專利名稱：一種分離肝癌α1－抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的凝集素親和層析離心柱方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種分離肝癌相關(guān)糖鏈異常α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，屬醫(yī)療產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域，用于對(duì)肝癌的發(fā)生進(jìn)行早期診斷。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)原發(fā)性肝癌在全球癌癥死亡率中居第三位，在我國(guó)為第二位癌癥死因。全球45％以上的HCC發(fā)生在我國(guó)。我國(guó)的肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多已晚期，治療難度大，手術(shù)并發(fā)癥多，療效通常不好，生存期短，一般發(fā)病后生存時(shí)間僅為6個(gè)月，人稱“癌中之王”。肝癌療效不盡如人意的最主要原因是診斷較晚。早期肝癌除非位置特殊，治療上多無(wú)太大困難，切除、栓塞、消融甚至換肝樣樣皆能奏效，如得到科學(xué)治療，5年生存率當(dāng)在90％以上，不少患者可以長(zhǎng)期存活。因此對(duì)于肝癌，在亞臨床階段即可得出診斷非常重要。
目前，臨床用于早期診斷肝癌的指標(biāo)主要是甲胎甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)。甲胎蛋白是一種糖蛋白，檢測(cè)血液中的AFP含量是目前診斷肝癌最常見(jiàn)的手段。AFP陽(yáng)性作為早期肝癌篩查起到了重要作用，目前AFP與B超聯(lián)合早期篩查臨床應(yīng)用普及率已經(jīng)較高。AFP作為早期肝癌診斷指標(biāo)的缺點(diǎn)是有一部分肝癌患者AFP陰性，而在肝病和肝硬化疾病中也有相當(dāng)?shù)谋壤嬖陉?yáng)性結(jié)果。國(guó)內(nèi)外研究公認(rèn)在肝癌中20-30％的肝癌患者AFP陰性，而且有相當(dāng)數(shù)量的慢性肝病患者、肝硬化患者中11.7-44％AFP陽(yáng)性。因此AFP作為早期肝癌篩查指標(biāo)的價(jià)值大為降低，檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)有效提高了特異性和準(zhǔn)確度，而由于甲胎蛋白異質(zhì)體是檢測(cè)糖鏈異質(zhì)的甲胎蛋白組分，因此對(duì)于甲胎蛋白AFP陰性的患者篩查甲胎蛋白異質(zhì)體也是缺乏意義的。因此肝癌中存在相當(dāng)比例的AFP陰性肝癌，這種存在給早期篩查帶來(lái)了更大困難。
國(guó)內(nèi)外多年研究希望尋找一種檢測(cè)甲胎蛋白陰性肝癌的血清學(xué)標(biāo)志物和簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，以希望和AFP一起聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)肝癌早期診斷提高敏感性。
凝集素是一類廣泛存在于自然界的一大類非免疫來(lái)源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價(jià)地可逆結(jié)合，并且有凝集血細(xì)胞的作用，故稱為凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先從刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)種子純化了伴刀豆凝集素-ConA(Con-A)。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推測(cè)ConA的血凝作用是與細(xì)胞表面糖作用的結(jié)果。
目前已有近千種植物被測(cè)得具有凝集素活性。植物中，不只種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實(shí)汁中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。除植物外，其它生物，如各種真菌、某些病毒、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物及至人體的各種組織和器官中都存在凝集素。
凝集素可與糖專一性地結(jié)合。目前按結(jié)合糖的類型，凝集素可分為六類D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-巖藻糖；麥胚凝集素(WGA)可專一結(jié)合唾液酸。
