專利名稱：植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化植物的轉(zhuǎn)化和再生。本發(fā)明尤其涉及轉(zhuǎn)化通常難以轉(zhuǎn)化的植物。
通過基因轉(zhuǎn)化改良植物品種對于現(xiàn)代植物育種已變得日益重要。具有潛在商業(yè)利益的基因，例如賦予抗病性、抗蟲性或品質(zhì)改善的植物性狀的基因，可能通過各種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)引入作物物種。
分析植物基因表達(dá)必需開發(fā)有效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的必要條件包括，使植物有效再生的適當(dāng)植物靶組織、有效傳送外源DNA進(jìn)入植物靶細(xì)胞的基因運(yùn)載工具、以及選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的有效方法。例如在雙子葉物種的基因轉(zhuǎn)化中，利用細(xì)菌根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)常常用于基因傳送的載體。目前供土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的優(yōu)選靶組織包括子葉、葉片組織和下胚軸。高速微粒轟擊提供了將基因傳送給植物的另一方法。
盡管基因轉(zhuǎn)化以及其后再生基本上是現(xiàn)今許多植物品種的常規(guī)事件，眾多現(xiàn)有方法中大部分仍然難以轉(zhuǎn)化某些具有商業(yè)意義的作物，例如糖用甜菜、南瓜、向日葵、大豆和棉花。
例如，甜菜(Beta vulgaris)(包括糖用甜菜、飼料甜菜、食用甜菜和唐萵苣(Swiss chard))盡管在某些細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并偶爾成功獲得特定基因型，但是沒有可利用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的簡單、常規(guī)方法。糖用甜菜原生質(zhì)體難以轉(zhuǎn)化，其有詳細(xì)記述。例如參見國際專利申請NO.WO91/13159以及K.D’Halluin等人，Bio/Technology，10 309-314(1992))。關(guān)于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，″糖用甜菜以困難聞名″，并且″報(bào)導(dǎo)的制備轉(zhuǎn)基因糖用甜菜植物的大部分技術(shù)需要研究它們的實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)專家，并(已經(jīng))證明不容易被他人重復(fù)″，F(xiàn).A.Krens等人，Plant Sci.116，97-106(1996)，引述M.C.Elliot等人Physiology and Biochemistry of Cytokinins inPlants，329-334頁(SPB Publishing，The Hague，1992)；K.Lindsey等人，J.Exp.Bot.41，529-536(1990)；以及上述D’Halluin等人。Krens等人的文章另外描述，″選擇方法...利用子葉作為外植體系統(tǒng)，其只被在表面上進(jìn)行了描述″。以上Krens等人引述J.E.Fry等人，Molecular Biology of Plant Growth andDevelopment，Third International Congress of theInternational Society for Plant Molecular Biology摘要#384(R.B.Hallick，editor，Tuscon，Arizona，USA 1991)。然而，該方法效率不高；例如，一研究人員報(bào)告從15,000個(gè)培植的外植體僅僅獲得21個(gè)轉(zhuǎn)基因芽，包括若干嵌合體。U.Sander，Transformation von Beta vulgaris L.，(Ph.D.論文，University of Hanover，Germany 1994)。Krens等人的文章自己報(bào)告，利用子葉節(jié)以及卡那霉素選擇技術(shù)，糖用甜菜的轉(zhuǎn)化頻率為0.9％。上述Krens等人，103頁。
文獻(xiàn)中有有關(guān)從糖用甜菜的表皮細(xì)胞制備愈傷組織(參見Kotowska等人，Bull.of the Polish Acad.Sci.32，11-12(1984)；Kotowska，Beitr.Biol.Pflanz.67，209-223(1992))的簡述，以及描述在糖用甜菜葉柄表皮上制備不定芽的若干報(bào)告。例如參見Harms等人，Plant Cell Tissue Organ Culture 2，93-102(1983)；Schneider等人，Biochem.Physiol.Pflanz.182，485-490(1987))。然而，這些報(bào)告沒有提供證據(jù)，證明利用這些方法能夠轉(zhuǎn)化糖用甜菜植物。
已經(jīng)報(bào)告利用糖用甜菜原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化糖用甜菜。例如參見R.Hall等人，Nature Biotechnology 14，1133-1138(1996)；R.Hall等人，Plant Physiol.107，1379-1386(1995)；R.Sevenier等人，Nature Biotechnology 16，843-846(1998)；以及歐洲專利EP0 723 393 B1。然而，從糖用甜菜葉子分離的原生質(zhì)體大小和形態(tài)不同，反映來源組織內(nèi)部在生理及細(xì)胞遺傳水平的高度細(xì)胞不均一性。因此，利用原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化技術(shù)需要研究特定方法的實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)技術(shù)人員，而且結(jié)果不容易重復(fù)。
總之，糖用甜菜的轉(zhuǎn)化技術(shù)迄今非常依賴于外植體來源、植物基因型以及所用選擇條件，并難以獲得高效轉(zhuǎn)化。例如參見K.Lindsey等人，J.Experimental Botany41，529-536(1990)；K.Lindsey等人，″Transformation in Sugar Beet(Beta vulgarisL.)，″Biotechnology in Agriculture and Forestry，Vol.23，Plant Protoplasts and Genetic Engineering IV(Y.P.S.Bajaj，Ed.，Springer-Verlag，Berlin，1993)。糖用甜菜是溫帶氣候區(qū)域的重要作物。世界食糖消費(fèi)超過30％來自糖用甜菜。因此一直需要適于迄今難以轉(zhuǎn)化的甜菜和其它植物的簡單、高效的轉(zhuǎn)化方法。
