本發(fā)明涉及一株戊糖片球菌，尤其涉及一株對擬穴青蟹具有益生活性的戊糖片球菌G11及其篩選與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

擬穴青蟹(Scylla paramamosain) ，簡稱青蟹，屬廣鹽廣溫性的海水經(jīng)濟甲殼動物, 主要分布于我國東南沿海地區(qū), 是粵東特別是汕頭主要的海水養(yǎng)殖品種，具有生長快、個體大、適應(yīng)性和抗病能力強、耐干露、易運輸、肉味鮮美獨特、營養(yǎng)豐富等特點, 頗受國內(nèi)外生產(chǎn)者和消費者的青睞。近年來青蟹病害特別是病毒性?。ㄈ缜嘈窏U狀病毒病，呼腸孤樣病毒?。?、細(xì)菌性病和寄生蟲病等給我省乃至全國青蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。如自2004年秋冬以來，廣東青蟹養(yǎng)殖發(fā)生了前所未有的突發(fā)性病害，尤其是育肥過程中，膏蟹的死亡率在70 %以上。2005～2006年廣東南水青蟹育肥死亡率在90 %以上。2006、2007年的病害仍然嚴(yán)重，發(fā)病情況和發(fā)病時間與前2年基本相同。4年來，僅汕頭牛田洋圍墾區(qū)群眾青蟹養(yǎng)殖就減產(chǎn)了60％，估計每年經(jīng)濟損失達5000萬元以上。汕頭市青蟹養(yǎng)殖面積10萬余畝；其中牛田洋圍墾區(qū)3萬多畝。青蟹病害發(fā)病迅速、范圍廣，主要爆發(fā)于每年的9-11月份。

一般認(rèn)為，青蟹屬甲殼類無脊椎動物，不具備特異性免疫系統(tǒng)，其免疫以非特異性免疫為主，故運用疫苗防治青蟹病害的可靠性和廣泛性目前尚存在爭論。迄今為止，國內(nèi)外許多學(xué)者從青蟹病原、青蟹免疫防御機制和養(yǎng)殖環(huán)境等多方面進行了大量的研究和探索，在青蟹病害治療方面取得了許多進展，但是這些研究很難從根本上解決青蟹的病害問題。因此，尋找“以防為主”的生態(tài)學(xué)防治方法，被認(rèn)為是解決目前青蟹養(yǎng)殖疾病，提高青蟹品質(zhì)的一條有效途徑。

使用益生菌進行青蟹的生態(tài)健康養(yǎng)殖，是提高青蟹免疫力，預(yù)防青蟹病害特別是細(xì)菌性病害的有效途徑之一。目前已有報道的水產(chǎn)益生菌有乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌、硝化菌、光合菌等。乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等已作為餌料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)動物，起到很好的防治疾病和增進健康的作用。為陸生生物設(shè)計的微生態(tài)制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，不一定能盡快成為優(yōu)勢菌而進行微生態(tài)調(diào)節(jié)，而且，這些微生物很容易隨著時間而逐漸消亡。益生菌目前已應(yīng)用在對蝦、貝類及其他海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖動物上，但是適用于蝦貝的益生菌并不一定在青蟹養(yǎng)殖中起作用或作用效果不明顯。開發(fā)針對青蟹的益生菌種，對青蟹高密度及健康生態(tài)養(yǎng)殖模式意義重大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一株戊糖片球菌G11及其篩選培養(yǎng)與應(yīng)用解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。

為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術(shù)方案：

一株戊糖片球菌G11 Pediococcus pentosaceus G11，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢大學(xué)，保藏日期為2016年5月5日，其保藏編號為CCTCC NO：M2016248，分類命名為戊糖片球菌G11 Pediococcus pentosaceus G11。

