用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明作為用于檢測(cè)糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR胰腺癌的標(biāo)志物使用，則可與慢性胰腺炎患者或健康者區(qū)別開而特異性地判斷胰腺癌。另外，可監(jiān)測(cè)手術(shù)后的胰腺癌患者的預(yù)后的狀況。還有，通過與其他胰腺癌標(biāo)志物、例如，CA19-9等組合使用，可與慢性胰腺炎患者或健康者區(qū)別開來而更特異性地判斷。
【專利說明】用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物。更具體而言，本發(fā)明涉及用于與慢性胰腺 炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物、為了檢測(cè)胰腺癌測(cè)定特定的糖蛋白質(zhì)的方 法、用于檢測(cè)胰腺癌的方法、特定的糖蛋白質(zhì)作為胰腺癌檢測(cè)標(biāo)志物的用途、胰腺癌檢測(cè)用 試劑盒等。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 肝膽胰腺區(qū)域的惡性腫瘤、特別是胰腺癌已知是在消化器官癌之中最預(yù)后不良的 癌，其主要的理由可舉，由于向周圍器官的浸潤一轉(zhuǎn)移容易，所以被診斷時(shí)已經(jīng)成進(jìn)行性 癌，從而切除率低，再者，有效的輔助療法尚未確立。從而，就是為了升高唯一可期待根治的 外科切除的效率，鑒定胰腺癌的特異性診斷標(biāo)志物也是急務(wù)，開發(fā)以該蛋白質(zhì)作為目標(biāo)的 分子目標(biāo)治療藥，再者，為了得到更高的治療效果，通過進(jìn)行個(gè)別化治療來圖謀治療成績的 升高是重要的。
[0003] 作為胰腺癌標(biāo)志物，已知有CA19-9 (非專利文獻(xiàn)1)。另外，也有人提案將人觸珠蛋 白的巖藻糖基化糖鏈作為胰腺癌標(biāo)志物使用（專利文獻(xiàn)1)。但是，這些的標(biāo)志物未必在靈 敏度或特異性的方面充分，再者，需求新的胰腺癌標(biāo)志物的開發(fā)。
[0004] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】
[0005] 【專利文獻(xiàn)】
[0006] 專利文獻(xiàn)1 :特開2009-168470號(hào)公報(bào) [0007]【非專利文獻(xiàn)】
[0008]非專利文獻(xiàn) 1 Jr. J. Cancer，53 卷，197_2〇2 頁 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0009]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0010] 在這樣的環(huán)境下，本發(fā)明旨在提供用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物、特別是，用于與慢性 胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物。再者，本發(fā)明提供為了檢測(cè)胰腺癌而測(cè) 定特定的蛋白質(zhì)的方法、及用于檢測(cè)胰腺癌的方法。
[0011] 【解決課題的技術(shù)方案】
[0012] 本發(fā)明人以作為在靈敏度或特異性的方面優(yōu)良的新的胰腺癌標(biāo)志物的開發(fā)作為 目的，至現(xiàn)在使用蛋白組學(xué)方法進(jìn)行在肝膽胰腺區(qū)域中的幾個(gè)癌特異性蛋白質(zhì)的鑒定。于 是，以低侵襲并且廣泛使用性高的待測(cè)樣品的血清作為樣品，通過使用糖蛋白質(zhì)提取和TMT 試劑（串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽試劑）定量進(jìn)行對(duì)胰腺癌的血清中的特異性糖蛋白質(zhì)的鑒定，發(fā)現(xiàn)用 于與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺癌的新的標(biāo)志物，從而完成本發(fā)明。
[0013] 從而，本發(fā)明涉及：
[0014] [1].用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物，其含糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR ;
[0015] [2].上述[1]所述的標(biāo)志物，其用于與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺 癌；
