本發(fā)明屬于生物標(biāo)記物體外檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一組區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)患者與乳腺癌患者的脂類(lèi)分子標(biāo)記物，特別是涉及一組輔助診斷乳腺癌的脂質(zhì)化合物、包含該化合物的試劑盒、以及對(duì)所述脂質(zhì)化合物進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌(Breast Cancer)是女性中常見(jiàn)并且高度致命的一種的癌癥，也是女性癌癥死亡的第二大主要原因。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(American Cancer Society，ACS)估計(jì)，2015年有231840例新診斷的乳腺癌患者，占所有新診斷女性癌癥患者的29％。此外乳腺癌死亡人數(shù)40290例，占女性癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的15％，給女性健康造成巨大的威脅。

目前乳腺癌的臨床診斷比較復(fù)雜，主要包括近紅外乳腺掃描、乳腺B超掃描、乳腺X攝片等。而目前乳房X光檢查診斷乳腺癌假陽(yáng)性率很高甚至達(dá)到30％，而乳房X光檢查后異常的女性患者需要進(jìn)行額外的昂貴的篩查即磁共振成像以及組織抽樣通過(guò)細(xì)針(通過(guò)細(xì)針穿刺活檢，核心活檢，或切除活檢)。此外，篩選檢查的女性大約有10％還需進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，而其中只有5％的女性是真正罹患乳腺惡性腫瘤的人，其他的均為良性。這就給家庭及社會(huì)帶來(lái)不必要的資源浪費(fèi)，并給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失及負(fù)擔(dān)。所以良性患者急需一個(gè)更好的輔助診斷方法避免不必要的昂貴費(fèi)用和侵入性檢查，尋找乳腺癌相關(guān)的標(biāo)志物已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。

越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)重視并開(kāi)展乳腺癌的病因?qū)W及機(jī)制研究，而且研究也主要集中在抗腫瘤聯(lián)合化療、血液腫瘤標(biāo)志物等，然而目前研究成果很少應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，有限的腫瘤標(biāo)志物如CA15.3和BR27.29敏感性較低，因此它們還沒(méi)有被用于乳腺癌的篩查，因此迫切需要一種微創(chuàng)方法篩選有效標(biāo)準(zhǔn)品用于對(duì)惡性乳腺病變的早期診斷及預(yù)防甚至預(yù)后判斷。

脂質(zhì)參與調(diào)節(jié)許多生理活動(dòng)，諸如能源存儲(chǔ)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等。許多研究報(bào)道，脂質(zhì)是代謝綜合征的一個(gè)主要組成部分，血脂異常在各種癌癥的癌變中起著重要的作用，包括前列腺癌、卵巢癌和腎癌。代謝組學(xué)或脂質(zhì)組學(xué)已經(jīng)表明，脂質(zhì)具有被用于乳腺癌診斷及追蹤的潛力。然而，已有的相關(guān)脂質(zhì)的研究大多數(shù)只是集中在癌癥患者中脂類(lèi)的含量與正常人之間的差異研究，其中只有少數(shù)研究涉及良性乳房疾病患者，其中楊等人進(jìn)行的包含良性乳腺疾病患者的血漿脂質(zhì)圖譜的綜合評(píng)價(jià)，只涉及5例乳腺癌病例和6例良性病人，樣本量少對(duì)問(wèn)題的研究力度不足。此外單一脂質(zhì)物種沒(méi)有良好的診斷效率來(lái)區(qū)分良性患者與乳腺癌患者。

目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有公開(kāi)關(guān)于用于輔助診斷乳腺癌病的脂質(zhì)化合物標(biāo)準(zhǔn)品，尤其是一組涉及區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)女性與乳腺癌患者的有效的標(biāo)準(zhǔn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一組可用于診斷并區(qū)分乳腺癌病及高危潛在患者的脂質(zhì)因子標(biāo)記物，通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)研究從數(shù)百個(gè)血漿參照因子鑒定出與乳腺癌的患病率呈正相關(guān)的脂質(zhì)分子、建立相應(yīng)的檢測(cè)方法、并用于乳腺癌的輔助診斷。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：可用于檢測(cè)乳腺癌病及高危潛在患者的多個(gè)脂質(zhì)化合物作為組合的一組標(biāo)準(zhǔn)品。該標(biāo)準(zhǔn)品涉及一個(gè)組合包括15個(gè)血漿脂類(lèi)分子，其中下調(diào)的因子：LPC(18：3)，LPC(20：2)，LPC(20：1)，LPC(20：0)，C19：1CE，C19：0CE，C20：0CE；上調(diào)的因子：PC(32：1)，PC(34：4)，PC(38：3)，PC(40：5)，PC(40：3)，PC(44：11)，ePC(32：2)，ePC(38：3)。