進一步的，所述戊糖片球菌G11對復(fù)方新諾明和頭孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌和乙型鏈球菌均具有抑菌活性。所述戊糖片球菌G11對復(fù)方新諾明和頭孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌和乙型鏈球菌均具有抑菌活性。此外戊糖片球菌G11具備一定的抗逆性、產(chǎn)酶能力，無血細(xì)胞溶解性，對絕大多數(shù)抗生素?zé)o耐藥性，安全性高，分泌卵黃卵磷脂酶及酸性物質(zhì)（有機酸），革蘭氏陽性，pH耐受性高，在pH=4時仍有11.24%的活菌率。經(jīng)浸浴試驗驗證對宿主無害，而且還能夠提高機體的免疫力。

一種戊糖片球菌G11的篩選培養(yǎng)方法，主要包括以下步驟：

（1）菌株分離于養(yǎng)殖池塘的水樣；

（2）采用MRS培養(yǎng)基稀釋涂平板，28℃恒溫靜置培養(yǎng)24h；

（3）挑選單菌落，過夜搖菌液，將其加入涂布了副溶血弧菌平板上的牛津杯內(nèi)，選擇抑菌效果最好的菌株，并加甘油，-80℃保種。

進一步的，步驟（1）所述菌株分離于養(yǎng)殖池塘的水樣的方法為：采樣樣品用滅菌生理鹽水做梯度稀釋涂布MRS平板， 28℃培養(yǎng) 2-3 d，在MRS培養(yǎng)基上挑選單菌落，搖菌液，采用牛津杯法，檢測對副溶血弧菌抑菌效果最好的菌株，將其重新劃平板，分離純化保種。

一種戊糖片球菌G11在抑制副溶血弧菌生長中的用途。

一種戊糖片球菌G11在制備益生菌制劑中的用途。

一種益生菌制劑，含有上述的戊糖片球菌G11。

一種菌粉，采用上述戊糖片球菌G11制備的。

上述菌粉作為飼料添加劑的用途。

一種青蟹飼料，含有上述戊糖片球菌G11，所述戊糖片球菌G11活菌數(shù)為1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一株戊糖片球菌G11，該戊糖片球菌G11對復(fù)方新諾明和頭孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、金黃色葡萄球菌和乙型鏈球菌均具有抑菌活性。而且還能夠提高機體的免疫力，其應(yīng)用前景廣泛，可以將其應(yīng)用于益生菌制劑，也可以將其制成菌粉，作為飼料添加劑添加到飼料中，用來抑制動物體內(nèi)致病菌生長，降低動物死亡率，是一株值得開發(fā)的益生菌株。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菌株G11的掃描電鏡照片；

圖2為本發(fā)明菌株G11的系統(tǒng)進化樹；

圖3為本發(fā)明菌株G11對青蟹病原菌副溶血弧菌的抑菌效果圖片；

圖4為G11對嗜水氣單胞菌，溶藻弧菌，金黃色葡萄球菌，乙型鏈球菌牛津杯抑菌實驗圖；

圖5為本發(fā)明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激時血液中ALF基因的表達情況；

圖6為本發(fā)明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激時血液中LYS基因的表達情況；

圖7為本發(fā)明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激時血液中CAT基因的表達情況；

圖8為飼料中添加本發(fā)明菌株G11接受副溶血弧菌刺激后3天內(nèi)的累積成活率。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步地詳細(xì)描述。

實施例

1、菌株的分離篩選和鑒定

菌株分離于養(yǎng)殖池塘的水樣（該養(yǎng)殖池塘的青蟹生長良好，且無病害發(fā)生）。梯度稀釋涂布MRS平板，在MRS培養(yǎng)基上挑選單菌落，搖菌液，采用牛津杯法，檢測對副溶血弧菌抑菌效果最好的菌株，將其重新劃平板，分離純化保種。

為鑒定菌株采用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及測試菌株的部分生理生化反應(yīng)，掃描電鏡如圖1所示，初步確定該菌株為戊糖片球菌。

