專(zhuān)利名稱(chēng)：豬肺炎支原體溫度敏感型活疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)是導(dǎo)致豬產(chǎn)量降低的越來(lái)越重要的一種原因，豬產(chǎn)量降低的特征在于豬生長(zhǎng)遲緩、飼養(yǎng)效率降低、厭食、發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。豬肺炎支原體，又稱(chēng)為豬肺炎霉形體，是導(dǎo)致豬支原體肺炎(又稱(chēng)為豬地方流行性肺炎、病毒性肺炎、感染性肺炎、以及前葉性肺炎)的致病病原體。豬肺炎支原體是一種小的原核微生物，比細(xì)菌小，結(jié)構(gòu)比細(xì)菌簡(jiǎn)單，但比病毒復(fù)雜。與病毒不同，它們能夠獨(dú)立存活，盡管發(fā)現(xiàn)它們時(shí)通常都與真核細(xì)胞相伴隨，因?yàn)樗鼈兘^對(duì)需要外源性固醇和脂肪酸，而這些物質(zhì)通常在含血清的培養(yǎng)基中是必需生長(zhǎng)物質(zhì)。豬肺炎支原體具有細(xì)胞膜，而沒(méi)有細(xì)胞壁。它們的基因組非常小，長(zhǎng)度大約為750,000堿基對(duì)。豬是目前所知該支原體的唯一宿主。
在世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬國(guó)家中，支原體肺炎是一種最常見(jiàn)的豬呼吸道疾病。來(lái)自PigMon的監(jiān)測(cè)資料顯示，發(fā)生肺炎的中西部豬群占97％，其中取樣動(dòng)物中的流行率＞70％(Dybvig 1992)。PigMon是一項(xiàng)旨在評(píng)價(jià)美國(guó)上中西部牧場(chǎng)損失的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。支原體肺炎的致死率較低，但病廢率很高(30-80％)。這種疾病通?？梢詫?dǎo)致顯著的經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)樗蓪?dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)率減緩，效率降低以及患病。
通過(guò)感染豬噴射出的空氣傳播微生物，該病可以通過(guò)鼻腔在豬間傳播。支原體可以深入肺臟的肺尖和心葉，在那里導(dǎo)致肉眼可見(jiàn)的暗紫色或灰色病損，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物呼吸困難，體重增加減緩。豬肺炎支原體原發(fā)感染后，還可以繼發(fā)其他種類(lèi)的支原體(如豬鼻支原體和絮狀支原體)以及細(xì)菌病原體(如巴氏桿菌和博德特菌)感染。豬肺炎支原體導(dǎo)致的呼吸道疾病可以使動(dòng)物在喂養(yǎng)增肥期間體重增加變緩。因此，感染了這種微生物的動(dòng)物在屠宰時(shí)，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于那些未感染動(dòng)物。
盡管很多牧場(chǎng)業(yè)已采取了多地點(diǎn)飼養(yǎng)、改善衛(wèi)生條件的措施，但肺炎的流行率并未顯著降低，只是其流行病學(xué)特征發(fā)生了改變。由于豬肺炎可以導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，科學(xué)家們一直在尋求針對(duì)豬肺炎支原體的疫苗和治療方法。在豬中預(yù)防支原體一直是通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用抗生素治療和疫苗接種來(lái)達(dá)成。該方法的缺點(diǎn)是花費(fèi)巨大，效果不可預(yù)計(jì)，采取這些措施后，很多牧場(chǎng)并未顯示出明顯改善。針對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行疫苗接種是最近引入的一種方法，只在最近6-7年才可以在市面上購(gòu)買(mǎi)到這些疫苗。
