本發(fā)明屬于光譜學和生物分析技術領域，具體涉及一種基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺及方法。

背景技術：

近年來，盡管目前人們越來越了解乳腺癌的演變過程，醫(yī)療方式也在不斷的進步，但是乳腺癌患者的死亡率依然非常高。其中的一個原因就是乳腺癌患者被診斷出患有乳腺癌比較晚，所以提高乳腺癌患者的早期診斷準確性顯得至關重要，這能提高乳腺癌患者的存活率。

到目前為止，已經(jīng)有大量的實驗證明腫瘤標志物對于癌癥早期診斷和監(jiān)控有很大的潛力。然而只檢測一種腫瘤標志物從而判斷患者是否患有癌癥是往往不準確的，同時檢測多種腫瘤標志物能夠增加癌癥早期診斷的準確性。如同時檢測三種乳腺癌腫瘤標志物(antigen 15-3)CA153、(antigen 12-5)CA125、(carcinoembryonic antigen)CEA能夠提高乳腺癌診斷的準確性已經(jīng)被證明，所以我們需要一個平臺能夠同時檢測多種腫瘤標志物。

目前對于癌癥腫瘤標志物的檢測主要有SERS、ELISA、LSPR、SPR、RIA、CLEIA等等。由于標志物在早期癌癥患者體內的含量很少，如乳腺癌腫瘤標志物(CA153<30u/ml CA125<35u/ml CEA≤5.9ng/ml)，而SERS能夠提高探測的靈敏度，所以使用SERS檢測技術?；赟ERS的檢測方法主要分為無標和有標檢測，無標探測是指生物分子被直接的檢測，而有標檢測為使用連接上拉曼報告分子的探針間接的檢測目標分子。由于有標檢測相比無標檢測能大幅度的提高檢測的靈敏度，所以有標檢測方法被采用。

近年來，由于微流控芯片具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高，以及可以在幾分鐘甚至更短的時間內進行上百個樣品的同時分析，并且可以在線實現(xiàn)樣品的預處理及分析全過程等的優(yōu)點，使得基于微流控芯片進行DNA、蛋白質等微量物質的探測得到了越來越廣泛的應用。于此同時微流控芯片由于其體積小便于集成，使用樣品和試劑少的同時還能獲得高通道，試劑在微流控通道內反應速度快等特點以及在生物、化學、醫(yī)學等領域獲得了大量的使用?？紤]到實際應用中的便攜性和患者樣品量少等原因，我們選用了PDMS芯片。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提高早期癌癥診斷的準確性和靈敏度，本發(fā)明提供一種基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺，能同時檢測多種腫瘤標志物并能提高檢測靈敏度，可以極大的增強腫瘤標志物的檢測靈敏度，為早期癌癥的診斷提供有力的技術支持。

技術方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺，包括由微流控芯片制成的微流控通道及其內的SERS襯底，以及SERS探針和探測抗體；