[0016] [3].測(cè)定C4BPA或PIGR的方法，其用于基于待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR 來檢測(cè)胰腺癌；
[0017] [4].上述[3]所述的方法，其中待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的測(cè)定由免 疫測(cè)定法、電泳法、質(zhì)譜分析法或液相層析法進(jìn)行；
[0018] [5].用于檢測(cè)胰腺癌的方法，其包括測(cè)定待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR， 而使C4BPA或PIGR的量與胰腺癌的檢測(cè)相關(guān)；
[0019] [6].上述[5]所述的用于檢測(cè)胰腺癌的方法，其除C4BPA或PIGR之外，還包括使 CA19-9的量與胰腺癌的檢測(cè)相關(guān)；
[0020] [7].糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR作為用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物的用途；
[0021] [8].上述[7]所述的用途，其是用于與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺 癌的標(biāo)志物；
[0022] [9].胰腺癌檢測(cè)用試劑盒，其含用于測(cè)定糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的試劑；及
[0023] [10].上述[9]所述的胰腺癌檢測(cè)用試劑盒，其含針對(duì)糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的 抗體。
[0024] 【發(fā)明效果】
[0025] 作為本發(fā)明的用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物，使用糖蛋白質(zhì)C4BPA、PIGR，則與慢性胰 腺炎患者或健康者區(qū)別開來而可特異性地判斷胰腺癌的可能性。另外，可監(jiān)測(cè)手術(shù)后的胰 腺癌患者的預(yù)后的狀況。還有，通過與其他胰腺癌標(biāo)志物、例如，CA19-9等組合使用，可與 慢性胰腺炎患者或健康者區(qū)別開來而更特異性地判斷。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0026] 【圖1】顯示對(duì)來自各種血清待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)的利用SDS-PAGE的檢查結(jié)果。
[0027] 【圖2】顯示對(duì)各種血清待測(cè)樣品的利用ELISA法的C4BPA的測(cè)定結(jié)果。
[0028] 【圖3】顯示對(duì)各種血清待測(cè)樣品的利用ELISA法的PIGR的測(cè)定結(jié)果。
[0029] 【圖4】顯示在胰腺癌的診斷中的C4BPA、PIGR及CA19-9的R0C曲線。
[0030] 【實(shí)施方式】
[0031] 接下來，再詳細(xì)地說明本發(fā)明。
[0032] 由本發(fā)明得知，對(duì)于從健康者、慢性胰腺炎患者及胰腺癌患者（手術(shù)前及手術(shù)后） 采集的血清待測(cè)樣品，通過使用糖蛋白質(zhì)提取和TMT試劑定量進(jìn)行對(duì)胰腺癌的血清中的特 異性糖蛋白質(zhì)的鑒定的結(jié)果，與來自健康者、慢性胰腺炎患者及胰腺癌患者（手術(shù)后）的血 清相比，來自胰腺癌患者（手術(shù)前）的血清中存在高水平的作為糖蛋白質(zhì)的C4BPA或PIGR， 從而發(fā)現(xiàn)，C4BPA及PIGR可成為胰腺癌標(biāo)志物。
[0033] 本發(fā)明的用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物包括C4BPA或PIGR。C4BPA、即C4b-結(jié)合蛋 白 a鏈?zhǔn)且訳niProt的登錄編號(hào)P04003表示的糖蛋白質(zhì)（http://www.uniprot.org/ uniprot/P04003)。C4BPA控制補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑。C4BPA是C3bINA的輔因子，水解 補(bǔ)體片段C4b。再者，有促進(jìn)C4bC2a復(fù)合物、補(bǔ)體片段C2a的分解的功能（Barbosa et al. , Infection and Immunity, Mr. 2009, p. 1137-1143 ；Dahlback et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 80, pp. 3461-3465, Junel983)。
