專利名稱：一種α1-抗胰蛋白酶藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種a l-抗胰蛋白酶藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
a l-抗胰蛋白酶(a 1-AT)屬于生物制品的范圍，是利用血漿分離的廢棄物即低溫乙醇分離法所獲得的組分IV為原料，采用生物學工藝或分離純化技術(shù)制備的生物活性制劑，在醫(yī)療急救、肺病搶救以及某些特定疾病的預(yù)防和治療上，有著其它藥品不可替代的重要作用。 a 1-抗胰蛋白酶(a l-Antitrypsin， a 1-AT或AAT)主要是肝細胞和單核細胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，分子量為52-54KD，PI值4.8，含有10% _12%糖，是人體內(nèi)血清蛋白溶解酶(如胰蛋白酶)的主要抑制物。在醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳中泳動于a 1區(qū)帶，是這一區(qū)帶的主要組分。健康人血漿中平均含量為3. 75±0. 61mg/ml，含量隨年齡而異，性別之間差異較小，體內(nèi)半衰期約4-6天。在正常情況下，人體血循環(huán)中90%以上的彈性蛋白酶等與al-AT以l : 1的比例結(jié)合成復(fù)合物而失活，同時被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞清除，但在如肺炎癥性疾病中，炎癥部位的某些細胞就會大量釋放彈性蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶，使蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致炎癥的加劇。1963年瑞典Eriksson首先發(fā)現(xiàn)a 1_抗胰蛋白酶缺乏者極易發(fā)生肺氣腫，其原因是蛋白酶抑制劑a l-AT缺乏，使蛋白酶活性升高，肺的結(jié)構(gòu)蛋白特別是彈性蛋白被降解，而彈性蛋白是細胞外基質(zhì)成分，其降解造成肺結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致肺氣腫。急性肺損傷時，由于大量的NE及胰蛋白酶等被釋放，引起體內(nèi)正常含量的al-AT的活性中心-蛋氨酸被氧自由基所氧化，使a l-AT失去對NE及胰蛋白酶的抑制作用，從而使蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，正常組織細胞受到損傷，炎癥進一步擴散。用a 1-AT治療肺和某些器官的急性炎癥性疾病在國外臨床已得到高度重視。
Gadek等應(yīng)用兩部沉淀過程制備臨床應(yīng)用的a l-AT濃縮制劑，a l-AT僅占濃縮制劑蛋白含量的5%。 Glaser等建立的獨特的a 1_AT制備工藝，采用二硫蘇糖醇處理結(jié)合硫酸銨沉淀，DEAE-纖維素層析，從Cohn's低溫乙醇工藝的廢棄組分IV_1中提純出純度70%的a 1-AT濃縮制劑。朱威等從Cohn組分IV中提純a l-AT，將Cohn組分FIV抽提液經(jīng)沉淀，超濾，離子交換及凝膠過濾后，提純a 1-AT ;巴氏滅活病毒，并考察其效果。用免疫單擴散，雙向交叉免疫電泳、SDS-PAGE及合成基質(zhì)法檢測a 1_AT蛋白活性，用區(qū)帶掃描法測其純度達90%以上。20世紀80年代中期，Coan等在a 1-AT的生產(chǎn)工藝中加入60°C 10h病毒滅活方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理后a l-AT的活性回收率在90X以上，從而使a l-AT濃縮制劑的工藝日益成熟。Chen等采用離子交換層析技術(shù)從Cohn's低溫乙醇分離法提取的組分IV-1中分離得到純化的al-AT濃縮制劑。國內(nèi)曾有研制al-AT制劑的報道，也是利用低溫乙醇法制備血漿蛋白制品過程中的組分IV-1為原料，經(jīng)過聚乙二醇沉淀、離子交換及凝膠層析、病毒滅活、除菌過濾、分裝凍干制成a l-AT制劑，但是收率較低，所得產(chǎn)品純度與活性均不高，不具有工業(yè)化生產(chǎn)的條件。目前，al-AT用于搶救和治療急性肺氣腫及肝病等疾病供不應(yīng)求，中國完全依賴進口 ，由于價格昂貴，很多病人得不到及時的治療，延誤了

