng)上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，及1∶500稀釋的50μl HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長測定A值。
5.雜交瘤細胞克隆化 間接ELISA法篩選為陽性的細胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養(yǎng)上清檢測為100％陽性。雜交瘤細胞的克隆化用有限稀釋法(1)在克隆化的當(dāng)天或前1天制備滋養(yǎng)細胞脫頸處理昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用20％胎牛血清1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml。(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細胞移至另一無菌試管中，并準確計數(shù)。(3)有限稀釋法進行亞克隆。(4)將培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)，5天左右在顯微鏡下可觀察到細胞克隆。適時換液，檢測，取陽性單克隆細胞株進行擴大培養(yǎng)，及時凍存細胞株。
6.雜交瘤細胞的染色體核型分析在對數(shù)生長期的雜交瘤細胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02μg/ml，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時后收集細胞，經(jīng)低滲裂解(加入預(yù)溫至37℃的0.075M KCL8ml，輕輕打勻，37℃30-40分鐘)、預(yù)固定(甲醇∶冰醋酸＝3∶1新鮮配制，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理后用少量固定液制備細胞懸液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10％Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖2)。結(jié)果顯示經(jīng)30個分裂相細胞的統(tǒng)計平均值，雜交瘤細胞染色體數(shù)目在85-116(n＝30)之間變動，平均數(shù)目為106條，且有1-2個中部著絲粒染色體。已知Balb/c小鼠脾細胞染色體數(shù)目為40條，Sp2/0細胞染色體數(shù)目為60-70條，融合后的雜交瘤細胞染色體數(shù)目應(yīng)該為90-120條，由此提示所獲得的抗體分泌細胞為雜交瘤細胞。
7.雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型的確定 用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴散實驗，證明3E1雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
通過本部分工作，篩選到蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體3E1。
實施例二具有蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點和中和性單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選和鑒定一、材料同上。
二、方法結(jié)果1.ricin對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0半數(shù)致死劑量(IC50)的確定用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0.156ng/ml、0.078ng/ml，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每一濃度3復(fù)孔，100μl/孔，調(diào)整對數(shù)生長期的SP2/0細胞濃度調(diào)整為5×105/ml，100μl/孔。37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，每孔加入10μl MTT，37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μl DMSO溶解結(jié)晶，于570nm波長測定A值。按公式細胞死亡率％＝[1-(實驗組A值一空白組A值)/(對照組A值一空白組A值)]×100％評價細胞毒作用，并計算IC50(圖3)。用MTT法，就蓖麻毒素對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行了細胞毒實驗，結(jié)果算出IC50＝0.31ng/ml。
2.單克隆抗體3E1的篩選及中和活性用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、0.156ng/ml、0.078ng/ml，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每一濃度3復(fù)孔，100μl/孔。依次分別加入4種待測細胞培養(yǎng)上清液50μl/孔。調(diào)整對數(shù)生長期的SP2/0細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，50μl/孔。37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，每孔加入10μl MTT，37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μl DMSO溶解結(jié)晶，于570nm波長測定A值。按公式細胞存活率％＝[(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100％評價細胞毒作用(圖4)。
3.單克隆抗體3E1特異性鑒定 將Ricin經(jīng)120g/L還原SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，滴加含5％奶粉的PBS于4℃封閉過夜，用含0.5ml/LTween-20的PBS洗膜3次。將膜剪成相同寬度，依次滴加蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1交瘤細胞培養(yǎng)上清(37℃結(jié)合1h，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Tween-20的TBS洗滌3次)。及HRP-GAMIgG(37℃結(jié)合1h，洗膜3次)以DAB顯色后，觀察結(jié)果(圖5)。
4.動物體內(nèi)誘生單克隆抗體制備蓖麻毒素單克隆抗體3E1 接種雜交瘤細胞前10天，先給Balb/c小鼠(♂，8～12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最后將細胞濃度調(diào)整為4×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7～10天后，可見小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心10min，收集上清，加等量甘油，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 通過本部分工作，獲得了命名為3E1的蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點中和性單克隆抗體交瘤細胞，在體外實驗中，3E1可中和蓖麻毒素對SP2/0細胞的毒性作用，中和性單克隆抗體3E1可特異性識別蓖麻毒素B鏈(半乳糖結(jié)合位點)線性表位。
實施例三單克隆抗體3E1的Protein A純化及對BALB/C小鼠的保護性實驗一、材料Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱北京本元正陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；余同上。
二、方法結(jié)果1.在2毫升小鼠腹水中加入1毫升PH8.0，0.1moL/L磷酸緩沖液并用PH9.0，1moL/L TRIS-HCL調(diào)整PH為9。把小鼠腹水加入已經(jīng)用0.1moL/L磷酸緩沖液PH 8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中測不到雜蛋白為止。用PH 3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用1moL/L TRIS-HCL PH 8.5緩沖液中和，用PH7.2，0.01M BS透析72h。取樣在紫外分光光度計上測0D260，0D280，計算蛋白質(zhì)含量，凍干-20℃保存(圖6，圖7)。
2.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠38只，分為4組，雌雄各半，按每公斤體重分別于左測腹腔注射0μg、10μg、20μg、40μg蓖麻毒素，正常飼養(yǎng)，每1h觀察一次，記錄生長情況，觀察2周，計算半數(shù)致死劑量LD50，見表1。
3.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠，雌雄各半，分為抗體組、PBS組和正常對照3組，共計5批次。按每公斤體重分別于左測腹腔注射20μg、40μg、60μg、100μg、蓖麻毒素，分別于0min、10min、20min、30min后于右側(cè)腹腔注射純化的中和性單克隆抗體3E1 100μg，正常飼養(yǎng)，每1h觀察一次，記錄生長情況，觀察2周，結(jié)果見(表2、表3、表4)。