[0034] 另一方面，PIGR、即多聚免疫球蛋白受體是以UniProt的登錄編號(hào)P01833表示的 糖蛋白質(zhì)（http://www. uniprot. org/uniprot/P01833)。PIGR在上皮細(xì)胞的基底外側(cè)表 面與聚合物的IgA及IgM結(jié)合。結(jié)合的復(fù)合物在其切斷的過程從膜貫通區(qū)域輸送到細(xì)胞 外（Deitcher et al.，The Journal of Cell Biology, Volume 102,March 1986,911-919; Asano et al. , Journal of Oral Science, Vol. 53,No. 2, 147-156,2011)〇
[0035] 本發(fā)明的用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物包括C4BPA或PIGR。特別是，本發(fā)明的標(biāo)志物 與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而可檢測(cè)胰腺癌。
[0036] 在本發(fā)明的測(cè)定的方法中，為了基于待測(cè)樣品中的C4BPA或PIGR檢測(cè)胰腺癌而測(cè) 定 C4BPA 或 PIGR。
[0037] 在本發(fā)明中，通過測(cè)定待測(cè)樣品中的C4BPA或PIGR，使C4BPA或PIGR的量與胰腺 癌的檢測(cè)相關(guān)，從而可檢測(cè)胰腺癌。在實(shí)際測(cè)定待測(cè)樣品中的C4BPA或PIGR時(shí)，也可測(cè)定 作為糖蛋白質(zhì)的C4BPA或PIGR，另外，例如，用待測(cè)樣品處理等自糖蛋白質(zhì)除去糖鏈，也可 測(cè)定C4BPA或PIGR的氨基酸序列部分。
[0038] 在本發(fā)明中，例如，可測(cè)定從疑患胰腺癌的患者或胰腺癌的術(shù)后患者采集的待測(cè) 樣品中的C4BPA或PIGR的水平而判斷胰腺癌的罹患可能性或預(yù)后的狀況。此時(shí)，在C4BPA 或PIGR的水平與健康者的水平相比高時(shí)，可認(rèn)為檢測(cè)胰腺癌的可能性高，另外，當(dāng)在術(shù)后 的胰腺癌患者的待測(cè)樣品中C4BPA或PIGR的水平降低時(shí)，可認(rèn)為胰腺癌的預(yù)后良好。
[0039] 在本發(fā)明中，通過與其他胰腺癌標(biāo)志物、例如，CA19-9等組合使用，可與慢性胰腺 炎患者或健康者區(qū)別開來而更特異性地可檢測(cè)胰腺癌。
[0040] 作為可在本發(fā)明中使用的待測(cè)樣品，可舉出從疑患胰腺癌的患者或胰腺癌的術(shù)后 患者采集的血清、血漿、血液、尿等。
[0041] 為了測(cè)定C4BPA或PIGR，可采用現(xiàn)在已知的所有的方法?？膳e出例如，免疫測(cè)定 法、電泳法、質(zhì)譜分析法、液相層析法等。
[0042] 作為免疫測(cè)定法，可舉出例如，免疫比濁測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法等。免疫測(cè)定法 是，在將以往知道的蛋白質(zhì)作為抗原進(jìn)行測(cè)定的免疫測(cè)定法中，作為抗體，可通過使用作為 抗C4BPA抗體或抗PIGR抗體的多克隆抗體或單克隆抗體來實(shí)施。作為抗C4BPA抗體或抗 PIGR抗體，可使用市售品的抗體，另外，也可由公知的方法制造。作為這些抗體，可為特異性 地識(shí)別C4BPA或PIGR的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)的，也可為特異性地識(shí)別含糖鏈的全體結(jié)構(gòu)的。
[0043] 在免疫比濁測(cè)定法中，只要是使待測(cè)樣品中的C4BPA或PIGR與抗C4BPA抗體或抗 PIGR抗體反應(yīng)而進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，結(jié)果，由發(fā)生的渾濁的程度測(cè)定C4BPA或PIGR的濃度， 就不特別限定。作為那樣的方法，可例示TIA法、乳膠免疫比濁法、比濁法。TIA法是將在免 疫比濁測(cè)定法中渾濁的程度用，例如，340nm?800nm的吸光度測(cè)定的方法。另外，乳膠免疫 比濁法是，在免疫比濁測(cè)定法中，使用作為抗體，使抗C4BPA抗體或抗PIGR抗體與乳膠粒子 結(jié)合的進(jìn)行測(cè)定的方法。再者，比濁法是將在免疫比濁測(cè)定法中渾濁的程度，使以一定角度 以上的大小散射的光集合而作為散射光測(cè)定的方法。
