專利名稱：檢棒分析改良的捕獲及檢測形式多樣性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢棒(dipsticks)改良的核酸檢測。本發(fā)明的檢棒用于檢測樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，例如鑒定病人是否受致病微生物，例如砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis(CT))的感染。
用于檢測樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的一些常規(guī)測試依賴?yán)镁酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增目標(biāo)核酸。此反應(yīng)可檢測小量的目標(biāo)核酸，然而得到結(jié)果前需耗時數(shù)小時，但因通常希望可盡快得到結(jié)果，例如使病人等待的時間減至最少，故此為其顯著缺點。此等方法的進一步缺點是需要昂貴的專家設(shè)備進行反應(yīng)以及相當(dāng)高成本的試劑。
相反，檢棒可檢測未擴增的目標(biāo)核酸，不需任何專家設(shè)備且能比基于PCR的方法更快速地得到結(jié)果。病人就可于同時接受治療，故特別有益于不喜歡或不能日后復(fù)診的病人。
US5,310,650所述的典型常規(guī)檢棒中，單鏈DNA捕獲探針固定于硝化纖維素濾器上遠離過濾器末端(接觸端)的捕獲區(qū)。捕獲探針序列互補于欲測目標(biāo)核酸第一區(qū)域的序列。標(biāo)記的單鏈DNA檢測探針固定于硝化纖維素濾器上捕獲區(qū)及濾器接觸端之間的探針區(qū)。檢測探針含有互補于目標(biāo)核酸第二區(qū)域序列(不同于第一區(qū)域)的序列。
在認(rèn)為含有目標(biāo)DNA的樣品溶液中檢測目標(biāo)DNA時，將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液。樣品溶液通過毛細作用進入濾紙并經(jīng)過探針區(qū)及捕獲區(qū)。當(dāng)樣品溶液經(jīng)過探針區(qū)時，可使檢測探針移動并使其與樣品溶液一起朝向捕獲區(qū)上升。然后移動的檢測探針能雜交到樣品溶液中存在的任何目標(biāo)DNA的第二區(qū)域。
當(dāng)雜交的檢測探針及目標(biāo)DNA到達捕獲區(qū)時，目標(biāo)DNA的第一區(qū)域能雜交到固定的捕獲探針。由此在目標(biāo)核酸、捕獲探針及標(biāo)記的檢測探針之間形成三重復(fù)合物。捕獲區(qū)出現(xiàn)標(biāo)記時說明樣品溶液中存在目標(biāo)DNA。
至于第二類常規(guī)檢棒，標(biāo)記的DNA檢測探針未固定在硝化纖維素濾器上。而是在允許檢測探針雜交到樣品溶液中任何目標(biāo)核酸的條件下將檢測探針加入到樣品溶液中。然后將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液，且當(dāng)樣品溶液沿檢棒上移時，雜交到檢測探針的目標(biāo)核酸沿硝化纖維素濾器上升，并可通過捕獲探針在捕獲區(qū)捕獲。
上述常規(guī)檢棒檢測法的缺點為捕獲探針特異地雜交目標(biāo)核酸，以至對于欲檢測的每一種不同的目標(biāo)核酸必須制備不同的含有固定捕獲探針的檢棒。同樣，標(biāo)記的檢測探針特異地雜交目標(biāo)核酸，以至對于欲檢測的每一種不同的目標(biāo)核酸必須制備不同的已標(biāo)記的檢測探針。
根據(jù)本發(fā)明，提供在檢棒分析中能雜交到目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針，以及能雜交到吊鉤捕獲探針的通用捕獲探針的用途，以測試檢測樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
文中使用的“檢棒分析”術(shù)語意指使用檢棒的任何分析，其中樣品溶液與檢棒接觸，通過毛細作用移動到檢棒捕獲區(qū)，由此使樣品溶液中的目標(biāo)核酸在捕獲區(qū)通過通用及吊鉤捕獲探針捕獲，并于捕獲區(qū)檢測。
根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，含有接觸端用于接觸樣品溶液以及通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；b)提供吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及能雜交通用捕獲探針；c)提供檢測探針，其能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸；d)在檢測探針可附著樣品溶液中目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液與檢測探針；以及在吊鉤捕獲探針可附著樣品溶液中目標(biāo)核酸第一區(qū)域的條件下，孵育樣品溶液與吊鉤捕獲探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使吊鉤捕獲探針、檢測探針及目標(biāo)核酸之間形成復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過復(fù)合物的吊鉤捕獲探針與固定在捕獲區(qū)的通用捕獲探針間的相互作用而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查檢測探針的存在。
這種方法允許使用相同的層析片來捕獲不同的目標(biāo)核酸，只需使用特異于目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針即可。
檢測探針及吊鉤捕獲探針可以任何順序與樣品溶液孵育，或者它們可在同時加入樣品溶液。
如果樣品足夠允許雜交發(fā)生，也可以通過簡單的將探針同樣品溶液接觸而孵育它們。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，也提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，檢棒含有的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該通用捕獲探針能雜交已結(jié)合目標(biāo)核酸第一區(qū)域的吊鉤捕獲探針；以及檢測部分(detection moiety)，可釋放性地固定在層析片的接觸端與捕獲區(qū)之間的綴合區(qū)(conjugate zone)，檢測部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合已雜交了目標(biāo)核酸第二區(qū)域的檢測探針。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，也提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有用于接觸樣品溶液的接觸端，以及通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；ii)吊鉤捕獲探針，能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及能雜交通用捕獲探針；以及iii)檢測探針，能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用該檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸。
