本發(fā)明涉及食品安全檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

鄰苯二甲酸二丁酯是應(yīng)用于塑料工業(yè)的主要增塑劑和軟化劑，該物質(zhì)可以通過食品包裝材料直接遷移到食品中，也可通過含有該物質(zhì)的塑料制品遷移到環(huán)境中，從而對空氣、水、土壤和食品造成污染。通過呼吸、飲食和皮膚接觸進入人體后會對人體健康造成危害。

針對食品安全領(lǐng)域中危害較大的鄰苯二甲酸二丁酯添加物，傳統(tǒng)的檢測方法是：利用人工合成半抗原免疫小鼠獲取單克隆抗體技術(shù)再進一步制備相關(guān)的檢測試劑盒，該工藝流程復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，單抗的穩(wěn)定性差，靈敏度低等因素制約著相關(guān)檢測試劑的規(guī)?；a(chǎn)與使用；另外試紙條中膠體金和磁性納米顆粒生物相容性低，只能進行半定量，不能準確的定量。除了試劑盒的檢測方法，現(xiàn)有技術(shù)還公開有利用高效液相色譜或氣相色譜等精密儀器檢測鄰苯二甲酸二丁酯的方法，但是該方法測量處理繁瑣、時間長，儀器使用費昂貴等缺點。因此，如何構(gòu)建一種集快速、定量、靈敏和高特異性等技術(shù)優(yōu)勢為一體的檢測方法稱為本領(lǐng)域急需解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于量子點和納米抗體技術(shù)的鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條，所述試紙條包括樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板，所述樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板；所述的量子點標記墊上設(shè)置有量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

優(yōu)選的，所述量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體是由鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體與水溶性熒光量子點通過酰胺鍵結(jié)合得到的。

優(yōu)選的，所述的水溶性熒光量子點的粒徑為10～100nm。

優(yōu)選的，所述的水溶性熒光量子點的發(fā)射波長為620nm，發(fā)紅色光。

優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)噴涂鄰苯二甲酸二丁酯包被抗原，所述質(zhì)控區(qū)噴涂與量子點鄰苯二甲酸二丁酯標記納米抗體特異結(jié)合的抗抗體。

本發(fā)明還提供了一種試紙條的制備方法，將量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體噴涂在標記墊上得到所述量子點標記墊，將所述樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上得到試紙條。

本發(fā)明還提供了一種量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，所述抗體的制備方法包括以下步驟：

將鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和水溶性熒光量子點溶液進行偶聯(lián)反應(yīng)，得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

優(yōu)選的，所述水溶性熒光量子點和鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體的質(zhì)量比為20～30:1。

優(yōu)選的，所述步驟1)中羧基活化的溫度為35～40℃，羧基活化的時間為20～40min。

優(yōu)選的，所述步驟2)中偶聯(lián)的溫度為35～40℃，偶聯(lián)的時間為3～4h。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的基于量子點的鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條，通過將量子點技術(shù)和納米抗體結(jié)合，可定量的對鄰苯二甲酸二丁酯進行快速檢測，靈敏度高，鄰苯二甲酸二丁酯的檢出限低至為1ng/ml；特異性強，交叉反應(yīng)少，本發(fā)明所述的試紙條對鄰苯二甲酸二異丁酯交叉反應(yīng)為49％，鄰苯二甲酸二甲酯，鄰苯二甲酸二辛酯，鄰苯二甲酸二異辛酯和鄰苯二甲酸二異壬酯的交叉反應(yīng)小于1％。

附圖說明

圖1為鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條示意圖；

圖2為量子點的電鏡圖；

圖3為量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條檢測值與濃度標準曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條，所述試紙條包括樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板，所述樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板；所述的量子點標記墊上設(shè)置有量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

在本發(fā)明中，所述的量子點標記墊上設(shè)置有量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，所述的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體為能特異識別鄰苯二甲酸二丁酯的小分子多肽。

在本發(fā)明中，所述的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體是通過酵母展示技術(shù)獲得的新型納米抗體篩選文庫，然后利用鄰苯二甲酸二丁酯作為靶標進行高通量篩選，獲取特異的小分子多肽。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的將所述的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體與水溶性熒光量子點通過酰胺鍵結(jié)合，得到量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

在本發(fā)明中，所述的水溶性熒光量子點的粒徑優(yōu)選為10～100nm，更優(yōu)選的為2～20nm，最優(yōu)選的為5～15nm；所述的水溶性熒光量子點的發(fā)射波長為620nm；所述的水溶性熒光量子點發(fā)紅色光，所述的水溶性熒光量子點可通過熒光強度檢測。在本發(fā)明中，所述的量子點優(yōu)選的為硒化鎘/硫化鋅量子點。

