專利名稱：一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，該方法通過定量檢測存在于血清/血漿中凝溶膠蛋白(gelsolin)含量，無創(chuàng)性地輔助胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)。
背景技術：
胰腺癌是一種兇險的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，預后差。近10年來其發(fā)病率和死亡率呈上升的趨勢，根據(jù)中國疾病監(jiān)測指示系統(tǒng)的報告，1991年至2000年我國胰腺癌的死亡率由2.18/10萬上升到3.26/10萬，胰腺癌是我國因癌癥死亡的第5-7位常見惡性腫瘤。在美國，2003年新增胰腺癌病人30,700人，因胰腺癌死亡30,000人，位居惡性腫瘤死亡的第四位。胰腺癌早期一般沒有癥狀。當腫瘤向周圍臟器浸潤，出現(xiàn)腹脹、背痛甚至黃疸等癥狀時，大部分病人已經(jīng)出現(xiàn)局部血管、臟器或淋巴結的侵犯或轉移，喪失了根治切除的機會，而化療、放療對胰腺癌的控制也不能很有效地延長生命。目前，胰腺癌總的5年存活率僅為3-5％，確診后的中位生存時間＜6個月。然而對于局限在胰腺內的、無淋巴結轉移的小胰腺癌(直徑＜3cm)實行根治性切除后，5年存活率可達40％，中位生存時間延長至32個月。因此能否實現(xiàn)對胰腺癌的早期診斷是胰腺癌防治中的關鍵所在。
尋找胰腺癌特異的生物標志分子一直是胰腺癌研究的重要內容。Rosty等使用表面增強激光解吸離子化質譜技術從胰液中發(fā)現(xiàn)了稱為肝癌-小腸-胰腺/胰腺炎相關蛋白I。在胰腺癌患者的胰液中該蛋白含量明顯升高，其輔助胰腺癌診斷的敏感性和特異性分別為75％和87％。由于采集人體胰液具有一定的危險性，該方法不適合用于常規(guī)臨床檢查。目前用于胰腺癌輔助診斷的血清腫瘤標志物有10余種，其中最常用的CA19-9，診斷胰腺癌的敏感性和特異性約為70％和60％。但是，由于CA19-9是Lewis血型抗原標志，在人群中約有5％-10％Lewis血型抗原陰性者不分泌CA19-9，因此CA19-9輔助診斷胰腺癌的應用具有局限性。尋找特異性和敏感性高的血清/血漿腫瘤相關標志物分子，對胰腺癌早診、早治很有必要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，該方法可以測定人血清中凝溶膠蛋白含量，血清凝溶膠蛋白含量明顯降低可以作為一個血清學標志分子，無創(chuàng)性地輔助胰腺癌診斷，早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌。
本發(fā)明的目的是采用以下技術方案實現(xiàn)的一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，通過定量免疫印記法檢測人血清/血漿中凝溶膠蛋白濃度，根據(jù)所述凝溶膠蛋白含量降低的水平無創(chuàng)性地輔助早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌，其具體步驟是A、采集病人手術前的血清，使用1×磷酸鹽緩沖液稀釋50倍后制成待測血清樣品；B、將已知濃度的人血漿凝溶膠蛋白標準品，按照一定濃度梯度與所述待測血清樣品共同經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其中，每塊含有所述待測血清樣品的膠上至少含有4個泳道連續(xù)濃度的所述人血漿凝溶膠蛋白標準品；C、通過電轉移將經(jīng)過分離的蛋白質從所述的膠上轉移至聚偏氟乙烯膜上，該膜經(jīng)脫脂牛奶封閉后，用抗人凝溶膠蛋白抗體進行免疫印跡反應，反應信號經(jīng)化學發(fā)光、放大，并在暗室內對X光片曝光，形成凝溶膠蛋白印跡結果X光片；D、使用掃描儀對凝溶膠蛋白印跡結果X光片掃描，用圖像分析軟件根據(jù)已知凝溶膠蛋白標準品含量信號強度繪制標準曲線，并在標準曲線的線性范圍內計算出同一塊膠上所述待測血清樣品中未知的凝溶膠蛋白含量。
本發(fā)明的有益效果是通過建立檢測病人血清中凝溶膠蛋白(gelsolin)含量的定量免疫印跡方法，準確測定血清凝溶膠蛋白含量。該方法簡便、快捷、患者易于接受，對輔助胰腺癌診斷有較高的敏感性和特異性，也為胰腺癌高危人群篩查提供了一種新的、無創(chuàng)性的檢查方式。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
圖1血清凝溶膠蛋白含量的計算方法圖2血清凝溶膠蛋白平均含量的計算圖3血清凝溶膠蛋白標準曲線的繪制具體實施方式