結(jié)果顯示蓖麻毒素對小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1在小鼠注射10倍致死計量的蓖麻毒素20分鐘后仍對小鼠具有保護作用。
表1.蓖麻毒素對Balb/c鼠的半數(shù)致死量確定

從結(jié)果可以計算出LD50為10.4μg/kg表2.蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體對小鼠的保護作用(6 LD50)

表3.蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體對小鼠的保護作用(10LD50，20分鐘后)

表4.蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點單克隆抗體對小鼠的保護作用(10LD50，30分鐘后)

實施例四 蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點中和性單克隆抗體雜交瘤細胞3E1輕、重鏈基因的釣取一、材料引物PHs1見序列表中序列13；PHs2見序列表中序列14；PLs1見序列表中序列15；PLa1見序列表中序列16；PHa1見序列表中序列17。DNA片段純化試劑盒OMEGA生物科技公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶NewEngland Biolabs產(chǎn)品；載體PGEM TeasyPromega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細菌JM109購自Promega公司。余同上。
二、方法結(jié)果1.取對數(shù)生長期的中和性單克隆抗體3E1細胞5×106-107個，離心去除上清，將細胞均勻彈起。加1ml TRIzol(Invitrogen)反復(fù)吹打使細胞充分裂解，振蕩5分鐘后，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-8℃12000r/min，離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500μl異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-8℃12000r/min離心10分鐘。75％乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20μl無RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖8)。
2.取含1μg總RNA的溶液，依次加入AMV5×緩沖液4μl，Oligo(dT)(500ng/μl)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，去離子水補至20μl、反轉(zhuǎn)錄酶2-5U，42℃延伸1小時。95℃變性5分鐘，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。用2對特異性引物PHs1、PHal和PLs1、PLa1，在20μl PCR反應(yīng)體系中，分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，Taq酶10×buffer2μl，上下游引物各1μl，2.5mmo1/L dNTP 1μl，加Taq酶1-2U，去離子水補至20μl。95℃變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個循環(huán)，72℃后延伸10分鐘(圖9)。
3.用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55℃水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產(chǎn)物在T4 DNA連接酶緩沖液中按2∶1的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，連接反應(yīng)的總體積為10μL。
4.取連接液10μl，加入200μl感受態(tài)細菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42℃水浴熱休克90秒，迅速轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800μl LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37℃恒溫搖床，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動45分鐘，4000r/min離心1分鐘，棄去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(終濃度為100μg/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37℃孵箱12～18小時。
5.在上述平板中挑取單個克隆，接種于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中。37℃恒溫搖床170rpm，震蕩培養(yǎng)過夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，10000rpm離心1min，棄上清。將沉淀菌體重懸于100μL溶液I中，加新鮮配制的溶液II 200μL，輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150μl溶液III，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4℃，12000rpm離心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酚，劇烈震蕩后，12000rpm離心5min，將上層水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水乙醇混勻，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40μL無菌雙蒸水溶解，進行PCR鑒定及DNA測序分析。
構(gòu)建了含有蓖麻毒素中和抗體3E1輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測序分析、序列比對為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1、序列2)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體3E1，其制備方法和用途<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>638<212>DNA<213>
<400>1ccagatgacc cagtctccat cctcactgtc tgcatctctg ggaggcaaag tcaccatcac 60ttgcaaggca agccaagaca ttaaaaagta tatagcttgg taccaacaca agcctggaaa120aggtcctagg ctgctcatac attacacatc tacattacag ccaggcatcc catcaaggtt180cagtggaagt gggtctggga gagattattc cttcagcatc agcaacctgg agcctgaaga240tattgcaact tattattgtc tacagtatga taatctgtac acgttcggag gggggaccaa300gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga360gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga420catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg480gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa540ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catcaacttc600acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaat638<210>2<211>654<212>DNA<213>
<400>2tctggagctg agctgatgaa gcctggggcc tcagtgaaaa tttcctgcaa ggctactggc 60tacacattca gtagctactg gatagagtgg ataaagcaga ggcctggaca tggccttgag120tggattggag acattttacc tggaagtggt agtactaact acaatgagaa gttcaagggc180aaggccacat tcactgcaga tacatcctcc aacacagcct acatgcaact cagcagcctg240acatctgagg actctgccgt ctattactgt tcaagatctt tctactataa ttacgacggg300gcctactttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca360cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc420ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga480tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg540agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt600gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgt 654
