本發(fā)明屬于微生物制藥領域，具體地說，涉及一株產(chǎn)生的抗HIV-1活性物質(zhì)的鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585及其用。
背景技術：
：HIV(HumanImmunodeficiencyVirus)病毒，中文全稱人類免疫缺陷病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。HIV病毒侵入宿主細胞后，會嚴重破壞宿主機體免疫功能，從而引起嚴重的機會性感染以致引起以惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜，即為獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)。首例艾滋病于1981年發(fā)現(xiàn)于美國，隨后開始在全球蔓延，嚴重威脅著人類的健康。HIV病毒可分為HIV-1型和HIV-2型，兩者基因組具有很大的差異，其中HIV-1是引起全球性艾滋病蔓延的主要病原體?；瘜W治療仍然是目前最重要的HIV-1治療手段。從1987年齊多夫定應用與抗HIV-1治療，至今已有25種藥物進入臨床應用。按藥物的作用機制分類，這些已上市藥物中主要是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。另外，還有1種整合酶抑制劑和2種病毒進入抑制劑。隨著抗HIV藥物的不斷研發(fā)應用，特別是依靠聯(lián)合藥物治療方式即高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)對艾滋病患者進行治療，已可以有效降低病毒載量，顯著延長患者生存時間，但是藥物的耐藥性、不良反應及患者的依從性等方面存在的問題常會引起臨床治療的失敗。因此，仍需要堅持開發(fā)不同結構類型，特別是不同作用機制的新型抗HIV-1藥物供臨床應用。微生物種類龐大，具有豐富類型的代謝產(chǎn)物，是尋找高效低毒的新抗HIV活性化合物和先導化合物的重要來源。通過建立相應篩選模型快速篩選出抗HIV活性微生物菌株，繼而從其代謝產(chǎn)物中尋找活性化合物或具有一定活性的化合物為先導,進行結構簡化和修飾,揭示作用機理和構效關系,是發(fā)現(xiàn)新抗HIV藥物的有效途徑。病毒的耐藥性是目前艾滋病藥物治療中最亟需解決的問題。HIV-1之所以能夠迅速產(chǎn)生針對現(xiàn)有臨床應用的抗病毒藥物的耐藥性，其主要根源在于這些藥物所針對的靶點都是病毒本身。而病原病毒天然就具有高變異的特點，在藥物的選擇壓力下，很容易引起病毒的迅速變異從而產(chǎn)生耐藥。因此，解決HIV-1的耐藥性問題的關鍵之一在于必須突破傳統(tǒng)的“以病原病毒本身為靶”的藥物發(fā)展模式。在眾多的潛在新靶點當中，HIV-1宿主限制因子(restrictionfactors)APOBEC3G(humanproteinapoliproteinBmRNA-editingenzyme-catalyticpolypeptide-like-3G，簡稱hA3G)以其高效抑制HIV-1復制的能力、獨特的抗病毒機制及廣譜的抗病毒活性，而成為極具發(fā)展?jié)摿Φ目笻IV-1藥物的新靶點。hA3G是在人的淋巴細胞中表達的一種RNA/DNA編輯酶，歸屬于APOBEC蛋白超家族。該家族至少有11個成員，其中包括AID、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A-H，以及APOBEC4。這些同源蛋白都含有高度保守的胞嘧啶脫氨基功能域(cytodinedeaminatingdomain,簡稱CD)，而且具有比較高的序列及結構相似性。該家族的多數(shù)成員都具有編輯核酸的功能，可以使mRNA上的胞嘧啶殘基脫氨形成尿嘧啶，或單鏈DNA上的脫氧胞嘧啶殘基脫氨形成脫氧尿嘧啶。hA3G不僅可以抑制包括HIV-1在內(nèi)的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的復制，而且對非逆轉(zhuǎn)錄病毒象乙肝病毒也有很好的抑制效果，具有廣譜的抗病毒活性。隨后的研究進一步發(fā)現(xiàn)，該家族的其他成員以及其他物種所編碼同源蛋白對不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒都具有不同程度的抑制能力，其中包括HIV-1、鼠白血病病毒(MuLV)、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒等。因此，hA3G和其他APOBEC3蛋白不僅僅是一類HIV-1限制因子，更是代表了一種全新的宿主天然免疫系統(tǒng)。作為病毒的拮抗手段，HIV-1的Vif蛋白可以特異性地結合hA3G，并與細胞蛋白Cu15,elonginsBandC,Rbx1相互作用，形成Skp1-cullin-F-box(SCF)復合物，通過泛素介導的降解途徑，導致hA3G的降解，從而阻斷了宿主細胞hA3G抗病毒系統(tǒng)對HIV-1病毒復制的抑制作用。