盡管針對(duì)豬的支原體疫苗取得了巨大的經(jīng)濟(jì)成功，它們?cè)谝吧鷹l件下的功效卻仍然爭(zhēng)議頻多。通常情況下，這些疫苗可以在屠宰時(shí)降低這些患肺炎肺臟的平均病損評(píng)分，但卻不能影響受累豬的流行率。也就是說(shuō)，受累豬的數(shù)量并未發(fā)生改變，只是最終的損傷程度似乎變小了。支原體疫苗接種對(duì)癥狀的影響就更值得懷疑了，因?yàn)榧词褂羞@樣的論文，也沒(méi)有幾篇論文顯示，(疫苗接種)在增重或轉(zhuǎn)化方面具有肯定的改善效果。
這些疫苗表現(xiàn)不盡如人意的原因可能與它們是滅活疫苗、以及豬中支原體感染的特性等事實(shí)有關(guān)。豬肺炎支原體是纖毛上皮細(xì)胞的非侵襲性定殖體。由于該微生物不侵襲呼吸系統(tǒng)，由滅活疫苗激發(fā)的循環(huán)抗體必須通過(guò)上皮屏障，分泌到氣管支氣管管腔，而該過(guò)程異常困難，而且效率低下。為了能夠達(dá)到這種粘膜分泌，支原體疫苗必須能夠刺激高水平的系統(tǒng)抗體。當(dāng)然，這需要相對(duì)較高的抗原劑量和較強(qiáng)的佐劑，這樣，就使這些疫苗變得價(jià)格昂貴，而且難以應(yīng)用。
應(yīng)用目前這些疫苗的另一個(gè)問(wèn)題是需要通過(guò)兩劑注射方法。這種兩劑注射方法需要對(duì)豬進(jìn)行嚴(yán)格控制，這需要對(duì)時(shí)間進(jìn)行精密控制，而且會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物應(yīng)激。由于牧場(chǎng)規(guī)模不斷壯大，這種兩劑注射疫苗接種法變得越來(lái)越不受歡迎，而需要一種替代接種方法，這種方法不需要這些嚴(yán)格控制。
因此，對(duì)豬肺炎支原體的安全有效疫苗存在一種持續(xù)的需求，這種疫苗必須易于應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種分離純化的豬肺炎支原體溫度敏感型菌苗。該菌苗可以是ATCC保藏號(hào)＿＿＿＿＿。
本發(fā)明還提供了一種疫苗制劑，該疫苗制劑含有豬肺炎支原體溫度敏感型活菌苗，以及生理可接受的無(wú)毒載體。該菌苗可以是ATCC保藏號(hào)＿＿＿＿＿。該疫苗制劑還可進(jìn)一步含有免疫佐劑。同樣，疫苗制劑還可含有至少一種其他感染致病因子。所述感染致病因子可以是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)。特別是，感染致病因子可以是支氣管炎博德特氏菌(Borderella bronchiseptica)，A型或D型多殺巴氏桿菌或副豬型嗜血桿菌。
本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或保護(hù)易感豬免受豬肺炎支原體定殖或感染的方法，該方法是給豬應(yīng)用有效劑量的疫苗制劑，所述疫苗制劑含有豬肺炎支原體溫度敏感型活菌苗和生理可接受的無(wú)毒載體。所述疫苗制劑還可進(jìn)一步含有免疫佐劑。該疫苗可以通過(guò)皮下或肌內(nèi)注射、口服或鼻腔內(nèi)進(jìn)行給藥。該疫苗制劑可以單劑應(yīng)用，也可多劑應(yīng)用。
發(fā)明詳述本文所用術(shù)語(yǔ)“疫苗”的定義是其廣義含義，指用來(lái)產(chǎn)生活性免疫的生物物質(zhì)。通常，疫苗采用四類(lèi)抗原中的一類(lèi)通過(guò)非自然途經(jīng)給予的活體微生物，減毒活體微生物，滅活微生物，以及微生物的部分、甚至單一抗原或者產(chǎn)物。在所有這些情況下，目的是提呈抗原，而不帶來(lái)疾病。業(yè)已采用了多種不同的滅活物質(zhì)和方法，包括福爾馬林，疊氮化物，凍融，超聲波降解，熱處理，突然減壓，去污劑(特別是非離子去污劑)，溶菌酶，苯酚，蛋白水解酶和丙內(nèi)酯。疫苗的實(shí)例包括那些在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,894,332，5,788,962，5,338,543和EP571,648中描述的疫苗。