在本發(fā)明中，將所述樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到試紙條。在本發(fā)明中，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)含有鄰苯二甲酸二丁酯包被抗原，所述質(zhì)控區(qū)含有與量子點鄰苯二甲酸二丁酯標記納米抗體特異結(jié)合的抗抗體；

本發(fā)明中，所述試紙條的工作原理如下：在樣品墊加入待測樣品后，基于競爭法原理，當(dāng)樣品中沒有待測鄰苯二甲酸二丁酯小分子時，鄰苯二甲酸二丁酯標記抗體層析到檢測區(qū)處噴涂的包被抗原并與抗原結(jié)合，在檢測區(qū)處形成包被抗原-量子點標記抗體免疫復(fù)合物；同時，多余的量子點標記抗體則在質(zhì)控區(qū)處與抗抗體結(jié)合形成量子點標記抗體-抗抗體免疫復(fù)合物；當(dāng)樣品中有待測鄰苯二甲酸二丁酯小分子時，鄰苯二甲酸二丁酯小分子與鄰苯二甲酸二丁酯標記抗體結(jié)合后層析到檢測區(qū)處噴涂的包被抗原而不被包被抗原結(jié)合，在檢測區(qū)處不能形成包被抗原-量子點標記抗體免疫復(fù)合物；使用熒光檢測判讀儀測定檢測區(qū)的熒光強度，通過與設(shè)定的標準曲線比對而確定樣品中的鄰苯二甲酸二丁酯小分子含量。質(zhì)控區(qū)的測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標。

在本發(fā)明中，所述的鄰苯二甲酸二丁酯檢測試紙條優(yōu)選與干燥劑共同包裝成鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒，所述干燥劑的功能為防潮，防止所述試紙條失效，所述的干燥劑為本領(lǐng)域常規(guī)干燥劑，無其他特殊要求。本發(fā)明將得到的試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，得到量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒。

在本發(fā)明中，還涉及所述的試紙條的制備，所述的試紙條的制備包括將量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體噴涂在標記墊上得到所述量子點標記墊；將所述樣品墊、量子點標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上得到試紙條。

其中還包括設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜的制備，具體的方法為：將鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)BSA包被抗原和抗抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述的鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)BSA包被抗原的濃度優(yōu)選的為1～2mg/ml，更優(yōu)選的為1.5mg/ml，所述抗抗體的濃度優(yōu)選的為0.5～1.5mg/ml，更優(yōu)選的為1mg/ml；所述抗原和抗抗體的噴涂優(yōu)選的使用噴膜儀；本發(fā)明在得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜后對其進行干燥，所述的干燥采用本領(lǐng)域常規(guī)的干燥方法即可，無其他特殊要求。

本發(fā)明還提供了一種量子點標記的鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，所述抗體的制備方法，包括以下步驟：將鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和水溶性熒光量子點溶液偶聯(lián)得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

在本發(fā)明中，水溶性量子點的制備優(yōu)選的包括以下步驟，向硒粉和油酸中通入氮氣，加熱到220℃后溶于十八烯，制備得到硒前驅(qū)體；

向氧化鎘和油酸中通入氮氣，加熱到240℃后溶于十八烯，制備得到鎘前驅(qū)體；

向鋅粉和油酸中通入氮氣，加熱到310℃后溶于十八烯，制備得到鋅前驅(qū)體；

向硫粉和油酸中通入氮氣，加熱到150℃后溶于十八烯，制備得到硫前驅(qū)體；

將所述硒前驅(qū)體加熱到240℃，然后與鎘前驅(qū)體混合，制備得到硒化鎘量子點。

在本發(fā)明中，所述硒粉和用于溶解硒粉的油酸的質(zhì)量比優(yōu)選的為1：(2.8～3.2)，更優(yōu)選的為1：3；所述氧化鎘和用于溶解氧化鎘油酸的質(zhì)量比優(yōu)選的為1：(2.8～3.2)，更優(yōu)選的為1：3；所述鋅粉和用于溶解鋅粉的油酸的質(zhì)量比優(yōu)選的為1：(7.5～8.5)，更優(yōu)選的為1：8；所述硫粉和用于溶解硫粉的油酸的質(zhì)量比優(yōu)選的為1：(7.5～8.5)，更優(yōu)選的為1：8。