鑒定得最清楚的植物凝集素家族是豆科，包括刀豆蛋白凝集素ConA、小扁豆凝集素LCA等。
小扁豆學(xué)名兵豆，從小扁豆中提取的凝集素LCA(Lens culinaris lectin)，可以特異結(jié)合巖藻糖基化聚糖。
隨著生物化學(xué)及其相關(guān)分析技術(shù)的進(jìn)展與應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞糖鏈異常與腫瘤發(fā)生具有密切的關(guān)系。在細(xì)胞的癌變過(guò)程中總是普遍伴有糖鏈結(jié)構(gòu)的改變。
惡性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的物質(zhì)代謝有很大的不同，參與代謝的很多酶都發(fā)生活力的改變，特別是細(xì)胞增殖生長(zhǎng)有關(guān)代謝過(guò)程的酶往往明顯增高，使這一代謝過(guò)程加快，以適應(yīng)腫瘤細(xì)胞不斷分裂增殖的需要。其中糖基轉(zhuǎn)移酶也是一類在惡性腫瘤細(xì)胞中活力有明顯改變的酶。由于糖鏈的結(jié)構(gòu)是由參與糖鏈合成的各種糖基轉(zhuǎn)移酶的活力所決定，某一糖基轉(zhuǎn)移酶活力的增減可以直接影響糖鏈中某一糖基的多少，所以惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶活力的變化必然帶來(lái)細(xì)胞合成的糖蛋白上糖鏈結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化。這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈可出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白上，使腫瘤細(xì)胞表面(細(xì)胞膜)的性質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力的改變，這是造成腫瘤細(xì)胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個(gè)重要原因。糖鏈異常的糖蛋白也可從腫瘤細(xì)胞中分泌出來(lái)，進(jìn)入各種體液中。臨床上收集病人的體液來(lái)測(cè)定其中糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的變化，這就是利用糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常來(lái)診斷惡性腫瘤的基本原理。
早在1970年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者血清AFP淀粉凝膠電泳時(shí)常出現(xiàn)不同的遷移率，而新生兒、胎兒的AFP電泳遷移率相同。當(dāng)時(shí)認(rèn)為系A(chǔ)FP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP異質(zhì)體(AFP Variants AFP-V)的概念。隨后的研究表明，AFP的糖鏈結(jié)構(gòu)存在不同程度的變異，而所謂的異質(zhì)性主要是因?yàn)锳FP所含碳水化合物不同所致。AFP異質(zhì)體形成的確切機(jī)制還不十分清楚，其過(guò)程可能是這樣的增生的肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞于G1期和S期合成AFP，并將其分布于核周、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔及高爾基分泌小囊中，位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中的AFP在糖基化轉(zhuǎn)移酶參與下受到不同的糖基化修飾后分泌到循環(huán)中。由于糖基化的不同，導(dǎo)致了AFP異質(zhì)性的差異。另一可能的原因是糖基化轉(zhuǎn)移酶異常造成糖基化后AFP構(gòu)象的改變。AFP的糖鏈結(jié)構(gòu)能與多種凝集素相作用，與不同凝集素結(jié)合的AFP分子結(jié)構(gòu)蛋白部分基本相同，但糖鏈部分有所差異。不同的糖鏈決定其與凝集素的親和力。根據(jù)親和性的不同，可將AFP異質(zhì)體分為不同類型，如扁豆凝集素(LCA)親和型、豌豆凝集素不親和型，刀豆凝集素(ConA)親和型和ConA不親和型。另有一種分類方法是將電泳獲得的區(qū)帶從陽(yáng)極開(kāi)始以1、2、3編號(hào)，結(jié)合凝集素進(jìn)行命名。如使用LCA則命名為AFP-L1(LCA非結(jié)合型)、AFP-L2(LCA弱結(jié)合型)、AFP-L3(LCA強(qiáng)結(jié)合型)；國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證明AFP-L3是由肝癌細(xì)胞特異產(chǎn)生的。
