專利名稱：：魚用浸泡疫苗多組合佐劑及其應(yīng)用和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋生物疾病免疫防治技術(shù)，具體是魚用浸泡疫苗免疫多組合佐劑及其應(yīng)用和使用方法。
背景技術(shù)：
：我國養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量據(jù)世界首位，但魚類的疾病防治技術(shù)研發(fā)速度較慢，開發(fā)的漁用疾病防治產(chǎn)品不能滿足生產(chǎn)的需求，特別在漁用疫苗開發(fā)與應(yīng)用方面，目前可供漁業(yè)生產(chǎn)上選擇使用的產(chǎn)品不多。因此養(yǎng)殖中魚類細(xì)菌性疾病治療過多依靠投喂抗生素，其結(jié)果是長期的應(yīng)用抗生素不僅會降低水產(chǎn)品的質(zhì)量，還會導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強，給以后的疾病控制增加難度。國外在魚類疾病控制方面已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡用疫苗及口服疫苗等。國內(nèi)的魚用疫苗產(chǎn)品制劑種類不多，在魚類疫苗研究方面多側(cè)重于注射用疫苗。魚類注射用疫苗對疾病預(yù)防效果明顯，但注射免疫工作量大、工作效率低，且會對魚體造成傷害。而魚類浸泡用疫苗不存在上述缺點，但單純的使用疫苗浸泡效果不佳。目前，有關(guān)魚類浸泡免疫用疫苗產(chǎn)品因受浸泡免疫效果較差的限制，開發(fā)的產(chǎn)品不多。國內(nèi)已開發(fā)的魚類浸泡疫苗佐劑有莨菪堿、葡聚糖、MS1312，試驗證實，使用后免疫保護率均不理想。而國外的魚類浸泡免疫佐劑多為保密配方?；谝陨犀F(xiàn)狀，我國的魚類浸泡疫苗研發(fā)速度處于緩慢發(fā)展?fàn)顟B(tài)，限制阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此提供魚類浸泡疫苗佐劑，提高魚類浸泡疫苗效果，對推動水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗制劑產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展是非常必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為魚類浸泡用疫苗提供一種高效的多組合免疫佐劑。魚類選用浸泡疫苗免疫，不僅操作方便節(jié)省時間，而且相對于注射免疫對魚的損傷小，因此魚類選用浸泡疫苗免疫是一種最佳的免疫方案。但選用浸泡疫苗免疫時，在通常不加浸泡疫苗佐劑或特異免疫增強劑的情況下，魚體僅僅通過鰓部接觸疫苗抗原，身體表面其他的可以激發(fā)免疫反應(yīng)的部位多被體表的粘液所覆蓋，導(dǎo)致可呈遞疫苗抗原的細(xì)胞不能有效接觸到疫苗抗原，因此使用能夠去除魚體粘液的佐劑成分，可以提高魚類浸泡疫苗免疫的效果。研究經(jīng)過試驗研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸(簡稱NAC)、曲拉通X-100(即TRIT0NX-100)具有溶解魚體表粘液的能力，皂角苷具有提高魚類粘液免疫力與細(xì)胞免疫的功效，而消旋山莨菪堿(又稱654-2)可使魚體肌肉松弛，易于疫苗抗原向體內(nèi)的滲入。四種佐劑通過組合既解決了魚體粘液阻止疫苗抗原接觸魚體抗原呈遞細(xì)胞的問題，又通過皂角苷提高了魚體粘液免疫與細(xì)胞免疫力，同時654-2使魚體肌肉松弛，加強了抗原滲透魚體的效果。該四種佐劑組合有效提高了魚類浸泡疫苗免疫效果，使用證實具備佐劑的功能，且安全試驗證實在使用濃度范圍內(nèi)對魚類及環(huán)境安全。因此確定NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2佐劑組合為高效魚用浸泡疫苗免疫多組合佐劑。因此，本發(fā)明魚用浸泡疫苗多組合佐劑包括NAC、TRITONX-100、皂角苷和654_2，其中NAC、TRIT0NX-100、皂角苷和654-2的使用濃度范圍分別為0.l_10mg/L、0.l-10mg/L、0.l-50mg/L、l-60mg/L。