本發(fā)明在得到上述硒、鎘、鋅和硫前驅(qū)體后，優(yōu)選的將硒前驅(qū)體加熱到240℃，然后與鎘前驅(qū)體混合，制備得到硒化鎘量子點；本發(fā)明在得到硒化鎘量子點后，依次交替的向其中滴加硫前驅(qū)體和鋅前驅(qū)體，得到核殼結(jié)構(gòu)的油相硒化鎘/硫化鋅量子點。

本發(fā)明在得到油相硒化鎘/硫化鋅量子點后，通過聚馬來酸十六醇酯包覆修飾油相硒化鎘/硫化鋅量子點，制備得到水溶性熒光量子點，所述的油相硒化鎘/硫化鋅量子點與聚馬來酸十六醇酯的摩爾比優(yōu)選的為1:75～85，更優(yōu)選的為1:80；所述包覆修飾的溶液為氯仿，所述包覆修飾的時間優(yōu)選的為22～26h，更優(yōu)選的為24h；所述的包覆修飾的溫度優(yōu)選的為20～30℃，更優(yōu)選的為25℃；所述包覆修飾是在密閉條件下緩慢攪拌進行的，所述攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選的為10～100rpm；本發(fā)明在所述的包覆修飾步驟后，還包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟除去氯仿；并將去除氯仿后的硒化鎘/硫化鋅量子點用10％氨水溶解，并通過揮發(fā)除氨，用去離子水清洗后得到水溶性熒光量子點。

得到水溶性量子點后，本發(fā)明將所述水溶性量子點進行羧基活化，在本發(fā)明中水溶性熒光量子點羧基活化的溫度優(yōu)選的為35～40℃，更優(yōu)選的為37℃，羧基活化時間優(yōu)選的為20～40min，更優(yōu)選的為30min。

在本發(fā)明中所述的水溶性熒光量子點的羧基活化優(yōu)選的包括以下步驟：2A)制備含量子點的MES溶液；2B)制備量子點-MES-EDC溶液；2C)制備量子點-MES-EDC-NHS溶液。

在本發(fā)明中，將水溶性熒光量子點分散到MES緩沖液中得到含量子點的MES溶液，所述的水溶性熒光量子點和MES的質(zhì)量體積比優(yōu)選的為5:1，所述的MES緩沖液的濃度優(yōu)選的為0.05～0.15M，更優(yōu)選的為0.1M，所述MES緩沖液的pH值優(yōu)選的為4.5～5.0，更優(yōu)選的為4.7。本發(fā)明在得到含量子點的MES溶液后，向所述含量子點的MES溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)得到量子點-MES-EDC溶液，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺在量子點-MES-EDC溶液中的終濃度優(yōu)選的為4～6mM，更優(yōu)選的為5mM。

本發(fā)明在得到量子點-MES-EDC溶液后，向所述的量子點-MES-EDC溶液中加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)得到量子點-MES-EDC-NHS溶液，所述的N-羥基丁二酰亞胺在量子點-MES-EDC-NHS溶液中的終濃度優(yōu)選的為3～8mM，更優(yōu)選的為5mM。

在本發(fā)明中，得到羧基活化后的水溶性熒光量子點溶后，鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和羧基活化后的水溶性熒光量子點溶液偶聯(lián)，所述偶聯(lián)的溫度優(yōu)選的為35～40℃，更優(yōu)選的為37℃，所述偶聯(lián)的時間優(yōu)選的為3～4h，更優(yōu)選的為3.5h。

本發(fā)明中所述的偶聯(lián)優(yōu)選的為將羧基活化后的水溶性熒光量子點和鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體混合到硼砂緩沖液中進行偶聯(lián)；本發(fā)明在所述的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，加入BSA溶液對剩余活性羧基位點進行封閉；本發(fā)明在所述封閉反應(yīng)結(jié)束后優(yōu)選的進行洗滌、重懸得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體。

在本發(fā)明中所述羧基活化后的水溶性熒光量子點和鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體的質(zhì)量比優(yōu)選的為20～30:1；更優(yōu)選的為23～27:1，最優(yōu)選的為25:1；所述硼砂緩沖液的濃度優(yōu)選的為45～55mM，更優(yōu)選的為50mM，所述硼砂緩沖液的pH優(yōu)選的為8.2～8.7，更優(yōu)選的為8.5。

所述封閉反應(yīng)的溫度優(yōu)選的為35～40℃，更優(yōu)選的為37℃，所述封閉反應(yīng)的時間優(yōu)選的為0.3～0.7h，更優(yōu)選的為0.5h。