除了甲胎蛋白糖鏈異常之外，還有抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白在肝細(xì)胞癌變時(shí)也伴隨產(chǎn)生糖鏈異常。
α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)為一種糖蛋白，分子量約為52～58KD。AT基因編碼由394個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白，在形成過(guò)程折疊成球形AT半個(gè)球形表面有3條糖，通過(guò)N-糖苷鍵以Ash基分別連接在46、83和427殘基位置，其總糖含量為11-18％。
α1-抗胰蛋白酶是血清中最主要的蛋白酶抑制劑，占血清中抑制胰蛋白酶活力的91％。AAT也是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。在許多炎性疾患時(shí)，AAT顯著增加。由于AAT的分子量較小，可透過(guò)毛細(xì)血管進(jìn)入組織液，在炎癥局部往往濃度很高，對(duì)急性炎性病變有一定的限制作用。
AAT是血清中最普遍的蛋白酶抑制劑，其生物學(xué)功能主要是通過(guò)形成11的復(fù)合物而抑制嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。AAT缺乏患者易患肺部疾病，對(duì)原因不明的肝硬化和無(wú)肝炎病毒感染證據(jù)的慢性活動(dòng)性肝炎病人檢測(cè)AAT對(duì)診斷及處理有一定的價(jià)值。妊娠、雌激素治療以及炎癥、腫瘤等疾病時(shí)，AAT也會(huì)成倍增加。因此，測(cè)定血清中α1-AT的含量也可作為肝癌等惡性腫瘤的一項(xiàng)輔助診斷指標(biāo)，但缺乏特異性。研究認(rèn)為肝癌患者中＞90％患者AAT升高，但是由于50％肝炎和肝硬化患者中也有AAT升高。因此臨床公認(rèn)AAT檢測(cè)肝癌靈敏度高，但是缺乏特異性。
基礎(chǔ)研究表明在不同的病理狀態(tài)下，肝臟合成的AAT分子結(jié)構(gòu)有明顯差異。1979年Larrell用淀粉凝膠電泳將AAT分成8條帶.證實(shí)了AAT的微小異質(zhì)性。進(jìn)而深入研究發(fā)現(xiàn)AAT的微小異質(zhì)性在于其糖鏈結(jié)構(gòu)的變異，主要表現(xiàn)為AAT側(cè)鏈含甘露糖的多寡。
1987年Sekine用小扁豆凝集索(LCA)分離AAT異質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞惡變后能產(chǎn)生一種異常的AAT，該異常AAT與LCA具有親和性，而且不受血清AAT濃度的影響。Sekine等觀察各種肝病血清中ATT異質(zhì)體變化，肝癌患者血清LCA-R-ATT明顯地高于良性肝病和健康人。慢性肝病發(fā)展為PHC以后，LCA-R-ATT百分比顯著提高于癌變前，認(rèn)為ATT糖鏈部分具癌胚性特征，可作為腫瘤標(biāo)志。
相關(guān)國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)肝癌組AAT-LCA百分率顯著高于慢性肝病組及對(duì)照組，而且AFP≤20ng與AFP＞20ng/L肝癌患者之間AAT-LCA的百分率及陽(yáng)性率差異無(wú)顯著性.抗胰蛋白異質(zhì)體肝癌組陽(yáng)性率為66.57％-75％，AFP陽(yáng)性組和陰性組檢測(cè)AAT異質(zhì)體都具有臨床診斷價(jià)值。而且PHC時(shí)血清升高的LCA-R-ATT與ATT無(wú)相關(guān)關(guān)系。在AFP＜200ng/ml的PHC，敏感性達(dá)66.7，與AFP聯(lián)檢，敏感性可提高到92.9％，結(jié)果提示LCA-R-ATT可作為一種新的PHC血清標(biāo)記，與AFP有互補(bǔ)價(jià)值。尤其在AFP陰性PHC，可彌補(bǔ)AFP及異質(zhì)體的不足。
轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF，siderophilin)是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵。以TRF-Fe3+的復(fù)合物形式進(jìn)入骨髓中，供成熟紅細(xì)胞的生成。
轉(zhuǎn)鐵蛋白TF分子量約7.7萬(wàn)，為單鏈糖蛋白，含糖量約6％。TRF可逆地結(jié)合多價(jià)離子，包括鐵、銅、鋅、鈷等。每一分子TRF可結(jié)合兩個(gè)三價(jià)鐵原子。TRF主要由肝細(xì)胞合成，半壽期為7天。血漿中TF的濃度受鐵供應(yīng)的調(diào)節(jié)，在缺鐵狀態(tài)時(shí)，血漿TF濃度上升，經(jīng)鐵有效治療后恢復(fù)到正常水平。