脂質(zhì)分析是通過(guò)三重四極質(zhì)譜LC-ESI-MS/MS(API 4000，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特市，CA)分析，這一結(jié)構(gòu)識(shí)別基于碰撞-誘導(dǎo)離解(CID)，樣本導(dǎo)入靠電噴霧電離(ESI)。復(fù)雜的脂質(zhì)經(jīng)ESI生成簡(jiǎn)單的帶電離子，通過(guò)CID的可以產(chǎn)生碎片離子，它可以減少光譜擁堵引起的電離抑制效應(yīng)，并對(duì)所監(jiān)測(cè)的信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量分析具有很好的靈敏度和選擇性。

一方面，本發(fā)明提供一種乳腺癌血漿分子標(biāo)記物，其特征在于：所述診斷標(biāo)記物包含一種、兩種或三種脂質(zhì)化合物，所述脂質(zhì)化合物選自由38：3磷脂酰膽堿(38：3PC)、C19：0膽固醇酯(C19：0CE)、20：0溶血磷脂酰膽堿(20：0LPC)組成的組。

第二方面，本發(fā)明提供一種在乳腺癌患者中下調(diào)的血漿分子標(biāo)記物，其特征在于所述診斷標(biāo)記物包含一種或多種脂質(zhì)化合物，所述脂質(zhì)化合物選自由18：3溶血磷脂酰膽堿(18：3LPC)、20：2溶血磷脂酰膽堿(20：2LPC)、20：1溶血磷脂酰膽堿(20：1LPC)、20：0溶血磷脂酰膽堿(20：0LPC)、C19：1膽固醇酯(C19：1CE)、C19：0膽固醇酯(C19：0CE)、C20：0膽固醇酯(C20：0CE)組成的組。

第三方面，本發(fā)明提供一種在乳腺癌患者中上調(diào)的血漿分子標(biāo)記物，其特征在于所述診斷標(biāo)記物包含一種或多種脂質(zhì)化合物，所述脂質(zhì)化合物選自由32：1磷脂酰膽堿(32：1PC)、34：4磷脂酰膽堿(34：4PC)、38：3磷脂酰膽堿(38：3PC)、40：5磷脂酰膽堿(40：5PC)、40：3磷脂酰膽堿(40：3PC)、44：11磷脂酰膽堿(44：11PC)、32：2卵磷脂(32：2ePC)、38：3卵磷脂(38：3ePC)組成的組。

第四方面，本發(fā)明提供一種乳腺癌血漿分子標(biāo)記物，其特征在于：所述診斷標(biāo)記物包含一種或多種脂質(zhì)化合物，所述脂質(zhì)化合物選自由18：3溶血磷脂酰膽堿(18：3LPC)、20：2溶血磷脂酰膽堿(20：2LPC)、20：1溶血磷脂酰膽堿(20：1LPC)、20：0溶血磷脂酰膽堿(20：0LPC)、C19：1膽固醇酯(C19：1CE)、C19：0膽固醇酯(C19：0CE)、C20：0膽固醇酯(C20：0CE)、32：1磷脂酰膽堿(32：1PC)、34：4磷脂酰膽堿(34：4PC)、38：3磷脂酰膽堿(38：3PC)、40：5磷脂酰膽堿(40：5PC)、40：3磷脂酰膽堿(40：3PC)、44：11磷脂酰膽堿(44：11PC)、32：2卵磷脂(32：2ePC)、38：3卵磷脂(38：3ePC)組成的組。

第五方面，本發(fā)明提供一種用于乳腺癌檢測(cè)的試劑盒，其本發(fā)明所述的血漿分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包含對(duì)本發(fā)明所述的血漿分子標(biāo)記物進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的試劑。

本發(fā)明所述的試劑盒，其特征在于所述的定性或定量檢測(cè)的方法為L(zhǎng)C-ESI-MS/MS。

第六方面，本發(fā)明提供一種對(duì)本發(fā)明所述的血漿分子標(biāo)記物進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的方法，所述方法不用做診斷目的。

本發(fā)明所述的方法，包括以下步驟

(1)樣本提取：提取血漿中的脂質(zhì)物質(zhì)，溶解到溶劑中；

(2)HPLC：將步驟(1)的樣本注入高效液相色譜，溶劑為氯仿∶甲醇∶300mM醋酸銨＝360∶840∶44；

(3)質(zhì)譜：采用三重四極LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析。

本發(fā)明所述的方法，其還包括對(duì)獲得LC-ESI-MS/MS脂質(zhì)圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的步驟。