不與樣品溶液孵育，而將吊鉤捕獲探針可釋放性地固定在層析片上接觸端與捕獲區(qū)之間，這只要將吊鉤捕獲探針溶液點在層析片上并風(fēng)干就可實現(xiàn)。如此可制備數(shù)種層析片含有相同的通用捕獲探針固定在捕獲區(qū)上。使用層析片檢測特定的目標(biāo)核酸之前，將適合的吊鉤捕獲探針可釋放性地固定在層析片上使其能捕獲目標(biāo)核酸。于此方法制備層析片，比通過永久固定捕獲探針于層析片而制備含有特異于目標(biāo)核酸的捕獲探針的層析片容易。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液、通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上、以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)提供檢測探針，能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用該檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸；c)在檢測探針可附著樣品溶液中目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液與檢測探針；d)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使目標(biāo)核酸附著檢測探針而可通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過固定在捕獲區(qū)的吊鉤捕獲探針與目標(biāo)核酸第一區(qū)域間的相互作用而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及e)在捕獲區(qū)檢查檢測探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，也提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，檢棒含有的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，進一步提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液、通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上、以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；以及ii)檢測探針，能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸。
可制備數(shù)種層析片含有相同的通用捕獲探針固定在捕獲區(qū)上。使用層析片檢測特別的目標(biāo)核酸之前，將適當(dāng)?shù)牡蹉^捕獲探針雜交到通用捕獲探針上而制備能捕獲目標(biāo)核酸的層析片。再一次，于此方法制備層析片，比通過永久固定捕獲探針于層析片而制備含有特異于目標(biāo)核酸的捕獲探針的層析片容易。
檢測探針可通過共價或非共價連接附著目標(biāo)核酸。優(yōu)選檢測探針含有可通過雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域而附著于目標(biāo)核酸的核酸或核酸類似物。
檢測探針可偶聯(lián)標(biāo)記而由此允許運用檢測探針直接檢測目標(biāo)核酸。然而，優(yōu)選當(dāng)檢測探針雜交目標(biāo)核酸時，通過可結(jié)合檢測探針的檢測部分間接檢測目標(biāo)核酸。
當(dāng)檢測探針含有核酸或核酸類似物時，檢測部分可包含抗體或抗體片段，其能結(jié)合檢測探針雜交目標(biāo)核酸時與目標(biāo)核酸形成的雙鏈體。
然而，優(yōu)選檢測部分是配體(ligand)結(jié)合部分，且檢測探針包括偶聯(lián)檢測配體(其能通過檢測部分而被結(jié)合)的探針。當(dāng)檢測探針含有檢測配體時，檢測部分可為非抗體，或優(yōu)選為抗體或抗體片段。
優(yōu)選檢測配體含有生物素(biotin)，而檢測部分含有抗-生物素的抗體，或檢測配體含有熒光素，而檢測部分含有抗-熒光素的抗體，或檢測配體含有2，4-二硝基苯酚(DNP)，而檢測部分含有抗-DNP的抗體。
或者，檢測配體可含有生物素，而檢測部分含有抗生物素蛋白(avidin)、鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、或其保有生物素結(jié)合活性的衍生物。
檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間的綴合區(qū)，以至于當(dāng)檢測探針通過毛細作用移行到捕獲區(qū)時，檢測部分被釋放并結(jié)合檢測探針。
優(yōu)選為檢測部分含有允許運用檢測探針間接檢測目標(biāo)核酸的標(biāo)記。然而，已標(biāo)記的結(jié)合部分(其能結(jié)合已結(jié)合檢測探針的檢測部分)，可取代用于間接地檢測目標(biāo)核酸。
檢測探針或檢測部分的標(biāo)記優(yōu)選為非放射性。更優(yōu)選標(biāo)記是顏色標(biāo)記，例如紡織染料，金屬溶膠如膠體金，著色的顆粒如著色的乳膠顆粒。
檢測探針可包含一或多種探針。例如檢測探針可包含吊鉤檢測探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第二區(qū)域，以及通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交目標(biāo)核酸時，其能雜交吊鉤檢測探針。
當(dāng)檢測探針含有通用檢測探針及吊鉤檢測探針時，檢測配體或檢測探針的標(biāo)記應(yīng)偶聯(lián)于通用探針。
假如檢測探針含有單個偶聯(lián)檢測配體的探針，每當(dāng)欲檢測不同目標(biāo)核酸或同一目標(biāo)核酸的不同區(qū)域時，則必須將不同的探針偶聯(lián)于檢測配體。使用偶聯(lián)檢測配體的通用檢測探針配合吊鉤檢測探針特別有利，因為偶聯(lián)檢測配體的同一通用檢測探針可與不同的吊鉤檢測探針配合使用來檢測不同的目標(biāo)核酸或同一目標(biāo)核酸的不同區(qū)域。如此，只需制備一種偶聯(lián)檢測配體的探針。