血漿中TF水平可用于貧血的診斷和對(duì)治療的監(jiān)測(cè)。在缺鐵性的低血色素貧血中TF的水平增高(由于其合成增加)，但其鐵的飽和度很低(正常值在30％-38％)。相反，如果貧血是由于紅細(xì)胞對(duì)鐵的利用障礙(如再生障礙性貧血)，則血漿中TF正?；虻拖?，但鐵的飽和度增高。在鐵負(fù)荷過(guò)量時(shí)，TF水平正常，但飽和度可超過(guò)50％，甚至達(dá)90％。
TF在急性時(shí)相反應(yīng)中往往降低。因此在炎癥、惡性病變時(shí)常隨著白蛋白、前白蛋白同時(shí)下降。在慢性肝疾病及營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)亦下降，因此可以作為營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)。
HCC時(shí)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)明顯降低。瘤體愈大，Tf值愈低。Tf值可隨病情加重而進(jìn)行性下降。但是檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)于肝癌早期篩查卻意義不大，原因是小肝癌、早期肝癌Tf僅輕度降低，表明Tf無(wú)助于HCC的早期診斷。轉(zhuǎn)鐵蛋白是只有肝臟才能分泌的特異糖蛋白，如果轉(zhuǎn)鐵蛋白糖基發(fā)生異常，必定是反映肝臟的病變。正常人血清中TF上的N-糖鏈幾乎100％是二天線，而肝癌病人的TF的N-糖鏈有一部分變成三天線或四天線，且其中核心巖藻糖增多，而該聚糖能夠特異與小扁豆凝集素結(jié)合。采用HRP-LCA酶標(biāo)凝集素探針檢測(cè)TF中的核心巖藻糖，發(fā)現(xiàn)54.4％的原發(fā)性肝癌呈中度或強(qiáng)陽(yáng)性。轉(zhuǎn)移肝癌和良性肝病、良性腫瘤則陰性。99年日本科學(xué)家Akira Naitoh采用凝集素親和電泳顯影方法檢測(cè)肝病的糖基化異常，發(fā)現(xiàn)在肝癌和肝炎、肝硬化之間，甲胎蛋白異質(zhì)體、抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的含量和比率具有顯著性差異。并且甲胎蛋白異質(zhì)體和抗胰蛋白酶異質(zhì)體、甲胎蛋白異質(zhì)體和轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體這二種組合都能起到較好的肝癌檢出率。
研究發(fā)現(xiàn)，肝癌時(shí)α1-AT除由干正常細(xì)胞分泌外.腫瘤細(xì)胞也合成并分泌α1-AT。由于它們的糖基化過(guò)程不同.因此腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞分泌的α1-AT在糖鏈組成及結(jié)構(gòu)上有差異.它們與外源性凝集翥的親和性不同.據(jù)此可將正常細(xì)胞分泌的α1-AT與肝癌細(xì)胞分泌的區(qū)分開(kāi)，由于肝癌細(xì)胞分泌的α1-AT為肝癌細(xì)胞所特有，因此可將其作為肝癌標(biāo)志物。
抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體檢測(cè)的臨床意義1)鑒別肝癌與良性肝病。原發(fā)性肝癌患者抗胰蛋白酶常升高，但許多良性肝臟疾病也可有抗胰蛋白酶升高，單憑抗胰蛋白酶結(jié)果有時(shí)很難區(qū)分良、惡性病變。此時(shí)抗胰蛋白酶異質(zhì)體檢測(cè)就具有良好的臨床意義。轉(zhuǎn)鐵蛋白在肝癌和肝硬化患者中都會(huì)降低，但是在肝癌中轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的比率則是升高的。
2)早期預(yù)警由于相關(guān)蛋白異質(zhì)體在細(xì)胞癌變后就已經(jīng)產(chǎn)生，而此時(shí)影象學(xué)很有可能還不能觀察到，因此作為預(yù)警指標(biāo)，肝細(xì)胞相關(guān)蛋白糖鏈異常化是肝癌發(fā)生的預(yù)警指標(biāo)。甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3對(duì)肝癌發(fā)生的有效預(yù)警已經(jīng)說(shuō)明。臨床研究也表明抗胰蛋白酶異質(zhì)體和轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體可以對(duì)肝癌發(fā)生時(shí)進(jìn)行及時(shí)預(yù)警，特別是小肝癌的早期發(fā)現(xiàn)，具有重要臨床價(jià)值。