對(duì)組合物或疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是在宿主體內(nèi)發(fā)生的針對(duì)感興趣多肽或疫苗產(chǎn)生的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常情況下，這樣的應(yīng)答包括產(chǎn)生抗體的物質(zhì)，B細(xì)胞，輔助T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞，和/或特異性針對(duì)感興趣組合物或疫苗中所含抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。本發(fā)明疫苗還可包括有效劑量的免疫佐劑，所述免疫佐劑已知可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
而且，疫苗的目標(biāo)是對(duì)自然感染提供保護(hù)。可以檢測(cè)到的免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生可以檢測(cè)到的抗體，可能未必能夠起到保護(hù)作用。因此，盡管以前的疫苗試圖保護(hù)豬免于豬肺炎支原體的感染，但尚未達(dá)到可以接受的保護(hù)水平。
對(duì)目前現(xiàn)存的用于豬的支原體疫苗的替代品是應(yīng)用活疫苗。這種活疫苗應(yīng)該具有很多優(yōu)勢(shì)。例如，可以應(yīng)用氣霧劑將疫苗直接送達(dá)粘膜部位，實(shí)現(xiàn)局部免疫；只需單劑疫苗；制造起來(lái)更加便宜。本發(fā)明發(fā)明者制備的溫度敏感型突變株在正常豬體溫的情況下不能生長(zhǎng)，但在體外更低的溫度下可以生長(zhǎng)。
簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將豬肺炎支原體暴露于N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍，使其突變。將突變的豬肺炎支原體生長(zhǎng)于Friis培養(yǎng)基中，應(yīng)用亞硝基胍處理，然后在Friis瓊脂糖平板上生長(zhǎng)10-14天。將含有分離良好集落的每個(gè)平板復(fù)制到硝化纖維素濾器上，應(yīng)用表面熒光檢測(cè)胞漿LDH的存在。選擇不表達(dá)LDH的集落，用于動(dòng)物研究。暴露于亞硝基胍的微生物生長(zhǎng)于34℃。將集落印跡在硝化纖維素上，然后轉(zhuǎn)移到瓊脂平板，39℃孵育。選擇能夠在34℃生長(zhǎng)但在39℃不生長(zhǎng)的集落，保藏于ATCC(ATCC保藏號(hào)＿＿＿＿＿＿＿＿＿)。
為了制備針對(duì)豬肺炎支原體感染的保護(hù)性疫苗，本發(fā)明采用了溫度敏感型活細(xì)菌。很多微生物在傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)多代后，就會(huì)喪失它們的感染性，并發(fā)生抗原變異。實(shí)際上，脊髓灰質(zhì)炎標(biāo)準(zhǔn)疫苗本質(zhì)上就是活的脊髓灰質(zhì)炎病毒，但該病毒在傳代培養(yǎng)多代后發(fā)生變異，不能在神經(jīng)或腦組織生長(zhǎng)，因此喪失了大部分致病性。對(duì)于這種病毒，關(guān)鍵抗原并未發(fā)生改變。
適宜的豬肺炎支原體菌株可以自多種來(lái)源獲得。菌株可以從儲(chǔ)備處如ATCC和NRRL獲得。由于該疾病的廣泛傳播，大多數(shù)菌株可以通過(guò)從患病動(dòng)物的肺臟分泌物或組織中分離豬肺炎支原體并在適宜培養(yǎng)基中孵育獲得。
本發(fā)明的溫度敏感型活體豬肺炎支原體，又稱(chēng)為豬肺炎支原體“菌苗”，可以直接作為疫苗應(yīng)用。有效劑量取決于種類(lèi)、品種、年齡、大小、健康狀況以及動(dòng)物以前是否接種過(guò)針對(duì)同一微生物的疫苗。疫苗中的其他組分以及給藥途經(jīng)也會(huì)影響有效劑量。每個(gè)批號(hào)的疫苗都應(yīng)該單獨(dú)進(jìn)行校準(zhǔn)。通過(guò)不同劑量的系統(tǒng)試驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定有效劑量。
本文所述術(shù)語(yǔ)“保護(hù)”當(dāng)用來(lái)描述針對(duì)豬肺炎支原體導(dǎo)致的支原體肺炎疫苗時(shí)是指該疫苗可以預(yù)防豬肺炎支原體導(dǎo)致的支原體肺炎的發(fā)生，防止豬肺炎支原體的定殖，或者減輕或降低豬罹患疾病的嚴(yán)重程度。