進一步通過16SrDNA序列分析采用的引物為通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR，克隆并測序。NCBI網(wǎng)站中Blast比對發(fā)現(xiàn)，其中一株與Pediococcus pentosaceus DSM 20336 同源性最高（99.74%），確定為Pediococcus pentosaceus G11（以下簡稱G11）。其系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

2、菌株的抑菌試驗

抑菌實驗：將菌株MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用牛津杯法，檢測對擬穴青蟹養(yǎng)殖的常見弧菌的抗菌效果。按照抑菌圈的大小評估其抑菌效果。從圖3可以看出，G11對副溶血弧菌有抑菌效果。從圖4可以看出G11對嗜水氣單胞菌，溶藻弧菌，金黃色葡萄球菌，乙型鏈球菌均具有顯著抑菌活性。

藥敏性試驗：所選的抗生素有：阿莫西林、青霉素、四環(huán)素、奧格門汀、恩諾沙星、萬古霉素、頭孢唑啉、米洛環(huán)素、多粘菌素B、頭孢芐氨、新霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢他啶、丁胺卡那霉素、頭孢呋辛、麥迪霉素、氨芐西林、慶大霉素、紅霉素、苯唑西林。G11只對復(fù)方新諾明和頭孢他啶耐受性高，具有很高的安全性。

飼料中添加G11飼養(yǎng)幼蟹實驗：青蟹養(yǎng)殖選用25±1g的幼蟹160只，將青蟹分為兩類（喂養(yǎng)添加戊糖片球菌G11 約1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g的飼料及無戊糖片球菌G11添加的飼料），每類設(shè)4組，每組20只幼蟹。分別飼喂飼料12天后，投喂添加了副溶血弧菌的飼料（濃度為1.99×10¹⁰ cfu/g；從牛田洋青蟹養(yǎng)殖區(qū)分離，本實驗室保存）3天。

1). 利用實時熒光PCR(real time PCR)方法檢測飼喂添加益生菌15天后受副溶血弧菌刺激的免疫應(yīng)激情況，從圖5、圖6和圖7中可以看出，發(fā)現(xiàn)處理組免疫基因抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor Precursor, ALF, FJ013272.1) 、過氧化氫酶（catalase, CAT, FJ774660.1）、溶菌酶（lysozyme, LYS, 304441008）表達顯著高于對照組。

2). 記錄3天內(nèi)的死亡情況。從圖8中可以看出，與對照組（正常飼料組）相比，喂養(yǎng)添加G11的量為1×10⁸ - 1×10⁹cfu/g飼料的青蟹組的3天內(nèi)的累積存活率顯著高于對照組(比空白對照組高31.94%)。

上述結(jié)果顯示，戊糖片球菌G11在擬穴青蟹的養(yǎng)殖中具有顯著的益生效應(yīng)，對青蟹養(yǎng)殖常見的副溶血弧菌預(yù)防效果顯著，是一株值得開發(fā)的益生菌株。

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕頭大學(xué)

<120> 一株戊糖片球菌G11及其篩選與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggtatggtc gggactctag agattagagt ttgatcctgg ctcaggatga acgctggcgg 60

cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact tccgttaatt gattatgacg tacttgtact 120

gattgagatt ttaacacgaa gtgagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 180

cagaagtagg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gtataacaga gaaaaccgca 240

tggttttctt ttaaaagatg gctctgctat cacttctgga tggacccgcg gcgtattagc 300

tagttggtga ggtaaaggct caccaaggca gtgatacgta gccgacctga gagggtaatc 360

ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 420

ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 480

taaagctctg ttgttaaaga agaacgtggg taagagtaac tgtttaccca gtgacggtat 540

ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 600

cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg tcttttaagt ctaatgtgaa 660

agccttcggc tcaaccgaag aagtgcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga 720

cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 780

aagcggctgt ctggtctgca actgacgctg agctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 840

agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg gtttccgccc 900

ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 960

actcaaaaga ttgacggggc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttatcg agctacgcga 1020

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<212> DNA

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