本發(fā)明在封閉反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選的用pH7.4的0.02M PBS緩沖液洗滌、重懸得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，于4℃保存待用。

在本發(fā)明中，將制備得到的量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體用PBS緩沖液稀釋后得到稀釋抗體溶液，所述PBS緩沖液的濃度優(yōu)選的為0.01～0.03M，更優(yōu)選的為0.02M，所述稀釋的倍數(shù)優(yōu)選的為80～120倍，更優(yōu)選的為100倍；本發(fā)明在得到稀釋抗體溶液后，使用所述的稀釋抗體溶液浸泡玻璃纖維膜，并將浸泡后的玻璃纖維素膜在37℃烘箱中干燥，得到量子點標記墊。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒及其制備方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

硒粉，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到220℃溶于十八烯，制備硒前驅(qū)體；將氧化鎘，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到240℃溶于十八烯，制備鎘前驅(qū)體；將鋅粉，油酸，按1：8比例通氮氣加熱到310℃溶于十八烯，制備鋅前驅(qū)體；將硫粉通氮氣加熱到150℃溶于十八烯，制備硫前驅(qū)體。將硒前驅(qū)體加熱到240℃，然后注入鎘前驅(qū)體，制備硒化鎘量子點。硒化鎘量子點，通過依次交替滴加硫和鋅前驅(qū)體，得到核殼結(jié)構(gòu)的油相硒化鎘/硫化鋅量子點。油相硒化鎘/硫化鋅量子點與聚馬來酸十六醇酯的按1:80摩爾比溶于氯仿，并在室溫密閉條件下10rpm攪拌24h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿；用10％氨水溶解，并通過揮發(fā)除氨和用去離子水清洗后得到水溶性熒光量子點。

5mg水溶性熒光量子點分散到lmL MES緩沖液(0.1M、pH4.7)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)至終濃度為5mM、加入NHS(N-羥基丁二酰亞胺)至終濃度為10mM，在37℃，反應(yīng)30min得到羧基活化后的量子點。離心分離后取0.2mg鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和上述羧基活化后的量子點混合到50mMpH8.5的硼砂緩沖液中37℃下反應(yīng)3.5h時。反應(yīng)結(jié)束后，加入終濃度為5％的BSA溶液對剩余活性羧基位點進行封閉，封閉反應(yīng)在37℃下進行0.5h。完成后，用pH7.4的0.02MPBS緩沖液洗滌、重懸得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，4℃保存待用。將制得的量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體用0.02M PBS緩沖液稀釋100倍，將此溶液浸泡玻璃纖維膜并在37℃烘箱中干燥，得到量子點標記墊。

將所述鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)BSA包被抗原濃度配制為1.5mg/ml，抗抗體濃度配制為1mg/ml分別用噴膜儀噴在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，干燥后使用。

將樣品墊、干燥好的量子點鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測鄰苯二甲酸二丁酯試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，得到量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒。

實施例2

硒粉，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到220℃溶于十八烯，制備硒前驅(qū)體；將氧化鎘，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到240℃溶于十八烯，制備鎘前驅(qū)體；將鋅粉，油酸，按1：8比例通氮氣加熱到310℃溶于十八烯，制備鋅前驅(qū)體；將硫粉通氮氣加熱到150℃溶于十八烯，制備硫前驅(qū)體。將硒前驅(qū)體加熱到240℃，然后注入鎘前驅(qū)體，制備硒化鎘量子點。硒化鎘量子點，通過依次交替滴加硫和鋅前驅(qū)體，得到核殼結(jié)構(gòu)的油相硒化鎘/硫化鋅量子點。油相硒化鎘/硫化鋅量子點與聚馬來酸十六醇酯的按1:80摩爾比溶于氯仿，并在室溫密閉條件下50rpm攪拌24h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿；用10％氨水溶解，并通過揮發(fā)除氨和用去離子水清洗后得到水溶性熒光量子點。

5.5mg水溶性熒光量子點分散到lmLMES緩沖液(0.1M、pH4.7)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)至終濃度為5mM、加入NHS(N-羥基丁二酰亞胺)至終濃度為10mM，在37℃，反應(yīng)30min得到羧基活化后的量子點。離心分離后取0.26mg鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和上述羧基活化后的量子點混合到50mMpH8.5的硼砂緩沖液中37℃下反應(yīng)3.8h時。反應(yīng)結(jié)束后，加入終濃度為5％的BSA溶液對剩余活性羧基位點進行封閉，封閉反應(yīng)在37℃下進行0.5h。完成后，用pH7.4的0.02MPBS緩沖液洗滌、重懸得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，4℃保存待用。將制得的量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體用0.02M PBS緩沖液稀釋110倍，將此溶液浸泡玻璃纖維膜并在37℃烘箱中干燥，得到量子點標記墊。

