專利名稱：血清學(xué)h-y抗原基因dby抗體制備及其xy精子免疫分選法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血清學(xué)H-Y抗原基因DBY重組抗原肽，及其血清學(xué)H-Y抗原基因DBY抗體制備和XY精子免疫分選法。
背景技術(shù)：
雄性特異性弱組織相容性抗原(Malespecific minor histompatibilityantigens, H_Y抗原)最初發(fā)現(xiàn)是作為一種異性間移植抗原，為雄性動(dòng)物特有的物質(zhì)，在雄性個(gè)體中無組織和器官特異性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)H-Y抗原是糖蛋白，存在于雄性哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面。H-Y抗體在哺乳動(dòng)物性別鑒定和控制的理論和實(shí)踐研究上具有重要意義，國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)了 H-Y抗原抗血清及單克隆抗體，并進(jìn)行了胚胎的性別鑒定和控制，但由于其抗原的特異性較弱和復(fù)雜性，抗體實(shí)際應(yīng)用效果不理想，未能在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。雄性傳遞偏移現(xiàn)象和性別偏移現(xiàn)象的發(fā)生證明了 X和Y精子間存在非共享蛋白(Hendriksen et al.，1996)，同時(shí)血清學(xué)H-Y抗原部分抗原表位的成功鑒定、X和Y精子免疫學(xué)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Y精子特異性蛋白的檢測(cè)結(jié)果都為X和Y精子膜蛋白差異的存在提供了間接的證據(jù)(Grant et al., 2008;Robbins et al., 2008;Zhang et al.，2008)。Blecher等(1999)用色譜柱得到相對(duì)保守的牛精子性別特異性蛋白(Sex specificproteins, SSPs),研究發(fā)現(xiàn)SSPs抗體可引起約 半數(shù)的牛精子凝集,未凝集精子體外受精，生產(chǎn)出90%以上雄性胚胎；Souza等(1999)純化并產(chǎn)生了一個(gè)針對(duì)19kDa的牛精子膜蛋白的單克隆抗體，流式細(xì)胞儀分析顯示結(jié)合約60%的精子，免疫組化僅有雄性組織被染色。然而，到目前為止，仍未見用上述法產(chǎn)生性別控制后代的實(shí)際應(yīng)用研究報(bào)道。利用H-Y抗原進(jìn)行胚胎早期性別鑒定和精子的分離應(yīng)用于生產(chǎn)研究。無論是應(yīng)用免疫技術(shù)分離X精子與Y精子，還是進(jìn)行胚胎的性別鑒定，都必須依賴高純度、高效價(jià)的特異H-Y抗體。早期研究已分別采用雄性動(dòng)物細(xì)胞免疫雌性動(dòng)物的方法和單克隆抗體技術(shù)來制備H-Y抗體，但其特異性不強(qiáng)，且操作繁瑣。H-Y抗體純度低、效價(jià)不高，這些都限制了 H-Y抗體的應(yīng)用及H-Y抗原的研究。Y精子的血清學(xué)H-Y抗原是一弱自身組織抗原，這為H-Y抗原候選蛋白和抗體的篩選帶來了挑戰(zhàn)，借助基因序列信息和生物信息學(xué)技術(shù)來篩選血清學(xué)H-Y抗原的候選抗原表位，為血清學(xué)H-Y抗體的研究提供了新技術(shù)途徑。DBY基因?yàn)檠鍖W(xué)H-Y抗原的候選基因之一，定位于Y染色體短臂末梢AZFa區(qū)域Xpll.3-11.23，含有17個(gè)外顯子，編碼660個(gè)氨基酸殘基，為ATP依賴性RNA解螺旋酶，是DEAD-Box (天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列)RNA解旋酶基因家族成員之一。DBY的轉(zhuǎn)錄子僅在雄性胚胎細(xì)胞中檢測(cè)到，在胚胎性腺發(fā)育17.5天DBY基因表達(dá)水平達(dá)到最高峰，出生后有所降低，但在成年雄性性腺中仍維持較低水平；可育小鼠精子中，DBYmRNA被選擇性保留，并且在受精時(shí)通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)轉(zhuǎn)移到卵子內(nèi)，在雄性小鼠合子早期受精卵發(fā)育中起重要作用。同時(shí)DBY基因編碼一個(gè)僅在睪丸中表達(dá)的短轉(zhuǎn)錄子，由此推斷DBY在精子發(fā)生過程中起重要作用。
由于DBY基因與X染色體上的對(duì)應(yīng)基因Dbx有較高的同源性，這為DBY特異性抗體的制備帶來很大的難度。利用生物信息學(xué)方法分析DBY與DBX間的同源性，去掉高度同源序列區(qū)域，在序列差異區(qū)域選擇DBY特異性抗原表位為特異性抗體的制備提供了新的思路。在本發(fā)明中我們通過選取具有代表性和應(yīng)運(yùn)廣泛性的幾個(gè)軟件模型來研究DBY蛋白的線性B細(xì)胞表位，全面分析了 DBY蛋白的生物特性。分別進(jìn)行跨膜區(qū)分析和序列比對(duì)去除同源區(qū)，利用在線軟件預(yù)測(cè)獲得優(yōu)選序列區(qū)域，最后用獨(dú)立軟件進(jìn)一步篩選，綜合評(píng)價(jià)得出抗原肽序列。小鼠DBY蛋白的空間構(gòu)象相關(guān)信息還沒有公布，而沒有分析其構(gòu)象表位，所以在DBY抗原肽篩選中我們選取了 3段序列，用于下游實(shí)驗(yàn)抗原肽表達(dá)的參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DBY重組抗原肽，及其基于血清學(xué)H-Y抗原基因DBY的抗原表位抗體的制備方法和XY精子免疫分選法。一種DBY重組抗原肽，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY
SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1II
SRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN。一種DBY重組抗原肽，蛋白序列如下:KSSDNQNGGGN TESKGRYIPPHLRNRET SKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER
SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。血清學(xué)H-Y抗原基因DBY抗體制備方法，是以上述的重組抗原肽為抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物，獲得多克隆抗體。所述的重組抗原肽的制備過程如下:提取雄性小鼠腦組織中總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，設(shè)計(jì)特異性引物
DBV-1 -F5、GCCK〕AAnCGACC-似
DBY-1 -R5’-CCGGAGCTCTGGTTTTGTCATC-3，
DBY Il-F5:-GGCGAGCTCTTTC'AAGTATGCG'
DBY [1-R5,-GGGTCG ACC ACTA A ACTTTCG-r
DB^IIl-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’
DBY-1l 1-R5 -G C G A A Cj CTTA C CAA ATGTTGTGo '，將3段DBY抗原肽核酸片段擴(kuò)增出來；將抗原肽核酸片段分別克隆進(jìn)入pMD18_T載體，篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(見表I)后，將DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4連接酶連接后克隆入pET-32a表達(dá)載體中，篩選出陽性克隆質(zhì)粒pET-32a-DBY，然后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得的DBY重組抗原肽進(jìn)行純化。XY精子免疫分選法，以上述制備的抗體與動(dòng)物精子進(jìn)行免疫反應(yīng),來鑒別或者分離X和Y精子。所述的動(dòng)物精子包括小鼠的精子。本發(fā)明的創(chuàng)新性在于:精子分離需要X和Y精子之間存在可檢測(cè)的差異，到目前為止，只有利用DNA結(jié)合的染料直接檢測(cè)DNA含量的流式細(xì)胞分離X和Y精子是行之有效的方法，在牛性別選擇方面得到商業(yè)應(yīng)用(準(zhǔn)確度可達(dá)90%以上)。但使用流式細(xì)胞儀作為性別選擇常規(guī)工具應(yīng)用于動(dòng)物育種是相對(duì)低效的，因?yàn)槊繂挝粫r(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的精子是有限的，性別控制精液的精子數(shù)量比正常精液低，；需要價(jià)格昂貴的專門設(shè)備(Seidel，2003)、專利授權(quán)和操作高度熟練的的技術(shù)人員(Hendriksen，1999)，此法未得到廣泛應(yīng)用。而且精子在分離、后續(xù)的處理、保存、使用等階段都可能受到許多因素(高度稀釋、核染色、機(jī)械高壓、激光照射、離心、冷凍等)的損害，使得分離精子活力、精液的密度等精子的常規(guī)性狀受到影響，導(dǎo)致牛性控后代出現(xiàn)個(gè)體差異(Rath et al.2009,陸陽清，2005, Spinaciet al.，2006; Berme jo-人丨varezet al., 2008) 0免疫學(xué)分選方法可避免或減少與DNA含量檢測(cè)有關(guān)的影響。本發(fā)明探求X和Y精子表面的特異性標(biāo)記蛋白的序列和結(jié)構(gòu)信息，首次利用Y精子特異性表面抗原(血清學(xué)檢測(cè)H-Y抗原復(fù)合物)的候選基因DBY抗原表位制備抗體，建立了簡(jiǎn)單、高效的X和Y精子免疫學(xué)分選法。


圖1為pET-32a_DBY誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖；1:37°C , Oh ；2:37°C，Ih ；3:37°C,3h ；4:37°C,6h 沉淀；5:37°C,6h 上清；6:30°C,6h 沉淀；7:30°C,6h 上清；圖2為DBY多肽抗血清與雌鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)結(jié)果(200倍)；圖3為DBY多肽抗血清與雄鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)結(jié)果(200倍)；圖4為小鼠精子細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖5為DBY多肽抗血清與小鼠精子反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。1、DBY抗原肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和篩選利用DNAStar 軟件 PROTEAN program (Gamier-Robson program)、在線蛋白質(zhì)分析工具 ABCpred servers(http://www.1mtech.res, in/raghava/abcpred/)、BepiPredl.0servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)等生物信息學(xué)技術(shù)，分別從蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、可塑性、表面可極性以及抗原指數(shù)等方面，綜合分析DBY蛋白全序列的結(jié)構(gòu)特性，同時(shí)我們對(duì)DBY蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。