根據(jù)本發(fā)明也提供在檢棒分析中能雜交目標(biāo)核酸的吊鉤檢測探針，以及能雜交吊鉤檢測探針的通用檢測探針的用途，以測試檢測樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
文中使用的“檢棒分析”術(shù)語意指使用檢棒的任何分析，其中樣品溶液與檢棒接觸，通過毛細作用移動到檢棒捕獲區(qū)，由此使樣品溶液中的目標(biāo)核酸在捕獲區(qū)被捕獲，并利用吊鉤及通用檢測探針檢測。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，含有接觸端用于接觸樣品溶液以及捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)提供吊鉤檢測探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第二區(qū)域；c)提供通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域時其能雜交吊鉤檢測探針，而由此允許運用通用檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸；
d)在吊鉤檢測探針可雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域以及通用檢測探針可雜交吊鉤檢測探針的條件下，孵育樣品溶液與吊鉤檢測探針和通用檢測探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使由通用檢測探針、吊鉤檢測探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過復(fù)合物中的目標(biāo)核酸與固定在捕獲區(qū)的捕獲探針間的相互作用而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查通用檢測探針的存在。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，也提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液，以及捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；ii)吊鉤檢測探針，能雜交目標(biāo)核酸的第二區(qū)域；以及iii)通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域時其能雜交吊鉤檢測探針，而由此允許運用通用檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸。
不與樣品溶液孵育，可選帶有吊鉤檢測探針的通用檢測探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間。然后當(dāng)探針通過毛細作用移行到捕獲區(qū)時釋放到樣品溶液中。
在其它實施方案中，以層析片接觸端接觸樣品溶液之后，可選帶有通用檢測探針的吊鉤檢測探針與捕獲區(qū)接觸，而使得目標(biāo)核酸在捕獲區(qū)被捕獲。這可以通過直接用捕獲區(qū)接觸檢測探針溶液，或以層析片接觸端在接觸樣品溶液之后接觸檢測探針溶液而實現(xiàn)，由此使得檢測探針通過毛細作用移動到捕獲區(qū)。如果檢測探針溶液不含通用檢測探針，則需在吊鉤檢測探針接觸捕獲區(qū)之后將通用檢測探針結(jié)合到吊鉤檢測探針。
另外，如果吊鉤檢測探針與樣品溶液孵育或可釋放性地固定在層析片，以層析片接觸端接觸樣品溶液之后，通用檢測探針可與捕獲區(qū)接觸。再一次，其可通過直接應(yīng)用檢測探針溶液接觸捕獲區(qū)，或以層析片接觸端接觸通用檢測探針溶液而實現(xiàn)。
需知吊鉤檢測探針必須存在以使通用檢測探針能結(jié)合目標(biāo)核酸。
在其他類型的檢棒分析中，目標(biāo)核酸可在捕獲區(qū)被捕獲部分(capture moiety)捕獲，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合雜交了目標(biāo)核酸的捕獲探針。捕獲探針可包含能被捕獲部分結(jié)合的配體。通常通過向能夠雜交目標(biāo)核酸的捕獲探針部分共價偶聯(lián)配體而制備捕獲探針。
因為捕獲探針特異地雜交目標(biāo)核酸，所以對于每種不同的欲檢測目標(biāo)核酸必須制備不同的帶有配體的捕獲探針。
或者，如果捕獲部分通過非堿基配對相互作用直接結(jié)合捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的部分，則每次用不同的捕獲探針去捕獲不同的目標(biāo)核酸時可能需要不同的捕獲部分。例如，如果捕獲部分是能結(jié)合由捕獲探針和目標(biāo)核酸之間形成的雜交體的抗體時，該抗體可能不對所有的捕獲探針/目標(biāo)核酸雜交體都有高的親和力。
根據(jù)本發(fā)明進一步的方面，提供測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，含有接觸端用于接觸樣品溶液以及捕獲部分固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用捕獲探針，后者通過吊鉤捕獲探針結(jié)合目標(biāo)核酸；b)提供吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸；c)提供通用捕獲探針，其能雜交吊鉤捕獲探針；d)將樣品溶液接觸在吊鉤捕獲探針可雜交目標(biāo)核酸的條件下的吊鉤捕獲探針；和在通用捕獲探針可雜交吊鉤捕獲探針的條件下的通用捕獲探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使由通用捕獲探針、吊鉤捕獲探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物中的捕獲配體(通過非堿基配對相互作用)而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及
f)在捕獲區(qū)檢查目標(biāo)核酸的存在。
優(yōu)選，通用捕獲探針包含能被捕獲部分結(jié)合而捕獲復(fù)合體的捕獲配體。適合的捕獲配體實例包括生物素，熒光素和DNP。生物素能被抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素抗體結(jié)合。熒光素和DNP可分別被抗熒光素抗體和抗DNP抗體結(jié)合。
需知通過簡單地使用不同的吊鉤捕獲探針可以捕獲不同的目標(biāo)核酸。只需要制備一類偶聯(lián)捕獲配體(或能被捕獲部分結(jié)合)的探針。