一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，通過定量免疫印記法檢測人血清/血漿中凝溶膠蛋白(gelsolin)濃度，根據(jù)所述凝溶膠蛋白含量降低的水平無創(chuàng)性地輔助早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌，其具體步驟是A、采集病人血清用不含任何抗凝劑的真空采血管(Greiner-Bio One，F(xiàn)rickenhausen，Germany)采集病人清晨空腹血液樣本4毫升，在4℃下經(jīng)3000轉/分，離心15分鐘，于冰上分離血清。血清分裝于多個0.5毫升的離心管中，于干冰上速凍后立即轉-80℃冰箱保存。使用時從冰箱中取出，在冰上自然融化后，用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，簡稱PBS)稀釋50倍后制成待測血清樣品；B、用1×PBS稀釋人血漿凝溶膠蛋白標準品至5微克/毫升，制成已知濃度的人血漿凝溶膠蛋白標準品；將已知濃度的人血漿凝溶膠蛋白標準品和待測血清樣品共同經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱SDS-PAGE)分離蛋白標準品和待測血清樣品在2×SDS凝膠加樣緩沖液中，經(jīng)100℃加熱10分鐘處理后，加入SDS-PAGE加樣孔。每塊膠上含有由4種連續(xù)遞增濃度的標準凝溶膠蛋白泳道(即每泳道上樣量分別為1微克/毫升；2微克/毫升；3微克/毫升；3.5微克/毫升)和數(shù)個1∶50稀釋的待測病人血清樣品(每泳道上樣5微升)。凝膠置于垂直蛋白質電泳儀(mini-protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120伏恒壓條件下使標準品和待測樣品的蛋白質在同一塊膠上和完全相同的實驗條件下分離；C、電泳后將已分離的蛋白從凝膠上通過電轉膜儀(mini-transblot cell，Bio-Rad Laboratories)在4℃、110伏恒壓條件下轉移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，簡稱PVDF膜)，轉膜1小時；含有樣品的PVDF膜經(jīng)1×PBS稀釋的10％脫脂牛奶(安怡長青高鈣脫脂奶粉)于4℃封閉3小時。用抗人凝溶膠蛋白抗體在膜上進行免疫印跡反應加入1∶1000稀釋的小鼠抗人凝溶膠蛋白單克隆抗體(BD Biosciences Pharmingen)室溫孵育2-3小時；洗膜液洗膜，5分鐘/次，共洗3次；加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室溫孵育1小時；洗膜液洗膜，5分鐘/次，共洗5次；加入化學發(fā)光試劑ECL(Santa CruzBiotechnology)放大凝溶膠蛋白印跡信號，在暗室內對X光片(Kodak X-Omat V.Film)曝光(每張膜至少選3種不同曝光時間，曝光3次以上)，經(jīng)顯影、定影后形成凝溶膠蛋白印跡結果X光片，見圖1中的A部。圖中顯示出梯度稀釋的凝溶膠蛋白標準品(一塊膠上至少有連續(xù)4個不同濃度)與待測血清樣品在同一膠上使蛋白質分離，并用凝溶膠蛋白抗體做特異性免疫印跡分析。結果顯示，血清中凝溶膠蛋白分子量為93kDa，N113、N115和N116為正常血清樣品；P16、P57和P118為胰腺癌血清樣品。用人血清中相對恒定表達的轉鐵蛋白(transferrin，分子量為80kDa)含量作為血清樣本上樣量的內對照。
D、用掃描儀(N-TEK NuScan 900)掃描凝溶膠蛋白印跡結果X光片，用圖像分析軟件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根據(jù)已知凝溶膠蛋白標準品含量信號強度繪制標準曲線。只有當已知含量的標準品與其對應的蛋白印跡強度呈線性分布時(r＞0.94)，方可繪制二者之間線性關系的標準曲線反之，如果r≤0.94，表示標準曲線不可信。進一步在標準曲線的線性范圍內，定量分析同一膠上待測血清的蛋白印跡強度，換算出凝溶膠蛋白含量。
參見圖2所示，為了減小由于曝光時間不同對蛋白量與印跡強度間線性關系影響的實驗誤差，分別計算三次不同曝光時間下凝溶膠蛋白含量，并取平均值作為待測樣本中凝溶膠蛋白的最終含量。