根據(jù)疫苗濃度、給藥途經(jīng)和動(dòng)物狀況，可以容易地確定所用疫苗的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定有效劑量。關(guān)鍵因素是該劑量可以針對(duì)自然感染提供至少部分保護(hù)效應(yīng)。因此，疫苗的有效劑量是足以保護(hù)豬免于罹患支原體肺炎的疫苗數(shù)量。該劑量可以在宿主動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，確定的疫苗有效劑量大約為106-109集落形成單位(CFU)/ml，優(yōu)選大約為106-107CFU/ml?；钚猿煞值拇硇苑秶蠹s為組合物的1％-95％(w/w)，如果可能，甚至可以更高或更低。應(yīng)用的量取決于以下因素，如考慮接種動(dòng)物的年齡、體重和身體狀況。應(yīng)用量還取決于動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力，以及所需保護(hù)的程度。通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)建立劑量反應(yīng)曲線，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以容易地建立優(yōu)選劑量?？梢酝ㄟ^(guò)應(yīng)用單劑或多劑疫苗，使受體獲得免疫。在需要維持對(duì)微生物的免疫狀態(tài)時(shí)，可以給予多劑疫苗。
疫苗制劑可以包括一種或多種佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，使其足以基本上預(yù)防自然感染。佐劑是指任何與注射的免疫原混合后，可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。適宜的佐劑包括但不限于表面活性劑，如十六烷胺，十八烷胺，溶血卵磷脂，溴化二甲基雙十八烷基銨，N，N-雙十八烷基-N’-雙(2-羥乙基丙烷二胺)，甲氧基十六烷基-甘油，pluronicpolyols；polanions，如吡喃，硫酸右旋糖苷，poly IC，聚丙烯酸，carbopol；肽，如胞壁酰二肽，MPL，aimethylglycine，吞噬肽，油乳劑，明礬及其混合物。其他潛在佐劑包括大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素或霍亂毒素的B肽亞單位。(McGhee 1993)。
一種廣泛應(yīng)用的程序包括給予無(wú)機(jī)凝膠，如明礬，氫氧化鋁或磷酸鋁。一些最有效的佐劑是油包水乳劑，特別是那些其中懸浮了存活或滅活分支桿菌的佐劑，如完全性Freund’s佐劑。但是，沒(méi)有分支桿菌的乳劑(不完全性Freund’s佐劑)刺激作用更小，常被應(yīng)用。為了增強(qiáng)一種疫苗的免疫原性，可以應(yīng)用含有氫氧化鋁和/或DEAE右旋糖苷(二乙氨乙醚右旋糖苷)的佐劑。氫氧化鋁的濃度范圍可以很寬，依賴(lài)于給藥途經(jīng)，范圍可以高達(dá)大約1.5％。濃度范圍0.1-1.0％更具代表性。同樣，DEAE右旋糖苷的濃度范圍也很寬，例如可以應(yīng)用高達(dá)大約6％的濃度。疫苗中氫氧化鋁和DEAE右旋糖苷的濃度可以是，氫氧化鋁大約為0.24-0.39％，DEAE右旋糖苷大約為1.5％。
可以買(mǎi)到的DEAE右旋糖苷具有多種分子量。盡管實(shí)施例中應(yīng)用的DEAE右旋糖苷的分子量是500,000道爾頓，但作為佐劑，也可以應(yīng)用不同分子量的右旋糖苷。硫酸右旋糖苷也可用作佐劑，但結(jié)果不盡如人意。
氫氧化鋁和DEAE右旋糖苷的最佳濃度可以由那些應(yīng)用本發(fā)明的人容易地確定，方法是在一種佐劑濃度固定的情況下改變另一種佐劑的濃度，然后確定哪個(gè)濃度最具保護(hù)效應(yīng)。
菌苗，無(wú)論是否含有佐劑，都可以與可接受的載體混合進(jìn)行免疫接種。眾所周知的示例包括無(wú)菌水，鹽水或緩沖液。還可應(yīng)用能夠增強(qiáng)在溶液中懸浮度和分散的其他物質(zhì)。用于攜帶疫苗的多種傳統(tǒng)載體是已知的，并在上述參考文獻(xiàn)中有提及。根據(jù)給藥途經(jīng)和受體動(dòng)物狀況選擇適宜載體，是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的。