通用和吊鉤捕獲探針不需要同樣品溶液孵育。在其他方法中，可選帶有吊鉤捕獲探針的通用捕獲探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間。通過毛細作用移行到捕獲區(qū)的樣品溶液釋放通用捕獲探針(和吊鉤捕獲探針)而允許釋放的探針結(jié)合目標(biāo)核酸。在層析片上可釋放性地固定一或多種探針的優(yōu)點是由此簡化方法以及減少需要加入樣品溶液的單獨的試劑的數(shù)量。這會是重要的優(yōu)點，尤其是在偏遠地區(qū)用檢棒測試患者的樣品溶液(如尿液)來確定患者是否患有疾病的時候。
需知如果吊鉤捕獲探針未同通用捕獲探針一起可釋放性地固定在層析片上，則在樣品溶液沿層析片上移之前應(yīng)該優(yōu)選將吊鉤捕獲探針同樣品溶液孵育。然而，也可能用吊鉤捕獲探針的單獨溶液接觸層析片而使吊鉤捕獲探針溶液通過毛細作用向捕獲區(qū)遷移，由此釋放通用捕獲探針并允許通用和吊鉤捕獲探針在捕獲區(qū)捕獲。然后需要用樣品溶液接觸層析片而允許目標(biāo)核酸通過在捕獲區(qū)同吊鉤捕獲探針雜交而被捕獲。
在這種方法的進一步變化中，通用和吊鉤捕獲探針可以結(jié)合捕獲部分，例如，通過直接將它們應(yīng)用于捕獲區(qū)或在層析片的接觸端接觸樣品溶液之前將層析片分別接觸通用捕獲探針和吊鉤捕獲探針溶液?；蛘撸灰诮佑|端接觸樣品溶液之前通用捕獲探針結(jié)合于捕獲部分，可以將吊鉤捕獲探針可釋放性地固定于層析片。
然而，優(yōu)選在層析片的接觸端接觸樣品溶液之前將通用和吊鉤捕獲探針加入樣品溶液，因為認(rèn)為在層析片上雜交反應(yīng)的發(fā)生比非堿基配對相互作用更慢。如果在溶液中進行雜交則可以更方便地控制雜交條件。
根據(jù)本發(fā)明，也提供用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液，以及捕獲部分固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用捕獲探針，后者通過吊鉤捕獲探針結(jié)合目標(biāo)核酸。；吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸；以及通用捕獲探針，其能雜交吊鉤捕獲探針。
通用捕獲探針和/或吊鉤捕獲探針可以可釋放性地固定于層析片的接觸端和捕獲區(qū)之間。
可以用前述檢測探針檢測目標(biāo)核酸。
本發(fā)明的試劑盒中檢測探針或通用檢測探針包含檢測配體，該試劑盒還可以進一步包含能結(jié)合檢測配體的被標(biāo)記的檢測部分，由此允許間接檢測目標(biāo)核酸。標(biāo)記的檢測部分可以可釋放性地固定于層析片的接觸端和捕獲區(qū)之間。
根據(jù)本發(fā)明也提供本發(fā)明的檢棒或試劑盒的用途，以測試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
目標(biāo)核酸可為任何核酸，但優(yōu)選致病微生物的核酸，更優(yōu)選引起性傳播疾病的微生物的核酸。更優(yōu)選目標(biāo)核酸為砂眼衣原體的核酸。
本發(fā)明優(yōu)選方法中，探針與目標(biāo)核酸的雜交在樣品溶液與層析片接觸端接觸之前在樣品溶液中進行(不同于固定的通用捕獲探針與目標(biāo)核酸的雜交)。最優(yōu)選探針雜交于一步進行。這樣簡化方法，由此使它們的操作更快速及更容易。
多步驟雜交可通過將不同探針同樣品溶液中的目標(biāo)核酸相繼雜交，或通過將層析片接觸各含有不同探針的不同溶液而進行。通常后一種多步驟雜交方法涉及在接觸每一不同探針溶液之間要清洗層析片。
然而某些情況中優(yōu)選多步驟雜交，需知通常優(yōu)選更簡單及更快速形式的一步雜交。
最優(yōu)選樣品溶液具有適當(dāng)?shù)慕M成而使雜交反應(yīng)于單一雜交步驟中進行，也允許非堿基配對相互作用(例如在檢測配體和檢測配體結(jié)合部分之間)進行并通過毛細作用使含有目標(biāo)核酸及一或多種已雜交的探針及(可選地)配體結(jié)合部分的復(fù)合物在層析片上傳送。
使用這樣的樣品溶液時，需知在樣品溶液直接與層析片接觸端接觸之前雜交反應(yīng)可于單一步驟中進行，并且可發(fā)生任何配體-配體結(jié)合部分的相互作用(不需第一次稀釋或改變樣品溶液)。一旦樣品溶液與層析片接觸，如果需要，則配體-配體結(jié)合部分的相互作用可以額外或另外在層析片上進行。由此促進目標(biāo)核酸的簡單且快速的檢棒檢測。
我們發(fā)現(xiàn)此等結(jié)果是以含具有鹽，去污劑及封閉性蛋白質(zhì)例如BSA或奶粉的標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(例如SSPE緩沖液或Tris緩沖液)的樣品溶液完成的。使用此種分析檢測目標(biāo)核酸的敏感度，已知與其它檢棒分析法大約相當(dāng)。
僅以實施例的方式說明本發(fā)明實施。
以下敘述的實施例關(guān)于砂眼衣原體(Chllamydia trachomatis(CT))核酸的檢測。CT是性傳播疾病最常見的誘因之一。CT感染能引起不孕，且于懷孕期間乃至出生可造成自發(fā)性流產(chǎn)或產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。在新生兒，CT感染能引起失明及慢性呼吸道疾病。接近10％受感染男性及高達70％受感染女性未表現(xiàn)CT感染的癥狀。因此，CT感染的正確診斷是重要的，以至能開始此疾病的早期治療。
下列實施例使用的探針序列如下所示SEQ ID NO15’TTC ATA TCC AAG GAC AAT AGA CCA ASEQ ID NO25’TCC CTC GTG ATA TAA CCT ATC CGSEQ ID NO35’CAG GTT GTT AAC AGG ATA GCA CGCSEQ ID NO45’CTC GTT CCG AAA TAG AAA ATC GCASEQ ID NO55’GGT AAA GCT CTG ATA TTT GAA GACSEQ ID NO65’CTG AGG CAG CTT GCT AAT TAT GAG T
實施例1使用通用捕獲探針捕獲CT目標(biāo)核酸(1011至108拷貝的872bpDNA)。雜交于吊鉤捕獲探針的通用捕獲探針固定于檢棒。吊鉤捕獲探針的序列互補于通用捕獲探針的序列及目標(biāo)核酸的序列。利用1012拷貝的偶聯(lián)生物素的Seq ID No 2，3，5及6的檢測探針，并以抗-生物素抗體-染料綴合物為檢測部分進行檢測。檢測限經(jīng)觀察為109拷貝的目標(biāo)核酸。
實施例2使用SEQ ID No4為捕獲探針固定于檢棒以捕獲CT目標(biāo)核酸(1011至1010拷貝的872bp DNA)。使用吊鉤檢測探針及通用檢測探針檢測目標(biāo)核酸。吊鉤檢測探針具有對應(yīng)于SEQ ID No6的序列(能雜交到目標(biāo)核酸)以及互補于通用檢測探針的序列。通用檢測探針偶聯(lián)染料允許檢測通用檢測探針。少至1010拷貝的目標(biāo)核酸可被檢測到。
本發(fā)明允許簡化檢棒及檢測探針的制備。