需要簡單、高效轉(zhuǎn)化方法的其它難以轉(zhuǎn)化的植物包括各種品種的南瓜。在一項(xiàng)研究中，利用從種子切離的子葉，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生夏季南瓜栽培品種。C.Gonsalves，HortScience 30，1295-1297(1995)。然而，計(jì)算該方法的再生效率為每個(gè)原始Id外植體0.3個(gè)小植株。其它報(bào)告報(bào)道了制備轉(zhuǎn)基因南瓜，但是沒有描述或不能公開獲得用于得到再生植物的轉(zhuǎn)化方法。例如參見D.Tricoli等人，Bio/Technology 13，1458-1465，1464(1995)。
已經(jīng)描述了利用幼苗(非切離的)芽尖或切離的芽尖的轉(zhuǎn)化方法。參見Smith等人，美國專利NO.5,164,310(在此全文引入供參考)；P.Chee等人，Plant Physiol.91，1212-1218(1989)；F.J.L.Aragao等人，Int.J.Plant Sci.158，157-163(1997)；以及P.Christou等人，Plant J.8，275-281(1992)。在這些方法中，芽尖或者轉(zhuǎn)化時(shí)仍然附著于幼苗或萌芽種子，或者從幼苗切離。在后一種情況下，每個(gè)切離的芽尖最終只產(chǎn)生一個(gè)芽。
也已描述了利用芽尖分生培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化方法。例如參見Zhong等人，美國專利NO.5,767,368(在此全文引入供參考)；H.Zhong等人，Plant Physiol.110，1097-1107(1996)；以及S.Zhang等人，Plant Cell Reports 18，959-966(1999)。然而，已經(jīng)證明這些方法只對少數(shù)單子葉植物(即玉米、大麥和燕麥)有效，而且利用該方法嘗試轉(zhuǎn)化以后，轉(zhuǎn)化的雙子葉植物植物沒有成功再生。此外，一般通過微粒轟擊(即一般不通過根癌土壤桿菌介導(dǎo))，如上述文獻(xiàn)所述，利用芽尖分生培養(yǎng)物實(shí)現(xiàn)單子葉植物的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從植物組織(例如在人工培養(yǎng)基上的芽尖或腋芽)誘導(dǎo)多芽結(jié)構(gòu)的方法，產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物。然后用根癌土壤桿菌、DNA包被的微粒高速轟擊或已知的其它轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化這些多芽培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)化以后，多芽培養(yǎng)物可能轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基，以區(qū)分轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨后轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基和/或生根培養(yǎng)基中，從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物。本發(fā)明可能應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物，包括糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、蕓苔屬(Brassica)、煙草、番茄和胡椒。本發(fā)明提供相比現(xiàn)有方法的某些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠淇捎糜谵D(zhuǎn)化通常難以高效轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明也用于轉(zhuǎn)化植物、特別是雙子葉植物的質(zhì)體(plastid)基因組。
本發(fā)明提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的雙子葉植物的方法，包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)難以轉(zhuǎn)化的雙子葉植物的組織，以從該組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物；(b)將核酸引入多芽培養(yǎng)物的細(xì)胞中，從而產(chǎn)生包含該核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。組織優(yōu)選分生組織，優(yōu)選從芽尖、腋芽或花分生組織切離，或者該組織是愈傷組織。優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物是葫蘆(Cucurbitaceae)科或藜科(Chenopodiacea)的一員。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物選自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、甜瓜、西瓜和南瓜。該植物優(yōu)選糖用甜菜、南瓜、甜瓜或西瓜。另一優(yōu)選方案中，該組織切離自植物幼苗的芽尖。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選細(xì)胞分裂素。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長調(diào)節(jié)劑選自6-糠基氨基嘌呤(激動素)、6-芐基-氨基嘌呤(6-BAP)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羥基-3-甲基丁-2-烯基)(trans-6-(4-hydroxzy-3-methlbut-2-enyl))氨基尿(玉米素)、TDZ、赤霉酸(GA)、IAA、NAA、dicamba、2，3，5-T和2，4-D。培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的濃度優(yōu)選介于大約0.01mg/L至大約25mg/L，更優(yōu)選介于大約0.01mg/L至大約10mg/L，更優(yōu)選介于大約0.01mg/L至大約5mg/L，更優(yōu)選介于大約0.05mg/L至大約8mg/L。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過微粒轟擊、電泳或電穿孔，或者利用屬于土壤桿菌屬的細(xì)菌，將核酸引入細(xì)胞。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸包含與雙子葉植物異源的核酸。該核酸優(yōu)選包含編碼具有PPO活性的多肽的基因、編碼具有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)活性的多肽的基因、編碼具有木糖異構(gòu)酶(xylA)活性的多肽的基因、或者編碼具有GUS活性的多肽的基因。核酸優(yōu)選為包含核酸的載體，核酸包含與該植物異源的基因。
