專利名稱：Angptl4作為缺氧檢測的標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)和檢測領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種可用于缺氧檢測的血清標(biāo)記物ANGPTL4及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ANGPTL4基因(最初該基因被發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室命名為ppll58)[朱洪新等，中華腫瘤雜志(2002)24(2) =123-125]就是利用此功能篩選技術(shù)平臺從人胎盤cDNA文庫中克隆到的新基因，該基因cDNA全長為1943bp，開放閱讀框含1218bp，編碼406個氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為45.2kDa。N端有一疏水信號肽和卷曲(Coiled-Coil)結(jié)構(gòu)域，C端有一纖維蛋白原樣(Fibrinogen-like)結(jié)構(gòu)域。并于2000年首先將該基因(原基因名為ppll58)的cDNA序列在GenBank上登錄(登錄號為AF202636)?，F(xiàn)已同Yoon等克隆的PGAR[Mol. Cell. Biol.，Jul 2000 ；20 :5343-5349]和 Kim 等克隆的 HFARP [Biochem. J，2000，346 :603-610]由 HUGO統(tǒng)一正式命名為 ANGPTL4 (angiopoietin-like 4)。ANGPTL4在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越引起人們的關(guān)注。目前的研究表明ANGPTL4對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響是非常復(fù)雜的，在不同的腫瘤中有不同的作用對Lewis肺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞B16R)的研究表明ANGPTL4能夠通過對血管和腫瘤細(xì)胞的雙重影響，即改變血管的滲透及腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和侵潤能力，來抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。與此相反，在乳腺癌的最新研究表明，TGFP I在乳腺癌中誘導(dǎo)ANGPTL4的上調(diào)，乳腺癌細(xì)胞分泌的ANGPTL4能夠破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接，增加肺毛細(xì)管的滲透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，與TGFP I共同啟動了乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。另外，超過一半的晚期原位實(shí)體瘤存在局部缺氧，并分散在腫瘤的不同區(qū)域。造成腫瘤缺氧的原因主要是正常血管輸送的氧氣不能滿足腫瘤快速生長的需要。為了減輕缺氧，腫瘤細(xì)胞會釋放促進(jìn)血管新生的分子，新生血管往往使血管網(wǎng)紊亂，有大量的血管盲 端、扭曲血管以及動靜脈間短路，易于腫瘤細(xì)胞穿透而形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時缺氧細(xì)胞基因組非常不穩(wěn)定，具有更強(qiáng)的侵潤性和轉(zhuǎn)移能力。因此缺氧對腫瘤的進(jìn)展包括腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用。據(jù)報(bào)道對缺氧或者說缺氧信號最為敏感的轉(zhuǎn)錄因子是HIF。其中HIF-I a與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等多種生物學(xué)行為相關(guān)。HIF-Ia是一個螺旋-環(huán)-螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于哺乳動物細(xì)胞中；在常氧條件下，HIF-Ia的脯氨酰和天冬酰胺酰殘基被羥化，然后與VHL蛋白結(jié)合，發(fā)生降解，因此其半衰期非常短；而在缺氧條件下，HIF-Ia不被降解，入核與HIFlP結(jié)合形成異源二聚體，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能。HIF-Ia有可以調(diào)控很多與血管新生、細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的侵潤和糖代謝等有關(guān)的基因。缺氧與腫瘤進(jìn)展尤其是轉(zhuǎn)移密切相關(guān)密切相關(guān)，腫瘤是否處于缺氧狀態(tài)的判斷一般是根據(jù)腫瘤組織的形態(tài)學(xué)以及缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的改變，這需要腫瘤病人手術(shù)后得到腫瘤組織才能進(jìn)行檢測。從科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)角度看，HIF-I a蛋白在常氧下半衰期非常短，檢測不方便。
綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏令人滿意的檢測缺氧狀態(tài)的方法，更缺乏血清檢測缺氧的方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)可用于檢測(尤其是血清檢測)缺氧(狀態(tài))的標(biāo)志物和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于檢測(尤其是血清檢測)缺氧(狀態(tài))的標(biāo)志 物及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特異性抗體的用途，它們用于制備缺氧檢測的診斷試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記選自下組生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑是單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性抗體是單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的缺氧檢測是血清檢測。在另一優(yōu)選例中，所述的血清檢測是ELISA法、或雙抗夾心時間分辨免疫熒光法(TRFIA 法)。