本發(fā)明涉及一種胰蛋白酶抑制劑，特別涉及一種利用海洋源抗生鏈霉菌制備產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的方法。

(二)

背景技術(shù)：

胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，是人體消化系統(tǒng)必不可少的成分。胰腺分泌的胰蛋白酶原進(jìn)入小腸，在腸激酶作用下水解形成胰蛋白酶，降解蛋白質(zhì)生成小分子肽類和氨基酸，提供人體必需的營(yíng)養(yǎng)。但是，當(dāng)胰蛋白酶原在胰腺內(nèi)被激活，會(huì)自行裂解胰腺導(dǎo)致胰腺炎的產(chǎn)生，造成不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷。胰蛋白酶除了分泌于胰腺中，還少量存在于皮膚、腎臟、肝臟、大腦和免疫系統(tǒng)細(xì)胞中。胰蛋白酶參與人體各種生理和病理過程，活性水平異常會(huì)導(dǎo)致各種疾病。

胰蛋白酶抑制劑可以與胰蛋白酶發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，從而調(diào)控酶的活性。目前，已知的胰蛋白酶抑制劑主要從大豆、動(dòng)物內(nèi)臟等動(dòng)植物中提取獲得，如：抑肽酶、烏司他丁等，它們具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)急性胰腺炎、肺氣腫、出血性和敗血性休克等疾病有獨(dú)特的療效。動(dòng)植物源胰蛋白酶抑制劑雖已應(yīng)用于臨床，并取得了良好的醫(yī)療效果，但存在諸多不足。首先，動(dòng)植物源胰蛋白酶抑制劑原料受限；其次，動(dòng)植物源胰蛋白酶抑制劑主要是分子量較大的蛋白質(zhì)，生物活性往往不穩(wěn)定，易受多種理化因素的作用而失活，如凝聚、降解、消旋化等，而且不耐酸堿、不耐高溫；另外，作為蛋白類藥物，其進(jìn)入人體后易產(chǎn)生首過消除效應(yīng)，藥效降低，給藥方式局限于靜脈、皮下注射，易產(chǎn)生免疫反應(yīng)，危及患者的生命健康。

微生物具繁殖速度快、產(chǎn)活性物質(zhì)能力強(qiáng)及種類多、生產(chǎn)成本低等多種優(yōu)勢(shì)，微生物活性代謝產(chǎn)物已成為當(dāng)前藥物開發(fā)的豐富資源，從微生物中開發(fā)胰蛋白酶抑制劑，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。海洋微生物作為一個(gè)巨大的尚待開發(fā)的資源越來越受到關(guān)注，已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。海洋面積占地球面積的70％以上，且海洋生境為一封閉、高壓、高鹽和低溫的特殊環(huán)境，這賦予海洋微生物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎和作用獨(dú)特代謝產(chǎn)物的能力。因此，海洋微生物已成為胰蛋白酶抑制劑開發(fā)的新資源。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是從海洋生境中篩選獲得產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的新菌株—抗生鏈霉菌FY57，以及提供一種利用抗生鏈霉菌FY57制備胰蛋白酶抑制劑的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株新菌株--抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC NO.12560，保藏日期為2016年5月30日，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。

本發(fā)明還提供一種所述的抗生鏈霉菌FY57在制備胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用，所述抑制劑源自抗生鏈霉菌FY57經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液離心后獲得的上清液。

進(jìn)一步，所述的抗生鏈霉菌FY57在制備胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用為：以抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵上清液為抑制劑，以胰蛋白酶為作用目標(biāo)酶，25～50℃，pH6～9，反應(yīng)5～30min，進(jìn)行抑制反應(yīng)；再加入Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA)，25～50℃，pH6～9，反應(yīng)5～60min，在410nm下測(cè)定BAPNA降解所釋放出對(duì)硝基苯胺的吸光值，測(cè)定抑制率。抑制劑活性越高，抑制率越高，對(duì)硝基苯胺的量越低，410nm下的吸光值越低。