另一優(yōu)選方案中，該方法的步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽然后生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選地，將該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
另一優(yōu)選方案中，該方法的步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；克隆該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；以及使該克隆的芽成熟為轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選地，將克隆芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該克隆芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明另外提供通過上述任一方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
通過上述任一方法產(chǎn)生的多芽培養(yǎng)物。
通過上述任一方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化植物是表達(dá)具有PMI活性的多肽的南瓜植物、甜瓜植物或者西瓜植物。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化植物是表達(dá)具有PPO活性的多肽的糖用甜菜。
本發(fā)明另外提供上述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子(其中該種子包含轉(zhuǎn)化到多芽培養(yǎng)物的核酸)以及由該種子長成的植物。
本發(fā)明另外提供產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的植物的方法，包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，從該組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物；(b)將核酸引入多芽培養(yǎng)物細(xì)胞的質(zhì)體基因組中，從而產(chǎn)生包含該核酸的所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組；以及(c)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選實(shí)施方案中，該組織是分生組織，優(yōu)選從芽尖、腋芽、花分生組織或葉子組織切離，或者該組織是愈傷組織。優(yōu)選實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組同質(zhì)。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物與轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組同質(zhì)。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物是雙子葉植物。優(yōu)選地，該植物是葫蘆科或藜科的一員。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物選自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、煙草、番茄、南瓜、蕓苔屬和胡椒。優(yōu)選地，該植物是糖用甜菜、煙草和番茄。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該組織切離或者來源于植物幼苗的芽尖。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基包含至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選細(xì)胞分裂素。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該生長調(diào)節(jié)劑選自6-糠基氨基嘌呤(激動素)、6-芐基-氨基嘌呤(6-BAP)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羥基-3-甲基丁-2-烯基)氨基尿(玉米素)、TDZ、赤霉酸(GA)、IAA、NAA、dicamba、2，3，5-T和2，4-D。優(yōu)選地，培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的濃度介于大約0.01mg/L至大約25mg/L，更優(yōu)選介于大約0.01mg/L至大約10mg/L，更優(yōu)選介于大約0.01mg/L至大約5mg/L，更優(yōu)選介于大約0.05mg/L至大約8mg/L。優(yōu)選通過微粒轟擊、電泳或電穿孔將核酸引入細(xì)胞。優(yōu)選地，該核酸包含與雙子葉植物異源的核酸。優(yōu)選地，該核酸為包含核酸的載體，該核酸包含與該雙子葉植物異源的基因。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；然后至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽然后生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選實(shí)施方案中，將該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；克隆該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；以及使克隆的芽成熟為轉(zhuǎn)化植物。優(yōu)選地，將該克隆芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該克隆芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明另外提供通過上述任一方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組。
通過上述任一方法產(chǎn)生的包含轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的質(zhì)體。
通過上述任一方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。優(yōu)選地，該植物細(xì)胞與轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組同質(zhì)。
通過上述任一方法產(chǎn)生的多芽培養(yǎng)物。