序列表<110>Lee，Helen<120>檢棒分析改良的捕獲和檢測形式多樣性<130>41743A/JMD/NT<140>PCT/GB01/03029<141>2001-07-06<150>GB 0016833.6<151>2000-07-07<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>1ttcatatcca aggacaatag accaa 25<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>2tccctcgtga tataacctat ccg23<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>3caggttgtta acaggatagc acgc 24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>4ctcgttccga aatagaaaat cgca 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>5ggtaaagctc tgatatttga agac 24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>探針序列<400>6ctgaggcagc ttgctaatta tgagt 2權(quán)利要求
1.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液以及通用捕獲探針(universal capture probe)固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；b)提供吊鉤捕獲探針(hook capture probe)，其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及通用捕獲探針；c)在吊鉤捕獲探針可雜交到樣品溶液中目標(biāo)核酸第一區(qū)域的條件下，孵育樣品溶液與吊鉤捕獲探針；d)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使吊鉤捕獲探針、檢測探針(detection probe)及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過復(fù)合物的吊鉤捕獲探針與固定在捕獲區(qū)的通用捕獲探針之間的相互作用結(jié)合到捕獲區(qū)；以及e)在捕獲區(qū)檢測目標(biāo)核酸的存在。
2.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；以及吊鉤捕獲探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及通用捕獲探針；b)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，通過毛細作用引起樣品溶液移行到捕獲區(qū)，并當(dāng)其向捕獲區(qū)移動時由此釋放吊鉤捕獲探針并使釋放的吊鉤捕獲探針雜交到樣品溶液中的目標(biāo)核酸，以至含有目標(biāo)核酸及吊鉤捕獲探針的復(fù)合物能通過通用捕獲探針雜交復(fù)合物的吊鉤捕獲探針而在捕獲區(qū)被捕獲；以及c)在捕獲區(qū)檢測目標(biāo)核酸的存在。
3.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液以及通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；b)提供吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及通用捕獲探針；c)提供檢測探針，其能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用檢測探針直接或間接地檢測目標(biāo)核酸；d)在檢測探針可附著到樣品溶液中目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液與檢測探針；以及在吊鉤捕獲探針可附著到樣品溶液中目標(biāo)核酸第一區(qū)域的條件下，孵育樣品溶液與吊鉤捕獲探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使吊鉤捕獲探針、檢測探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過復(fù)合物的吊鉤捕獲探針與固定在捕獲區(qū)的通用捕獲探針間的相互作用而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查檢測探針的存在。
4.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使樣品溶液中的目標(biāo)核酸可通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過固定在捕獲區(qū)的吊鉤捕獲探針與目標(biāo)核酸第一區(qū)域間的相互作用結(jié)合到捕獲區(qū)；以及c)在捕獲區(qū)檢測目標(biāo)核酸的存在。
5.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，以及雜交通用捕獲探針的的吊鉤捕獲探針，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)提供檢測探針，其能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸；c)在檢測探針可附著到樣品溶液中目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液與檢測探針；d)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使附著檢測探針的目標(biāo)核酸可通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過固定在捕獲區(qū)的吊鉤捕獲探針與目標(biāo)核酸第一區(qū)域之間的相互作用結(jié)合到捕獲區(qū)；以及e)在捕獲區(qū)檢查檢測探針的存在。