免疫接種可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何方法進(jìn)行，如口服，鼻腔內(nèi)給藥，氣霧劑和注射給藥(IM，SC，IV，ID或其他方法)。給藥途經(jīng)的選擇取決于將進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物，免疫接種史，以及(給動(dòng)物進(jìn)行)疫苗接種人員的方便。優(yōu)選的給藥途經(jīng)是鼻腔內(nèi)給藥。例如，疫苗可以通過(guò)氣霧劑進(jìn)行給藥(Murphy 1993)。優(yōu)選該給藥途經(jīng)是因?yàn)轭A(yù)防該病、針對(duì)豬肺炎支原體的天然保護(hù)性免疫是局部(肺部)免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，而非循環(huán)抗體。將抗原(疫苗)提呈給呼吸道免疫系統(tǒng)可以刺激局部免疫應(yīng)答。因此，局部應(yīng)用疫苗可能更加有效。而且，在封閉的畜棚或空間使用氣霧劑疫苗并使豬吸入，可以減少在加強(qiáng)生產(chǎn)系統(tǒng)中給大量動(dòng)物進(jìn)行免疫接種所需的人員。氣霧劑免疫接種，又稱(chēng)為噴霧免疫接種，目前還作為商業(yè)基礎(chǔ)用于家禽的免疫接種，可以有效預(yù)防某些疾病。
可以固定時(shí)間間隔進(jìn)行重復(fù)免疫接種來(lái)增強(qiáng)首次免疫應(yīng)答，或在最后一劑接種較長(zhǎng)時(shí)間段后進(jìn)行重復(fù)免疫。兩次免疫接種之間的時(shí)間間隔根據(jù)動(dòng)物的年齡和狀況不同而有所差異。對(duì)于首次免疫接種，時(shí)間通常超過(guò)1周，優(yōu)選大約2-3周。對(duì)于以前免疫接種過(guò)的動(dòng)物，在懷孕前或懷孕期間，大約每年接種一次。
豬肺炎支原體疫苗可以單獨(dú)應(yīng)用，也可為了方便或加強(qiáng)效果，與其他疫苗聯(lián)合應(yīng)用。聯(lián)合疫苗優(yōu)選可以對(duì)多種感染提供保護(hù)。特別令人感興趣的是豬肺炎支原體與支氣管炎博德特氏菌、A型或D型多殺巴氏桿菌聯(lián)合，因?yàn)檫@三種病原體均可導(dǎo)致豬患重病。此外，這種聯(lián)合還不應(yīng)彼此影響它們刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生的能力。這些其他種類(lèi)的疫苗可以通過(guò)完全不同的方法進(jìn)行滅活。與豬肺炎支原體疫苗聯(lián)合的其他疫苗還應(yīng)該與用于豬肺炎支原體疫苗中的同種佐劑相兼容。
肺臟評(píng)分或肺臟病損評(píng)分是指肺臟組織中可以檢測(cè)到的病損程度。評(píng)分系統(tǒng)的實(shí)施如Goodwin and Whittlestone(1973)Br.Vet.J.129456-462所述。
鼻腔內(nèi)制劑應(yīng)包括載體，所述載體既不會(huì)導(dǎo)致鼻腔粘膜刺激，也不會(huì)顯著干擾纖毛功能。本發(fā)明還可采用稀釋劑，如水，鹽水或其他已知物質(zhì)。鼻腔制劑還可含有某些防腐劑，例如但不限于氯丁醇和殺藻胺。還可含有表面活性劑，增強(qiáng)鼻腔粘膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸收。
口服液體制劑可以采用以下形式，如水溶液或油懸液，溶液，乳劑，糖漿或酏劑，或者也可以以片劑的形式存在，或者以一種在使用前需要用水或其他適宜載體進(jìn)行重建的產(chǎn)品的形式存在。這些液體制劑可以含有傳統(tǒng)的添加劑，如懸浮劑，乳化劑，非水載體(可包括食用油)或防腐劑。
為了制備疫苗，需要分離活的溫度敏感型豬肺炎支原體。然后將豬肺炎支原體的量調(diào)整到一個(gè)適宜的濃度，最好與適宜的疫苗佐劑結(jié)合，并包裝備用。