通過上述任一方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選地，該植物與轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組同質(zhì)。
本發(fā)明另外提供上述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子(其中該種子包含轉(zhuǎn)化到多芽培養(yǎng)物的核酸)以及由種子長成的植物。
下述說明書詳細(xì)說明了本發(fā)明上述及其它方面。
現(xiàn)在，下文將參考所附說明書，更充分地描述本發(fā)明，其中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，本發(fā)明可能包含于不同形式，并不應(yīng)理解為限于此處所述實(shí)施方案。更確切而言，提供這些實(shí)施方案，以使本公開全面而完整，并將本發(fā)明范圍完全傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。此處發(fā)明說明書中所用術(shù)語只用于描述特定實(shí)施方案目的，并非意在限制本發(fā)明。用于發(fā)明說明書和所附權(quán)利要求時(shí)，除非上下文另外清楚指明，單數(shù)形式″一個(gè)″(″a″、″an″)以及″這個(gè)″(″the″)也用于包括復(fù)數(shù)形式。
除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，其含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員通常所理解的相同。所有出版物、專利申請、專利及此處提及的其它參考文獻(xiàn)，均全文引入以供參考。
除非另外指明，可能使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生本發(fā)明克隆的基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植物。除非另外指明，可能使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生本發(fā)明克隆的基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如參見J.Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual Second Edition(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)，以及F.M.Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology(GreenPublishing Associates，Inc.and Wiley-lnterscience，NewYork，1991)；J.Draper等人，eds.，Plant GeneticTransformation And Gene ExpressionA Laboratory Manual，(Blackwell Scientific Publications，1988)；以及S.B.Gelvin& R.A.Schilperoort，eds.，Introduction，Expression，AndAnalysis Of Gene Production In Plants。本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。首先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，從該組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物。然后將核酸引入多芽培養(yǎng)物的細(xì)胞中，從而產(chǎn)生包含該核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。最后從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞通常難以轉(zhuǎn)化。特別優(yōu)選實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞，最優(yōu)選如此處定義難以轉(zhuǎn)化的雙子葉植物細(xì)胞。此處所用″植物細(xì)胞″或″植物″包括整個(gè)植物、植物細(xì)胞、或植物組織中的植物亞細(xì)胞細(xì)胞器(即質(zhì)體)，或者培養(yǎng)中的植物組織、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞懸液、植物亞細(xì)胞細(xì)胞器和原生質(zhì)體。植物組織包括分化和未分化的植物組織，包括而不限于根、芽、葉、花粉、種子、瘤組織、配子體、孢子體、小孢子以及各種形式的培養(yǎng)細(xì)胞，例如單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織。植物組織可能位于植物、或器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物。
雙子葉植物一般是具有雙子葉胚、葉子有網(wǎng)狀葉脈、莖中維管束環(huán)形圍繞中央木髓的開花植物。如上所述，本發(fā)明可能轉(zhuǎn)化的雙子葉植物優(yōu)選那些難以轉(zhuǎn)化的雙子葉植物。難以轉(zhuǎn)化的植物，通常其細(xì)胞不能利用當(dāng)前已知的轉(zhuǎn)化方法(即微粒轟擊或生物彈轉(zhuǎn)化、土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、電穿孔、電泳等)轉(zhuǎn)化，或者利用這些方法的轉(zhuǎn)化效率低(即低于1.0％、或低于0.5％、或甚至低于0.1％)。其細(xì)胞、組織、原生質(zhì)體或愈傷組織可能通過已知方法轉(zhuǎn)化，但是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織、原生質(zhì)體或愈傷組織不能再生為成熟的轉(zhuǎn)基因植物，這些植物也是難以轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，該雙子葉植物是葫蘆科的一員。本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該雙子葉植物是藜科的一員。更優(yōu)選實(shí)施方案中，該雙子葉植物選自甜菜(即糖用甜菜、飼料甜菜、食用甜菜和唐萵苣)、向日葵、大豆、棉花、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、煙草、番茄、蕓苔屬和胡椒。最優(yōu)選實(shí)施方案中，該雙子葉植物是糖用甜菜或南瓜。
本發(fā)明通過首先從植物組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物，而轉(zhuǎn)化植物。此處所用術(shù)語″多芽培養(yǎng)物″可能也互指″外植體″。本發(fā)明可能利用的組織包括而不限于分生組織、根尖組織、芽尖組織(包括葉原基、頂區(qū)、腋區(qū)、下胚軸和有子葉的葉子)、幼苗芽尖(可能包括分生組織、葉片、葉柄或葉片-葉柄過渡區(qū)組織)以及愈傷組織。優(yōu)選實(shí)施方案中，從芽尖、腋芽或花分生組織切離的分生組織，產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物的組織。