將所述鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)BSA包被抗原濃度配制為1.45mg/ml，抗抗體濃度配制為0.95mg/ml分別用噴膜儀噴在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，干燥后使用。

將樣品墊、干燥好的量子點鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測鄰苯二甲酸二丁酯試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，得到量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒。

實施例3

硒粉，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到220℃溶于十八烯，制備硒前驅(qū)體；將氧化鎘，油酸，按1：3比例通氮氣加熱到240℃溶于十八烯，制備鎘前驅(qū)體；將鋅粉，油酸，按1：8比例通氮氣加熱到310℃溶于十八烯，制備鋅前驅(qū)體；將硫粉通氮氣加熱到150℃溶于十八烯，制備硫前驅(qū)體。將硒前驅(qū)體加熱到240℃，然后注入鎘前驅(qū)體，制備硒化鎘量子點。硒化鎘量子點，通過依次交替滴加硫和鋅前驅(qū)體，得到核殼結(jié)構(gòu)的油相硒化鎘/硫化鋅量子點。油相硒化鎘/硫化鋅量子點與聚馬來酸十六醇酯的按1:80摩爾比溶于氯仿，并在室溫密閉條件下30rpm攪拌24h，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿；用10％氨水溶解，并通過揮發(fā)除氨和用去離子水清洗后得到水溶性熒光量子點。

4.5mg水溶性熒光量子點分散到lmLMES緩沖液(0.1M、pH4.7)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)至終濃度為5mM、加入NHS(N-羥基丁二酰亞胺)至終濃度為10mM，在37℃，反應(yīng)30min得到羧基活化后的量子點。離心分離后取0.24mg鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體和上述羧基活化后的量子點混合到50mMpH8.5的硼砂緩沖液中37℃下反應(yīng)3.2h時。反應(yīng)結(jié)束后，加入終濃度為5％的BSA溶液對剩余活性羧基位點進行封閉，封閉反應(yīng)在37℃下進行0.5h。完成后，用pH7.4的0.02MPBS緩沖液洗滌、重懸得到量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體，4℃保存待用。將制得的量子點標記鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體用0.02M PBS緩沖液稀釋90倍，將此溶液浸泡玻璃纖維膜并在37℃烘箱中干燥，得到量子點標記墊。

將所述鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)BSA包被抗原濃度配制為1.55mg/ml，抗抗體濃度配制為1.05mg/ml分別用噴膜儀噴在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，干燥后使用。

將樣品墊、干燥好的量子點鄰苯二甲酸二丁酯納米抗體標記墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測鄰苯二甲酸二丁酯試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，得到量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒。

實施例4

測試上述實施例1中制備得到的量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒的靈敏度和交叉反應(yīng)情況。

稱取鄰苯二甲酸二丁酯標準品，用甲醇配制為1mg/mL濃度標準樣品，然后用0.02M的PBS(pH＝7.4)緩沖液進行稀釋，配制濃度為0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的標準溶液，使用量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒進行檢測；每個樣品加樣50ul，10分鐘后采用熒光檢測儀讀取檢測結(jié)果；繪制標準曲線時采用雙對數(shù)模型進行標準曲線的擬合。以B的自然對數(shù)ln(B)為縱坐標，以標準溶液實際濃度C(ng/ml)的自然對數(shù)ln(C)為橫坐標。檢測值比值按公式B＝A/(A0-A)計算(A0為0ng/ml標準樣檢測值，A為標準樣或待測樣檢測值)。檢測標準曲線如圖2所示，檢出限為1ng/ml。

交叉反應(yīng)的測定，使用量子點鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒分別檢測鄰苯二甲酸二甲酯，鄰苯二甲酸二異丁酯，鄰苯二甲酸二辛酯，鄰苯二甲酸二異辛酯，鄰苯二甲酸二異壬酯，結(jié)果顯示檢測鄰苯二甲酸二丁酯的量子點定量試劑盒對鄰苯二甲酸二異丁酯交叉反應(yīng)率為49％，與其余4種藥物交叉反應(yīng)小于1％。

由以上實施例可知，本發(fā)明中所述的基于量子點的鄰苯二甲酸二丁酯檢測試劑盒通過將量子點技術(shù)和納米抗體結(jié)合，可實現(xiàn)了對鄰苯二甲酸二丁酯小分子的定量檢測，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。