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于缺氧檢測的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有(a) 一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特異性抗體；以及(b)標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于缺氧檢測；或者所述的試劑盒含有(a’)一容器，所述容器中含有抗HIF-I a的特異性抗體和另一容器以及位于該容器中的特異性擴(kuò)增ANGPTL4啟動子區(qū)域HREl的特異性引物；以及(b’ )標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于缺氧檢測。。在另一優(yōu)選例中，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記選自下組生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，它被(a)用作血清學(xué)檢測缺氧的標(biāo)志物；或(b)用于制備血清缺氧檢測的試劑盒。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種“HIF-1 a -ANGPTL4”復(fù)合物，所述的復(fù)合物是HIF-I a蛋白結(jié)合于ANGPTL4的啟動子區(qū)域HREl而形成的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述的HIF-I a和ANGPTL4都來源于人。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明第四方面中所述的復(fù)合物的用途，它被用于制備缺氧檢測的診斷試劑或試劑盒。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種ANGPTL4的啟動子區(qū)域HREl的用途，它被用于制備 “HIF-1 a -ANGPTL4” 復(fù)合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了缺氧上調(diào)ANGPTL4的表達(dá)。各圖如下
a.實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果表明缺氧能明顯上調(diào)SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)；b.蛋白印跡檢測結(jié)果表明缺氧能明顯上調(diào)SMMC-7721、Huh7和MHCC-97L細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)；c. DFO在常氧條件下模擬缺氧環(huán)境，能夠明顯上調(diào)MHCC-97L細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞中HIF-1 a和ANGPTL4的蛋白水平。d.MHCC-97L和SMMC-7721細(xì)胞在裸鼠皮下接種后，每周取材一次，獲得的瘤組織進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果表明隨著時間的延長，腫瘤體積的增大，瘤內(nèi)缺氧程度增加，HIF-Ia和ANGPTL4表達(dá)上調(diào)并在缺氧區(qū)共表達(dá)。e.免疫組化結(jié)果表明在肝癌患者臨床標(biāo)本中HIF-1 a的表達(dá)和ANGPTL4的表達(dá)密切相關(guān)。圖2顯示了缺氧通過HIF-1 a上調(diào)MHCC-97L和SMMC-7721細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)。各圖如下a.在腿(1-971細(xì)胞中利用811 應(yīng)干擾11正-10和HIF-2 a后，在缺氧條件下培養(yǎng)24h，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明HIF-1 a干擾后，即使在缺氧條件下，ANGPTL4的表達(dá)不再明顯上調(diào)；而干擾HIF_2a則無影響；b.在 SMMC-7721 細(xì)胞中利用 siRNA 干擾 HIF-1 a 和 HIF-2 a，結(jié)果同 a ；c.不同濃度2ME2處理缺氧條件下培養(yǎng)的MHCC-97L細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞，蛋白印跡檢測HIF-1 a和ANGPTL4蛋白水平的變化。圖3顯示了 HIF-1 a能夠與ANGPTL4啟動子區(qū)域的HRE結(jié)合。各圖如下a.生物信息學(xué)分析表明ANGPTL4啟動子區(qū)域有5個HRE ;b. ChIP實(shí)驗(yàn)表明HIF-1 a能夠與ANGPTL4啟動子區(qū)域的HREl結(jié)合，表明ANGPTL4是HIF-1 a的靶基因。圖4顯示了 ANGPTL4抗體抑制缺氧誘導(dǎo)的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。各圖如下a.缺氧能夠促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，加入ANGPTL4抗體后，能明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；b.為遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；*指P < 0. 001。圖5顯示了 ANGPTL4抗體抑制缺氧誘導(dǎo)的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。各圖如下a.采用Western blot檢測ANGPTL4在各肝癌細(xì)胞系中蛋白的表達(dá)；b.采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表達(dá)；c.采用Western blot檢測ANGPTL4在過表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白的表達(dá)；