參見圖1中的B部，圖中顯示根據(jù)凝溶膠蛋白標準品的蛋白含量及其對應印跡信號強度，用Quantity One 4.4.1軟件繪制的標準曲線，并根據(jù)待測血清樣本凝溶膠蛋白免疫印跡信號強度，在標準曲線的線性范圍內計算出待測血清樣本中凝溶膠蛋白含量。橫坐標為蛋白印跡強度(像素/平方毫米)，縱坐標為蛋白濃度(微克/毫升)。Std1-Std4為凝溶膠蛋白標準品，N113、N115和N116為正常血清樣本；P16、P57和P118為胰腺癌血清樣品。
圖2顯示血清中凝溶膠蛋白平均含量的計算方法。圖中的A部、B部、C部、D部、E部和F部代表六次實驗結果。由于曝光時間的不同對蛋白含量與蛋白印跡強度之間的線性關系有一定的影響，為了減小實驗誤差，每次實驗取三種不同曝光時間對X光片曝光(曝光時間1、2、3)，分別計算三次不同曝光時間的血清樣本凝溶膠蛋白的平均含量，作為待測樣品中凝溶膠蛋白最終含量。
結果判定待測血清樣品中凝溶膠蛋白的含量降低，低于191.15mg/L時，提示該患者可能患有胰腺癌，需高度注意。
在本實施例中，需要提供一個已知濃度的人血漿凝溶膠蛋白作為標準品的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)產(chǎn)生如下將已知濃度(1毫克/毫升)的人血漿凝溶膠蛋白標準品(購自Cytoskeleton公司，美國Denver，CO)用1×PBS稀釋至5微克/毫升，并呈梯度遞增加樣，使每泳道標準品上樣量分別為1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5微克/毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升。在每一批實驗中至少含有4個連續(xù)濃度的標準品點，繪制標準曲線。
人血漿凝溶膠蛋白標準品和數(shù)個1∶50稀釋的待測血清(每泳道上樣5微升)樣本在2×SDS凝膠加樣緩沖液中經(jīng)100℃加熱10分鐘后，SDS-PAGE凝膠置于垂直蛋白質電泳儀(mini-protein III，Bio-Rad Laboratories)上，在100-120伏恒壓條件下使標準品和待測樣本的蛋白質在同一塊膠上和完全相同的實驗條件下按分子量大小分離；通過電轉膜儀(mini-transblot cell，Bio-Rad Laboratories)在4℃、110伏恒壓條件下，將電泳后的蛋白從凝膠上轉移至PVDF膜(轉膜1小時)。含有樣本的PVDF膜經(jīng)1×PBS稀釋的10％脫脂牛奶(安怡長青高鈣脫脂奶粉)于4℃封閉3小時。加入1∶1000稀釋的小鼠抗人凝溶膠蛋白單克隆抗體(BD BiosciencesPharmingen)室溫孵育2-3小時；洗膜液洗膜，5分鐘/次，共洗3次；加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)室溫孵育1小時；洗膜液洗膜，5分鐘/次，共洗5次；加入化學發(fā)光試劑ECL(SantaCruz Biotechnology)放大凝溶膠蛋白印跡信號，在暗室內對X光片(KodakX-Omat K Film)曝光(每張膜至少選3種不同曝光時間，曝光3次以上)，經(jīng)顯影、定影后形成凝溶膠蛋白印跡結果X光片，參見圖3中的A部。
凝溶膠蛋白印跡結果經(jīng)掃描儀(N-TEK NuScan 900)掃描，使用圖像分析軟件Quantity One 4.4.1(Bio-Rad Laboratories)根據(jù)已知凝溶膠蛋白標準品含量和對應的印跡信號強度繪制標準曲線。只有當已知含量的標準品與其對應的蛋白印跡強度呈線性分布時(r＞0.94)，方可繪制二者之間線性關系的標準曲線。
圖3中的A部顯示凝溶膠蛋白標準品呈梯度遞增加樣后的免疫印跡結果。每泳道標準品上樣量分別為1微克/毫升、1.5微克/毫升、2微克/毫升、2.5微克/毫升、3微克/毫升和3.5微克/毫升等；圖3中的B部顯示使用Quantity One 4.4.1軟件繪制凝溶膠蛋白標準品的蛋白濃度與其對應的蛋白印跡強度之的標準曲線(r＝0.996)。橫坐標為蛋白印跡強度，即每平方毫米面積中的平均像素數(shù)(pixel/mm2)，縱坐標為蛋白濃度，即每毫升體積含蛋白質的微克數(shù)(μg/ml)。
本實施例中所用液體配方如下1、1×PBS(pH7.4)137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4。
2、2×SDS凝膠加樣緩沖液100mM Tris-HCl，pH6.8，200mM DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍，20％甘油。
3、Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mM Tris，250mM甘氨酸，pH8.3，0.1％SDS。
