本發(fā)明涉及一種動物布魯氏菌病的診斷方法——布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒，屬生物制品檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯氏菌引起的以感染家畜為主的人畜共患傳染病。本病不但對動物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前全世界范圍內(nèi)消除該病的主要方法是撲殺與免疫相結(jié)合，所以建立快速準(zhǔn)確的診斷方法對防治和清除布病非常必要。
布魯氏菌抗體檢測常用血清學(xué)方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光偏振試驗(yàn)(FPA)。其中SAT因特異性不高，通常認(rèn)為不適合國際貿(mào)易檢測；RBT、CFT和ELISA為國際貿(mào)易指定試驗(yàn)；FPA為國際貿(mào)易選擇試驗(yàn)。FPA利用生物物理學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對疾病的快速檢測，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。本發(fā)明中，我們在布魯氏菌O鏈多糖(OPS)上標(biāo)記熒光素分子(FITC)，當(dāng)布魯氏菌特異性抗體與抗原結(jié)合形成抗原/抗體復(fù)合物后，分子量變大，此時檢測到的熒光偏振程度也較高，當(dāng)檢測到的偏振強(qiáng)度值超過cutoff值時，即判為布病陽性，反之為陰性。到時相對于ELISA方法，F(xiàn)PA特具有更高的檢測效率，并具有良好的特異性和敏感性；另外，其試驗(yàn)操作也比ELISA簡單，特別適合于對大量樣品的檢測，在布魯氏菌血清學(xué)檢測中有特定的優(yōu)勢。
本申請人在成功開發(fā)了牛布病間接ELISA試劑盒、動物布病競爭ELISA試劑盒和布魯氏菌抗體檢測試紙條的基礎(chǔ)上，又開發(fā)成功了布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于建立了一種布魯氏菌抗體高通量檢測技術(shù)。其核心是將提純的光滑型布魯氏菌O鏈脂多糖(OPS)標(biāo)記上異硫氰酸熒光素，經(jīng)精確定量后用作檢測抗原。以人工免疫健康牛制備陽性血清，以健康非免疫牛血清作陰性血清，及25×樣品稀釋液等組分組裝而成，用于檢測多種動物血清中的光滑型布魯氏菌抗體。
本發(fā)明的技術(shù)方案
1.一種布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒由布魯氏菌熒光標(biāo)記抗原OPS、布魯氏菌陽性對照血清、陰性對照血清和樣品稀釋液組成。
2.如權(quán)利要求1所述一種布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒，其特征在于其中的布魯氏菌熒光標(biāo)記抗原OPS是檢測布魯氏菌抗體的熒光標(biāo)記光滑型布魯氏菌S2株脂多糖的小分子片段，該OPS對常見的布魯氏菌病原抗體均具有良好的特異性和敏感性。
3.權(quán)利要求1所述的布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒的應(yīng)用，該可檢測多種動物血清中的布魯氏菌特異性抗體，即該試劑盒能對豬、牛、羊的布魯氏菌病進(jìn)行高通量快速檢測。
本發(fā)明具體實(shí)施方式
布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒。通過對標(biāo)記抗原、反應(yīng)條件、結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)等多方面條件的優(yōu)化，特別是對陽性血清的效價進(jìn)行了精確標(biāo)定，比較理想地解決了布魯氏菌熒光偏振試驗(yàn)診斷方法中特異性、敏感性、重復(fù)性、保存期、操作方便性等問題。本專利中使用了異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記光滑型布魯氏菌O鏈脂多糖小分子片段(OPS)，作為抗原?；贔PA的實(shí)驗(yàn)原理，該試劑盒能對多種動物進(jìn)行布病檢測，同時能檢測血清中的IgG和IgM類抗體，因此該試劑盒在敏感性方面具有更明顯的優(yōu)勢。
在本發(fā)明實(shí)施過程中，為了客觀評價試劑盒的特異性和敏感性，將近6年收集的343份田間牛、羊的血清樣本，經(jīng)虎紅凝集試驗(yàn)初篩后，再用試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測，剔除了部分檢測結(jié)果不一致的樣本，共確定了148份布病陽性血清(其中牛血清70份，羊血清78份)，155份布病陰性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)。本發(fā)明開發(fā)的試劑盒，與已確認(rèn)的148份布病陽性血清樣本的符合率為98.0％(145/148)，與已確認(rèn)的155份陰性樣本的符合率為98.7％(153/155)，由此確定試劑盒對田間樣本的敏感性為98.0％，特異性為98.7％，顯示了試劑盒診斷結(jié)果的可靠性。