d.采用ELISA方法檢測過表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)系培養(yǎng)上清中分泌性ANGPTL4蛋白的表達(dá)；e. SMMC-7721過表達(dá)ANGPTL4細(xì)胞接種裸鼠6周后，裸鼠血清中ANGPTL4濃度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠明顯上調(diào)ANGPTL4，并證實(shí)了 ANGPTL4是HIF-1 a的靶基因，受其直接調(diào)控。進(jìn)一步的分析表明在裸鼠成瘤組織和肝癌患者腫瘤組織中ANGPTL4的表達(dá)和HIF-1 a的表達(dá)是呈正相關(guān)的。ANGPTL4是血管生 成素樣基因家族的成員之一，與腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、浸潤和血管新生密切相關(guān)。ANGPTL4作為一個分泌性蛋白，在細(xì)胞培養(yǎng)上清和人血清中均可以利用ELISA檢測到，方法簡便。因此血清ANGPTL4可以作為缺氧檢測的標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。ANGPTL4蛋白和基因在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明蛋白”、“ ANGPTL4蛋白”、“ ANGPTL4多肽”或“血管生成素樣蛋白ANGPTL4”可互換使用，都指具有人血管生成素樣蛋白ANGPTL4氨基酸序列AAG22490(gi =10732648)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素樣蛋白ANGPTL4。此外，該術(shù)語還包括全長的ANGPTL4及其片段。本發(fā)明所指的ANGPTL4蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突變體以及其功能上活性的片段。在本發(fā)明中，術(shù)語“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素樣蛋白基因ANGPTL4”可互換使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636)的核酸序列。需理解的是，當(dāng)編碼相同的氨基酸時，密碼子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。在得到了 ANGPTL4的氨基酸片段的情況下，可根據(jù)其構(gòu)建出編碼它的核酸序列，并且根據(jù)核苷酸序列來設(shè)計(jì)特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的ANGPTL4核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的ANGPTL4多肽。一般來說有以下步驟(I).用本發(fā)明的編碼人ANGPTL4多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，ANGPTL4多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ANGPT L4編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；動物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 o特異性抗體在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明抗體”和“抗ANGPTL4的特異性抗體”可互換使用。本發(fā)明還包括對人ANGPTL4多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人ANGPTL4基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ANGPTL4基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ANGPTL4蛋白的分子，也包括那些并不影響人ANGPTL4蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人ANGPTL4基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab”或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人ANGPTL4基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人ANGPTL4蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì) 胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人 ANGPTL4蛋白功能的抗體以及不影響人ANGPTL4蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ANGPTL4基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ANGPTL4基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E. Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得?？谷薃NGPTL4蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測標(biāo)本(尤其是血清樣本)中的人ANGPTL4蛋白。檢測方法利用ANGPTL4存在于血清中，且與腫瘤缺氧密切相關(guān)這一特點(diǎn)，本發(fā)明還提供了缺氧檢測的方法，尤其是血清學(xué)檢測方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，本發(fā)明提供一種檢測血清ANGPTL4的ELISA法以及時間分辨免疫熒光法(TRFIA)。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種缺氧檢測的試劑盒，它含有本發(fā)明的抗ANGPTL4的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。用本發(fā)明的人缺氧檢測的血清學(xué)診斷試劑盒檢測為陽性的對象，其腫瘤缺氧程度明顯高于正常人群或一般肝癌患者。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(I)首次提供了一種通過血清標(biāo)志物檢測和判斷腫瘤缺氧程度的方法，有助于檢測或輔助檢測缺氧狀態(tài)，從而有助于盡早采取相應(yīng)治療措施。(2)血清檢測方法更方便快速，更容易為病人接受。(3)便于動態(tài)監(jiān)察HCC患者的病情進(jìn)展。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