本發(fā)明實(shí)施方案中，首先在種子發(fā)芽培養(yǎng)基中，優(yōu)選無菌培養(yǎng)條件下萌芽種子，可能獲得多芽培養(yǎng)物。種子發(fā)芽技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，種子發(fā)芽培養(yǎng)基(GM)包含Murashige和Skoog(MS)鹽(商品供應(yīng)自Sigma Chemicals，St.Louis，Mo)。GM可能另外包括碳水化合物源，例如優(yōu)選蔗糖。碳水化合物存在的量可能為約20-40g/L(約2-4％w/v)，優(yōu)選約30g/L(約3％w/v)。GM任選并優(yōu)選包括維生素B5、肌醇(100mg)、泛酸和植物組織培養(yǎng)膠凝劑，例如PHYTAGELTM(也得自SigmaChemical)。具有細(xì)胞分裂素樣功能的植物生長調(diào)節(jié)劑(如下所述)，也可能(并優(yōu)選)加入種子發(fā)芽培養(yǎng)基中。具有細(xì)胞分裂素樣功能的合適植物生長調(diào)節(jié)劑，包括而不限于6-芐基-氨基嘌呤(6-BAP或BA)、6-糠基氨基嘌呤(激動素)、6-二甲丙烯基氨基-嘌呤(2ip)、反-6-(4-羥基-3-甲基丁-2-烯基)氨基尿(玉米素)等。加入GM中的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度可能低到約0.5mg/L、或約0.1mg/L、或約0.05mg/L、乃至更低；另外，加入的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度可能高達(dá)約1.0mg/L、或約2.0mg/L、或約5mg/L、乃至更高。加入酪蛋白水解產(chǎn)物、脯氨酸和/或谷氨酰胺也可能有益。某些雙子葉作物，例如糖用甜菜，GM中加入植物生長素抑制劑，例如2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)，可能有益。
種子在GM中約7-14天發(fā)芽(即變成幼苗)后，切下幼苗的芽尖，培養(yǎng)(即鋪板)于此處所述芽增殖培養(yǎng)基(SMM)。優(yōu)選地，芽尖包含頂生和腋生分生組織區(qū)、葉原基、下胚軸的3-4mm以及子葉，其可能修剪，以減少進(jìn)一步延長。用于本發(fā)明產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物的其它植物組織當(dāng)然也可能鋪板于SMM。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，SMM包含MS鹽、碳水化合物源(優(yōu)選蔗糖)、維生素B5以及膠凝劑，例如PHYTAGELTM。此外，SMM包含至少一種細(xì)胞分裂素樣生長調(diào)節(jié)劑，例如BA、激動素、2ip、玉米素等。BA是在包含蔗糖的培養(yǎng)基中，從糖用甜菜或其它雙子葉品種的頂生或腋生分生組織誘導(dǎo)芽分生組織培養(yǎng)物的優(yōu)選生長調(diào)節(jié)劑。存在于SMM中的細(xì)胞分裂素樣生長調(diào)節(jié)劑濃度可能低到約2.0mg/L、或約1.0mg/L、或約0.05mg/L、或約0.01mg/L、乃至更低；另外，存在于SMM中的細(xì)胞分裂素樣生長調(diào)節(jié)劑濃度可能高達(dá)約5mg/L、或約8mg/L、或10mg/L、或約25或約100mg/L、乃至更高；一個(gè)實(shí)施方案中，存在于SMM中的細(xì)胞分裂素樣生長調(diào)節(jié)劑介于大約0.05mg/L至大約25mg/L，更優(yōu)選從0.1mg/L至大約10mg/L，最優(yōu)選從大約0.5至大約8mg/L。SMM中可能加入另外的生長調(diào)節(jié)劑，以誘導(dǎo)芽分生組織培養(yǎng)物。這種生長調(diào)節(jié)劑包括赤霉酸(GA)以及具有植物生長素樣功能的生長調(diào)節(jié)劑，例如吲哚-3-乙酸(IAA)、α-萘乙酸(NAA)、賽苯隆(thidiazuron)(TDZ)、3，6-二氯-氧-對甲氧基苯甲酸(DICAMBA)、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4，5-T)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它生長調(diào)節(jié)劑。
在SMM中生長的多芽培養(yǎng)物，于溫度15-35℃、亮或暗的條件下培養(yǎng)，優(yōu)選于約20℃、日長約12-16小時(shí)、低照度(大約10至約30μEinsteins)條件下培養(yǎng)。大約4-6周以后。多芽培養(yǎng)物類似緊密的花結(jié)，就可以轉(zhuǎn)化了。
可能利用許多已知轉(zhuǎn)化方法中任何一種轉(zhuǎn)化多芽培養(yǎng)物。此處所用術(shù)語″轉(zhuǎn)化″是指將核酸片段(一般為異源核酸序列或基因)穩(wěn)定引入預(yù)先不包含該基因的植物、植物組織、植物細(xì)胞器(即質(zhì)體或葉綠體)、或植物細(xì)胞。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化導(dǎo)致該核酸序列穩(wěn)定整合到植物基因組中。此處所用術(shù)語″基因組″包含細(xì)胞核基因組、質(zhì)體基因組以及線粒體基因組。本發(fā)明的發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，多芽培養(yǎng)物的細(xì)胞中存在大量質(zhì)體。這種培養(yǎng)物因而提供了供質(zhì)體轉(zhuǎn)化的重要靶組織。因此，另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組。優(yōu)選地，利用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化雙子葉植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，利用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化通常難以轉(zhuǎn)化的雙子葉植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組。