所述的胰蛋白酶為牛胰蛋白酶、兔胰蛋白酶、豬胰蛋白酶、鼠胰蛋白酶、猴胰蛋白酶、雞胰蛋白酶、馬胰蛋白酶或犬胰蛋白酶，優(yōu)選牛胰蛋白酶。

所述抑制劑為抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵液中濕菌體濃度為10～50mg/L，所述胰蛋白酶濃度為20～200μg/mL，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為0.05～2.5mg濕菌體/mg胰蛋白酶，所述含濕菌體發(fā)酵液是指離心前的含濕菌體發(fā)酵液。

所述的發(fā)酵上清液按如下步驟制備：(1)斜面培養(yǎng)：將抗生鏈霉菌FY57接種于斜面培養(yǎng)基，20～37℃培養(yǎng)3～5d，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉5～30g/L，K₂HPO₄ 0.01～0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.005～0.02g/L，海鹽10～35g/L，瓊脂15～30g/L，溶劑為水，pH6～9；優(yōu)選所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.01g/L，海鹽25g/L，瓊脂25g/L，溶劑為水，pH7.5；(2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取1～3接種環(huán)菌種接種至種子培養(yǎng)基，20～37℃培養(yǎng)5～7d(25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5d)，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉5～30g/L，K₂HPO₄ 0.01～0.05g/L，MgSO₄·7H₂O0.01～0.05g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.005～0.02g/L，海鹽10～35g/L，溶劑為水，pH6～9；優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g/L，海鹽25g/L，溶劑為水，pH7.5；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度1～10％(優(yōu)選2％)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，20～37℃培養(yǎng)5～9d(優(yōu)選25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)7d)，獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液經(jīng)8000～12000rpm，離心5～30min后(優(yōu)選8000rpm，離心10min)，棄去沉淀，收集上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉5～30g/L，葡萄糖2～20g/L，胰蛋白胨2～20g/L，酵母粉2～20g/L，海鹽10～35g/L，CaCO₃ 0.5～5g/L，K₂HPO₄ 0.1～1g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.1～1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.1g/L，溶劑為水，pH6～8；優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，海鹽25g/L，CaCO₃ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，溶劑為水，pH7.5。

更進(jìn)一步，所述的抗生鏈霉菌FY57在產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用為：以抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵上清液為抑制劑源，以牛胰蛋白酶為作用目標(biāo)酶，37℃，pH8，反應(yīng)10min，再用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽法即BAPNA法測(cè)定抑制率。

本發(fā)明還涉及所述抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵培養(yǎng)獲得的上清液在制備胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。

所述的BAPNA法測(cè)定抑制率為：實(shí)驗(yàn)共設(shè)三組，分別是樣品組(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57的發(fā)酵上清液)、陰性對(duì)照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl緩沖液)和樣品對(duì)照組(100μL菌株FY57發(fā)酵上清液)；三組實(shí)驗(yàn)均在37℃下反應(yīng)10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反應(yīng)20min；然后加入100～300μL 30％醋酸終止反應(yīng)，在25～37℃下保溫10～60min；樣品對(duì)照組加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有實(shí)驗(yàn)組均在8000～12000rpm下離心5～30min，取上清；上清稀釋2～5倍，測(cè)定410nm下對(duì)硝基苯胺吸光值。

胰蛋白酶抑制率的計(jì)算：以胰蛋白酶水解BAPNA產(chǎn)生對(duì)硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，樣品對(duì)胰蛋白酶的抑制率通過以下公式計(jì)算獲得：