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供了一種從人血漿分離的組分IV-1中純化安全有效的al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法。
其技術(shù)解決方案是 —種a 1-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，包括以下步驟 a選取組分IV-l溶于pH為8. 1 8. 5的0. 1M Tris+25mM NaCl緩沖液中，在2 l(TC溶解lh，然后升溫至34 4(TC恒溫60 80分鐘，調(diào)整pH至6. 8，再降溫至2 l(TC ，向緩沖液中加入PEG，調(diào)整pH至5 5. 2，攪拌20 40分鐘，在2 8"靜置一段時間，沉淀后提取上層清液； b對上層清液依次進行S/D病毒滅活、陰離子交換層析，得到a 1-抗胰蛋白酶洗脫液； c對步驟b中所獲取的a 1-抗胰蛋白酶洗脫液進行超濾得到濾液l，接著對濾液1進行分子篩層析，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液； d對步驟c中所獲取的流出液進行超濾、濃縮得到濃縮液，選取適量濃縮液，配制pH為6. 6 7. 4的20mM磷酸緩沖液，接著進行DV20納米膜過濾，得到濾液2，濾液2經(jīng)分裝、冷凍干燥得到al-抗胰蛋白酶成品。 上述步驟a中，所述PEG的分子量為4000，濃度為10%。 上述步驟b中，陰離子交換層析按以下步驟進行層析柱用pH為7. 0的0. 03MNaCl緩沖液平衡，然后將S/D病毒滅活后的上層清液以160cm/h的速度上柱，再用pH為4. 5 7. 0的0. 025 0. 05M NaCl-磷酸緩沖液洗滌，最后用pH為8. 0的0. 5M NaCl緩沖液洗脫。 上述步驟c中，所述分子篩層析步驟中的平衡過程，選用pH為7. 0的0. 05MTris-HCl緩沖液。 上述步驟d中，所述磷酸緩沖液還含有50mM氯化鈉、2 5%甘露醇及保護劑，保護劑為糖、氨基酸、蛋白或其組合物。 上述步驟d中，超濾過程選用分子量為10KD的濾膜，然后對超濾所得濾液進行3倍濃縮，濃縮液中a 1-抗胰蛋白酶的濃度為20 40mg/ml。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是 1、采用血漿分離的廢棄物，組分IV-1為原料，提取有高度治療價值的a 1-抗胰蛋
白酶，大大提高了寶貴的人血漿的綜合利用能力，降低成本，提高了經(jīng)濟效益。
2、利用AKTA系統(tǒng)對目的蛋白純化過程進行了分步洗脫和梯度洗脫的大量正交實驗研究，最終確立了以離子交換為主的大規(guī)模蛋白提純工藝，該工藝操作簡便，縮短了生產(chǎn)時間，提高了效率與收率，收率^ 70%，比活> 0.8，所得產(chǎn)品具有高純度，純度^ 95%。
3、該提純工藝中采用滲透壓休克法，目的蛋白溶解在低滲緩沖溶液中，激活a 1-抗胰蛋白酶，以及后續(xù)步驟中調(diào)節(jié)蛋白溶解液pH為6. 8，以保證蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。另外，采用冷凍干燥法防止高溫條件下al-抗胰蛋白酶失活，確保獲得的產(chǎn)品具有高活性。
4、采用兩步病毒滅活工藝，即S/D法(有機溶劑與去污劑去除病毒的方法)與納米膜過濾除病毒相結(jié)合的方法，同時純化步驟中的PEG沉淀也有去除病毒的作用，確保了產(chǎn)品的安全性。
具體實施例方式
下面通過具體實施例來詳細說明本發(fā)明，有必要指出的是，以下實施例只用于對