質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點(diǎn)在于，質(zhì)體一般能夠表達(dá)沒有很多修飾的細(xì)菌基因，并能夠在單個(gè)啟動子控制之下表達(dá)多個(gè)開放閱讀框架。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)描述于美國專利NO.5,451,513；5,545,817和5,545,818；PCT申請NO.WO95/16783及McBride等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305(1994)。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)涉及利用生物彈或其它原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法(例如氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法)，將側(cè)翼接有選擇標(biāo)志連同目的基因的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)域引入合適的靶組織。命名為打靶序列的1-1.5kb側(cè)翼區(qū)，促進(jìn)與質(zhì)體基因組的同源重組，從而產(chǎn)生該質(zhì)體組(plastome)的特定區(qū)域的置換或者修飾。最初，帶來壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的葉綠體16S rRNA和rps12基因的點(diǎn)突變，用作轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志。參見Z.Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530(1990)以及J.M.Staub等人，Plant Cell 4，39-45(1992)。這些標(biāo)志之間存在克隆位點(diǎn)，能形成供引入外源基因的質(zhì)體打靶載體。參見J.M.Staub等人，EMBO J.12，601-606(1993)。將隱性rRNA或r-蛋白質(zhì)抗生素抗性基因置換為顯性選擇標(biāo)志，編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌aadA基因，獲得轉(zhuǎn)化頻率的大幅度提高。參見Z.Svabet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917(1993)。這些標(biāo)志先前已經(jīng)成功用于高頻率轉(zhuǎn)化綠藻萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質(zhì)體基因組。M.Goldschmidt-Clermont，Nucl.Acids Res.19，4083-4089(1991)。用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其它選擇標(biāo)志為本領(lǐng)域已知。質(zhì)體表達(dá)通過同源重組，將基因插入每個(gè)植物細(xì)胞的數(shù)千個(gè)拷貝的環(huán)狀質(zhì)體基因組，利用優(yōu)于核表達(dá)基因的龐大拷貝數(shù)，使得表達(dá)水平能夠輕易超過可溶性植物蛋白質(zhì)總數(shù)的10％。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，目的核苷酸序列插入質(zhì)體打靶載體，轉(zhuǎn)化目的植物宿主的質(zhì)體基因組中。優(yōu)選獲得包含目的核苷酸序列質(zhì)體基因組的同質(zhì)植物，并優(yōu)選該核苷酸序列能夠高表達(dá)。
此處所用術(shù)語″異源″是指具有相對于其當(dāng)前宿主不同的天然來源(即來自不同物種，或者相同物種而不同的染色體定位、方向或拷貝數(shù))核酸序列(例如基因)或蛋白質(zhì)。″異源″也用于表明，蛋白質(zhì)中存在的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，相對于存在的其它結(jié)構(gòu)域而言，其天然來源不同。此處所用術(shù)語″核酸″是指以共價(jià)鍵相連的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸一般將包含磷酸二酯鍵，盡管有些情況下，包括可能具有其它主鏈的核酸類似物。此外，可能使用天然存在的核酸和類似物以及非天然存在的核酸和類似物的混合物。核酸可能是單鏈或雙鏈，或者包含雙鏈或單鏈序列兩種成分。核酸可能是DNA(基因組和cDNA)、RNA或雜合體，其中核酸包含脫氧核糖和核糖核苷酸的任何組合，以及堿基的任何組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。
用于給定植物品種或特定類型植物組織的轉(zhuǎn)化方法取決于熟練技術(shù)人員根據(jù)已知方法確定的最適當(dāng)?shù)姆椒?。如果開發(fā)出供外源基因穩(wěn)定插入植物細(xì)胞和操作改變的細(xì)胞的新方法，熟練技術(shù)人員將能從已知的方法中選擇，以獲得所要求的結(jié)果。已知的用于實(shí)踐本發(fā)明的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括而不限于微粒轟擊(Sanford等人的美國專利NO.4,945,050，McCabe等人，Bio/Technology 6，923-926)；直接DNA攝取(J.Paszkowski等人，EMBO J.3，2717(1984))；電穿孔(M.Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985)；顯微注射(A.Crossway等人，Mol.Gen.Genet.202，179(1986))；以及土壤桿菌介導(dǎo)的植物組織基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中，優(yōu)選微粒轟擊以及土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，最優(yōu)選土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移利用細(xì)菌根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根病土壤桿菌(A.rhizogenes)轉(zhuǎn)移DNA進(jìn)入植物染色體的天然能力。土壤桿菌是一種植物病原體，轉(zhuǎn)移分別在根癌土壤桿菌和發(fā)根病土壤桿菌的Ti和RI質(zhì)粒稱為T-DNA的區(qū)域編碼的一組基因進(jìn)入植物細(xì)胞。利用發(fā)根病土壤桿菌的轉(zhuǎn)化與根癌土壤桿菌相似。參見Ryals等人，美國專利NO.5,777,200，其公開內(nèi)容在此全文引入以供參考。Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的典型結(jié)果是稱作根癌的徒長(tumorous growth)，其中T-DNA穩(wěn)定整合到宿主染色體中。Ri質(zhì)粒整合到宿主染色體DNA中，產(chǎn)生稱為″毛根病″的形態(tài)。通過T-DNA中基因缺失可以消除使宿主植物致病的能力，而不損失其DNA轉(zhuǎn)移和整合作用。為轉(zhuǎn)化目的而轉(zhuǎn)移給植物細(xì)胞的核酸(即異源基因)連接至確定所整合的T-DNA末端的邊界序列。本發(fā)明可能使用供植物轉(zhuǎn)化的任何合適的土壤桿菌載體或載體系統(tǒng)。