鑒于HIV-1主要的靶細胞(外周血單核細胞、T-淋巴細胞、單核巨噬細胞)均為非允許性細胞，如果能特異而有效地阻斷VIF介導的降解途徑，宿主細胞就可以利用自身編碼的hA3G抑制HIV-1的復制。因此，阻斷Vif降解hA3G成為極具發(fā)展?jié)摿Φ目笻IV-1藥物的新靶點。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一株鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585，其發(fā)酵液的提取物可明顯抑制HIV-1的復制；從其菌絲體的提取物中分離得到的Surfactin類化合物具有抑制HIV-1復制的活性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一株鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585，其分離自云南省景洪勐?？h的土壤樣品中，已經(jīng)于2014年12月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCCNo.10265。所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585在ISP2培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)7天時，菌落多數(shù)呈白色至棕色，無可溶性色素生成。該菌株在培養(yǎng)基上形成高度分支的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，并產(chǎn)生松散的螺旋形孢子鏈，孢子表面多刺狀突起。本發(fā)明還提供了所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585在制備抗HIV-1病毒藥物中的應用。本發(fā)明還提供了所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585在制備Surfactin類化合物中的應用。本發(fā)明所述的鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585，其發(fā)酵液的提取物可明顯抑制HIV-1的復制；從其菌絲體的提取物中分離得到的Surfactin類化合物具有抑制HIV-1復制的活性。本發(fā)明還提供含有權利要求1所述的鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585的菌劑。本發(fā)明還提供了一株鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液的提取方法，包括如下步驟：1)將上述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585活化，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)采用本領域技術人員所掌握的常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；2)向步驟1)所得的發(fā)酵液中加入等體積的丙酮，超聲提取，離心，回收丙酮，冷凍干燥后即得。本發(fā)明所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液的提取方法中，在步驟1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度26～32℃，搖床震蕩培養(yǎng)4～8天。本發(fā)明所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液的提取方法中，在步驟2)中，所述超聲提取條件為：室溫，超聲提取20～30min。本發(fā)明還提供了一種利用鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585產(chǎn)生Surfactin類化合物的方法。所述Surfactin類化合物的結構通式(I)如下：其中，R選自鏈烷基，優(yōu)選-(CH2)6CH(CH3)CH2CH3、-(CH2)8CH(CH3)2、-(CH2)10CH3、-(CH2)8CH(CH3)CH2CH3。所述優(yōu)選的Surfactin類化合物的分子式分別為C51H89N7O13，C52H91N7O13，C52H91N7O13，C53H93N7O13，結構如式(II)所示：所述化合物1-4均為白色固體粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶劑中。