本發(fā)明的進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例1 本發(fā)明中選用常規(guī)工業(yè)化血漿蛋白純化過程中的Cohn氏組分IV-1作為提取a l-抗胰蛋白酶的原料，將其溶于24倍體積的pH為8. 1的O. 1M Tris(三羥甲基氨基甲烷)+25mM NaCl緩沖液中，在1(TC溶解lh，升溫，在4(TC加熱60分鐘，用以激活a 1-抗胰蛋白酶。然后調(diào)整溶液pH至6. 8，以保證a 1-抗胰蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，再將溶液冷卻到10°C，向冷卻后的溶液中加入分子量為4000，濃度為10%的聚乙二醇(PEG)，然后將其pH值調(diào)整到5. 2，攪拌40分鐘，去除組分IV-1中雜蛋白及病毒，在『C靜置一段時間，使之充分沉淀后提取出上層清液。由于PEG是非離子沉淀劑，而且作用溫和，所以不易使a l-抗胰蛋白酶的活性損失。對上清液進行S/D法病毒滅活，也就是向上層清液中加入有機溶劑和去污劑，有機溶劑優(yōu)選磷酸三丁酯，去污劑優(yōu)選Triton X-100或吐溫80。然后進行陰離子交換層析，陰離子交換層析所用原料為DEAE-S印harose Fast Flow凝膠，另外陰離子交換層析分平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟，其中層析柱用PH值7. 0、0. 03M的NaCl-磷酸緩沖液平衡，用量約4V(V :流出體積對總體積之比)，然后將S/D病毒滅活后的上層清液以160cm/h的速度上柱，用量為7V，再用pH為4. 5的0. 05M NaCl-磷酸緩沖液洗滌，用量為8V，洗滌的目的主要是除去雜蛋白、PEG、有機溶劑與去污劑等物質(zhì)，純化了 a 1-抗胰蛋白酶，最后用pH為8. 0的0. 5麗aCl緩沖液洗脫，用量為3V，得到a 1_抗胰蛋白酶洗脫液，其它結(jié)合在層析介質(zhì)上al-抗胰蛋白酶用2M的NaCl-磷酸緩沖液洗脫并使交換介質(zhì)再生。對a 1-抗胰蛋白酶洗脫液進行超濾膜過濾得到濾液l，超濾膜可選用分子量為10KD的濾膜，然后對濾液1進行分子篩層析，分子篩層析同樣分為平衡、洗脫等步驟，其中我們選用PH為7. 0的0. 05M Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，然后加樣，樣品體積為床體積的5% ，再用pH8. 0的0. 1M Tris-HCl緩沖液分步洗脫，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液；采用分子量為10KD濾膜的濾器超濾除去流出液中的糖及檸檬酸鈉等雜質(zhì)，然后進行濃縮，以濃縮到a 1-抗胰蛋白酶的濃度為20 40mg/ml為宜，濃縮次數(shù)優(yōu)選3次，接著采用DV20納米膜對濃縮液進行過濾，得到濾液2。為了防止蛋白變性而導(dǎo)致活性損失，濃縮液在過濾前可加入適量的保護劑、氯化鈉及甘露醇等物質(zhì)配制得到pH為7. 4的20mM磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液中含有氯化鈉50慮、甘露醇2%。所加入的保護劑可以為糖、氨基酸、蛋白或者其混合物。將濾液2分裝，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機中進行真空低溫升華去除其中的水份，得到a 1-抗胰蛋白酶成品。經(jīng)檢測一次干燥工藝除水率為90%，再經(jīng)第二次干燥后除水率達到98%。所得a 1-抗胰蛋白酶成品的純度為95%，回收率為70%，比活性為0. 85。
實施例2 選取適量Cohn氏組分IV-l，將其溶于24倍體積的pH為8. 5的0. 1M Tris+25mMNaCl緩沖液中，在2t:溶解lh，升溫，在34t:加熱80分鐘。然后調(diào)整溶液pH至6. 8，以保證a l-抗胰蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，再將溶液冷卻到2°C，向冷卻后的溶液中加入分子量為4000，濃度為10%的聚乙二醇(PEG)，然后將其pH值調(diào)整到5.0，攪拌20分鐘，在8t:靜置一段時間，使之充分沉淀后提取出上層清液。向上層清液中加入磷酸三丁酯和TritonX-100，然后進行陰離子交換層析，陰離子交換層析所用原料為DEAE-S印harose Fast Flow凝膠，另外陰離子交換層析分平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟，其中層析柱用PH值7. 