<210>3<211>211<212>PRT<213>
<400>3Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr Ile Ala20 25 30Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr35 40 45Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly50 55 60Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp65 70 75 80Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val100 105 110Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys130 135 140Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp145 150 155 160Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu165 170 175Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu180 185 190Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg195 200 205Asn Glu Cys210<210>4<211>218<212>PRT
<213>
<400>4Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys1 5 10 15Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys20 25 30Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Leu Pro Gly35 40 45Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe50 55 60Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu65 70 75 80Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Phe Tyr Tyr85 90 95Asn Tyr Asp Gly Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala115 120 125Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu130 135 140Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly145 150 155 160Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp165 170 175Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro180 185 190Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys195 200 205Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys210 215<210>5<211>108<212>PRT<213>
<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr20 25 30Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105<210>6<211>122<212>PRT<213>
<400>6Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Ser Phe Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Ala Tyr Phe Ala Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120<210>7<211>12
<212>PRT<213>
<400>7Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp1 5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>
<400>8Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>
<400>9Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>
<400>10Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu1 5 10<210>11<211>17<212>PRT<213>
<400>11Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>12<211>13<212>PRT<213>
<400>12Ser Phe Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Ala Tyr Phe Ala Tyr1 5 10
<210>13<211>22<212>DNA<213>
<400>13aggtccagct tctcgagtca gg 22<210>14<211>22<212>DNA<213>
<400>14aggtccaact gctcgagtct gg 22<210>15<211>32<212>DNA<213>
<400>15ccagttccga gctccagatg acccagtctc ca 32<210>16<211>34<212>DNA<213>
<400>16gcgccgtcta gaattaacac tcattcctgt tgaa 34<210>17<211>30<212>DNA<213>
<400>17aggcttacta gtacaatccc tgggcacaat 30
權(quán)利要求
1.一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1，其特征在于輕、重鏈蛋白質(zhì)分子分別具有如序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述單克隆抗體3E1的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子編碼基因，其特征在于分別具有如序列表中序列1、序列2所示的核甘酸序列。
3.權(quán)利要求1所述單克隆抗體3E1的輕、重鏈蛋白質(zhì)分子中的可變區(qū)，其特征在于分別具有如序列表中序列5、序列6所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體3E1的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列7、序列8、序列9所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體3E1的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列10、序列11、序列12所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1的制備方法，包括如下步驟(1)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構(gòu)建；(2)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選和鑒定；(3)單克隆抗體3E1對小鼠的保護作用；(4)雜交瘤細胞3E1輕、重鏈基因的釣取；(5)單克隆抗體3E1輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定。
7.權(quán)利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體3E1，在制備蓖麻毒素檢測、疫苗以及蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體3E1，該單克隆抗體的制備方法及其在制備蓖麻毒素檢測試劑、疫苗以及診斷和治療蓖麻毒素或免疫毒素中毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從制備的蓖麻毒素半乳糖結(jié)合位點中和性單克隆抗體3E1雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)?；谏鲜鰡慰寺】贵w的輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達多種小分子基因工程抗體，基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/395GK1970573SQ20051012379
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日
發(fā)明者郭建巍, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所