本領(lǐng)域已知多種土壤桿菌株，可能用于本發(fā)明方法。典型的土壤桿菌載體系統(tǒng)描述于G.An等人EMBO J.4，277(1985)；L.Herrera-Estrella等人，Nature 303，209(1983)；L.Herrera-Estrella等人，EMBO J.2，987(1983)；L.HerreraEstrella等人Plant Genetic Engineering(CambridgeUniversity Press，New York，63頁(1985)；Hooykaas，PlantMol.Biol.13，327(1989)；Smith等人，Crop Science 35，301(1995)；Chilton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3119(1993)；Mollony等人，Monograph Theor.Appl.Genet.NY19，148(1993)；Ishida等人，Nature Biotechnol.14，745(1996)；以及Komari等人，The Plant Journal 10，165(1996)，其公開內(nèi)容在此全文引入以供參考。
除土壤桿菌T區(qū)之外，Ti(或Ri)質(zhì)粒包含vir區(qū)。vir區(qū)對于有效轉(zhuǎn)化是重要的，并似乎具有物種特異性。已經(jīng)發(fā)展了雙載體系統(tǒng)(binary vector system)，其中操作的攜帶例如異源DNA的空(disarmed)T-DNA以及vir功能存在于分別的質(zhì)粒上。換言之，缺少vir區(qū)的雙載體能夠攜帶目的異源核酸序列(即基因或多個(gè)基因)和側(cè)翼T-DNA。然后由空的Ti質(zhì)?；虻诙€(gè)雙質(zhì)粒提供vir區(qū)。照此，在大腸桿菌中復(fù)制的小質(zhì)粒上構(gòu)建包含異源DNA的改變的T-DNA區(qū)。此質(zhì)粒通過三親雜交(tri-parental mating)或電穿孔接合轉(zhuǎn)移到包含具有致病性基因序列的相容質(zhì)粒的根癌土壤桿菌中。反式提供vir功能，轉(zhuǎn)移T-DNA到植物基因組中。作為另一可選方案，通過兩次重組事件，用新的T-DNA替換原來的Ti質(zhì)粒T-DNA，異源核酸序列和T-DNA邊界序列可以插入Ti質(zhì)粒的T-DNA位點(diǎn)?？梢杂蒚i質(zhì)?；螂p質(zhì)粒提供vir區(qū)。作為另外的可選方案，如Schilperoort等人，美國專利NO.4,940,838所述，異源核酸序列和側(cè)翼T-DNA可以整合到細(xì)菌染色體中，然后可由Ti質(zhì)?；螂p質(zhì)粒提供vir區(qū)。此處所述雙載體可能用于實(shí)踐本發(fā)明，并為優(yōu)選。
另外，本發(fā)明其它實(shí)施方案中，土壤桿菌方法使用超級雙(suyper-binary)土壤桿菌載體或″超毒力″(supervirulent)土壤桿菌載體。例如參見美國專利NO.5,591,615和EP0 604 662，此處引入以供參考。已經(jīng)構(gòu)建了這種超級雙載體，其包含來源于Ti質(zhì)粒pTiBo542(Jin等人，J.Bacteriol.169，4417(1987))超毒力區(qū)的DNA區(qū)，該Ti質(zhì)粒包含于具有極高轉(zhuǎn)化效率的超毒力根癌土壤桿菌A281(Hood等人，Biotechnol.2，702(1984)；Hood等人，J.Bacteriol.168，1283(1986)；Komari等人，J.Bacteriol.166，88(1986)；Jin等人，J.Bacteriol.169，4417(1987)；Komari，Plant Science 60，223(1987)；ATCC登錄號37394。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的代表性超級雙載體包括pTOK162(參見日本專利申請(Kokai)NO.4-222527、歐洲專利申請EP504,869和EP604,662以及美國專利NO.5,591,616，在此引入以供參考)和pTOK233(參見Komari，Plant Cell Reports 9，303(1990)以及Ishida等人，Nature Biotechnology 14，745(1996)；在此引入以供參考)?？赡芾靡陨衔墨I(xiàn)所述方法構(gòu)建其它的超級雙載體。超級雙載體pTOK162在大腸桿菌(E.coli)和根癌土壤桿菌中均能復(fù)制。另外，載體包含pTiBo542毒力區(qū)的virB、virC和virG基因。質(zhì)粒也包含抗生素抗性基因、選擇標(biāo)志基因以及如有需要，要轉(zhuǎn)化入植物的目的核酸?？梢詷?gòu)建具有pTOK162上述特性的本發(fā)明超級雙載體。本發(fā)明所用超級雙載體及其它載體的T區(qū)可能構(gòu)建為具有供插入例如要轉(zhuǎn)移給植物的異源基因的限制性位點(diǎn)。另外，轉(zhuǎn)化的異源核酸可以利用體內(nèi)同源重組而插入載體的T-DNA區(qū)。參見Herrera-Esterella等人，EMBO J.2，987(1983)；Horch等人，Science 223，496(1984)。這種同源重組有賴于超級雙載體具有與pBR322或其它類似質(zhì)粒同源的區(qū)域。因而，兩個(gè)質(zhì)粒放在一起時(shí)，目的基因通過同源區(qū)域基因重組插入超級雙載體。
優(yōu)選地，通過重組核酸技術(shù)改變用于本發(fā)明方法的土壤桿菌載體和載體系統(tǒng)，以包含在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的異源核酸(例如目的基因或多個(gè)目的基因)?！灞磉_(dá)″是指異源結(jié)構(gòu)性核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)。例如就反義構(gòu)建體而言，表達(dá)也可能只涉及轉(zhuǎn)錄。表達(dá)的異源核酸優(yōu)選插入T區(qū)，并側(cè)翼接有土壤桿菌載體的T-DNA邊界序列。
除編碼序列以外，本發(fā)明的載體也可能任意包含為異源核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯所用或所必需的調(diào)節(jié)序列。這種調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括而不限于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(包括啟動子)、增強(qiáng)子、信號序列、多腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5’和3’非翻譯區(qū)(即5’前導(dǎo)序列)、終止子序列及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可能用來產(chǎn)生本發(fā)明所用改變的載體的一般分子生物學(xué)技術(shù)。