所述的BAPNA法測(cè)定菌株FY57發(fā)酵上清液對(duì)胰蛋白酶抑制率為90％左右。

本發(fā)明中菌株FY57所產(chǎn)生的胰蛋白酶抑制劑是被分泌到細(xì)胞外的，因此，抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心后去除菌體，獲得的上清液中含有抑制劑，即抑制劑源。所以本發(fā)明中以抗生鏈霉菌FY57發(fā)酵液離心后獲得的上清液而不是濕菌體來進(jìn)行抑制反應(yīng)。所述上清液的用量以離心前含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體的質(zhì)量來計(jì)。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一株新的產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的微生物菌種——抗生鏈霉菌FY57，利用該菌種生產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的方法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好(傳代4次的抑制率保持在80％以上)、環(huán)境友好等特點(diǎn)，所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑不但酸堿穩(wěn)定性(能耐受2～13的pH)和熱穩(wěn)定性好(能耐受100℃高溫)，而且其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性好(25℃下保藏20天仍保持50％左右抑制率)及活力高(稀釋度達(dá)55倍左右)，這些特點(diǎn)賦予抗生鏈霉菌FY57所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

(四)附圖說明

圖1為菌株FY57發(fā)酵液抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白的示意圖；

圖2為抗生鏈霉菌FY57的系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖3為pH對(duì)菌株FY57發(fā)酵液對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率影響；

圖4為溫度對(duì)菌株FY57發(fā)酵液對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率影響；

圖5為煮沸對(duì)菌株FY57發(fā)酵液對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率影響；

圖6為保藏條件對(duì)菌株FY57發(fā)酵液對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率影響；

圖7為稀釋倍數(shù)對(duì)菌株FY57發(fā)酵液對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率影響。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1:抗生鏈霉菌FY57菌種的篩選與鑒定

(1)菌種篩選

①菌種來源：從廈門鼓浪嶼(24.45°N，118.07°E)的海泥中分離篩選獲得；

②菌種分離篩選：從廈門鼓浪嶼海域(24.45°N，118.07°E)海平面50cm以下收集海泥，置于無菌的樣品瓶中帶至實(shí)驗(yàn)室，然后稱取10g海泥樣品，加入到90mL的無菌海水中，混勻后即是濃度為10^-1的樣品，然后按常規(guī)方法分別梯度稀釋成濃度為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的樣品；分別取不同濃度的樣品100μL涂布于海洋高氏固體培養(yǎng)基(終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g/L，海鹽25g/L，瓊脂25g/L，溶劑為水，pH7.5)平板上，于25℃下培養(yǎng)4d，獲得單菌落；然后將初篩獲得的單菌落在海洋高氏固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行兩次劃線復(fù)篩；再將復(fù)篩后獲得的單菌落(編號(hào)見表1)分別接種于50mL的海洋高氏液體培養(yǎng)基(終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.01g/L，海鹽25g/L，溶劑為水，pH7.5)中，于25℃、200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)4d，8000rpm離心5min收集發(fā)酵液上清，測(cè)定胰蛋白酶活性，篩得胰蛋白酶抑制劑產(chǎn)生菌。

③酪蛋白平板法篩選胰蛋白酶抑制劑產(chǎn)生菌

酪蛋白平板的制備(質(zhì)量組成)：1％的酪蛋白，2％的瓊脂，加入pH8.0磷酸鉀緩沖溶液中，加熱煮沸，邊攪拌邊加熱防止酪蛋白焦化。煮沸后，用玻璃棒將溶液上層的氣泡去除干凈，倒入平皿中(每個(gè)平板倒入體積為25mL)，靜置，冷卻凝固。用打孔器對(duì)稱地在平板上打4個(gè)直徑6mm的孔，用火焰固定。

產(chǎn)生菌所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的活性測(cè)定(BAPNA法)：100μg/mL牛胰蛋白酶溶液(溶劑為無菌水)和pH8.0磷酸鉀緩沖溶液預(yù)先放到37℃水浴5min，待用。將200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL菌株發(fā)酵上清液混合(以200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL pH8.0磷酸鉀緩沖溶液的混合液為陰性對(duì)照)加入酪蛋白平板的孔中，37℃下放置12h。在酪蛋白平板上加100μL三氯乙酸，涂布均勻，酪蛋白變性呈乳白色，牛胰蛋白酶的水解圈則是透明的，用尺子測(cè)量水解圈的直徑?？偣矞y(cè)定三批發(fā)酵液，每批三組平行。