本發(fā)明的濃度分別在0.l-10mg/L、0.l_10mg/L、0.1-50mg/L、l_60mg/L的NAC、TRIT0NX-100、皂角苷和654-2免疫多組合佐劑，應(yīng)用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協(xié)同作用達到高效免疫效果。本發(fā)明的使用方法如下(1)首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重應(yīng)在每尾2g以上；(2)將待免疫的魚移入濃度范圍均為0.l-10mg/1的NAC、TRITONX-100混合養(yǎng)殖用水溶液中，預(yù)浸泡l-20min，之后加入濃度0.l-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡l-20min，再向疫苗浸泡液中加入濃度l-60mg/L的654-2待l-10min即完成免疫。本發(fā)明的積極效果在于用NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2多組合制劑作為疫苗組合佐劑后可以顯著提高疫苗的免疫效果，效果顯著好于單一佐劑；使用方法簡便，成本較低，使用安全，對魚的存活率與生長速度沒有影響，而且不需要額外的設(shè)施與工序，對環(huán)境及操作人員同樣無害。具體實施例方式本發(fā)明魚用浸泡疫苗多組合佐劑其特征在于作為魚類浸泡疫苗的多組合佐劑包括，NAC、TRIT0NX-100、皂角苷和654-2，其中NAC、TRIT0NX-100、皂角苷和654-2的使用濃度范圍分別為0.l-10mg/L、0.l-10mg/L、0.l-50mg/L、l-60mg/L。上述的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷、消旋山莨菪堿的純度優(yōu)于或相當(dāng)于化學(xué)純級。本發(fā)明的濃度分別在0.l-10mg/L、0.1-10mg/L、0.l-50mg/L、l-60mg/L的NAC、TRIT0NX-100、皂角苷和654-2免疫多組合佐劑，應(yīng)用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協(xié)同作用達到高效免疫效果。本發(fā)明的使用方法如下(1)首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重應(yīng)在每尾2g以上；(2)將待免疫的魚移入濃度范圍均為0.l-10mg/1的NAC、TRIT0NX-100混合養(yǎng)殖用水溶液中，預(yù)浸泡l-20min，之后加入濃度0.l-50mg/L的皂角苷及待用疫苗，浸泡免疫l-20min，再向疫苗浸泡液中加入濃度l-60mg/L的654-2維持l-10min即完成免疫。為了保證免疫效果，浸泡時水中溶解氧保持7mg/L以上，溫度變化控制在士2t:內(nèi)。完成浸泡免疫后，小心將魚移入養(yǎng)殖池進行養(yǎng)殖即可。本發(fā)明中NAC、TRIT0N-100的使用濃度范圍均為0.1-10mg/L，浸泡時間均為3-50min;皂角苷的濃度范圍為0.l-50mg/L，浸泡時間2-30min;645-2的濃度范圍為l-60mg/L，浸泡時間l-10min。并且適用于海水魚類、淡水魚類及半咸水魚類。以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1:應(yīng)用本發(fā)明的濃度分別為0.lmg/L、0.lmg/L、50mg/L、lmg/L的NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2多組合佐劑和滅活鰻弧菌(Vibrio.Anguillarum)疫苗對牙鲆浸泡免疫1材料(1)試驗用魚及養(yǎng)殖管理選用體重5g的健康牙鲆，試驗前暫養(yǎng)1周，試驗用海水穩(wěn)定20-23°C，PH8.1-8.2，鹽度30，試驗期間投喂配合餌料，日投喂2次，24小時連續(xù)充氣，流水養(yǎng)殖。(2)疫苗制備將V.anguillarum接種至2216E液體培養(yǎng)基，28。