下述實(shí)施例旨在描述而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1制備豬肺炎支原體的溫度敏感型突變株豬肺炎支原體在暴露于N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍后，發(fā)生突變。該方法業(yè)已成功用于幾種支原體(Lam 1984，Lai 1990)。豬肺炎支原體生長(zhǎng)于Friis培養(yǎng)基中，應(yīng)用100mg/ml亞硝基胍處理，然后在Friis瓊脂糖平板上生長(zhǎng)10-14天。暴露于亞硝基胍的微生物生長(zhǎng)于34℃。然后將集落印跡到硝化纖維素上，再轉(zhuǎn)移到瓊脂平板上，39℃孵育。選擇能夠在34℃生長(zhǎng)但在39℃不能生長(zhǎng)的集落備用。然后將選擇的突變株克隆三次，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。分離株保藏于ATCC(ATCC保藏號(hào)＿＿＿＿)。
實(shí)施例2制備疫苗為了制備疫苗，在34℃Friis培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇的一株突變株(ATCC保藏號(hào)＿＿＿＿＿)，直至培養(yǎng)基混濁，并出現(xiàn)酸性顏色改變。通過(guò)10倍稀釋法在Friis肉湯中進(jìn)行集落形成單位(cfu)的測(cè)定，每個(gè)稀釋濃度采用5個(gè)復(fù)制樣本。應(yīng)用的疫苗是新鮮肉湯培養(yǎng)物，沒(méi)有添加佐劑。
實(shí)施例3豬免疫接種的試驗(yàn)性研究為了預(yù)先評(píng)價(jià)疫苗的安全性和有效性，進(jìn)行了一項(xiàng)小型試驗(yàn)性研究。為了進(jìn)行這項(xiàng)研究，從沒(méi)有支原體感染的牧場(chǎng)引進(jìn)了16只5日齡小豬，并在明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的隔離飼養(yǎng)單位進(jìn)行喂養(yǎng)。
試驗(yàn)草案將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，每組8只豬，接受下述處理組別 動(dòng)物數(shù)量疫苗接種 病原體激發(fā) 尸檢14鼻腔內(nèi)(2劑)接種后12天 7周14肌內(nèi)(1劑) 相同 7周24安慰劑(2劑)相同 相同24肌內(nèi) 未進(jìn)行 第1，2，3，7天這種設(shè)計(jì)可以檢測(cè)疫苗的粘膜提呈(鼻腔內(nèi))和非腸道提呈(肌內(nèi))。組2包括未進(jìn)行免疫接種但進(jìn)行病原體激發(fā)的對(duì)照動(dòng)物，以及進(jìn)行免疫接種但未給予病原體激發(fā)的動(dòng)物，后者可以用來(lái)評(píng)價(jià)產(chǎn)品的安全性。
監(jiān)測(cè)的指標(biāo)每周監(jiān)測(cè)豬的體溫以及提示支原體感染的呼吸道體征。每周還應(yīng)用PCR技術(shù)(Calsamiglia 1999)對(duì)豬進(jìn)行鼻腔豬肺炎支原體存在性檢測(cè)。尸檢時(shí)，所有動(dòng)物都進(jìn)行顯微鏡檢查，并評(píng)價(jià)鏡下肺臟損害。通過(guò)PCR以及氣管支氣管拭子細(xì)菌培養(yǎng)，評(píng)定豬肺炎支原體的存在。此時(shí)，還需應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)支原體抗體的存在。
結(jié)果突變株的制備和篩選成功制備了能夠在34℃生長(zhǎng)但不能在39℃生長(zhǎng)的溫度敏感型突變株。篩選、克隆并凍存了兩種突變集落。然后將其中一種突變集落(MNtemp-1)傳代培養(yǎng)3代，檢測(cè)其穩(wěn)定性。該處理過(guò)程后，該突變株沒(méi)有回復(fù)突變，在39℃仍然不能生長(zhǎng)。通過(guò)PCR鑒定該突變株為豬肺炎支原體。
試驗(yàn)性研究疫苗安全性無(wú)論給藥途經(jīng)，所有免疫接種的豬均維持正常體溫38.5-39.5℃。而且，這些動(dòng)物在觀察期內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)呼吸道疾患的臨床癥狀。接受免疫接種但沒(méi)有經(jīng)過(guò)病原體激發(fā)的豬，觀察時(shí)(接種后1、2、3和7天)在注射部位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的大體或鏡下?lián)p害。
疫苗效力疫苗接種劑量為108cfu/ml。