胰蛋白酶抑制率的計(jì)算：胰蛋白酶抑制劑將導(dǎo)致胰蛋白酶水解酪蛋白的體積減少(水解圈變小)，抑制率通過以下公式計(jì)算獲得：

其中R₁為陰性對(duì)照水解圈的半徑/mm；R₂為樣品水解圈的半徑/mm；H為酪蛋白平板的高度/mm；

發(fā)現(xiàn)17株菌的發(fā)酵上清液能夠抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白，導(dǎo)致水解圈減小(比陰性對(duì)照小)(表1)，其中，菌株FY57對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率最高，詳見表1和圖1。

表1酪蛋白平板法篩選的菌株胰蛋白酶抑制率

(2)菌種FY57的鑒定

①菌種FY57的分子鑒定

基因組DNA的提取：取菌液1.5mL，移入1.5mL EP管中，12000rpm，4℃離心1min，棄上清。向沉淀中加入125μL濃度為0.5M EDTA(pH8.0)，1μL RNaseA(10mg/mL)，20μL溶菌酶(10mg/mL)，劇烈震蕩，37℃水浴30min。加70μL 10％SDS，5μL 10mg/mL蛋白酶K，振蕩搖勻，將EP管置于37℃水浴5min，然后55℃水浴30min。加70μL 5M NaCl，搖勻，冰浴30min。12000r/min、4℃離心20min。取上清，補(bǔ)水至500μL，加入一倍體積的Tris飽和酚，上下混勻，12000r/min、4℃離心10min。取上清，加兩倍體積的無水乙醇，-20℃下放置10min。12000r/min、4℃離心10min，棄上清。用體積濃度75％的乙醇水溶液清洗一遍，晾干后加入50μL ddH₂O，冰箱備用。

16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序：配制50μL的PCR反應(yīng)混合液，內(nèi)含：37μL無菌水，5μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液，4μL濃度為2.5mM的dNTPs，100nM上游引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，100nM下游引物1492R(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，1ng菌株FY57基因組DNA和1U Taq DNA聚合酶。然后將反應(yīng)混合液置于PCR儀上擴(kuò)增菌株FY57的16S rDNA，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5min，然后是30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性1min，55℃退火50s，72℃延伸90s，循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min，然后保存在4℃下。擴(kuò)增結(jié)束后，用濃度為1.0％瓊脂糖凝膠電泳確證PCR產(chǎn)物大小后，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1)為：CTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTCTTGCAGGCATCTGTGAGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGTCCTTCGGGATGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCAGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGG。

將菌株FY57的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，再用MEGA6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)菌株FY57與鏈霉菌屬中的一些菌相似性較高，尤其是與兩株抗生鏈霉菌Streptomyces antibioticus strain NBRC 12838和Streptomyces antibioticus strain 1022-257的親緣關(guān)系最近，16S rRNA基因的相似性為100％，因此，基本可以確定菌株FY57是一株抗生鏈霉菌。

②菌種FY57的形態(tài)特征和生理生化特征

根據(jù)《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》(伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè))中對(duì)抗生鏈霉菌鑒定要求和鑒定方法，分別測(cè)定菌株FY57的形態(tài)特征和生理生化特性，結(jié)果如下：