[0044] 作為酶聯(lián)免疫測(cè)定法，可舉出以板作為支持體的EIA法。接下來具體記述。首先， 向聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯等的其公知的固相直接或間 接物理結(jié)合或化學(xué)結(jié)合、利用親和性使結(jié)合抗C4BPA抗體和抗PIGR抗體作為第一抗體。致 敏抗體量，例如，通常是lng?100mg/ml的范圍。
[0045] 在將C4BPA或PIGR用酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定時(shí)，例如，向由物理結(jié)合或化學(xué)結(jié)合、親 和性等與固相結(jié)合的第一抗體加用于測(cè)定C4BPA或PIGR的待測(cè)樣品而進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)一 定時(shí)間之后，將固相清洗，加第二標(biāo)記抗體而進(jìn)行第二次反應(yīng)。再度清洗固相，測(cè)定與固相 結(jié)合的標(biāo)記部分。
[0046] 在以上說明的免疫測(cè)定法中，代替抗C4BPA抗體或抗PIGR抗體，可使用特異性地 識(shí)別C4BPA或PIGR的糖鏈而與它們結(jié)合一交聯(lián)的蛋白質(zhì)、即作為特異性結(jié)合偶體的凝集 素。作為凝集素，優(yōu)選特異性地識(shí)別巖藻糖的凝集素，可舉出例如，與具有L-巖藻糖的糖鏈 結(jié)合的橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素（AAL)等。此時(shí)，例如，也可使用凝集素和抗C4BPA抗體或抗 PIGR抗體，各自作為與固相結(jié)合的特異性結(jié)合偶體及標(biāo)記的特異性結(jié)合偶體之任何組合， 用夾心法測(cè)定。
[0047] 在使用這些抗體或凝集素等的特異性偶體的免疫測(cè)定法中，在標(biāo)記物質(zhì)中可使用 辣根過氧化物酶（HRP)堿性磷酸酶等的酶。例如，在利用HRP標(biāo)記抗體時(shí)，在底物可使用已 知的DAB、TMB、0PD等。另外，在標(biāo)記物質(zhì)中，不僅是如HRP-樣的酶，可舉出膠體金、銪等 的標(biāo)記金屬或FITC、若丹明、Texas Red、AleXa、GFP等的化學(xué)、生物性的各種熒光物質(zhì)、32P、 51Cr等的放射性物質(zhì)等標(biāo)記可能的所有的物質(zhì)。另外，在本發(fā)明中使用標(biāo)記物質(zhì)時(shí)，也可使 用親和素-生物素系統(tǒng)或鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)。
[0048] 作為電泳法，一般而言可舉出SDS-PAGE法。SDS-PAGE法是在聚丙烯酰胺制成的 凝膠中使蛋白質(zhì)電泳，由在一定時(shí)間的移動(dòng)度與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的數(shù)、即，分子量成比 例來分類蛋白質(zhì)的方法。此外，也有以醋酸纖維素作為支持體的等。在蛋白質(zhì)的染色中，有 考馬斯一亮一藍(lán)、麗春紅S染色、酰胺黑染色、利用直接酶活性的方法等。例如，將一定量的 待測(cè)樣品與一般樣品緩沖液以一定的比例1:1混合，加熱處理。一般而言，在沸騰水中處理 5分鐘左右。其后，將樣品應(yīng)用于凝膠。聚丙烯酰胺電泳是以低電流運(yùn)行有利于好的結(jié)果。 一般而言，是5?100mA左右。電泳后,用上述試劑進(jìn)行染色，用由醋酸、甲醇、水混合液構(gòu) 成的脫色液處理，則可確認(rèn)C4BPA或PIGR的條帶。由該條帶的強(qiáng)弱，可測(cè)定C4BPA或PIGR 的水平。
[0049] 另外，利用蛋白印跡法的檢測(cè)也有效。即，將實(shí)施電泳的凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜 或PVDF膜等，接下來，使作為第一抗體的抗C4BPA抗體或抗PIGR抗體、再者，作為第二標(biāo)記 抗體的HRP標(biāo)記抗IgG反應(yīng)，接下來，用HRP顯色試劑（Wako)顯色，由相當(dāng)于C4BPA或PIGR 的條帶的顯色程度，可測(cè)定C4BPA或PIGR。