疫苗有效性沒(méi)有一只肌內(nèi)免疫接種的小豬在屠宰時(shí)出現(xiàn)肺炎的大體損害。這些動(dòng)物中有一只(1/4)存在小的鏡下?lián)p害，伴隨輕度支氣管周?chē)鷨魏思?xì)胞浸潤(rùn)。從該動(dòng)物氣管支氣管灌洗液和拭子中培養(yǎng)出豬肺炎支原體。同樣，有一只鼻腔內(nèi)免疫接種的豬顯示出小的肺炎大體損害(3％肺臟受累)，伴隨支氣管周?chē)鷨魏思?xì)胞浸潤(rùn)，以及一些心包積液。該動(dòng)物在尸檢時(shí)也培養(yǎng)出豬肺炎支原體，而且熒光抗體試驗(yàn)陽(yáng)性。其他接受免疫接種并經(jīng)病原體激發(fā)的豬(6/8)沒(méi)有顯示大體或鏡下?lián)p害，氣管支氣管樣本中也沒(méi)有產(chǎn)生豬肺炎支原體陽(yáng)性結(jié)果。
相反，3只未進(jìn)行免疫接種但經(jīng)病原體激發(fā)的動(dòng)物(3/4)存在肺炎的大體損害(9，9和20％的肺臟受累)，并且所有動(dòng)物均具有肺炎的鏡下?lián)p害。所有動(dòng)物熒光陽(yáng)性，氣管支氣管培養(yǎng)產(chǎn)生豬肺炎支原體。這些豬在病原體激發(fā)4天后體溫＞39.5℃。此外，2/4動(dòng)物出現(xiàn)咳嗽和呼吸困難的臨床癥狀。無(wú)論處理方法如何，應(yīng)用Tween-ELISA技術(shù)進(jìn)行評(píng)定，沒(méi)有一只豬存在支原體血清轉(zhuǎn)化。
討論在暴露于亞硝基胍后，通過(guò)隨機(jī)變異成功產(chǎn)生了溫度敏感型突變株(MNtemp-1)?？寺『笞C明，在傳代至少3代后，MNtemp-1菌株仍然穩(wěn)定，沒(méi)有回復(fù)突變?yōu)橐吧?。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR鑒定確證了菌株的純度。
在試驗(yàn)性研究中，應(yīng)用MNtemp-1制備的活疫苗證明，在應(yīng)用致命性豬肺炎支原體激發(fā)后，可以為6/8豬提供成功的完全性保護(hù)。每組中都有1只動(dòng)物存在小的鏡下?lián)p害，并在尸檢時(shí)培養(yǎng)出豬肺炎支原體。這些動(dòng)物中還有1只具有小的(3％)大體損害。相反，未進(jìn)行免疫接種的豬存在較大病損評(píng)分，其中75％具有大體損害，100％具有鏡下?lián)p害，熒光抗體試驗(yàn)全部陽(yáng)性。而且，所有這些對(duì)照動(dòng)物均從氣管支氣管灌洗液中培養(yǎng)產(chǎn)生了支原體。
這些結(jié)果顯示，成功制備了穩(wěn)定的豬肺炎支原體溫度敏感型突變株。它們也提示，該突變株可以成功用作疫苗，避免該物質(zhì)導(dǎo)致的豬肺炎。
實(shí)施例4免疫接種的擴(kuò)大研究進(jìn)行了一項(xiàng)擴(kuò)大性免疫接種研究，確證試驗(yàn)性研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。為了進(jìn)行這項(xiàng)研究，從沒(méi)有支原體感染的牧場(chǎng)引進(jìn)了41只小豬，并在隔離飼養(yǎng)單位進(jìn)行喂養(yǎng)。大體遵循上述實(shí)施例3中敘述的草案。動(dòng)物被隨機(jī)分為4組，接受下列處理減毒疫苗拮抗豬肺炎支原體的評(píng)價(jià)房間A3未進(jìn)行免疫接種和病原體激發(fā)豬ID起始體重終末體重肺臟評(píng)分201 3 71 8202 4 52 5203 5 71 12204 4 50 10205 5 64 7206 4 63 8207 5 63 5208 3 51 5209 5 71 0210 3 56 9
房間A5鼻腔內(nèi)免疫接種，并給予病原體激發(fā)豬ID起始體重終末體重肺臟評(píng)分4164 50 44176 68 94185 49 74195 39 04206 66 04215 50 04226 56 84237 67 04245 56 04255 64 0房間A7鼻腔內(nèi)免疫接種，但未給予病原體激發(fā)豬ID起始體重 終末體重 肺臟評(píng)分401570 0402565 0403670 0404469 04054免疫接種后2周無(wú)痛 0處死4064免疫接種后2周無(wú)痛 0處死4074免疫接種后2周無(wú)痛 0處死408566 0房間A9IM免疫接種，并給予病原體激發(fā)豬ID起始體重 終末體重 肺臟評(píng)分211451 0212459 0213473 8214576 02153免疫接種后2周無(wú)痛 0處死216583 02174肛門(mén)閉鎖，NA218563 2219582 02204免疫接種后2周無(wú)痛 0處死221454 0222455 4223565 0