C培養(yǎng)24h;4t:下4000rpm離心20min，收集菌體；將收集的菌體置于滅菌的PBS，pH7.2中，制成1.0X108cells/mL的弧菌懸液，0.5X甲醛28t:下滅活48h后為試驗用疫苗，4t:儲存；同時將滅活后的菌體接種于TSB固體平板，置2『C下恒溫培養(yǎng)24h、48h，確定無菌落長出。(3)浸泡免疫佐劑NAC、TRIT0NX-100、皂角苷、654-2，使用濃度分別為0.lmg/L、0.lmg/L、50mg/L、lmg/L。2試驗方法(1)試驗分組試驗設(shè)注射免疫組、無佐劑疫苗浸泡免疫組、佐劑+疫苗浸泡免疫組、注射空白對照組，浸泡空白對照組，每組設(shè)三個平行，每組3X30尾魚。(2)免疫方法試驗魚暫養(yǎng)1周后，注射免疫組每尾魚腹腔注射濃度為1.0X108cells/mL的V.anguillarum疫苗0.lml;無佐劑疫苗浸泡免疫組用海水配制疫苗濃度1.OX107cells/mL，浸泡llmin;佐劑+疫苗浸泡免疫組為用NAC、TRITONX-100的混合溶液浸泡待免魚20min，之后加入疫苗及皂角苷維持lmin，再加入654-2維持10min;注射空白對照組與浸泡空白對照分別用PBS溶液腹腔注射和海水浸泡，方法相同。(3)免疫后攻毒免疫30天后各組用鰻弧菌V.anguillarum攻毒，攻毒采用注射感染，劑量為5.OX106cells/尾。3試驗結(jié)果攻毒15天后，統(tǒng)計個組的存活率，根據(jù)公式RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X100X。計算免疫相當(dāng)保護率。結(jié)果見表l表1應(yīng)用NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2為組合佐劑浸泡免疫牙鲆的免疫相對保護率娜糊免鄉(xiāng)浸泡免鄉(xiāng)浸泡feg^(含佐劑)激PBS組浸泡海鄉(xiāng)結(jié)果表明，單純用鰻弧菌滅活疫苗浸泡免疫牙鲆，免疫相對保護率低僅為27%，使<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>CN用佐劑NAC、TRIT0NX-100、皂角苷、654-2組合佐劑后與疫苗聯(lián)合浸泡免疫相對保護率提高到83%，免疫保護效果明顯，證明應(yīng)用本發(fā)明可以顯著提高浸泡疫苗對海水魚的免疫相對保護率。實施例2:應(yīng)用本發(fā)明的濃度分別為5mg/L、5mg/L、lmg/L、30mg/L的NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2多組合佐劑和滅活點狀氣單胞菌疫苗對羅非魚浸泡免疫1材料(1)試驗用魚及養(yǎng)殖管理選用體重3g健康羅非魚，試驗前暫養(yǎng)IO天，試驗用淡水溫度27-28°C，pH7.1-7.2，試驗期間投喂配合餌料，日投喂2次，日換水30%，24小時連續(xù)充氣。(2)疫苗制備將點狀氣單胞菌接種到LB液體培養(yǎng)基，28t:培養(yǎng)24h;4t:下4000rpm離心20min，收集菌體；將收集的菌體置于滅菌的生理鹽水中，pH7.2中，制成1.0X109cells/mL的菌懸液，0.5X甲醛28t:下滅活48h后為試驗用疫苗，4t:儲存；同時將滅活后的菌體接種于LB固體平板，置2『C下恒溫培養(yǎng)24h、48h，確定無菌落長出。(3)浸泡免疫佐劑NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2組合佐劑，使用濃度分別為5mg/L、5mg/L、lmg/L、30mg/L。(4)疫苗使用濃度試驗組中疫苗的有效濃度為1.OX108cells/mL。2試驗方法(1)試驗分組無佐劑疫苗浸泡免疫組、使用NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2組合制劑+疫苗浸泡免疫組、浸泡空白對照組，每組設(shè)三個平行，每組3X40尾魚。(2)免疫方法試驗魚暫養(yǎng)10天后，無佐劑浸泡免疫組用海水配制疫苗達到濃度1.0X108cells/mL后將待免疫的魚移入其中，浸泡15min;使用佐劑+浸泡免疫組用NAC、TRITONX-100溶液浸泡待免魚10min，之后加入疫苗及皂角苷維持10min，再加入654-2維持5min;浸泡空白對照只用海水浸泡，方法相同。(3)免疫后攻毒免疫30天后各組用點狀氣單胞菌攻毒，攻毒采用注射感染，劑量為5.0X107cells/尾。