所述微流控通道為十字交叉形，橫向通道內為所述SERS襯底，垂直的縱向通道內通入所述SERS探針和探測抗體，交叉區(qū)域即為檢測區(qū)域；

所述SERS襯底由金屬納米粒子通入所述微流控通道內得到，所述SERS襯底上連接有捕獲抗體；

所述SERS探針由金屬納米粒子分別與拉曼報告分子、二抗連接，然后用BSA進行金屬表面空隙的填補制成。

進一步的，所述微流控芯片為PDMS芯片。

進一步的，所述捕獲抗體不少于兩種。

一種基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺的方法，包括以下步驟：

首先，制備SERS探針：

步驟1).制備金屬納米粒子；

步驟2).在步驟1)中得到的金屬納米粒子表面接上拉曼報告分子；

步驟3).在步驟2)中將連接有拉曼報告分子的金屬納米粒子表面連接上捕獲抗體；

步驟4).在步驟3)后使用BSA填補金屬納米粒子表面的空隙形成SERS探針；

其次，制備SERS襯底：

步驟5).將PDMS芯片貼合在羥基化的玻璃片上，形成微流控通道；

步驟6).向所述微流控通道內通入帶正電的溶液；

步驟7).將步驟1)中的金屬納米粒子通入所述微流控通道內，得到SERS襯底；

步驟8).重復步驟6)和步驟7)兩到三次，形成多層SERS襯底；

步驟9).在步驟8)得到的SERS襯底上連接上捕獲抗體；

步驟10).在步驟9)的基礎上通入BSA進行填補金屬表面空隙；

然后，抗體檢測：

步驟11).取下PDMS芯片等待玻璃表面干燥后，在與原來PDMS芯片垂直的方向貼合上新的PDMS芯片；

步驟12).在步驟11)的基礎上通入BSA；

步驟13).在步驟12)后進一步向新的微流通道內通入待測溶液；

步驟14).在步驟13)的基礎上向新的微流控通道內通入與步驟9)對應的探測抗體；

步驟15).在步驟14)后將步驟4)所制備的SERS探針通入到新的微流控通道內；

最后，SERS光譜成像：

步驟16).對步驟11)所形成的通道交叉區(qū)域進行SERS光譜成像。

進一步的，所述步驟2)、3)、4)、9)、10)、12)中的拉曼報告分子、捕獲抗體、BSA通過化學鍵插入到金屬納米粒子表面。

進一步的，所述步驟6)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)中向微流控通道內通入試劑的方法為通過注射泵將裝有試劑的注射器中的試劑通過PE管連接鋼針，然后鋼針插入到所述微流控通道內的方式注射，通過調注射泵參數(shù)控制注射的試劑量和注射速率。

進一步的，所述步驟7)中的所述SERS襯底是利用靜電吸附的原理形成。

進一步的，所述步驟13)和步驟14)中，待測溶液中的腫瘤標志物與捕獲抗體間的連接為抗原和抗體間的特異性識別。

進一步的，所述步驟15)中所述SERS探針與探測抗體的識別為SERS探針上的二抗與所述探測抗體的特異性識別。

進一步的，所述步驟13)～16)中所述待測試劑中若含有腫瘤標志物，則通入探測抗體，會形成“三明治”結構；繼續(xù)通SERS探針，即可檢測該“三明治”結構是否已形成。

有益效果：本發(fā)明提供的基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺，具有以下優(yōu)點：

1、所設計的平臺可以同時檢測多種腫瘤標志物，提高癌癥早期診斷的準確性；

2、所設計的平臺所使用的SERS襯底可以提高檢測的靈敏度；

3、所設計的平臺在抗體-抗原-抗體形成“三明治”結構的基礎上通過連接有二抗的SERS探針進行探測，由于二抗可以檢測一抗的存在并放大信號，并且和SERS技術聯(lián)用可以極大的增加檢測的靈敏度。

4、由于與腫瘤標志物相關的抗體價格相對都較高，而二抗普遍價格較低，所以二抗的使用可以在達到較高檢測靈敏度的同時節(jié)約成本。

5、所設計的平臺由于微流控芯片的使用，使得使用樣品和試劑少的同時還能獲得高通量，并且試劑在微流控通道內反應時具有反應速度快等特點。

6、所設計的平臺尺寸小巧便于攜帶和集成。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測原理示意圖；

圖2為本發(fā)明所設計的一種同時檢測多種腫瘤標志物示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。

如圖1所示為一種基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺，本發(fā)明為一種基于表面增強拉曼散射(SERS)檢測技術和微流控芯片能同時檢測多種腫瘤標志物并能提高檢測靈敏度的平臺，該平臺通過先在微流控通道內形成SERS襯底來提高檢測的靈敏度，然后在SERS襯底上形成經(jīng)典的“三明治”結構以檢測待測試劑中是否含有特定的腫瘤標志物。通過先用PDMS芯片在襯底上連接上特定的捕獲抗體，然后將新的PDMS芯片的放置位置垂直于之前的放置位置以達到在交叉區(qū)域可以同時檢測多種腫瘤標志物的作用。通過通入連接有二抗和拉曼報告分子的SERS免疫探針以達到定性以及定量探測待測試劑中腫瘤標志物的作用，由于二抗可以放大信號，所以可以進一步的提高檢測的靈敏度。整個平臺可以同時定性定量檢測多種腫瘤標志物，對癌癥患者早期診斷出患有癌癥并提高存活率提供了有利的技術支持。