3)肝癌術(shù)后的監(jiān)測(cè)。肝癌切除術(shù)后，如果還有腫瘤殘余組織存在，則其異質(zhì)體變化不明顯，提示手術(shù)不徹底，還存在邊緣殘留、血管癌栓、衛(wèi)星結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn)移等。
目前用于α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的檢測(cè)方法有凝集素親和電泳免疫印跡法(CIAE方法)。該方法是將凝集素加入到瓊脂糖中，溶解成膠，然后電泳分離出泳動(dòng)速度不同蛋白，用印跡法轉(zhuǎn)到膜上，然后采用抗體進(jìn)行結(jié)合，再用酶進(jìn)行顯色。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作復(fù)雜，長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)只有少數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室能夠開(kāi)展，無(wú)法用于醫(yī)院常規(guī)檢測(cè)使用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱。該離心柱內(nèi)裝有瓊脂糖介質(zhì)，瓊脂糖上偶聯(lián)有能夠吸附特異糖鏈的小扁豆凝集素，當(dāng)血清標(biāo)本中的目的蛋白流過(guò)時(shí)，就吸附于柱上，加入洗脫液后，通過(guò)離心技術(shù)收集處理后標(biāo)本，標(biāo)本中含有糖鏈異常的α1-抗胰蛋白酶(既其異質(zhì)體)、糖鏈異常的轉(zhuǎn)鐵蛋白(既其異質(zhì)體)。然后采用臨床普遍開(kāi)展的特種蛋白檢測(cè)試劑進(jìn)行α1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測(cè)，計(jì)算處理前后α1-抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量，α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的含量和比率可以準(zhǔn)確地診斷出早期原發(fā)性肝癌，具有極高的靈敏度，方法快速簡(jiǎn)便。
一種檢測(cè)α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，該預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離心管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液，所述分離管底部有一濾布，使得瓊脂糖顆粒無(wú)法穿過(guò)的濾布。
所述凝集素為小扁豆凝集素LCA。
所述親合介質(zhì)可采用瓊脂糖凝膠sephrose 4B、瓊脂糖凝膠sephrose 6B或瓊脂糖凝膠sephrose CL 4B、瓊脂糖凝膠sephrose CL 6B，所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
所述瓊脂糖凝膠為sephrose 4B，緩沖液為凝集素的活性保護(hù)液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過(guò)而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過(guò)的濾布。
所述裝有偶聯(lián)扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠由以下步驟得到的采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B和Sigma公司的LCA。
(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；
(2)稱取2mgLCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測(cè)定洗滌液中的LCA I含量，計(jì)得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1moll/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明提供了與微量離心柱配套使用，用于洗脫結(jié)合到LCA-Sepharose上面的異質(zhì)體蛋白，其制作方法和組成如下20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，為保證長(zhǎng)時(shí)間保存而不長(zhǎng)菌，加入防腐劑Proclin 300至0.1％.
在洗脫時(shí)，將上述溶液加入其中，在溫箱中溫育30分鐘，達(dá)到洗脫的目的.