菌株FY57的菌絲體呈簇狀生長(zhǎng)，孢子為橢圓形或桿狀，表面光滑，孢子鏈長(zhǎng)而直；營(yíng)養(yǎng)菌絲體為肉色，氣生菌絲體為白色，孢子培養(yǎng)短時(shí)間后顯示灰色帶白斑，培養(yǎng)7d以后，孢子的顏色由灰色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S棕色略帶粉紫色。菌株FY57可水解明膠，明膠一開始液化非常慢，5d后速度變快并產(chǎn)生黑色素；可以胨化牛奶變透明，還可產(chǎn)生酪氨酸酶和H₂S。菌株FY57可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇和D-木糖，不利用蔗糖和棉子糖，能水解淀粉和纖維素。以上所有的菌落形態(tài)特征和生理生化特性與《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》中對(duì)抗生鏈霉菌的描述是一致的。

綜上，將菌株FY57被命名為抗生鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57。

實(shí)施例2胰蛋白酶抑制劑

(1)斜面培養(yǎng)：將抗生鏈霉菌FY57接種于斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5d，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g/L，海鹽25g/L，瓊脂25g/L，溶劑為水，pH7.5；

(2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌株接種至種子培養(yǎng)基，25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5d，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄ 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.01g/L，海鹽25g/L，溶劑為水，pH7.5；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度2％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)7d，獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液經(jīng)8000rpm，離心10min后，棄去沉淀，收集上清液，獲得所述胰蛋白酶抑制劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：可溶性淀粉10g/L，葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，海鹽25g/L，CaCO₃ 1g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，溶劑為水，pH7.5。

實(shí)施例3:BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率

將實(shí)施例2制備發(fā)酵上清液共設(shè)三組測(cè)定抑制率，分別是樣品組(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57發(fā)酵上清液)、陰性對(duì)照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl緩沖液)和樣品對(duì)照組(100μL菌株FY57發(fā)酵上清液)；三組實(shí)驗(yàn)均在37℃下反應(yīng)10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反應(yīng)20min；然后加入100μL體積濃度30％醋酸水溶液終止反應(yīng)，在37℃下保溫10min；樣品對(duì)照組加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有實(shí)驗(yàn)組均在10000rpm下離心10min，取上清；上清用無菌水稀釋3倍，測(cè)定410nm下對(duì)硝基苯胺吸光值。

胰蛋白酶抑制率的計(jì)算：以胰蛋白酶水解BAPNA產(chǎn)生對(duì)硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，樣品中抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制率通過以下公式計(jì)算獲得：

測(cè)得菌株FY57發(fā)酵上清液對(duì)胰蛋白酶抑制率為89.5％。

實(shí)施例4：菌株FY57產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑的遺傳穩(wěn)定性

將菌株FY57在海洋高氏固體培養(yǎng)基(終濃度組成：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.02g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g/L，海鹽25g/L，瓊脂25g/L，溶劑為水，pH7.5；)平板上連續(xù)傳代4次，每次傳代后均按實(shí)施例2所述方法制備菌株FY57發(fā)酵上清液，再按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果顯示，從第一代到第四代菌株FY57所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率分別為88.4％、89.5％、90.5％和89.3％，總體一直維持在90％左右，比較穩(wěn)定。

實(shí)施例5：菌株FY57的胰蛋白酶抑制劑的酸堿穩(wěn)定性

取12支50mL的離心管，分別加入按實(shí)施例2所制備的菌株FY57發(fā)酵上清液10mL，分別用1M NaOH和1M HCl調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13，以原發(fā)酵液pH8為參照，室溫放置6h后，再用NaOH和HCl調(diào)回原發(fā)酵液的pH8，按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果見圖3。從圖3可見，隨著pH從2上升至7，菌株FY57發(fā)酵上清液對(duì)胰蛋白酶抑制率隨之增加；pH從7上升至13，菌株FY57發(fā)酵上清液對(duì)胰蛋白酶抑制率隨之減小，可見，菌株FY57發(fā)酵上清液中胰蛋白酶抑制劑的最佳pH為7.0，抑制率高達(dá)98.9％；另外，在pH為2.0(強(qiáng)酸)和pH為13.0(強(qiáng)堿)條件下，抑制劑均保持一定的活性，抑制率為30％左右。綜上可見，菌株FY57所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑具有較強(qiáng)的耐酸、耐堿能力。