[0050] 作為質(zhì)譜分析法，可舉出最近開發(fā)快速推進(jìn)的使用質(zhì)譜分析器的分析方法。例 如，可例示使用表面增強(qiáng)激光脫離/離子化（Surface Enhanced Laser Desorption/ Ionization)飛行時(shí)間型質(zhì)譜分析計(jì)（SELDI-TOF MS法）、基質(zhì)輔助激光脫離/離子化 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)飛行時(shí)間型質(zhì)譜分析計(jì)（MALDI-T0F MS 法）、ESI 法（電噴射離子化（Electrospray Ionization))的方法。SELDI-TOF MS 法以 在芯片表面的官能團(tuán)上均一地捕捉目的物質(zhì)的狀態(tài)除去雜質(zhì)，由于用激光進(jìn)行離子化，得 到有再現(xiàn)性的S/N比高的離子光譜，所以優(yōu)選。
[0051] 在SELDI-TOF MS法的情況中，通常、將待測(cè)樣品預(yù)處理之后，使吸附于芯片，供給 到SELDI-TOF MS質(zhì)量計(jì)。在待測(cè)樣品是血清的情況中，優(yōu)選使用白蛋白的吸附劑，或用緩 沖液清洗至在離子交換芯片上白蛋白不帶電荷，并將白蛋白從系統(tǒng)中除去。作為SELDI-TOF MS法中使用的使蛋白質(zhì)結(jié)合的芯片，只要是可吸附C4BPA或PIGR的蛋白質(zhì)的芯片，就不特 別限定種類?？衫臼杷曰螂x子交換等的對(duì)蛋白質(zhì)具有親和性的官能團(tuán)被修飾的芯片 (也稱為化學(xué)芯片）、固定化針對(duì)C4BPA或PIGR的抗體的芯片（生物化學(xué)芯片）等。
[0052] MALDI-TOF MS法是通過向待測(cè)樣品混合吸收激光的化合物，照射數(shù)納秒的短時(shí)間 的激光來將待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)離子化，測(cè)定的方法。作為使蛋白質(zhì)結(jié)合的芯片，可使用與 SELDI-TOF MS法中使用的芯片同樣的。在ESI法等的情況中，優(yōu)選將蛋白酶處理等的預(yù)處 理的待測(cè)樣品供給到高效液相層析等的分離手段和直結(jié)的質(zhì)譜分析計(jì)。
[0053] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將能分別檢測(cè)的同位素標(biāo)記C4BPA或同位素標(biāo)記PIGR作 為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到樣品中。在這些實(shí)施方式中，樣品中存在的內(nèi)源性C4BPA或內(nèi)源性 PIGR和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的兩方的全部或一部分被離子化而在質(zhì)譜分析計(jì)中生成能檢測(cè)的多 個(gè)離子，由質(zhì)譜分析法檢測(cè)從各自生成的1個(gè)以上的離子。在關(guān)聯(lián)實(shí)施方式中，同位素標(biāo) 記C4BPA或同位素標(biāo)記PIGR也可含 13C及15N同位素標(biāo)記纈氨酸、精氨酸、異亮氨酸、亮氨 酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸亞基、或者它們的組合。在再優(yōu)選的實(shí)施方式中，同位素標(biāo)記 C4BPA或同位素標(biāo)記PIGR是，碳原子被 13C同位素取代，或者氮原子被15N同位素取代，內(nèi)源 性C4BPA或內(nèi)源性PIGR與天然的C4BPA或PIGR相比帶來質(zhì)量的增加。在優(yōu)選的關(guān)聯(lián)實(shí)施 方式中，同位素標(biāo)記有碳原子之一部分或全部被 13C同位素取代，氮原子之一部分或全部被 15N同位素取代的氨基酸亞基。此同位素標(biāo)記C4BPA或同位素標(biāo)記PIGR的質(zhì)量通常比天然 的更高。
[0054] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，C4BPA離子或PIGR離子的有無及/或量通過與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)的比較，與待測(cè)樣品中的量相關(guān)聯(lián)。
[0055] 液相層析法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，在本發(fā)明中，可采用這些公知的方法。 例如，可舉出使用作為特異性地識(shí)別C4BPA或PIGR的糖鏈而與它們結(jié)合一交聯(lián)的蛋白質(zhì)的 凝集素、例如，以與具有L-巖藻糖的糖鏈結(jié)合的橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素（AAL)作為支持體的 親和柱的液相層析法等。