這些結(jié)果進(jìn)一步證明了減毒疫苗拮抗豬肺炎支原體的安全性和有效性。它們還顯示，該突變株可以作為疫苗，成功用于避免該物質(zhì)導(dǎo)致的豬肺炎。
所有的出版物和專(zhuān)利在此引入，作為參考，其程度與每篇出版物或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖司唧w明確地引入作為參考相同。很清楚，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以在不背離隨后所附權(quán)利要求范疇的情況下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種變化和調(diào)整。
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權(quán)利要求
1.一種分離純化的溫度敏感型豬肺炎支原體菌苗。
2.權(quán)利要求1的菌苗，其ATCC保藏號(hào)為＿＿＿＿＿。
3.一種疫苗制劑，含有活的溫度敏感型豬肺炎支原體菌苗，以及生理可接受的無(wú)毒載體。
4.權(quán)利要求3的疫苗制劑，其中菌苗的ATCC保藏號(hào)為＿＿＿＿。
5.權(quán)利要求5的疫苗制劑，其中疫苗還可進(jìn)一步含有一種免疫佐劑。
6.權(quán)利要求5的疫苗制劑，還進(jìn)一步含有至少一種其他感染致病因子，其中所述感染致病因子為病毒，細(xì)菌，真菌或寄生蟲(chóng)。
7.權(quán)利要求6的疫苗制劑，其中感染致病因子為支氣管炎博德特氏菌，A型或D型多殺巴氏桿菌或副豬型嗜血桿菌。
8.保護(hù)易感豬避免豬肺炎支原體定殖或感染的方法，包括給豬應(yīng)用有效劑量的疫苗制劑，所述疫苗制劑含有活的溫度敏感型豬肺炎支原體菌苗，以及生理可接受的無(wú)毒載體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中疫苗制劑還可進(jìn)一步含有一種免疫佐劑。
10.權(quán)利要求8的方法，其中疫苗制劑可以通過(guò)皮下或肌內(nèi)注射、口服或鼻腔內(nèi)應(yīng)用進(jìn)行給藥。
11.權(quán)利要求8的方法，其中疫苗制劑通過(guò)鼻腔內(nèi)給藥。
12.權(quán)利要求8的方法，其中疫苗制劑可以單劑給藥，也可以多劑給藥。
13.在易感豬中誘導(dǎo)針對(duì)豬肺炎支原體導(dǎo)致的支原體肺炎的免疫應(yīng)答的方法，包括給豬應(yīng)用有效劑量的疫苗制劑，所述疫苗制劑含有活的溫度敏感型豬肺炎支原體菌苗，以及生理可接受的無(wú)毒載體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中疫苗制劑還可進(jìn)一步含有一種免疫佐劑。
15.權(quán)利要求13的方法，其中疫苗制劑可以通過(guò)皮下或肌內(nèi)注射、口服或鼻腔內(nèi)應(yīng)用進(jìn)行給藥。
16.權(quán)利要求13的方法，其中疫苗制劑通過(guò)鼻腔內(nèi)給藥。
17.權(quán)利要求13的方法，其中疫苗制劑可以單劑給藥，也可以多劑給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對(duì)豬肺炎支原體的溫度敏感型活疫苗。本發(fā)明還提供了給豬進(jìn)行免疫接種預(yù)防豬肺炎支原體定殖或感染的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1461338SQ01815971
公開(kāi)日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2001年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月27日
發(fā)明者C·皮喬安 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)評(píng)議會(huì)