0、0. 03M的NaCl-磷酸緩沖液平衡，用量約4V(V :流出體積對總體積之比)，然后用S/D病毒滅活后的上層清液以160cm/h的速度沖洗，用量為7V，再用pH為7. 0的0. 025M NaCl-磷酸緩沖液洗滌，用量為8V，最后用pH為8. 0的0. 5M NaCl緩沖液洗脫，用量為3V，得到a 1-抗胰蛋白酶洗脫液，其它結(jié)合在層析介質(zhì)上a 1-抗胰蛋白酶用2M的NaCl-磷酸緩沖液洗脫并使交換介質(zhì)再生。對al-抗胰蛋白酶洗脫液進行超濾膜過濾得到濾液l，超濾膜可選用分子量為10KD的濾膜，然后對濾液1進行分子篩層析，分子篩層析同樣分為平衡、洗脫等步驟，其中我們選用pH為7. 0的0. 05M Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，然后加樣，樣品體積為床體積的2%，再用pH8. 0的0. 1M Tris-HCl緩沖液分步洗脫，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液；采用分子量為IOKD濾膜的濾器超濾除去流出液中的糖及檸檬酸鈉等雜質(zhì)，然后濃縮到a 1-抗胰蛋白酶的濃度為40mg/ml，接著采用DV20納米膜對濃縮液進行過濾，得到濾液2。為了防止蛋白變性而導(dǎo)致活性損失，濃縮液在過濾前可加入適量的氨基酸、氯化鈉及甘露醇等物質(zhì)配制得到pH為6. 6的20mM磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液中含有氯化鈉50mM、甘露醇5%。將濾液2分裝，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機中進行真空低溫升華去除其中的水份，得到a 1-抗胰蛋白酶成品。經(jīng)檢測一次干燥工藝除水率為90%，再經(jīng)第二次干燥后除水率達到97%。所得a 1_抗胰蛋白酶成品的純度為96%，回收率為80%，比活性為0.8。
實施例3 選取適量Cohn氏組分IV_1，將其溶于24倍體積的pH為8. 3的0. 1M Tris+25mMNaCl緩沖液中，在6t:溶解lh，升溫，在36t:加熱70分鐘。然后調(diào)整溶液pH至6. 8，以保證a l-抗胰蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，再將溶液冷卻到6°C，向冷卻后的溶液中加入分子量為4000，濃度為10%的聚乙二醇(PEG)，然后將其pH值調(diào)整到5. 1，攪拌30分鐘，在5t:靜置一段時間，使之充分沉淀后提取出上層清液。向上層清液中加入磷酸三丁酯和吐溫80，然后進行陰離子交換層析，陰離子交換層析所用原料為DEAE-S印harose Fast Flow凝膠，另外陰離子交換層析分平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟，其中層析柱用pH值7. 0、0. 03M的NaCl-磷酸緩沖液平衡，用量約4V(V :流出體積對總體積之比)，然后用S/D病毒滅活后的上層清液以160cm/h的速度沖洗，用量為7V，再用pH為5. 5的0. 04M NaCl-磷酸緩沖液洗滌，用量為8V，最后用pH為8.0的0.5M NaCl緩沖液洗脫，用量為3V，得到al-抗胰蛋白酶洗脫液，其它結(jié)合在層析介質(zhì)上a 1-抗胰蛋白酶用2M的NaCl-磷酸緩沖液洗脫并使交換介質(zhì)再生。對a 1-抗胰蛋白酶洗脫液進行超濾膜過濾得到濾液l，超濾膜可選用分子量為10KD的濾膜，然后對濾液1進行分子篩層析，分子篩層析同樣分為平衡、洗脫等步驟，其中我們選用pH為7. 0的0. 05M Tris-HCl緩沖液平衡層析柱，然后加樣，樣品體積為床體積的2% ，再用0. 1M pH為8. OTris-HCl緩沖液分步洗脫，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液；采用分子量為IOKD濾膜的濾器超濾除去流出液中的糖及檸檬酸鈉等雜質(zhì)，然后濃縮到a 1-抗胰蛋白酶的濃度為20mg/ml，接著采用DV20納米膜對濃縮液進行過濾，得到濾液2。為了防止蛋白變性而導(dǎo)致活性損失，濃縮液在過濾前可加入適量的氨基酸、氯化鈉及甘露醇等物質(zhì)配制得到pH為7. 0的20mM磷酸緩沖液，其中磷酸緩沖液中含有氯化鈉50mM、甘露醇4% 。將濾液2分裝，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機中進行真空低溫升華去除其中的水份，得到a l-抗胰蛋白酶成品。經(jīng)檢測一次干燥工藝除水率為90%，再經(jīng)第二次干燥后除水率達到98%。所得a 1_抗胰蛋白酶成品的純度為97%，回收率為90%，比活性為0.85。