雄性個(gè)體的DBY與雌性個(gè)體的DBX進(jìn)行序列比對(duì)，去除冗余序列和同源的重復(fù)序列進(jìn)一步縮小預(yù)測(cè)范圍。最后結(jié)合在線線性B細(xì)胞軟件預(yù)測(cè)結(jié)果篩選出3段DBY抗原肽序列(DBY-1，DBY-1I，DBY-1II，見序列表)。2、DBY抗原肽的原核表達(dá)利用Trizol法提取雄性小鼠腦組織中總RNA,再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)3段DBY抗原肽序列(DBY-1 ,DBY-1I，DBY-1II)設(shè)計(jì)特異性引物(見表1)，將3段DBY抗原肽核酸片段擴(kuò)增出來。將抗原肽核酸片段分別克隆進(jìn)入PMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。然后用原核表達(dá)載體pET-32a(大連寶生物工程有限公司)，進(jìn)行原核表達(dá)，獲得的DBY抗原肽(見序列表)用His純化試劑盒進(jìn)行純化。表IDBY抗原肽引物設(shè)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種DBY重組抗原肽，其特征在于，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1IISRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。
2.—種DBY重組抗原肽，其特征在于，蛋白序列如下: KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILV ATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGS SHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN0
3.血清學(xué)H-Y抗原基因DBY抗體制備方法，其特征在于， 以權(quán)利要求2所述的重組抗原肽為 抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物，獲得多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于， 所述的重組抗原肽的制備過程如下: 提取雄性小鼠腦組織中總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，設(shè)計(jì)特異性引物 DBY-1-F5,-GCGGAATTCGA€CTGAAAGAT-3,DBY-1 -R5' -C'CGGAGC-1 (:' IGGTTTTGTC'/VIC'-.3:DBY I1-F55-GGCGAGCTCTTTCAAGTATGCG-3’DBY [1-R5 '-GGGTCGACCACTAAACTTTCG-31DBY-1I1-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’ BV-1ll-R5 ■■(；( (i A A (i('iIA( ('A A AK.'I i(i Ki " ，將3段DBY抗原肽核酸片段擴(kuò)增出來；將抗原肽核酸片段分別克隆進(jìn)入PMD18-T載體，篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，將DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4連接酶連接后克隆入pET-32a表達(dá)載體中，篩選出陽性克隆質(zhì)粒 pET-32a-DBY,然后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得的DBY重組抗原肽進(jìn)行純化。
5.XY精子免疫分選法，其特征在于，以權(quán)利要求3或4制備的抗體與動(dòng)物精子進(jìn)行免疫反應(yīng)，來鑒別或者分離X和Y精子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫分選法，其特征在于，所述的動(dòng)物精子包括小鼠的精子。
全文摘要
本發(fā)明公開了血清學(xué)H-Y抗原基因DBY抗體制備及其XY精子免疫分選法。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并篩選出血清學(xué)H-Y抗原基因DBY的3個(gè)B細(xì)胞表位抗原肽，連接、重組、原核表達(dá)，得到了高純度的DBY重組抗原肽。以重組抗原肽為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體。利用DBY抗體結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)分選出約63.2±4.5%精子。本發(fā)明建立了以血清學(xué)H-Y抗原基因DBY抗體為基礎(chǔ)的X和Y精子的免疫分選法，利用該抗體來分離X和Y精子，可建立簡(jiǎn)單、高效、安全的性別選擇的理想方法，可更好地控制種用品種(或品種)的遺傳改良，獲得更快的遺傳進(jìn)展和畜牧業(yè)生產(chǎn)與管理的效率優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C07K16/40GK103114079SQ20131002877
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者王乃東, 譚慶輝, 薛立群, 袁安文, 許道軍 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)