4、轉膜液25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3。
5、洗膜液20mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，0.1％Tween-20。
本發(fā)明建立檢測病人血清中新的胰腺癌血清學標志分子——凝溶膠蛋白含量的定量免疫印跡方法，準確測定血清凝溶膠蛋白含量對早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌具有重要意義。通過定量免疫印跡方法檢測了血漿型凝溶膠蛋白(gelsolin)在65例胰腺導管腺癌、34例消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤(包括食管癌6例、胃癌6例、結直腸癌5例、十二直腸癌5例、膽囊癌4例、膽管癌3例和胰島細胞瘤5例)、11例胰腺良性疾病(慢性胰腺炎5例、假性囊腫3例和良性腺瘤3例)和54例正常人血清中的表達水平。胰腺癌病人血清中凝溶膠蛋白的平均含量為155.24±44.29mg/L，顯著低于正常人血清凝溶膠蛋白平均含量224.44±42.92mg/L；消化系統(tǒng)其它惡性腫瘤病人平均血清凝溶膠蛋白含量為212.10±60.35mg/L；胰腺良性疾病病人血清凝溶膠蛋白含量為203.74±26.70mg/L(P＜0.001)。而且，血清凝溶膠蛋白含量不受血清中其它成分，如白蛋白、膽紅素等的影響，比較穩(wěn)定。受試者工作特征(receiveroperating characteristic，ROC)曲線顯示，以血清凝溶膠蛋白濃度≤191.15mg/L為標準，用血清凝溶膠蛋白含量檢測胰腺癌的敏感性為78.5％，特異性為72.7％，可以作為胰腺癌的一個血清學輔助診斷標志分子。
權利要求
1.一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，其特征在于通過定量免疫印記法檢測人血清/血漿中凝溶膠蛋白濃度，根據(jù)所述凝溶膠蛋白含量降低的水平無創(chuàng)性地輔助早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌。
2.根據(jù)權利要求1所述的胰腺癌血清標志分子的檢測方法，其特征在于A、采集病人手術前的血清，使用1×磷酸鹽緩沖液稀釋50倍后制成待測血清樣品；B、將已知濃度的人血漿凝溶膠蛋白標準品，按照一定濃度梯度與所述待測血清樣品共同經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，其中，每塊含有所述待測血清樣品的膠上至少含有4個泳道連續(xù)濃度的所述人血漿凝溶膠蛋白標準品；C、通過電轉移將經(jīng)過分離的蛋白質從所述的膠上轉移至聚偏氟乙烯膜上，該膜經(jīng)脫脂牛奶封閉后，用抗人凝溶膠蛋白抗體進行免疫印跡反應，反應信號經(jīng)化學發(fā)光、放大，并在暗室內對X光片曝光，形成凝溶膠蛋白印跡結果X光片；D、使用掃描儀對凝溶膠蛋白印跡結果X光片掃描，用圖像分析軟件根據(jù)已知凝溶膠蛋白標準品含量信號強度繪制標準曲線，并在標準曲線的線性范圍內計算出同一塊膠上所述待測血清樣品中未知的凝溶膠蛋白含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰腺癌血清標志分子的檢測方法，通過定量免疫印記法檢測人血清/血漿中凝溶膠蛋白濃度，根據(jù)所述凝溶膠蛋白含量降低的水平無創(chuàng)性地輔助早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌。人血漿凝溶膠蛋白標準品，按照一定濃度梯度稀釋后與待測血清樣本總蛋白共同經(jīng)SDS－PAGE分離，將分離的蛋白從凝膠上轉移至PVDF膜上。含有樣本的PVDF膜與抗人凝溶膠蛋白抗體做免疫印跡反應，印跡信號經(jīng)化學發(fā)光、放大后使X光片曝光。印跡結果掃描后在圖像分析軟件輔助下，繪制凝溶膠蛋白標準品含量與印跡強度關系的標準曲線，并在標準曲線的線性范圍內計算出同一凝膠上待測血清樣品的凝溶膠蛋白含量。該方法簡便、快捷，易于被患者接受，對輔助胰腺癌診斷有較高的敏感性和特異性。
文檔編號G01N23/04GK1746676SQ20041007430
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月8日 優(yōu)先權日2004年9月8日
發(fā)明者趙曉航, 倪曉光, 趙平 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所