本發(fā)明提供了一種采用該預(yù)裝離心柱進(jìn)行純化異質(zhì)體蛋白步驟及其相關(guān)試劑組成。
該組合包括預(yù)裝微量離心柱(內(nèi)裝已經(jīng)偶聯(lián)了小扁豆凝集素LCA的瓊脂糖和其保護(hù)液)，清洗液(20mmTris-Hcl，PH7.4緩沖液，0.1％Proclin 300)，洗脫液(20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mm α-甲基-D-甘露糖苷，0.1％，Proclin 300)。
使用該離心柱的操作步驟如下1.將待檢測(cè)血清完全離心，無(wú)溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取1000ul血清于試管中，并加入1400ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出900ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請(qǐng)不要蓋離心管蓋子，血清稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；試管中剩余1500ul稀釋血清(樣本①)準(zhǔn)備對(duì)照檢測(cè)用。
4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液1200ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液1200ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液900ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時(shí)，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測(cè)。
本發(fā)明克服了以往檢測(cè)方法操作步驟煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、需要配套設(shè)備多等缺點(diǎn)，操作者只需要離心和溫育等簡(jiǎn)單操作，在1小時(shí)內(nèi)就可以完成檢測(cè)，直接定量計(jì)算出血樣標(biāo)本中所含的抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的含量，然后進(jìn)行定性或比值計(jì)算，方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供了支持。


附圖為本發(fā)明預(yù)裝離心柱的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
1，上部離心管2，過(guò)濾膜3，下部收集管4，填充介質(zhì)5，保護(hù)凝集素活性的保護(hù)液
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
參見(jiàn)附圖，本發(fā)明提供的一種檢測(cè)肝癌抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，由位于上部的分離管1和位于下部的收集管3組成，通?？梢圆捎脤⒎蛛x管插接到收集管上的方式實(shí)現(xiàn)兩者的連接，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)4(為圖面清晰起見(jiàn)，圖中標(biāo)注的是用于裝親合介質(zhì)的管內(nèi)空間，沒(méi)有繪出介質(zhì)實(shí)物)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液(為圖面清晰起見(jiàn)，圖中標(biāo)注的是用于裝緩沖溶液的管內(nèi)空間，沒(méi)有繪出溶液實(shí)物)，所述分離管底部主要是一濾布，該濾布采用能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過(guò)而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過(guò)的濾布，以便在離心分離時(shí)，分離出來(lái)的液體和蛋白質(zhì)能夠透過(guò)該濾布進(jìn)入下面的收集管?？梢允褂矛F(xiàn)有的這種濾布，并通過(guò)在分離管底部設(shè)置一個(gè)夾持塑料墊圈，將濾布固定住。
實(shí)施例1預(yù)裝離心柱的制備和使用1、預(yù)裝離心柱由離心柱和填充介質(zhì)組成，離心柱由上部的離心管和下部的收集管組成，二者套在一起，組成離心柱。
2、離心柱填充材料的制備采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的LCA，按以下步驟偶聯(lián)(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取2mgLCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA。經(jīng)測(cè)定洗滌液中的LCA I含量，計(jì)得偶聯(lián)率為98％；
(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 3、在上部分離管中，加入一層濾布，并加一個(gè)塑料墊圈固定，該濾布的孔徑小于瓊脂糖，因此瓊脂糖不能經(jīng)過(guò)，但是蛋白質(zhì)量和液體可以流過(guò)。取1mL已經(jīng)偶聯(lián)的凝集素sephrose 4B加入離心柱上部的離心管中。
4、加入1ml凝集素保存緩沖液，緩沖液經(jīng)過(guò)上部離心管后主要保存于下面的收集管中，本發(fā)明預(yù)裝離心柱下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5實(shí)施例2本發(fā)明分離方法的質(zhì)量控制方法是1)準(zhǔn)確性10份肝癌質(zhì)控血清(6份AFP陽(yáng)性、4份AFP陰性)的參考品檢測(cè)結(jié)果無(wú)假陰性出現(xiàn)。
2)特異性取10份肝炎、肝硬化標(biāo)本(均為抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白異常陽(yáng)性)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)。
實(shí)施例3本發(fā)明提供的檢測(cè)抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體含量的方法，包括下述步驟一、標(biāo)本處理使用該離心柱的操作步驟如下