本發(fā)明所述利用鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585產(chǎn)生Surfactin類化合物的方法包括如下步驟：1)將鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585活化，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)采用本領域技術人員所掌握的常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；2)將步驟1)所得的發(fā)酵液離心處理，得上清液和菌絲兩部分；3)所得菌絲用丙酮超聲提取，減壓回收丙酮后再用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯，得棕褐色浸膏；4)將所得浸膏洗脫分離，冷凍干燥即得目標化合物。所述化合物的制備方法中，步驟1)中，所述培養(yǎng)條件為：溫度26～32℃，搖床震蕩培養(yǎng)4～8天。所述化合物的制備方法中，步驟2)中，所述離心處理為本領域常規(guī)離心方法。所述化合物的制備方法中，步驟3)中，所述超聲提取條件為：室溫，超聲提取20～30min。所述化合物的制備方法中，步驟3)中，所述丙酮質(zhì)量百分比濃度為45-55％，優(yōu)選50％；所述萃取為采用等體積的乙酸乙酯萃取3～6h，再于40～50℃減壓濃縮回收乙酸乙酯。所述化合物的制備方法中，步驟4)中，所述洗脫分離過程為：先進行正相硅膠柱層析分離，再進行SephadexLH-20柱層析分離，最后利用半制備型反相C18柱分離。其中，所述正相硅膠柱層析分離過程中，洗脫液由石油醚與乙酸乙酯按體積比3:1～2:1混合而得，所得粗組分中富集較多目標化合物，優(yōu)選體積比為2:1時，富集的目標化合物最多。其中，所述SephadexLH-20柱層析分離過程中，洗脫液為甲醇、乙醇等。其中，所述半制備型反相C18柱分離過程中，洗脫液為水相含0.01％TFA(三氟乙酸)的90％甲醇-水，按色譜峰收集，冷凍干燥即得目標化合物。上述各分離過程的洗脫條件可采用本領域技術人員所熟知的各分離方法的常規(guī)洗脫條件，本發(fā)明在此不再贅述。采用上述方法得到的化合物經(jīng)熒光顯色和硫酸顯色，顯色不明顯，碘熏顯淡黃色，用氯仿-甲醇-水(體積比70:15:2)溶劑體系展開Rf值為0.3～0.4左右。本發(fā)明還提供上述Surfactin類化合物在制備抗HIV-1藥物中的應用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)從鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液中可獲得具有抗HIV-1活性的Surfactin類化合物，在20μM濃度下，該類化合物對VSVG/HIV假病毒的抑制達到84％以上，能夠有效抑制Vif對APOBEC3G(hA3G)的降解，其抗HIV作用機制不同于目前上市藥物，具有靶點新穎的特點，為抗HIV新藥的研發(fā)奠定了基礎，具有一定的市場前景。附圖說明圖1為鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵產(chǎn)生的活性化合物的制備流程圖。圖2為活性化合物1的1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)譜圖。圖3為活性化合物1的1C-NMR(150MHz，DMSO-d6)譜圖。圖4為活性化合物2的1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)譜圖。圖5為活性化合物2的1C-NMR(150MHz，DMSO-d6)譜圖。圖6為活性化合物3的1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)譜圖。圖7為活性化合物3的1C-NMR(150MHz，DMSO-d6)譜圖。圖8為活性化合物4的1H-NMR(600MHz，CD3OD)譜圖。圖9為活性化合物4的1C-NMR(150MHz,CD3OD)譜圖。圖10為實施例3中陽性對照藥MG132和Surfactin類化合物1-4抑制hA3G蛋白的降解的WesternBlot檢測圖。圖11為實施例3中Surfactin類化合物1-4對于vif與hA3G相互作用的影響的WesternBlot檢測圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585制備Surfactin類化合物的方法本發(fā)明的鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585，其分離自云南省景洪勐?？h的土壤樣品中，已經(jīng)于2014年12月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵政編碼為100101，保藏號為CGMCCNo.10265。