所述數(shù)據(jù)分析可通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明首次公開(kāi)了可用于檢測(cè)乳腺癌病及乳腺良性增生疾病的一組脂質(zhì)化合物。脂質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)被證明是相關(guān)作用機(jī)制研究的有用工具，15個(gè)脂質(zhì)分子的表達(dá)差異會(huì)影響乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展。因此所述特定脂質(zhì)分子的血漿水平與乳腺癌的患病率呈正比，通過(guò)測(cè)定特定脂質(zhì)分子的表達(dá)情況可以方便快捷有效地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的檢測(cè)。

(2)以脂質(zhì)因子組合為基礎(chǔ)的診斷標(biāo)準(zhǔn)品可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的輔助診斷，具有檢測(cè)效率高，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)，檢測(cè)脂質(zhì)因子是乳腺癌患者及乳腺良性增生疾病輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。

(3)本發(fā)明采用大量臨床確診的乳腺癌患者樣本和良性乳腺疾病患者樣本，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析、驗(yàn)證從367種血漿脂質(zhì)中篩選出15種乳腺癌脂質(zhì)標(biāo)記物，特別是其中的三種38：3磷脂酰膽堿(38：3PC)、C19：0膽固醇酯(C19：0CE)、20：0溶血磷脂酰膽堿(20：0LPC)在乳腺癌和良性乳腺疾病中差異極顯著，具有較高的臨床價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為乳腺癌患者和良性乳腺疾病患者的C19：1CE的質(zhì)譜圖。

圖2為15個(gè)脂質(zhì)物質(zhì)的組合預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線(xiàn)，A：訓(xùn)練組中乳腺癌與良性乳腺病人的比較；B：驗(yàn)證組中乳腺癌與良性乳腺病人的比較；C：全集中乳腺癌與良性乳腺病人的比較。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1：患者的選擇

訓(xùn)練集包括39例乳腺癌和51例良性乳腺病樣本，這些樣本從本公司乳腺癌存儲(chǔ)庫(kù)獲得。樣本挑選需遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者都確診并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；(2)根據(jù)臨床分期方法，乳腺癌患者需在早期階段(階段0，I，II)；(3)病人沒(méi)有其他可能會(huì)影響脂質(zhì)代謝的疾病，如高脂血癥，糖尿病，和其他癌癥；(4)所有患者是女性；(5)患者沒(méi)有進(jìn)行術(shù)前輔助化療或放療。乳腺良性病變被定義為增生，纖維腫瘤、囊腫和一些不明的乳腺診斷。對(duì)照組血液樣本來(lái)源于沒(méi)有歷史的惡性疾病和炎癥的健康女性。

根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，從廣西柳州工人醫(yī)院收集45例早期乳腺癌患者(0-II階段)和59例良性乳腺疾病血漿樣本。所有癌癥患者組織病理學(xué)結(jié)果經(jīng)手術(shù)切除腫瘤進(jìn)行臨床組織活檢從而臨確診，腫瘤病理特點(diǎn)和分期的評(píng)估基于組織切片結(jié)果。納入本研究的癌癥患者沒(méi)有進(jìn)行術(shù)前化療或放療。所有這些癌癥，良性和對(duì)照樣本年齡和種族匹配，IRB書(shū)面同意支持這項(xiàng)研究使用的所有信息和生物學(xué)樣本。乳腺癌及良性乳腺疾病患者信息如表1

實(shí)施例2：血漿樣本的采集

病人至少禁食12小時(shí)后采集血漿樣本。簡(jiǎn)單地說(shuō)，血漿收集即靜脈穿刺后血液被收集到真空采血EDTA抗凝管中，2小時(shí)內(nèi)，4℃，2600g離心10分鐘，取上層清液，以同樣的方式離心第二次，血漿分成0.5毫升/小份-80℃儲(chǔ)藏。所有血漿樣本用干冰運(yùn)送到堪薩斯脂質(zhì)組學(xué)研究中心進(jìn)行脂質(zhì)分析。

表1.訓(xùn)練集及驗(yàn)證集中乳腺癌及良性乳腺疾病病人信息表

實(shí)施例3：LC-ESI-MS/MS脂質(zhì)圖譜

每個(gè)樣本分析采用3μL血漿，檢測(cè)前離心20分鐘，在表管單位內(nèi)球化蛋白質(zhì)。此外為了對(duì)所有脂質(zhì)準(zhǔn)確識(shí)別，需精確的添加內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，其中每一類(lèi)脂質(zhì)物質(zhì)采用兩個(gè)內(nèi)標(biāo)物。離心20分鐘后，脂質(zhì)提取物再溶解到溶劑中，注入高效液相色譜。溶劑混合比率為氯仿/甲醇/300mM醋酸銨(μL)360/840/44溶解于水中。所有溶劑使用高效液相色譜級(jí)。