實(shí)施例6：菌株FY57的胰蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性

(1)取7支1.5mL的離心管，分別加入按實(shí)施例2所制備的菌株FY57發(fā)酵上清液1mL，然后在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中恒溫處理30min，接著再放至室溫(25℃)下30min，待恢復(fù)到原發(fā)酵液的溫度(25℃)后，按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果見圖4。從圖4可見，當(dāng)處理溫度維持在70℃以下，抑制劑的活性比較穩(wěn)定，對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率保持在80％以上；當(dāng)處理溫度升高至80℃以及90℃，抑制劑活性有所下降，但抑制率仍保持在50％左右；當(dāng)處理溫度升至100℃并處理30min，抑制活性基本喪失。

(2)取7支1.5mL的離心管，分別加入按實(shí)施例2所制備的菌株FY57發(fā)酵上清液1mL，然后在100℃水浴中恒溫處理0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，接著再放至室溫(25℃)下30min，待恢復(fù)到原發(fā)酵液的溫度(25℃)后，按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定菌株FY57發(fā)酵上清液中抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果見圖5。從圖5可見，整體上，隨著煮沸時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率隨之降低；當(dāng)處理時(shí)間在10min以內(nèi)，抑制率保持在60％左右；當(dāng)處理時(shí)間在25min以內(nèi)，抑制率仍然維持在30％左右。

綜上可見，菌株FY57所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑具有極強(qiáng)的耐高溫能力。

實(shí)施例7：菌株FY57的胰蛋白酶抑制劑的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將按實(shí)施例2所制備的菌株FY57發(fā)酵上清液分別在-20℃、4℃、25℃和50℃下保存，每隔一段時(shí)間取樣，按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果見圖6。從圖6可見，菌株FY57發(fā)酵上清液中抑制劑的最佳儲(chǔ)存溫度為-20℃，保存1個(gè)月內(nèi)抑制劑活性基本沒有變化；儲(chǔ)存溫度上升至4℃，1個(gè)月內(nèi)抑制劑活性也基本沒有變化；當(dāng)儲(chǔ)存溫度繼續(xù)上升至25℃，保存20天，菌株FY57發(fā)酵上清液中抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率仍然保持在50％左右；當(dāng)儲(chǔ)存溫度繼續(xù)上升至50℃，抑制劑活性下降比較快。綜上可見，菌株FY57所產(chǎn)胰蛋白酶抑制劑具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。儲(chǔ)藏溫度的上升有助于細(xì)菌滋生，從而降解抑制劑。對(duì)菌株FY57發(fā)酵液中抑制劑的分離純化有望進(jìn)一步提高抑制劑的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

實(shí)施例8：稀釋倍數(shù)對(duì)菌株FY57的胰蛋白酶抑制劑的抑制率影響

將按實(shí)施例2所制備的菌株FY57發(fā)酵上清液用pH8.0磷酸鉀緩沖液(pH與發(fā)酵液一致)分別稀釋5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍和55倍，按實(shí)施例3所述的BAPNA法測(cè)定抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率，結(jié)果見圖7。從圖7可見，整體上，隨著稀釋倍數(shù)的上升，菌株FY57發(fā)酵液中抑制劑對(duì)牛胰蛋白酶的抑制率逐漸下降；當(dāng)稀釋倍數(shù)為55時(shí)，抑制率接近為0，所以菌株FY57發(fā)酵液中抑制劑的最大稀釋倍數(shù)為55左右。由于測(cè)定的是未經(jīng)分離純化的發(fā)酵液的最大稀釋倍數(shù)，菌株FY57所產(chǎn)抑制劑的實(shí)際最大稀釋倍數(shù)有望遠(yuǎn)高于55。綜上可見，該胰蛋白酶抑制劑的效價(jià)是比較高的。