權(quán)利要求
一種α1-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征是包括以下步驟a選取組分IV-1溶于pH為8.1～8.5的0.1MTris+25mMNaCl緩沖液中，在2～10℃溶解1h，然后升溫至34～40℃恒溫60～80分鐘，調(diào)整pH至6.8，再降溫至2～10℃，向緩沖液中加入PEG，調(diào)整pH至5～5.2，攪拌20～40分鐘，在2～8℃靜置一段時間，沉淀后提取上層清液；b對上層清液依次進行S/D病毒滅活、陰離子交換層析，得到α1-抗胰蛋白酶洗脫液；c對步驟b中所獲取的α1-抗胰蛋白酶洗脫液進行超濾得到濾液1，接著對濾液1進行分子篩層析，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液；d對步驟c中所獲取的流出液進行超濾、濃縮得到濃縮液，選取適量濃縮液，配制pH為6.6～7.4的20mM磷酸緩沖液，接著進行DV20納米膜過濾，得到濾液2，濾液2經(jīng)分裝、冷凍干燥得到α1-抗胰蛋白酶成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征在于步驟a 中，所述PEG的分子量為4000，濃度為10%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征在于步 驟b中，所述陰離子交換層析按以下步驟進行層析柱用pH為7. 0的0. 03M NaCl緩沖液 平衡，然后用S/D病毒滅活后的上層清液以160cm/h的速度沖洗，再用pH為4. 5 7. 0的 0. 025 0. 05MNaCl-磷酸緩沖液洗滌，最后用pH為8. 0的0. 5M NaCl緩沖液洗脫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征在于步驟c 中，所述分子篩層析步驟中的平衡過程，選用pH為7. 0的0. 05M Tris-HCl緩沖液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征在于步驟d 中，所述磷酸緩沖液還含有50mM氯化鈉、2 5%甘露醇及保護劑，保護劑為糖、氨基酸、蛋 白或其組合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種al-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，其特征在于步驟 d中，超濾過程選用分子量為10KD的濾膜，然后對超濾所得濾液進行3倍濃縮，濃縮液中 a 1-抗胰蛋白酶的濃度為20 40mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種α1-抗胰蛋白酶藥物的制備方法，具體涉及從人血漿分離的組分IV-1中純化α1-抗胰蛋白酶藥物。本發(fā)明包括以下步驟將組分IV-1溶于緩沖液中，加入PEG，沉淀后提取上層清液，在對上層清液進行S/D法病毒滅活、陰離子交換層析得到α1-抗胰蛋白酶洗脫液，接著對獲取的α1-抗胰蛋白酶洗脫液超濾、分子篩層析，收集活性峰值范圍內(nèi)的流出液，然后對流出液進行超濾、濃縮、DV20納米膜過濾，所得濾液經(jīng)分裝、冷凍干燥得到α1-抗胰蛋白酶成品。本發(fā)明操作簡便，縮短了生產(chǎn)時間，提高了效率與收率，收率≥70％，比活≥0.8，所得產(chǎn)品具有高純度，純度≥95％。
文檔編號A61P11/00GK101747432SQ20091025583
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者喬福鋒, 仲立軍, 師秀梅, 龐廣禮, 菅長勇, 邵玉娟, 馬山 申請人:山東泰邦生物制品有限公司