本發(fā)明所述的布魯氏菌熒光偏振檢測試劑盒，選取豬種布魯氏菌S2株作為OPS提取的生產(chǎn)菌種，在常規(guī)提取OPS方法的基礎(chǔ)上，增加了蛋白酶K消化和濃縮步驟，提高了OPS濃度和純度。具體技術(shù)方案如下：
1.OPS提取
(1)將滅活菌懸液以10000g離心20min，收集沉淀。稱量并計(jì)算菌體濕重，將菌體濕重按1:8(W/V)比例加入2％(V/V)醋酸中，121℃高壓滅菌15min。4℃以10000g離心20min去除菌體碎片。
(2)在上清液中加入終濃度為5％的三氯乙酸，室溫攪拌15min后，4℃10000g離心10min，棄去沉淀。加入一定量的蛋白酶K，使其終濃度達(dá)50μg/ml，置56℃水浴消化2小時。
(3)上清液置100倍蒸餾水透析過夜，用PEG8000濃縮40倍，再次置于蒸餾水透析過夜，收集透析袋內(nèi)容物，分裝成2ml/瓶凍干保存，此即提純的OPS。
2.建立了FITC-OPS分子標(biāo)記方法
(1)將4mg OPS加入到2ml 0.5％(V/V)的三乙胺溶液中，置冰上超聲處理15min，超聲后加入200μl 100mmol/L的EDTA溶液，并用10μl 1mol/L的鹽酸將溶液pH調(diào)為5.0。
(2)取20mg FITC(異構(gòu)體I)溶解于800μl 0.25mol/L硼酸溶液(pH10.5)中，然后全部加入到OPS溶液中，繼續(xù)超聲處理1min。加入1ml 1.6％脫氧膽酸鈉溶液，37℃攪拌孵育18小時。
(3)4℃10000g離心30min，將上清液轉(zhuǎn)移到透析袋中用PEG6000濃縮，隨后用PBS透析1小時，將透析物用PD-10柱脫鹽，收集所有FITC-OPS標(biāo)記物，合并后用PEG6000再濃縮，最后再用PBS透析1小時，收集透析后產(chǎn)物4℃保存，即為標(biāo)記抗原原液。
3.FPA試劑盒陽性血清的效價標(biāo)定
(1)用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對臨床表現(xiàn)健康的2歲左右成年牛進(jìn)行檢測，篩選布病抗體陰性牛。
(2)將布魯氏菌參考強(qiáng)毒株M28滅活抗原以5×1010CFU/牛頸部皮下免疫，3個月后雙倍劑量加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后2周采血。
(3)用試管凝集試驗(yàn)測定凝集效價，當(dāng)效價超過800IU/ml時，靜脈放血，分離血清。根據(jù)實(shí)際測定的效價，用牛布病陰性血清將其效價稀釋至320IU/mL，用0.45μm濾器過濾除菌，作為試劑盒中布病陽性血清。
4.PFA試劑盒的特異性和敏感性評價
(1)將2009～2015年間課題組收集的343份田間牛、羊的血清樣本，分別用虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測，將兩種方法均檢測為陽性的血清樣本和均檢測為陰性的樣本再用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)確認(rèn)，選擇三種方法全為陽性的血清作為陽性參考血清，三種方法全為陰性的血清作為陰性參考血清。
(2)用篩選出的148份確定為布病陽性的血清(其中牛血清70份，羊血清78份)和155份布病陰性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)作為待檢血清，評價試劑盒的敏感性和特異性。
附圖說明
圖1豬種布魯氏菌S2的PCR鑒定鑒定圖圖中1:DNA Marker；2:大腸桿菌陰性對照；3:S2菌株的PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明微生物資源信息
本發(fā)明所涉及的微生物為：豬種布魯氏菌(Brucella suis)S2株(CVCC70502)，來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，系豬種布魯氏菌生物1型，是布魯氏菌病弱毒活疫苗株。羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)M28株(CVCC70003)，來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，系羊種布魯氏菌生物1型，是布魯氏菌病活疫苗效力評價檢驗(yàn)用強(qiáng)毒參考株。