3試驗結(jié)果攻毒15天后，統(tǒng)計各組的存活率，根據(jù)公式RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X100X。計算免疫相當(dāng)保護率。結(jié)果見表2表2.各免疫組免疫相對保護率統(tǒng)計6鄉(xiāng)U浸泡繊且浸泡繊且(佐劑)浸泡海7爐實驗結(jié)果表明，單純用狀氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫羅非魚，免疫相對保護率低僅為51.4%，使用NAC、TRITONX-100、皂角苷、654-2組合佐劑浸泡免疫組，浸泡免疫相對保護率提高到84.1%，效果提高了30%以上。再次證明應(yīng)用本發(fā)明可顯著提高浸泡疫苗對淡水魚的免疫保護。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種魚用浸泡疫苗多組合佐劑，其特征在于上述的多組合佐劑分別是N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪堿的四種佐劑組合，其中N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪堿的使用濃度分別為0.1-10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L和1-60mg/L。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚用浸泡疫苗多組合佐劑，其特征在于上述的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪堿的純度優(yōu)于或相當(dāng)于化學(xué)純級。3.權(quán)利要求1所述的魚用浸泡疫苗多組合佐劑的使用方法，其特征在于(1)首先選用體表完好健康的待免疫魚類，體重在每尾2g以上；(2)將待免疫的魚移入濃度范圍均為0.l-10mg/l的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-IOO混合養(yǎng)殖用水溶液中，預(yù)浸泡l-20min，之后加入濃度0.l-50mg/L的皂角苷及待用疫苗浸泡l-20min，再向疫苗浸泡液中加入濃度l-60mg/L的消旋山莨菪堿待l-10min即完成免疫。4.利用權(quán)利要求1的濃度分別在O.l-10mg/L、0.l-10mg/L、0.l-50mg/L和l-60mg/L的N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100和皂角苷和消旋山莨菪堿多組合免疫佐劑，應(yīng)用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協(xié)同作用達到高效的免疫效果。全文摘要本發(fā)明涉及一種魚用浸泡疫苗多組合佐劑及其應(yīng)用和使用方法，包括N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪堿的組合，其中N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、皂角苷和消旋山莨菪堿的使用濃度分別為0.1－10mg/L、0.1-10mg/L、0.1-50mg/L和1-60mg/L。應(yīng)用于包括海水和淡水魚類的浸泡疫苗中協(xié)同作用達到高效的免疫效果。使用方法首先選用待免疫魚類，將待免疫的魚移入N-乙酰半胱氨酸、曲拉通X-100、混合養(yǎng)殖用水溶液中預(yù)浸泡1-20min，之后加入皂角苷及待用疫苗浸泡1-20min，再向疫苗浸泡液中加入消旋山莨菪堿待1-10min即完成免疫。本發(fā)明顯著提高疫苗的免疫效果，方法簡便安全，成本低，無需額外的設(shè)施與工序，且對魚的存活率與生長速度沒有影響，對環(huán)境及操作員同樣無害。文檔編號A61K39/39GK101791401SQ20091025582公開日2010年8月4日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者王玉娟,王秀華,趙偉偉,黃倢申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所