實(shí)驗(yàn)方法缺氧實(shí)驗(yàn)缺氧實(shí)驗(yàn)在三氣(C02/N2/02)細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前一天取對數(shù)期生長的細(xì)胞接入6孔板，并在37°C ,5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后(約24小時)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三氣培養(yǎng)箱，在37°C，5% CO2, 2% O2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時，裂解細(xì)胞，制備蛋白和總RNA。DFO處理模擬缺氧環(huán)境實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前一天取對數(shù)期生長的細(xì)胞接入6孔板，并在37°C，5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)；鐵離子螯合劑(甲磺酸去鐵胺)(Deferoxamine mesylate,縮寫DF0,購自Sigma公司)稀釋于含10% FBS的DMEM中，DFO設(shè)梯度濃度，分別為2 y M、20 y M和200 y M ;細(xì)胞培養(yǎng)約24小時后，每孔加入2ml配制好的含DFO的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，裂解細(xì)胞，制備蛋 白和總RNA。2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,縮寫2ME2,購自sigma公司)處理實(shí)驗(yàn)同上述接種細(xì)胞，2ME2設(shè)梯度濃度稀釋于含10 % FBS的DMEM中，濃度分別為0. 2uMUuM,5uM,25uM^P 50 y M ;細(xì)胞培養(yǎng)約24小時后，每孔加入配制好的含2ME2的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，裂解細(xì)胞，制備蛋白和總RNA。HIF-1 a和HIF-2 a干擾后缺氧實(shí)驗(yàn)siRNA干擾HIF-1 a和HIF-2 a實(shí)驗(yàn)按“siRNA干擾試驗(yàn)” 一節(jié)中所述方法進(jìn)行；干擾24小時后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三氣培養(yǎng)箱，在37°C，5% CO2, 2% O2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時，裂解細(xì)胞，制備蛋白和總RNA。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)將siRNA干擾片段采用逆向轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前將40pmolsiRNA片段和2 ill Lipofectamine 2000分別溶于100 yl Opti-MEM，輕輕搖勻，靜置5分鐘；然后將Lipofectamine 2000稀釋液加入到siRNA片段稀釋液中，再靜置20分鐘；在靜置期間將貼壁細(xì)胞消化懸于無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度約為I X IO5個/ml ;待SiRNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物形成后，將混合液吸至12孔板中；然后將Iml細(xì)胞懸液加入已含有siRNA-Lipofectamine 2000溶液的孔中混勻；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37°C，5% CO2和飽和濕度條件下，培養(yǎng)24-48小時再進(jìn)行基因敲減的驗(yàn)證和功能實(shí)驗(yàn)。siRNA干擾缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 a和HIF-2 a表達(dá)實(shí)驗(yàn)siRNA干擾片段采用逆向轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中。各有效干擾片段序列見表I 表I. siRNA片段序列
權(quán)利要求
1.血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)或其特異性抗體的用途，其特征在于，用于制備缺氧檢測的診斷試劑或試劑盒。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述可檢測標(biāo)記選自下組生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑是單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的缺氧檢測是血清檢測。
6.一種用于缺氧檢測的診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有 (a)一容器，所述容器中含有ANGPTL4蛋白或其特異性抗體；以及 (b)標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于缺氧檢測； 或者所述的試劑盒含有 (a’)一容器，所述容器中含有抗HIF-I α的特異性抗體和另一容器以及位于該容器中的特異性擴(kuò)增ANGPTL4啟動子區(qū)域HREl的特異性引物；以及 (b’ )標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于缺氧檢測。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的ANGPTL4蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測標(biāo)記。
8.—種血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)的用途，其特征在于，它被(a)用作血清學(xué)檢測缺氧的標(biāo)志物；或(b)用于制備血清缺氧檢測的試劑盒。
9.ー種“HIF-la-ANGPTL4”復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物是HIF-Ia蛋白結(jié)合于ANGPTL4的啟動子區(qū)域HREl而形成的復(fù)合物。
10.如權(quán)利要求9所述的復(fù)合物的用途，其特征在于，用于制備缺氧檢測的診斷試劑或試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種ANGPTL4作為缺氧檢測的標(biāo)志物及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4蛋白)在制備缺氧檢測的診斷試劑或試劑盒中的用途。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的缺氧檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/533GK102692496SQ20111006803
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者李紅, 李錦軍, 葛超, 顧健人 申請人:上海市腫瘤研究所