兩個菌株均由北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心鑒定、保管和供應(yīng)(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p35，p32)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明涉及布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒。本發(fā)明使用了異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記光滑型布魯氏菌O鏈脂多糖小分子片段(OPS)，作為抗原?；贔PA的實(shí)驗(yàn)原理，該試劑盒能對多種動物進(jìn)行布病檢測，同時能檢測血清中的IgG和IgM類抗體，因此該試劑盒在敏感性方面具有更明顯的優(yōu)勢；本發(fā)明通過對主要試劑配方的改進(jìn)和優(yōu)化，特別是對陽性血清的效價進(jìn)行了精確標(biāo)定，有效提高了試劑盒的敏感性和特異性，敏感性、重復(fù)性、保存期、操作方便性等問題，大大縮短了高通量檢測所需的時間，本發(fā)明為我國布魯氏菌病診斷提供了新型高效的檢測方法。
實(shí)施例
以下實(shí)施例為進(jìn)一步明本發(fā)明，不構(gòu)成對本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案的限制。
實(shí)施例1
——抗原制備用菌種(豬種布魯氏菌S2株，B.suisS2)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
1.菌落形態(tài)菌落邊緣整齊、圓潤，露滴狀，斜光照射，逆光觀察微帶藍(lán)色乳光。
2.染色形態(tài)為球桿菌，單個散在，不形成芽孢和莢膜。大小在0.6～2.5μm之間。革蘭氏染色為陰性，柯氏染色為紅色。
3.純粹檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進(jìn)行，應(yīng)純粹。
4.特異性檢驗(yàn)
(1)血清學(xué)特異性以培養(yǎng)物制成抗原，與光滑型布魯氏菌陽性血清應(yīng)出現(xiàn)凝集，與粗糙型血清不出現(xiàn)凝集。
(2)PCR特異性合成如下4條引物，將其配成引物混合儲存液，各引物濃度均為25μM。
Feri：5’-GCGCCGCGAA GAACTTATCA A-3’ 21(序列1)
Reri:5’-CGCCATGTTA GCGGCGGTGA-3’ 20(序列2)
Fsuis：5’-GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG-3’ 23(序列3)
RIS711:5’-TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT-3’ 24(序列4)
模板S2培養(yǎng)菌落或試劑盒提取的S2基因組DNA。
PCR反應(yīng)體系50μL的反應(yīng)體系中，含5μL 10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物儲存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少許)。
PCR反應(yīng)程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min進(jìn)行28個循環(huán)，最后72℃10min。
結(jié)果：擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，應(yīng)出現(xiàn)2條特異性PCR條帶，大小分別為178bp和285bp(見附圖1)。
實(shí)施例2
——本申請檢測用抗原OPS的提純和標(biāo)記方法
1.菌懸液制備 將鑒定合格的B.suisS2株二級種子接種于胰眎瓊脂扁瓶中，37℃培養(yǎng)48小時后，每瓶加入含有0.5％苯酚的生理鹽水20ml浸泡菌體表面10min以上，洗下培養(yǎng)物，收集于無菌玻璃瓶中。
2.菌液滅活及滅活檢驗(yàn) 將收集好的菌懸液加熱到80℃，維持120min，待其自然冷卻后，存于4℃。對滅活菌液應(yīng)進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。取滅活菌液0.1ml涂布胰眎瓊脂或TSA平板，37℃培養(yǎng)7天，不應(yīng)無菌生長。
3.OPS的提純將滅活檢驗(yàn)合格的菌懸液以10000g離心20min，收集沉淀。稱量并計(jì)算菌體濕重，將菌體濕重按1:8(W/V)比例加入2％(V/V)醋酸中，充分混勻后，121℃高壓滅菌15min。冷卻后4℃10000g離心20min去除菌體碎片。在上清液中加入終濃度為5％的三氯乙酸，室溫攪拌15min后，4℃10000g離心10min，棄去沉淀。加入一定量的蛋白酶K，使其終濃度達(dá)50μg/ml，置56℃水浴消化2小時。將上清液置100倍蒸餾水中透析過夜，用PEG8000濃縮40倍后，再次置于蒸餾水透析過夜，收集透析袋內(nèi)容物，分裝成2ml/瓶凍干保存，此即提純的OPS。