脂質(zhì)是由三重四極LC-ESI-MS/MS(API 4000，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特市，CA)分析，可以區(qū)分他們的極性頭和鏈的長(zhǎng)度。樣本導(dǎo)入靠電噴霧電離(ESI)。它可以減少光譜擁堵引起的電離抑制效應(yīng)。復(fù)雜的脂質(zhì)經(jīng)ESI生成簡(jiǎn)單的帶電離子，通過(guò)CID的可以產(chǎn)生碎片離子。兩種類(lèi)型的掃描用來(lái)獲得極性脂質(zhì)：前體和中性丟失掃描。脂質(zhì)一個(gè)類(lèi)的確定是根據(jù)前體，或離子進(jìn)行中損失，一個(gè)共同的頭部片段。自定義腳本和應(yīng)用生物系統(tǒng)公司分析軟件被用于色譜峰的分辨率。質(zhì)量過(guò)濾器后，校準(zhǔn)，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化，數(shù)據(jù)量化以nmol/uL為單位。

從194例血漿樣本(84例乳腺癌和110例良性乳腺疾病)中，檢測(cè)到13類(lèi)磷脂和1類(lèi)膽甾醇酯CE共367種血漿脂質(zhì)。由于我們的測(cè)試采用脂質(zhì)微提取方法，脂質(zhì)水平小于0.0007nmol/uL被認(rèn)為是不可靠的。為了保證脂質(zhì)物質(zhì)的質(zhì)量，我們移除40％以上丟失數(shù)據(jù)或異常平均值表達(dá)的脂質(zhì)。因此，367種脂質(zhì)減少到191種脂質(zhì)。

實(shí)施例4：數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組血漿樣本之間的差異通過(guò)T-檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。所有p值來(lái)自雙側(cè)檢驗(yàn)。當(dāng)p值小于0.05及倍增大于1.5被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)顯著性差異。

二元邏輯回歸分析，用于預(yù)測(cè)所選脂質(zhì)物的診斷效率。并繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic curve，ROC)，從而對(duì)敏感性和特異性的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估，并計(jì)算ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)，AUC越大則診斷價(jià)值越高，散點(diǎn)圖由GraphPad 5.0生成。

我們分析了乳腺癌和良性血漿標(biāo)本中脂質(zhì)物質(zhì)的濃度。在訓(xùn)練集，平均血漿濃度的最顯著差異為PC(38：3)(p＝2.50297E-08)。存在顯著倍數(shù)變化的是LPC(20：0)(倍數(shù)變化＝4.08)。在驗(yàn)證集中，平均血漿濃度的最顯著差異為PC(38：3)(p＝2.50297E-08)。顯著倍數(shù)變化是C 19：0CE(倍數(shù)變化＝4.39)。在全部樣本中，平均血漿濃度存在最顯著差異的是PC(38：3)(p＝1.00749E-17)。顯著倍數(shù)變化的是C 19：0CE(倍數(shù)變化＝3.73)。這些數(shù)據(jù)表明，血漿脂質(zhì)可能是診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物。

根據(jù)篩選條件(p＜0.05和倍數(shù)變化>1.5)，只有15種脂質(zhì)物質(zhì)被選為診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物，包含4個(gè)LPC，6個(gè)PC，2個(gè)ePC，及3個(gè)CE(表2、表3)。與良性患者相比，癌癥患者中兩類(lèi)LPC和CE的血漿濃度減少，而其他脂質(zhì)物質(zhì)增加(表2、表3)。

表2乳腺癌早期診斷生物標(biāo)志物脂質(zhì)物質(zhì)的檢測(cè)(訓(xùn)練集)

SN：敏感性；SP：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值；AUC：ROC曲線(xiàn)下面積；

↑：上調(diào)；↓：下調(diào)。

表2乳腺癌早期診斷生物標(biāo)志物脂質(zhì)物質(zhì)的檢測(cè)(驗(yàn)證集)

SN：敏感性；SP：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值；AUC：ROC曲線(xiàn)下面積；

↑：上調(diào)；↓：下調(diào)。

15個(gè)脂質(zhì)物質(zhì)組合有較好的診斷性能，其中訓(xùn)練集中，15種脂質(zhì)物種組合的敏感性，特異性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)以及陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為83.3％，92.7％，89.7％，和87.9％。訓(xùn)練集的AUC為0.926，95％可信區(qū)間(0.869，0.982)。驗(yàn)證集也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果，敏感性，特異性，PPV和NPV分別為81.0％，94.5％，91.9％和86.7％。驗(yàn)證集中AUC為0.938，95％可信區(qū)間(0.889，0.986)(圖2A)。全集中(訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的組合)，敏感性，特異性，PPV和NPV分別是81.0％，90.0％，86.1和86.1％，AUC為0.916，95％可信區(qū)間(0.874，0.957)(圖2C)。

上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。