1.將待檢測(cè)血清完全離心，無(wú)溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取1000ul血清于試管中，并加入1400ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出900ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請(qǐng)不要蓋離心管蓋子，血清稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；試管中剩余1500ul稀釋血清(樣本①)準(zhǔn)備對(duì)照檢測(cè)用。
4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液1200ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液1200ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液900ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時(shí)，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測(cè)。
二)特種蛋白檢測(cè)血清α1-A T、Tf水平檢測(cè)采用全自動(dòng)特定蛋白分析儀(Array 360型，Backman公司)測(cè)定，全套試劑采用Backman公司產(chǎn)品。既如前所述檢測(cè)樣本②和樣本①中的抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，計(jì)算比值。當(dāng)比值大于10％時(shí)判斷蛋白異質(zhì)體異常。
實(shí)施例4采用本發(fā)明提供的離心管對(duì)肝癌病人陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果
為判斷本發(fā)明的蛋白異質(zhì)體分離管在臨床良惡性肝病鑒別的應(yīng)用，取本發(fā)明對(duì)來(lái)源于北京佑安醫(yī)院提供的標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)100份已知原發(fā)性肝癌陽(yáng)性標(biāo)本，50份體檢健康血清，80份肝硬化血清、100份肝炎。先采用本發(fā)明進(jìn)行凝集素親和層析離心分離，然后采用特種蛋白檢測(cè)試劑檢測(cè)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.在不同標(biāo)本中檢出率比較

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明分離出糖鏈異常的蛋白，并且聯(lián)合進(jìn)行分析，對(duì)于原發(fā)性肝癌的符合率高達(dá)92％，在肝硬化中的特異性高達(dá)91％，在肝炎中的特異度高達(dá)93％。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于其由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，上部分離管底部有一濾布，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
2，如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述凝集素為小扁豆凝集素LCA。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述親合介質(zhì)采用瓊脂糖凝膠sephrose 4B、瓊脂糖凝膠sephrose 6B、或瓊脂糖凝膠sephrose CL 4B、瓊脂糖凝膠sephrose CL 6B，所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過(guò)而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過(guò)的濾布。
5.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述裝有偶聯(lián)扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠通過(guò)以下步驟獲得(1)將CNBr-Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗滌；(2)稱取LCA，溶于偶聯(lián)緩沖液中，與經(jīng)洗滌的Sepharose4B合并混勻；(3)用偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測(cè)定洗滌液中的LCA含量，計(jì)得偶聯(lián)率為98％；(4)用甘氨酸封閉剩余活化基因，洗滌，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)肝癌α1-抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH7.5。
7，如權(quán)利要求1所指的預(yù)裝離心柱的使用配套溶液包括清洗緩沖液(20mmol/L Tris-HcL，PH7.4)和洗脫緩沖液(20mmol/LTris-HcL，PH7.4，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷)加入通過(guò)洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種分離肝癌α1－抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯(lián)小扁豆凝集素(LCA)的親合介質(zhì)，上部分離管底部是一個(gè)濾布，下部收集管中裝有緩沖溶液。小扁豆凝集素(LCA)能與α1－抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體相結(jié)合。經(jīng)過(guò)該裝置的分離，獲得與小扁豆凝集素相結(jié)合的α1－抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體。檢測(cè)α1－抗胰蛋白酶異質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白異質(zhì)體的含量可快速、簡(jiǎn)便的對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號(hào)B01J20/281GK101038275SQ20071009016
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者林長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:北京熱景生物技術(shù)有限公司