4.OPS的標(biāo)記取4mg OPS加入到2ml 0.5％(V/V)的三乙胺溶液中，置冰上超聲處理15min，超聲后加入200μl 100mmol/L的EDTA溶液，并用10μl 1mol/L的鹽酸將溶液PH調(diào)為5.0。取20mg FITC(異構(gòu)體I)溶解于800μl 0.25mol/L硼酸溶液(PH10.5)中，然后全部加入到OPS溶液中，繼續(xù)超聲處理1min。加入1ml 1.6％脫氧膽酸鈉溶液，37℃攪拌孵育18小時。4℃10000g離心30min，將上清液轉(zhuǎn)移到透析袋中用PEG6000濃縮，隨后用PBS透析1小時，將透析物用PD-10柱脫鹽，收集所有FITC-OPS標(biāo)記物，合并后用PEG6000再濃縮，最后再用PBS透析1小時，收集透析后產(chǎn)物4℃保存，即為標(biāo)記抗原原液。
實(shí)施例3
——本申請?jiān)噭┖兄嘘幮詫φ昭搴完栃詫φ昭宓闹苽渑c檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
1.陰性對照血清的制備
(1)動物用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)均檢測為布魯氏菌抗體陰性的2周歲左右、性成熟的健康牛。
(2)血清制備頸靜脈采血，分離血清，用0.45μm濾器過濾除菌，收集的血清加入0.05％proclin300防腐，無菌分裝，檢驗(yàn)合格后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.陰性對照血清的檢驗(yàn)
(1)性狀橙黃或淡黃色澄清液體。
(2)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
(3)特異性檢驗(yàn)經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢驗(yàn)應(yīng)均為陰性。將制備的陰性對照血清作為待檢血清，進(jìn)行FPA檢測，其70<mP<95。
3.陽性對照血清的制備
(1)動物篩選用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對臨床表現(xiàn)健康的2周歲左右、性成熟的健康牛進(jìn)行檢測，篩選布病抗體陰性牛。
(2)血清制備將布魯氏菌參考強(qiáng)毒株M28滅活抗原制成菌懸液，以5×1010CFU/牛頸部皮下免疫，3個月后雙倍劑量加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后2周采血。用試管凝集試驗(yàn)測定凝集效價，當(dāng)效價超過800IU/ml時，靜脈放血，分離血清。根據(jù)實(shí)際測定的效價，用牛布病陰性血清將其效價稀釋至320IU/mL，用0.45μm濾器過濾除菌，加入proclin 300至終濃度為0.05％，-20℃保存?zhèn)溆?，作為試劑盒中布病陽性血清?/p>
4.陽性對照血清的檢驗(yàn)
(1)性狀 橙黃或淡黃色澄清液體。
(2)無菌檢驗(yàn) 按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
(3)效價測定 采用試管凝集試驗(yàn)測定陽性對照血清的效價，應(yīng)為1:320。將制備的陽性對照血清作為待檢血清，進(jìn)行FPA檢測，其120<mP<250。將陽性對照血清用陰性對照血清進(jìn)行1:64稀釋作為待檢血清，進(jìn)行FPA檢測，計(jì)算△mP，應(yīng)不低于20。
實(shí)施例4
——試劑盒其它組分的制備和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)
1.標(biāo)記抗原的制備及檢驗(yàn)
(1)標(biāo)記抗原的制備標(biāo)記抗原原液用抗原保護(hù)劑(商品化)稀釋至250、500、1000、2000倍，隨著抗原濃度的降低，F(xiàn)PA檢測的敏感性逐步提高，當(dāng)標(biāo)記抗原作1:1000倍稀釋時，F(xiàn)PA檢測方法的敏感性為5IU/ml，與ELISA方法和布魯氏菌抗體檢測試紙條敏感性一致，因此確定最佳抗原稀釋濃度。稀釋抗原即為FPA試劑盒標(biāo)記抗原，于4℃棕色瓶避光保存。
(2)檢驗(yàn)
1)性狀無色透明液體。
2)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
2.25×樣品稀釋液的配制及檢驗(yàn)
(1)配制稱取Na2HPO4·12H2O 6.25g，NaH2PO4·2H2O 87.5g，NaCl212.5g，Tween-20 12.5ml，蔗糖125g，加去離子水至800ml，調(diào)pH值7.2～7.6，定容至1000ml。加入proclin 300溶液使其終濃度為0.05％，過濾除菌后，無菌分裝。