如圖1所示的SERS探針，該探針由金屬納米粒子分別與拉曼報告分子、二抗連接，然后用BSA進行金屬表面空隙的填補制成。圖1所示為本發(fā)明基于SERS檢測技術和微流控芯片平臺的檢測原理，在微流控通道中形成SERS襯底用于增強檢測的靈敏度，然后在襯底上連接上特定的抗體用以捕獲待測試劑中的特定腫瘤標志物，若待測試劑中含有特定的腫瘤標志物，則會在接下來通探測抗體時形成金典的“三明治”結構，如果待測試劑中未含有特定的腫瘤標志物時則不會形成該種“三明治”結構。然后在后續(xù)的通SERS探針時若形成了“三明治”結構則會由于二抗識別一抗而形成如圖1所示的4層結構，如果沒有則不會形成該種特殊結構，通過檢測探針上的拉曼分子信號即可間接定性的判斷待測試劑中是否含有特定的腫瘤標志物。

如圖2所示，通過先用PDMS芯片在襯底上連接上特定的捕獲抗體，然后將新的PDMS芯片的放置位置垂直于之前的放置位置，若在不同的微流控通道中通不同的捕獲抗體，則可以在交叉區(qū)域同時檢測多種腫瘤標志物。

本發(fā)明設計了一種基于SERS檢測技術和微流控芯片能同時檢測多種腫瘤標志物并能提高檢測靈敏度的平臺，利用微流控芯片所提供的特殊環(huán)境以及SERS極高的信號增強作用，再通過形成SERS襯底以及SERS探針來極大的增加檢測的靈敏度以及可以同時檢測多種腫瘤標志物。

本發(fā)明的一種基于SERS檢測技術和微流控芯片能同時檢測多種腫瘤標志物并能提高檢測靈敏度的平臺檢測方法過程，具體可以分為以下步驟：

步驟1).制備金屬納米粒子；

步驟2).在步驟1)中得到的金屬納米粒子表面接上拉曼報告分子；

步驟3).在步驟2)中將連接有拉曼報告分子的金屬納米粒子表面連接上特定捕獲抗體；

步驟4).在步驟3)后使用BSA填補金屬納米粒子表面的空隙形成SERS探針；

步驟5).將PDMS芯片貼合在羥基化過的玻璃片上；

步驟6).向微流控通道內通入帶正電的溶液；

步驟7).利用步驟1)中的金屬納米粒子通入微流控通道內，利用靜電吸附的原理形成SERS襯底；

步驟8).重復步驟6)和步驟7)兩到三次，形成多層SERS襯底；

步驟9).在步驟8)得到的SERS襯底上連接上特定捕獲抗體；

步驟10).在步驟9)的基礎上通入BSA進行填補金屬表面空隙；

步驟11).取下PDMS芯片等待玻璃表面干燥后在與原來PDMS芯片垂直的方向貼合上新的PDMS芯片；

步驟12).在步驟11)的基礎上通入BSA；

步驟13).在步驟12)后進一步向新的微流控通道內通入待測溶液；

步驟14).在步驟13)的基礎上向新的微流控通道內通入與步驟9)對應的特定探測抗體；

步驟15).在步驟14)后將步驟4)所制備的SERS探針通入到微流控通道內；探針與探測抗體的識別為探針上的二抗與特定的探測抗體的特異性識別；

步驟16).對步驟11)所形成的通道交叉區(qū)域進行SERS光譜成像。

其中，步驟2)、3)、4)、9)、10)、12)中的拉曼報告分子、抗體、BSA通過化學鍵插入到金屬納米粒子表面。

其中，步驟6)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)中向微流控通道內通入試劑的方法為通過注射泵將裝有試劑的注射器中的試劑通過PE管連接鋼針，然后鋼針插入到微流控通道內的方式注射，通過調注射泵參數(shù)可以控制注射的試劑量和注射速率。

步驟13)、14)中腫瘤標志物與特定抗體間的連接為抗原和抗體間的特異性識別。

實施例

如圖1和如圖2所示，本發(fā)明一種基于SERS檢測技術和微流控芯片能同時檢測多種腫瘤標志物并能提高檢測靈敏度的平臺檢測的過程包括以下步驟：

1)銀納米粒子的制備，首先，將390ml去離子水和0.072g AgNO₃以130℃在攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，然后加入10ml，1％的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱至溶液呈黃綠色，停止加熱，在室溫下讓溶液冷卻，從而制成銀膠以備后用.