[0056] 在本發(fā)明中，也提供用于進(jìn)行以上說明的各種測(cè)定法的，含用于測(cè)定糖蛋白質(zhì) C4BPA或PIGR的試劑的胰腺癌檢測(cè)用試劑盒。在這些的試劑盒，根據(jù)測(cè)定法，可含有各種試 劑作為構(gòu)成成分。例如，為了進(jìn)行免疫測(cè)定法，可含針對(duì)糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的抗體有。 作為這些抗體，也可使用市售品的抗體，另外，也可由公知的方法制造。作為這些抗體，可為 特異性地識(shí)別C4BPA或PIGR的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)的，另外，也可為特異性地識(shí)別含糖鏈的 全體結(jié)構(gòu)的。在試劑盒中，再根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)的顯色系統(tǒng)試劑等，實(shí)施的測(cè)定法，可含有公知 的試劑。 【實(shí)施例】
[0057] 接下來舉優(yōu)選的實(shí)施例更具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例等的任何限 定。
[0058] 【實(shí)施例1】
[0059] 【胰腺癌標(biāo)志物的鑒定】
[0060] 使用從健康者45名、慢性胰腺炎患者25名、胰腺癌患者57名采集的血清待測(cè)樣 品，進(jìn)行胰腺癌標(biāo)志物的探索，再進(jìn)行鑒定。
[0061]【A.方法】
[0062] 【1.對(duì)象的血清】
[0063] 將從健康者45名、慢性胰腺炎患者25名、胰腺癌患者57名采集的血清待測(cè)樣品 用于胰腺癌標(biāo)志物的探索及鑒定用的血清。
[0064] 【2.從各合并血清的糖蛋白質(zhì)的提取】
[0065] 隨機(jī)地各提取5名健康者、慢性胰腺炎患者、胰腺癌患者（手術(shù)前一手術(shù)后）的血 清，合并而得到3種合并血清。
[0066]用巖藻糖特異性凝集素，使用作為利用與具有L-巖藻糖的糖鏈結(jié)合的橙黃網(wǎng)孢 盤菌凝集素（AAL)的糖蛋白質(zhì)的檢索試劑盒的VECTREX AAL結(jié)合和洗脫試劑盒（Vector Laboratories公司），從各合并血清進(jìn)行糖蛋白質(zhì)的提取。
[0067] 向AAL珠20 ii L放入合并血清20 ii L，溫育1小時(shí)之后，以12000Xg離心1分鐘， 舍去上清。向殘留物放入 TENT 緩沖液（100mM Tris，pH8. 0 ;10mM EDTA ;1. 5M NaCl ;1. 0% (v/v)Tween20)80ii L而混合之后，以12000Xg離心1分鐘，舍去上清。向殘留物放入洗脫 緩沖液（1. 25ML-巖藻糖；TENT緩沖液）20 ii L而混合之后，于室溫溫育1小時(shí)，以12000 X g 離心1分鐘后，回收上清，從各合并血清提取糖蛋白質(zhì)，得到3種標(biāo)記化用樣品。
[0068] 【3.糖蛋白質(zhì)的標(biāo)記化】
[0069] 標(biāo)記化用樣品的標(biāo)記化使用TMT質(zhì)譜標(biāo)記試劑盒和試劑（Thermo SCIENTIFIC公 司）。
[0070] 在利用TMT(串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽）試劑的此方法中，可對(duì)各合并血清中的特定的糖蛋白 質(zhì)以物理性質(zhì)相同、分子量不同的方式附加標(biāo)簽。結(jié)果，由此方法，通過混合多個(gè)標(biāo)記化樣 品可定量各樣品的特定的糖蛋白質(zhì)的存在比。接下來示具體性的糖蛋白質(zhì)的標(biāo)記化的實(shí) 施。
[0071] 對(duì)在上述2得到的標(biāo)記化用樣品20 y L (血清20 y L相當(dāng)）進(jìn)行AAL (橙黃網(wǎng)孢盤 菌凝集素）珠處理，接下來，放入50mM TEAB(三乙基銨碳酸氫鹽）60iiL、2%SDS 5iiL和 200mM TCEP(Tris(2-羧乙基）膦）5iiL，于55°C溫育1小時(shí)，再加375mM碘乙酰胺5iiL，于 室溫靜置30分鐘。其后，向得到的各樣品加用100%乙腈42 y L可溶化的各質(zhì)量的TMT試 劑40 y L，于室溫溫育1小時(shí)，再加5%羥胺8 y L，于室溫靜置15分鐘而停止反應(yīng)。其后，將 各樣品用冷丙酮清洗，再冷凍干燥而得到完成糖蛋白質(zhì)的標(biāo)記化樣品。