如圖1所示，利用鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585制備Surfactin類化合物的方法，步驟如下：1)、所述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585的發(fā)酵菌種活化：配制斜面培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后，制斜面；將保存的鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4天；所述斜面培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖4g，麥芽膏10g，酵母膏4g，瓊脂14g，加水至終體積1L。發(fā)酵培養(yǎng)：挑取菌絲塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床震蕩培養(yǎng)2天，即為種子培養(yǎng)物；將100ml種子培養(yǎng)物接種到裝有1000ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)5天。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，玉米漿4g，黃豆餅粉10g，碳酸鈣4g，二氯化鈷(0.002％溶液)1mL，可溶性淀粉20g，加水至終體積1L，調(diào)pH至7.0-8.0。2)發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液離心，固液分離，得上清液和菌絲(即圖1中菌絲體)兩部分；3)、抗HIV活性化合物的提?。核镁z用質(zhì)量百分數(shù)50％丙酮在室溫下超聲(功率90％)提取兩次，每次30min，得圖1中丙酮提取物，減壓回收丙酮，再用等體積的乙酸乙酯萃取三次，得圖1中乙酸乙酯部位，于45℃減壓回收乙酸乙酯，得棕褐色浸膏；4)、抗HIV活性化合物的分離：將所得浸膏用正相硅膠柱層析分離，得圖1中目標組分1，其中洗脫液為石油醚與乙酸乙酯體積比2:1的混合液，按此體積比配制的洗脫液分離得到的組分中可富集到較多的目標化合物；接著進行SephadexLH-20柱層析分離，以甲醇為溶劑洗脫，得圖1中目標組分2；再進行半制備型反相C18柱分離，以水相含0.01％TFA的90％甲醇-水為流動相恒定洗脫，按色譜峰收集，冷凍干燥，即得Surfactin類目標化合物。上述各分離過程的洗脫條件采用本領域技術人員所熟知的各分離方法的常規(guī)洗脫條件。所得的Surfactin類化合物1-4均為白色固體粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶劑中，其分子式分別為C51H89N7O13，C52H91N7O13，C52H91N7O13，C53H93N7O13，結構如式(II)所示。其1H-NMR和1C-NMR譜圖如圖2-圖9所示。經(jīng)檢測，所得化合物熒光顯色和硫酸顯色不明顯，碘熏顯淡黃色，用氯仿-甲醇-水(體積比70:15:2)溶劑體系展開Rf值為0.3～0.4左右。對所得化合物進行HPLC檢測，檢測條件：Agilent1100series高效液相色譜儀，Alltech2000ES(Evap:110/Gas:2.4ml/min)檢測器，甲醇-水(0.01％TFA)(88:12)流動相，PhecdaC18(4.6mm*250mm,5μm)色譜柱，化合物的保留時間分別為：20.5min，26.8min，28.9min，34.5min。實施例2Surfactin類化合物1-4的抗HIV活性測試應用假病毒細胞水平藥理篩選模型測定活性化合物的抗HIV-1活性。1.藥理篩選模型的原理該高通量篩選模型應用重組技術，將表達HIV-1核心和VSV-G的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后生成以VSV-G外殼包裹HIV-1核心的VSVG/HIV假病毒顆粒，是以HIV-1復制為靶標的細胞水平篩選模型。HIV-1基因組去除了HIV-1的env，因此其單獨轉(zhuǎn)染后形成的病毒顆粒不能再次感染宿主細胞，可在常規(guī)實驗室進行操作；同時在nef基因的位置引入了熒光素酶報告基因，報告基因的活性可以反映假病毒在細胞中的復制水平。水泡性口膜炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)的受體在多種細胞內(nèi)廣泛存在，可以進入多種細胞系。將表達水泡性口膜炎病毒外殼蛋白的質(zhì)粒pCMV-VSV-G與質(zhì)粒pNL4-3Luc.R-E-共轉(zhuǎn)染至293T細胞后，可組裝成為VSVG/HIV假病毒。假病毒感染人T淋巴細胞SupT1細胞后，通過測定報告基因的表達可以間接反映對HIV復制水平。2.樣品制備化合物樣品：將實施例1中所得的Surfactin類化合物1-4分別溶解在DMSO中，制備成濃度為2mM的樣品溶液。3.樣品活性檢測將濃度為5×105/ml的SupT1細胞直接鋪96孔板(空白對照孔除外)，每孔200μL；按20μL/mL細胞比例加入病毒顆粒，分別向反應體系中添加各組分：A.