2)SERS探針的制備，取6ml銀膠用離心機以11000rpm的速率離心30分鐘，去掉上層清液加入4ml去粒子水。然后，向4ml的銀膠溶液中加入40μl的10mmol的4MBA并在攪拌狀態(tài)下讓其混合至少兩個小時。最后，取1.5ml混合后溶液以900rpm的速率離心20分鐘，去掉上清液然后加入1ml的BBS緩沖液。將50ul的1mg/ml的羊抗小鼠加入到之前處理好的1ml 4-MBA標記的銀膠中，讓其在4℃下放置2h。然后，以6500rpm的速率離心12min，去掉上清液中多余的抗體并向沉淀中加入1ml的BBS緩沖液。接著,加入10μl 5％的BSA溶液以填補銀納米粒子表面未被4-MBA和羊抗小鼠覆蓋的空隙，然后將其放置在4℃下1h。最后以6500rpm的速率離心12min，去掉上清液并加入200μl的BBS緩沖液。

3)玻璃片和PDMS芯片預處理，所使用的玻璃預先浸泡在98％H₂SO₄和30％H₂O₂以體積比3:1混合的溶液中，在使用時用大量的去離子水沖洗，然后用氮氣吹干，置于溫度設定為80℃的烘箱中。所使用的PDMS芯片預先浸沒在濃度為99％的酒精中，并密封好放置于超聲機中超洗2h，然后將PDMS芯片從酒精中取出并用大量的去離子水沖洗，然后用氮氣吹干，重復上述步驟至少兩次，然后置于80℃的烘箱中2h。從烘箱中取出PDMS芯片并將其與玻璃片貼合，確保芯片與玻璃片之間沒有氣泡。

4)免疫檢測，如圖2所示首先使用注射泵將1％的PDDA以0.8μl/min的速率注射到PDMS芯片上的微流控通道內25min，然后向微流控通道內以相同的速率通入濃縮了20倍的銀膠通25min。重復上述步驟。然后我們向微流控通道內以0.8μl/ml的速率通抗體兔抗CA153、兔抗CA125、兔抗CEA 25min,然后靜置25min以使抗體充分連接到銀納米粒子上，通抗體的目的是捕獲待測試劑中的腫瘤標志物CA153、CA125、CEA。接著以速率為2μl/min通5％BSA持續(xù)3min以沖掉未連接到納米粒子上的抗體，然后速率改為0.8μl/m通25min為了防止非特異性吸附。然后，小心的拿下PDMS芯片并等待玻璃片上的液體在室溫下自然風干。從烘箱中取出一塊新的PDMS芯片并使PDMS芯片與玻璃片貼合，PDMS上的通道方向與玻璃片上的襯底方向垂直。向微流控通道內依次用注射泵注BSA、待測試劑、特定的對應探測抗體小鼠抗CA153、小鼠抗CA125、小鼠抗CEA、SERS探針，每一種反應物都是以0.8μl/m的速率，注射時間都是25min，并且注射完都讓其靜置25min，而且每次在靜置完之后都用注射泵以2μl/m的速率注射PBST持續(xù)3分鐘。等上述步驟全部做完之后將微流控通道中的液體用空氣將其排出之后就可以SERS測量了。

上述實施例的結果為：當襯底上修飾了不同的捕獲抗體時，含有與襯底上捕獲抗體相對應的腫瘤標志物的待測試劑，當最終進行SERS測量時其SERS信號相對較強，而待測試劑中含有與襯底上捕獲抗體不對應的腫瘤標志物其SERS信號則相對較弱。上述結果說明所述基于SERS檢測技術和微流控芯片的多種腫瘤標志物檢測平臺及方法可以很好的通過SERS信號的測量來判斷待測試劑中是否含有特定的乳腺癌腫瘤標志物，而且該平臺相較與現(xiàn)有技術其在使用樣品和試劑少的同時還能獲得高通量，并且試劑在微流控通道內反應時具有反應速度快等特點，而且由于二抗的使用可以使得整個檢測的成本降低。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。