本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，涉及一種功能性成分的活性檢測方法，具體來說是一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法。

背景技術(shù)：

免疫活性肽通常是指外源性基因重組或人工化學(xué)合成的耐受原表位肽或變構(gòu)肽。作為一種短肽，免疫活性肽具有來源廣、活性高、穩(wěn)定性強的特點，在功能性食品、保健品及醫(yī)療藥品等領(lǐng)域中有著廣大的應(yīng)用前景。目前，免疫活性肽絕大部分來源于天然產(chǎn)物，在這些免疫活性肽的篩選過程中，淋巴細胞增殖法是常用的免疫活性檢測方法。該法操作過程繁瑣，檢測時間長，靈敏度低，檢測結(jié)果受到淋巴細胞來源、操作人員專業(yè)水平及操作環(huán)境等諸多因素的干擾，因而迫切需要發(fā)展一種更加簡單且準確的。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，免疫活性肽存在不同的抗原表位，當(dāng)免疫活性肽被抗原提呈細胞(apc)識別時，這些表位能與apc表面的mhc類分子發(fā)生特異性結(jié)合，形成mhc類分子-免疫活性肽復(fù)合物，該復(fù)合物與t細胞表面受體(tcr)分子發(fā)生特異性結(jié)合，進而激活自身反應(yīng)性t淋巴細胞的免疫應(yīng)答，使其活化、增殖。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法，所述的這種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測免疫活性肽免疫活性的方法操作過程繁瑣，檢測時間長，靈敏度低的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法，其特征在于包括如下步驟：

1)一個確定流感病毒熒光標記物工作濃度的步驟，用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標記物，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm，發(fā)射波長為520nm下檢測熒光偏振光強度，以達到穩(wěn)定偏振值所對應(yīng)的最小濃度作為流感病毒熒光標記物的工作濃度；

2)一個確定hla-drb4復(fù)合蛋白工作濃度的步驟，用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋hla-drb4復(fù)合蛋白溶液；取100μlhla-drb4復(fù)合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒熒光標記物和100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使流感病毒熒光標記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度，同時使得96孔板中的體積為200ul；將反應(yīng)溶液混勻后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm的條件下檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值60％對應(yīng)的hla-drb4復(fù)合蛋白濃度作為其最佳工作濃度；

3)一個建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線的步驟，以流感病毒素濃度為橫坐標，結(jié)合率為縱坐標建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線，結(jié)合率的計算公式如下：

式中：fp樣品為待檢測樣品的熒光偏振值，fp標記肽為流感病毒熒光標記物標記肽對應(yīng)的熒光偏振值，fp無競爭為流感病毒熒光標記物熒光標記肽和hla-drb4復(fù)合蛋白的熒光偏振值；

4)一個制備免疫活性肽樣品的步驟，稱取200mgii型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于溫度為50℃的酶反應(yīng)器中，按加酶量為80u/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活為10000u/g，收集酶解液，將酶解液于40℃、100rpm的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮；使其終濃度為4mg/ml；

5)一個檢測免疫活性肽免疫活性的步驟，將濃度為4mg/ml的免疫活性肽樣品用雙蒸水按100倍稀釋倍數(shù)稀釋成系列濃度，取總體積為200μl的溶液，該溶液中含有50μl的流感病毒熒光標記物、50μl的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒熒光標記物的濃度符合步驟1)的結(jié)果，所述的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液的濃度符合步驟2)的結(jié)果，將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm下檢測其熒光偏振光強度，然后計算免疫活性肽ic50值，其中，ic50值定義為在競爭性試驗中結(jié)合率為50％時的免疫活性肽的濃度。

本發(fā)明根據(jù)mhc類分子能與免疫活性肽特異性結(jié)合的原理，提出了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振免疫分析法。熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，fpia)是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光。

本發(fā)明利用流行感冒病毒偶聯(lián)fitc熒光素合成熒光標記物，并以該熒光標記物為競爭物，使其與待測免疫活性肽競爭性地與hla-drb4復(fù)合蛋白結(jié)合，通過對結(jié)合率的計算建立了免疫活性肽活性的的熒光偏振定量檢測方法。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進步是顯著的。本發(fā)明建立的免疫活性肽免疫活性的熒光偏振免疫分析方法，為免疫活性肽的高效篩選及制備的提供了一種可靠的分析手段。該法對免疫活性肽免疫活性檢測的ic50為98.32ng/ml，線形范圍為9.82～9985.43ng/ml(ic20-ic80)，具有較高的靈敏度。本發(fā)明的方法具有快速、簡便、高效及可靠的優(yōu)點，本發(fā)明的方法只需要加樣，無需分離和洗滌操作。國內(nèi)外尚未有關(guān)于采用熒光偏振免疫分析法檢測免疫活性肽免疫活性的方法。

附圖說明

圖1是用熒光偏振法建立的流感病毒素的結(jié)合率曲線。

圖2是用熒光偏振法建立的免疫活性肽結(jié)合率曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。另外，本發(fā)明采用的原料均為市場上可以購買的物質(zhì)。

實施例1

流感病毒熒光標記物工作濃度的確定，具體步驟為：

用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標記物(購自于南京肽業(yè)生物科技有限公司)，取200μl于96孔板中，37℃孵育72h，用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm，發(fā)射波長為520nm下檢測其熒光偏振光強度。當(dāng)偏振值達到穩(wěn)定后，所對應(yīng)的流感病毒熒光標記物的最小濃度為5μm，以此作為流感病毒熒光標記物的工作濃度。

實施例2

mhc工作濃度的確定，具體步驟為：

用100mmol/l、ph5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋hla-drb4復(fù)合蛋白溶液(購自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；取100μlhla-drb4復(fù)合蛋白溶液于96孔板，再加入同等體積的流感病毒熒光標記物，使流感病毒熒光標記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度；將反應(yīng)溶液混勻后于37℃孵育72min，用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm的條件下檢測其熒光偏振光強度。當(dāng)熒光偏振光強度達到最大偏振值的60％時，對應(yīng)的hla-drb4復(fù)合蛋白濃度為125nm，此即為hla-drb4復(fù)合蛋白的最佳工作濃度。見附圖1。

實施例3

建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線：以流感病毒素濃度為橫坐標，結(jié)合率為縱坐標建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線。結(jié)合率的計算公式如下：

式中：fp樣品為待檢測樣品的熒光偏振值，fp標記肽為流感病毒熒光標記物標記肽對應(yīng)的熒光偏振值，fp無競爭為流感病毒熒光標記物熒光標記肽和hla-drb4復(fù)合蛋白的熒光偏振值。

實施例4

免疫活性肽樣品的制備：稱取200mgii型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/ml的溶液，置于溫度為50℃的酶反應(yīng)器中。按加酶量為80u/ml加入中性蛋白酶(購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，酶活為10000u/g)酶解3h，收集酶解液。將酶解液于40℃、100rpm的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。

實施例5

免疫活性肽免疫活性的檢測，具體步驟如下：

將濃度為4mg/ml的免疫活性肽用雙蒸水按100倍稀釋倍數(shù)稀釋成系列濃度。取總體積為200μl的溶液，該溶液中含有50μl濃度為5μm的流感病毒熒光標記物、50μl濃度為125nm的hla-drb4復(fù)合蛋白溶液以及100μl的免疫活性肽溶液。將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用spectramaxm5酶標儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm下檢測其熒光偏振光強度。以雙蒸水作為空白對照。計算ic50值，ic50值定義為在競爭性試驗中結(jié)合率為50％時的免疫活性肽的濃度。結(jié)果表明免疫活性肽的ic50＝64.36ng/ml。見附圖2。