6.根據(jù)權(quán)利要求第3或5項的方法，其中檢測探針能通過雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域而附著于目標(biāo)核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求第6項的方法，其中檢測探針含有能雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域的吊鉤檢測探針，以及當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交到目標(biāo)核酸時能雜交吊鉤檢測探針的通用檢測探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求第6或7項的方法，其中檢測探針或通用檢測探針含有標(biāo)記而由此允許運用該檢測探針或該通用和吊鉤檢測探針直接檢測目標(biāo)核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求第6或7項的方法，其進一步包括將檢測探針或通用檢測探針與檢測部分(detection moiety)接觸，當(dāng)檢測探針雜交到目標(biāo)核酸時，該檢測部分能以非堿基配對的相互作用結(jié)合檢測探針，由此允許運用檢測探針或通用和吊鉤檢測探針間接檢測目標(biāo)核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求第9項的方法，其中檢測探針或通用檢測探針含有檢測配體，其能被檢測部分結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求第9或10項的方法，其中檢測部分包含抗體或抗體片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求第12項的方法，其中檢測配體含有生物素(biotin)并且檢測部分含有抗-生物素的抗體，或其中檢測配體含有熒光素而檢測部分含有抗-熒光素的抗體，或其中檢測配體含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而檢測部分含有抗-DNP的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求第9至12項中任一項的方法，其中檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間的綴合區(qū)(conjugatezone)，以至于當(dāng)復(fù)合物通過毛細作用移行到捕獲區(qū)時，檢測部分釋放并能結(jié)合檢測探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求第9至13項中任一項的方法，其中檢測部分含有標(biāo)記允許檢測檢測部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求第8或14項的方法，其中標(biāo)記為非放射性標(biāo)記。
16.根據(jù)權(quán)利要求第15項的方法，其中標(biāo)記為顏色標(biāo)記。
17.根據(jù)權(quán)利要求第16項的方法，其中顏色標(biāo)記包括紡織染料，金屬溶膠如膠體金，或著色的顆粒如著色的乳膠顆粒。
18.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液以及捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交到目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)提供吊鉤檢測探針，其能雜交到目標(biāo)核酸的第二區(qū)域；c)提供通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域時，其能雜交吊鉤檢測探針，而由此允許運用通用及吊鉤檢測探針直接或間接檢測目標(biāo)核酸；d)在吊鉤檢測探針可雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域以及通用檢測探針可雜交到吊鉤檢測探針的條件下，孵育樣品溶液與吊鉤檢測探針和通用檢測探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使通用檢測探針、吊鉤檢測探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過復(fù)合物的目標(biāo)核酸與固定在捕獲區(qū)的捕獲探針之間的相互作用結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查通用檢測探針的存在。
19.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端用于接觸樣品溶液；捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交到目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；以及通用檢測探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間；b)在吊鉤檢測探針可雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域的條件下，孵育樣品溶液與能雜交目標(biāo)核酸第二區(qū)域的吊鉤檢測探針；c)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，通過毛細作用使樣品溶液移行到捕獲區(qū)，并當(dāng)其向捕獲區(qū)移行時由此釋放通用檢測探針以使釋放的通用檢測探針能雜交到樣品溶液中的吊鉤檢測探針，并且含有通用檢測探針、吊鉤檢測探針及目標(biāo)核酸的復(fù)合物能通過復(fù)合物的目標(biāo)核酸與固定在捕獲區(qū)的捕獲探針之間的相互作用結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查通用檢測探針的存在。
20.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其含有接觸端用于接觸樣品溶液以及捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交到目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；b)提供吊鉤檢測探針，其能雜交到目標(biāo)核酸的第二區(qū)域；c)提供通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域時，其能雜交吊鉤檢測探針，而由此允許運用通用及吊鉤檢測探針直接地或間接檢測目標(biāo)核酸；d)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，通過毛細作用使樣品溶液移行到捕獲區(qū)，并被捕獲探針在捕獲區(qū)捕獲；e)將吊鉤檢測探針及通用檢測探針接觸捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查通用檢測探針的存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求第18、19或20項的方法，其中通用檢測探針含有標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求第20項的方法，其進一步包括將通用檢測探針與檢測部分接觸，當(dāng)通用檢測探針雜交到吊鉤檢測探針時，該檢測部分能以非堿基配對的相互作用結(jié)合通用檢測探針。
23.根據(jù)權(quán)利要求第22項的方法，其中通用檢測探針含有檢測配體，其能被檢測部分結(jié)合。