[0072] 【4?利用SDS-PAGE的蛋白質(zhì)的鑒定】
[0073] 作為SDS-PAGE，使用10-20 %的梯度凝膠（DRC公司）。使泳道1流過將預(yù)處理健康 者合并血清、慢性胰腺炎患者合并血清、胰腺癌患者合并血清的完成標(biāo)記化糖蛋白質(zhì)混合 的樣品，使泳道2流過將預(yù)處理健康者合并血清、胰腺癌患者（手術(shù)前）、胰腺癌患者（手術(shù) 后）合并血清的完成標(biāo)記化糖蛋白質(zhì)混合的樣品。再有，在泳道1中，對(duì)于健康者、慢性胰腺 炎患者、胰腺癌患者（手術(shù)前）來源的樣品，作為質(zhì)量報(bào)告物，各自使用TMT-126、TMT-127、 TMT-128的標(biāo)簽。另外，在泳道2中，在健康者合并血清、胰腺癌患者（手術(shù)前）、胰腺癌患 者（手術(shù)后）來源的樣品中，各自使用TMT-126、TMT-127、TMT-128的標(biāo)簽。
[0074] 對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行考馬斯染色，檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶（圖1)。將各泳道從凝膠以18 分割切出，使用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。得到的消化片段使用HPLC分離，用LTQ Orbitrap XL(Thermo SCIENTIFIC公司）進(jìn)行MS/MS測(cè)定。測(cè)常數(shù)據(jù)用Mascot搜索引擎（Matrix science公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)。各合并血清的蛋白質(zhì)的定量比較用Proteome Discoverer(Thermo SCIENTIFIC 公司）進(jìn)行。
[0075]【B.結(jié)果】
[0076] 用質(zhì)譜分析裝置定量比較待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)存在量的結(jié)果示于表1。
[0077]【表1】
[0078]
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物，其包含糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR。
2. 權(quán)利要求1所述的標(biāo)志物，其用于與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺癌。
3. 測(cè)定C4BPA或PIGR的方法，其用于基于待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR來檢 測(cè)胰腺癌。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的測(cè)定由免疫測(cè) 定法、電泳法、質(zhì)譜分析法或液相層析法進(jìn)行。
5. 用于檢測(cè)胰腺癌的方法，其包括測(cè)定待測(cè)樣品中的糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR，而使 C4BPA或PIGR的量與胰腺癌的檢測(cè)相關(guān)。
6. 權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)胰腺癌的方法，其除C4BPA或PIGR之外，還包括使 CA19-9的量與胰腺癌的檢測(cè)相關(guān)。
7. 糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR作為用于檢測(cè)胰腺癌的標(biāo)志物的用途。
8. 權(quán)利要求7所述的用途，其是用于與慢性胰腺炎或健康者區(qū)別開來而檢測(cè)胰腺癌的 標(biāo)志物。
9. 胰腺癌檢測(cè)用試劑盒，其含用于測(cè)定糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的試劑。
10. 權(quán)利要求9所述的胰腺癌檢測(cè)用試劑盒，其含針對(duì)糖蛋白質(zhì)C4BPA或PIGR的抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104395758SQ201380025877
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月18日
【發(fā)明者】野田健太, 三浦俊英, 野村文夫, 曾川一幸, 佐藤守, 吉富秀幸, 宮崎勝 申請(qǐng)人:日東紡績株式會(huì)社