(2)檢驗(yàn)
1)性狀為無色透明液體。
2)無菌檢驗(yàn) 按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
3)pH值應(yīng)為7.2～7.6。
實(shí)施例5
——布魯氏菌熒光偏振試劑盒(FPA)稀釋液的選擇
分別選用碳酸鹽緩沖液、PBST和含0.5％蔗糖的磷酸緩沖液作為樣品稀釋液，進(jìn)行FPA試驗(yàn)，陽性血清反應(yīng)△mP值最高者作為效果最好的稀釋液。結(jié)果通過對3種包被液的比較，表明含0.5％蔗糖的磷酸緩沖液作為稀釋液的稀釋效果最好(結(jié)果見表1)。
表1 3種稀釋液FPA結(jié)果比較
注：△mP＝樣品的mP—陰性血清mP的平均值
實(shí)施例6
——布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒陽性對照血清的制備
用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對臨床表現(xiàn)健康的2周歲左右成年牛進(jìn)行檢測，篩選布病抗體陰性牛。對篩選的陰性牛用布魯氏菌參考強(qiáng)毒株M28滅活抗原制成菌懸液，以5×1010CFU/牛頸部皮下免疫，3個月后雙倍劑量加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后2周采血。用試管凝集試驗(yàn)測定凝集效價，當(dāng)效價超過800IU/ml時，靜脈放血，分離血清。根據(jù)實(shí)際測定的效價，用牛布病陰性血清將其效價稀釋至320IU/mL，用0.45μm濾器過濾除菌，加入proclin 300至終濃度為0.05％，-20℃保存?zhèn)溆?，作為試劑盒中布病陽性血清?/p>
1.布病陰性羊篩選
采用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對臨床試驗(yàn)牛進(jìn)行檢測，選擇三種方法均檢測為陰性的牛作為制備陽性血清的候選牛。結(jié)果試驗(yàn)中選擇了編號為912、936、963的三份血清檢測，結(jié)果見表2。3份待檢血清樣品與虎紅抗原均無凝集顆粒出現(xiàn)，呈均勻渾濁，判為布病抗體陰性。對照陽性血清與虎紅抗原呈明顯凝集顆粒，液體幾乎完全透明。試管凝集試驗(yàn)中3份待檢血清樣品4個不同稀釋度(1:50、1:100、1:200、1:400)結(jié)果均為陰性。補(bǔ)體試驗(yàn)中3份待檢血清樣品均100％溶血，判為布病抗體陰性。
表2 三種不同方法對待檢血清的檢測結(jié)果
注：(1)虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果說明：++++：出現(xiàn)大的凝集片或顆粒，液體完全透明；+++：有明顯的凝集顆粒，液體幾乎完全透明；++：有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明；+：稍能見到凝集，液體混濁；—：無凝集，液體均勻混濁。
(2)試管凝集試驗(yàn)結(jié)果說明：4+：菌體完全凝集和沉淀，液體100％清亮；3+：菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75％清亮；2+：有顯著的凝集和沉淀，液體50％清亮；1+：有清楚可見的凝集和沉淀，液體25％清亮；—：無凝集和沉淀，液體菌液混濁。
(3)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果說明：P：陽性；N：陰性。
2.免疫
免疫一般只需進(jìn)行兩次。初免：用2ml布魯氏菌M28滅活抗原(5×1010CFU/ml)頸部皮下免疫布病陰性的牛。加強(qiáng)免疫：初免3個月后，雙倍劑量頸部皮下加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后2周采血，用試管凝集試驗(yàn)測定凝集效價應(yīng)不低于1:800。若效價達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，繼續(xù)加強(qiáng)免疫1～2次，15日后再試血，直至效價合格。本發(fā)明912、936號和963號牛進(jìn)行二次免疫后采用試管凝集試驗(yàn)測定的效價分別為1:900、1:1000、1:1200。
3.血清制備
二免14日后采血，測定試管凝集效價，進(jìn)一步用陰性對照血清將分離的陽性血清按比例稀釋到預(yù)期效價為1:320，加入ProClin 300(SUPELCO公司)至終濃度為0.05％，無菌分裝，作為待檢陽性對照血清。
4.檢驗(yàn)
對制備完成的陽性對照血清按如下項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)：
(1)性狀觀察血清制品色澤為淡黃或微紅色澄明液體。