24.根據(jù)權(quán)利要求第22或23項的方法，其中檢測部分包含抗體或抗體片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求第24項的方法，其中檢測配體含有生物素而檢測部分含有抗-生物素的抗體，或其中檢測配體含有熒光素而檢測部分含有抗-熒光素的抗體，或其中檢測配體含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而檢測部分含有抗-DNP的抗體。
26.根據(jù)權(quán)利要求第22至25項中任一項的方法，其中檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間的綴合區(qū)，以使得當(dāng)復(fù)合物通過毛細作用移行到捕獲區(qū)時，該檢測部分釋放并可結(jié)合通用檢測探針。
27.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包括a)提供層析片，其含有接觸端，用于接觸樣品溶液；和捕獲部分，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用捕獲探針，后者通過吊鉤捕獲探針結(jié)合目標(biāo)核酸。b)提供吊鉤捕獲探針，其能雜交目標(biāo)核酸；c)提供通用捕獲探針，其能雜交吊鉤捕獲探針；d)將樣品溶液接觸在吊鉤捕獲探針可雜交目標(biāo)核酸的條件下的吊鉤捕獲探針；和在通用捕獲探針可雜交吊鉤捕獲探針的條件下的通用捕獲探針；e)以層析片的接觸端接觸樣品溶液，以使通用捕獲探針、吊鉤捕獲探針及目標(biāo)核酸之間形成的復(fù)合物能通過毛細作用移行到捕獲區(qū)，并通過捕獲部分結(jié)合復(fù)合物中的捕獲配體(通過非堿基配對相互作用)而結(jié)合到捕獲區(qū)；以及f)在捕獲區(qū)檢查目標(biāo)核酸的存在。
28.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其含有的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，且其能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域。
29.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包括的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；以及可釋放性固定于層析片的接觸端和捕獲區(qū)之間的吊鉤捕獲探針，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域。
30.根據(jù)權(quán)利要求第28或29項的檢棒，其進一步包括檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)間的綴合區(qū)(conjugatezone)，該檢測部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合已雜交了目標(biāo)核酸第二區(qū)域的檢測探針。
31.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其含有的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該通用捕獲探針能雜交到已結(jié)合目標(biāo)核酸第一區(qū)域的吊鉤捕獲探針；以及檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)間的綴合區(qū)，該檢測部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合已雜交了目標(biāo)核酸第二區(qū)域的檢測探針。
32.根據(jù)權(quán)利要求第30或31項的檢棒，其中檢測部分含有標(biāo)記。
33.根據(jù)權(quán)利要求第32項的檢棒，其中標(biāo)記為非放射性標(biāo)記。
34.根據(jù)權(quán)利要求第33項的檢棒，其中標(biāo)記為顏色標(biāo)記。
35.根據(jù)權(quán)利要求第34項的檢棒，其中顏色標(biāo)記包括紡織染料，金屬溶膠如膠體金，或著色的顆粒如著色的乳膠顆粒。
36.根據(jù)權(quán)利要求第30至35項中任一項的檢棒，其中檢測部分包含抗體或抗體片段。
37.根據(jù)權(quán)利要求第36項的檢棒，其中檢測部分含有抗-生物素抗體，抗-熒光素抗體，或抗-DNP抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求第30至35項中任一項的檢棒，其中檢測部分含有抗生物素蛋白(avidin)、鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、或其保有生物素結(jié)合活性的衍生物。
39.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其含有的層析片具有接觸端，用于接觸樣品溶液；捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能直接或間接地結(jié)合目標(biāo)核酸；通用檢測探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間，該通用檢測探針能雜交吊鉤檢測探針；以及可選地吊鉤檢測探針可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)之間，該吊鉤檢測探針能雜交到目標(biāo)核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求第39項的檢棒，其包括檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)間的綴合區(qū)，該檢測部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用檢測探針。
41.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包括檢棒，其具有的層析片含有接觸端，用于接觸樣品溶液；和捕獲部分，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用捕獲探針，后者通過吊鉤捕獲探針結(jié)合目標(biāo)核酸；以及吊鉤捕獲探針和/或通用捕獲探針，可釋放性地固定在層析片的接觸端和捕獲區(qū)之間，該吊鉤捕獲探針能雜交目標(biāo)核酸，且該通用捕獲探針能雜交該吊鉤捕獲探針。