空白對照組：在96孔板中加200μL空白培養(yǎng)基。B.陰性對照組(化合物)：向活性測定體系中加入2μlDMSO溶劑，反應體系的總體積為200μl。C.陽性對照組：向活性測定體系中加入2μlEFV(1μM)溶劑，反應體系的總體積為200μl。D.樣品實驗組(化合物)：取2μl用DMSO溶解的待測樣品加入到該活測定體系中，反應體系的總體積為200μl。將96板置于37℃孵育48h。取50μL細胞懸液，加入2X裂解液50μL，37℃孵育半個小時后，取其中5μL細胞裂解液加入40μL熒光素酶底物，在熒光檢測器上測定熒光素酶的活性(RLUs)。依照下述公式計算HIV抑制率：4.測試結果樣品濃度(μM)抑制率(％)Efavirenz(EFV)0.0199.9化合物12084.4化合物22089.6化合物32088.3化合物42094.6實施例3Surfactin類化合物1-4抑制Vif降解APOBEC3G(hA3G)1.所得的Surfactin類化合物1-4抑制Vif降解hA3G293T鋪板于6孔板，細胞濃度2.0×105個/ml。24h后，共轉(zhuǎn)hA3G(600ng)與vif(200ng)，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染12h后，加入陽性對照藥MG132((5μM))與所得的Surfactin類化合物1-4(各20μM)，作用36h后，收集細胞樣品，加入上樣緩沖液金屬浴加熱，保存于-20℃。測試樣品經(jīng)聚丙烯酰胺電泳和轉(zhuǎn)膜后，依次加入抗體。一抗HA抗體(hA3G)1:3000，vif抗體1:5000，二抗山羊抗兔1:3000。結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)陽性對照藥即MG132和篩選到的Surfactin類化合物1-4均能不同程度的抑制hA3G蛋白的降解(見圖10)。2.化合物對vif與hA3G相互作用的影響。293T鋪板于10cm培養(yǎng)皿，細胞濃度2.0×105個/ml。24h后，共轉(zhuǎn)hA3G(1800ng)與vif(600ng)，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染12h后，加入陽性對照藥MG132((5μM))與Surfactin類化合物1-4(各20μM)，作用36h后，5ml預冷PBS收集細胞樣品。。加入0.5mlNP-40裂解液裂解,冰上處理1h，每10min渦旋振蕩一次。4℃，12000g離心10min。取上清，即得到細胞總蛋白。取出40μl，加入10μl5×蛋白上樣緩沖液。金屬浴加熱得到Pre-IP蛋白樣品，儲存于-20℃或者-80℃。剩余蛋白樣品用上述NP-40裂解液補充體積到0.5ml，加入抗體anti-HA兔(1:200)，4℃混合孵育4h。加入20μlProteinA瓊脂糖珠，4℃混合孵育過夜。4℃，1000g離心5min，棄上清，1ml冰上預冷的PBS清洗4次。加入上樣緩沖液，金屬浴加熱，離心取上清，得到IP樣品，WesternBlot檢測。Westernblots抗體：一抗HA抗體兔(hA3G)1:3000，vif抗體1:5000，二抗山羊抗兔1:3000。結果發(fā)現(xiàn)，Surfactin類化合物1-4對于vif與hA3G相互作用無明顯影響(見圖11)實施例4鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液的提取方法及提取物的抗HIV-1活性測試1、鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585發(fā)酵液的提取方法1)、將上述鏈霉菌(Streptomycessp.)CPCC201585接種于斜面培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)4天；活化后挑取菌絲塊接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-30℃下?lián)u床震蕩培養(yǎng)5d。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，玉米漿4g，黃豆餅粉10g，碳酸鈣4g，二氯化鈷(0.002％溶液)1mL，可溶性淀粉20g，加水至終體積1L，調(diào)pH至7.0～8.0。2)向所得發(fā)酵液中加入等體積的質(zhì)量百分數(shù)50％丙酮，室溫下超聲提取兩次，每次20～30min，離心，上清液回收丙酮后再經(jīng)真空冷凍離心干燥12小時即得發(fā)酵液提取物。2、丙酮提取物的抗HIV-1活性測試將所得丙酮提取物溶解在DMSO中，制備成濃度為3mM的樣品溶液，按實施例2中的方法進行抗HIV活性測定，結果顯示丙酮提取物在4mg/mL濃度下的HIV-1抑制率為94.2％。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3