(2)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，為無菌生長。
(3)效價測定將血清作1:140，1:150，1:160，1:170，1:180稀釋進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)，測定其效價。將制備的血清1:64稀釋作為待檢血清，進(jìn)行FPA檢測，計(jì)算△mP，應(yīng)不低于20。
實(shí)施例6
——試劑盒敏感性試驗(yàn)
1.稀釋的布魯氏菌抗體陽性對照血清的靈敏度試驗(yàn)
將布魯氏菌抗體陽性對照血清進(jìn)行2倍梯度稀釋后，用3批實(shí)驗(yàn)室自制試劑盒進(jìn)行檢測，確定該試劑盒對梯度稀釋的陽性對照血清的靈敏度，結(jié)果見表3。由表3可見，3批FPA試劑盒檢測梯度稀釋陽性對照血清的結(jié)果一致，血清效價均檢測至1:64倍(△mP值≥20)。
表3 對梯度稀釋的陽性對照血清的靈敏度檢測
注：布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣本△mP≥20時，布魯氏菌抗體陽性(標(biāo)為“+”)；樣本△mP值<20時，為布魯氏菌抗體陰性(標(biāo)為“－”)。
2.對已知陽性樣本的敏感性試驗(yàn)
采用3批布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒對148份布病陽性血清(其中牛血清70份，羊血清78份)進(jìn)行檢測，布病陽性血清樣本的符合率均為98.0％(145/148)，結(jié)果見表4和表5，顯示了試劑盒較高的敏感性及診斷結(jié)果的可靠性。
表4 對已知陽性樣本的敏感性檢測
注：布魯氏菌熒光偏振(FPA)檢測試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣本△mP≥20時，布魯氏菌抗體陽性(標(biāo)為“+”)；樣本△mP值<20時，為布魯氏菌抗體陰性(標(biāo)為“－”)。
表5 對已知陽性血清的敏感性分析
附注：
——FPA方法使用說明
1用法
1.1樣品處理取動物全血，待血液凝固后，以4000r/min離心10min，收集上清，血清應(yīng)清亮，無溶血。
1.2 1×樣品稀釋液的配制使用前，將25×樣品稀釋液恢復(fù)至室溫(20～25℃)，并搖動，使結(jié)晶溶解(可在37℃水浴中加熱5～10min)，然后用去離子水作1:25稀釋，充分混勻。
1.3操作步驟
1.3.1取反應(yīng)板，將待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清分別加入到ELISA板中，20μl/孔，其中陽性對照血清加1孔(孔1)和陰性對照血清各加3孔(孔2、孔3、孔4)。加樣過程要注意避免產(chǎn)生氣泡。
1.3.2每孔加180μl樣品稀釋液，充分混勻；室溫下孵育反應(yīng)板3～5min后讀取每孔的空白值。
1.3.3每孔立即加入10μl熒光標(biāo)記抗原，充分混勻；室溫下孵育反應(yīng)板3～5min后讀取每孔偏振值。
2結(jié)果判定
2.1計(jì)算公式：偏振值(△mP)＝(樣品mP—陰性對照mP平均值)
2.2試驗(yàn)成立條件：3個陰性對照血清重復(fù)測定孔的值均應(yīng)在70～95mP；1個陽性對照血清孔的值應(yīng)在120～250mP，試驗(yàn)成立。
2.3結(jié)果判定：當(dāng)血清樣本的△mP≥20mP時，為布魯氏菌病抗體陽性；當(dāng)血清樣本的△mP＜20mP時，為布魯氏菌病抗體陰性。
序列表
<110> 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
<120> 布魯氏菌熒光偏振（FPA）檢測試劑盒
<130>
<160> 4
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 對人工序列的描述：引物Feri
<400> 1
GCGCCGCGAA GAACTTATCA A 21（序列1）
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 對人工序列的描述：引物Reri
<400> 2
CGCCATGTTA GCGGCGGTGA 20（序列2）
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 對人工序列的描述：引物Fsuis
<400> 3
GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG 23（序列3）
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 對人工序列的描述：引物RIS711
<400> 4
TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT 24（序列4）
1