42.根據(jù)權(quán)利要求第28至41項中任一項的檢棒，其中目標(biāo)核酸為致病微生物的核酸，優(yōu)選引起性傳播疾病的微生物的核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求第42項的檢棒，其中目標(biāo)核酸為砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的核酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求第28至43項中任一項的檢棒的用途，用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在。
45.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液，以及通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；ii)吊鉤捕獲探針，其能雜交到目標(biāo)核酸的第一區(qū)域以及通用捕獲探針；以及可選地iii)檢測探針，其能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用該檢測探針直接或間接地檢測目標(biāo)核酸。
46.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液；通用捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上；以及雜交通用捕獲探針的吊鉤捕獲探針，該吊鉤探針能雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域；以及可選地ii)檢測探針，其能附著目標(biāo)核酸而由此允許運用該檢測探針直接或間接地檢測目標(biāo)核酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求第45或46項的試劑盒，其中檢測探針能通過雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域而附著目標(biāo)核酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求第47項的試劑盒，其中檢測探針含有吊鉤檢測探針能雜交到目標(biāo)核酸的第二區(qū)域，以及當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交到目標(biāo)核酸時能雜交吊鉤檢測探針的通用檢測探針。
49.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含i)檢棒，其含有的層析片具有接觸端用于接觸樣品溶液，以及捕獲探針固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲探針能雜交到目標(biāo)核酸的第一區(qū)域，或能間接結(jié)合目標(biāo)核酸；ii)吊鉤檢測探針，其能雜交目標(biāo)核酸的第二區(qū)域；以及iii)通用檢測探針，當(dāng)?shù)蹉^檢測探針雜交到目標(biāo)核酸第二區(qū)域時，其能雜交吊鉤檢測探針，而由此允許運用該檢測探針直接或間接地檢測目標(biāo)核酸。
50.根據(jù)權(quán)利要求第45至49項中任一項的試劑盒，其中檢測探針或通用檢測探針含有標(biāo)記而由此允許運用該檢測探針或該通用及吊鉤檢測探針直接檢測目標(biāo)核酸。
51.根據(jù)權(quán)利要求第45至49項中任一項的試劑盒，其中檢測探針或通用檢測探針含有能被檢測部分結(jié)合的檢測配體，而由此允許運用該檢測探針或該通用及吊鉤檢測探針間接檢測目標(biāo)核酸。
52.根據(jù)權(quán)利要求第51項的試劑盒，其進一步包括能結(jié)合檢測配體的檢測部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求第52項的試劑盒，其中檢測部分包含抗體或抗體片段。
54.根據(jù)權(quán)利要求第53項的試劑盒，其中檢測配體含有生物素而檢測部分含有抗-生物素的抗體，或其中檢測配體含有熒光素而檢測部分含有抗-熒光素的抗體，或其中檢測配體含有2，4-二硝基苯酚(DNP)而檢測部分含有抗-DNP的抗體。
55.根據(jù)權(quán)利要求第52至54項中任一項的試劑盒，其中檢測部分可釋放性地固定在層析片接觸端與捕獲區(qū)間的綴合區(qū)。
56.根據(jù)權(quán)利要求第52至55項中任一項的試劑盒，其中檢測部分含有標(biāo)記而允許檢測檢測部分。
57.根據(jù)權(quán)利要求第50或55項的試劑盒，其中標(biāo)記為非放射性。
58.根據(jù)權(quán)利要求第57項的試劑盒，其中標(biāo)記為顏色標(biāo)記。
59.根據(jù)權(quán)利要求第58項的試劑盒，其中顏色標(biāo)記包括紡織染料，金屬溶膠如膠體金，或著色的顆粒如著色的乳膠顆粒。
60.測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包括檢棒，其具有的層析片含有接觸端，用于接觸樣品溶液；和捕獲部分，固定在層析片遠離接觸端的捕獲區(qū)上，該捕獲部分能通過非堿基配對相互作用結(jié)合通用捕獲探針，后者通過吊鉤捕獲探針結(jié)合目標(biāo)核酸；吊鉤捕獲探針，能雜交目標(biāo)核酸；及
通用捕獲探針，能雜交該吊鉤捕獲探針。
61.通用及吊鉤檢測探針在檢棒分析中的用途，用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在。
62.通用及吊鉤檢測探針在檢棒分析中的用途，用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在。
63.根據(jù)權(quán)利要求第45至60項中任一項的試劑盒的用途，用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在。
全文摘要
本發(fā)明說明用于測試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒(dipsticks)。檢棒含有固定在檢棒捕獲區(qū)上的通用捕獲探針(universal captureprobe)。通用捕獲探針能雜交到吊鉤捕獲探針(hook capture probe)，吊鉤捕獲探針能雜交到樣品溶液中的目標(biāo)核酸。檢棒的接觸端接觸樣品溶液，通過毛細作用使雜交了目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針移行到捕獲區(qū)，而在此處檢測目標(biāo)核酸。通用及吊鉤捕獲探針的使用使得制備的檢棒可用于捕獲任何目標(biāo)核酸，由此簡化檢棒的制備。目標(biāo)核酸捕獲的特異性可通過使用適合的吊鉤捕獲探針實現(xiàn)。本發(fā)明也說明方法及試劑盒。
文檔編號C12M1/34GK1452662SQ0181530
公開日2003年10月29日 申請日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者海倫·李, 胡香云, 瑪格塔·阿納斯達索瓦·狄尼瓦 申請人:海倫·李