轉(zhuǎn)化后要表達(dá)的核酸優(yōu)選置于合適啟動子序列控制之下。術(shù)語″啟動子″是指位于結(jié)構(gòu)基因或編碼序列的5’端，指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的核苷酸序列。此處所用術(shù)語″有效連接″是指通過將啟動子與DNA編碼區(qū)相連，從而由啟動子控制和調(diào)節(jié)DNA編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄。啟動子與編碼序列有效相連的方法為本領(lǐng)域熟知。
對于植物中表達(dá)，必須針對宿主細(xì)胞選擇合適的啟動子，本領(lǐng)域技術(shù)人員善于選擇啟動子。用于實(shí)踐本發(fā)明的啟動子包括而不限于組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)間調(diào)節(jié)型、發(fā)育調(diào)節(jié)型、化學(xué)調(diào)節(jié)型、組織優(yōu)選型以及組織特異性啟動子。
已知或發(fā)現(xiàn)許多啟動子促進(jìn)植物細(xì)胞中RNA的轉(zhuǎn)錄，可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。合適啟動子的實(shí)例包括胭脂堿合酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動子、來自核酮糖二磷酸羧化酶啟動子小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子、CaMV 35S和19S啟動子、玄參(Figwort)花葉病毒的全長轉(zhuǎn)錄物啟動子、組蛋白啟動子、微管蛋白啟動子或甘露堿合酶啟動子(MAS)。啟動子也可能是引起特定組織中的優(yōu)先表達(dá)的啟動子，例如葉、莖、根、或分生組織，或者啟動子可能是由例如光、熱應(yīng)激、水應(yīng)激、或者施用或植物產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的。典型的綠色組織特異性啟動子包括玉蜀黍磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)啟動子、小亞基核酮糖二羧化酶啟動子(ssRUBISCO)以及葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子。
其它用于本發(fā)明的啟動子包括而不限于幾種肌動蛋白基因之一(例如稻肌動蛋白)，其已知在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)。用于實(shí)踐本發(fā)明的另一組成型啟動子，起源于已知在許多細(xì)胞類型中蓄積的另一基因產(chǎn)物--泛素。已經(jīng)從若干物種中克隆了泛素啟動子，用于轉(zhuǎn)基因植物(例如，向日葵(Binet等人，Plant Science 7987-94(1991))；以及玉蜀黍(Christensen等人，Plant Molec.Biol.12，619-632(1989))。其它有用的啟動子有玉蜀黍U2和U5 snRNA啟動子(Brown等人，Nucleic Acids Res.17，8991(1989))以及醇脫氫酶啟動子(Dennis等人，Nucleic Acids Res.12，3983(1984))。用于本發(fā)明的植物的組織特異性或組織優(yōu)先性啟動子是可指導(dǎo)根、髓、葉或花粉中的表達(dá)的啟動子。這種啟動子公開于美國專利NO.5,625,136(在此全文引入以供參考)。也可用賦予種子特異性表達(dá)的啟動子，例如Schernthaner等人，EMBO J.71249(1988)所公開的啟動子；花藥特異性啟動子ant32和ant43D；花藥(氈絨層)特異性啟動子B6(Huffman等人，J.Cell.Biochem.17B，摘要#D209(1993))；以及雌蕊特異性啟動子，例如改變的S13啟動子(Dzelkalns等人，Plant Cell5，855，(1993))。
可能獲得其它的植物啟動子，優(yōu)選來自植物或植物病毒，只要所選啟動子能夠引起植物中足夠的表達(dá)而產(chǎn)生有效量的目的蛋白質(zhì)，就可能使用。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動子是稻肌動蛋白-1啟動子。
任何想要在植物中表達(dá)的異源基因或核酸適于本發(fā)明轉(zhuǎn)化，并可用于本發(fā)明方法。
在本發(fā)明的植物中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的異源基因，包括而不限于編碼抗病性的基因、編碼抗蟲性的基因、賦予營養(yǎng)價(jià)值的基因、賦予抗真菌、抗細(xì)菌或抗病毒活性的基因、賦予除草劑抗性的基因、賦予改善植物或營養(yǎng)特性的基因等。另外，可以在利用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中表達(dá)治療性(例如供獸醫(yī)或醫(yī)藥用途)或者免疫原性(例如供接種使用)的肽和蛋白質(zhì)。
優(yōu)選表達(dá)結(jié)構(gòu)基因。此處所用″結(jié)構(gòu)基因″是包含編碼蛋白質(zhì)、多肽或其一部分的DNA片段、不包括驅(qū)動轉(zhuǎn)錄起始的5’序列的基因部分。結(jié)構(gòu)基因可能是在該細(xì)胞中通常存在的基因，或者在引入該基因的細(xì)胞位置通常不存在的基因(即異源基因)。異源基因可能完全或部分得自本領(lǐng)域已知的任何來源，包括細(xì)菌基因組或附加體、真核生物、細(xì)胞核、或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可能在編碼區(qū)或非翻譯區(qū)包含一種或多種改變，可以影響表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)速率或者表達(dá)控制方式。上述改變包括而不限于突變、插入、缺失和置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸。結(jié)構(gòu)基因可能構(gòu)成連續(xù)的編碼序列，或者可能包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，以合適的拼接接點(diǎn)為界。結(jié)構(gòu)基因可能是來自天然存在、或合成、或兩者的多個(gè)來源的片段的復(fù)合物。為提高宿主細(xì)胞中表達(dá)而合成基因時(shí)，希望設(shè)計(jì)該基因，以使其密碼子使用頻率接近宿主細(xì)胞優(yōu)選密碼子使用頻率。
同樣，本發(fā)明方法可能用來轉(zhuǎn)移供控制植物基因表達(dá)的任何核酸。例如，轉(zhuǎn)移的核酸可以編碼反義寡核苷酸。另外，可以用一種或多種基因轉(zhuǎn)化本發(fā)明的植物，以復(fù)制供化學(xué)合成或其它工業(yè)過程的酶學(xué)途徑。用于本發(fā)明的異源核酸可能是天然存在，并可能得自原核生物或真核生物(例如細(xì)菌、真菌、酵母、病毒、植物、昆蟲和哺乳動物)，或者核酸可能是完全或部分合成。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化到雙子葉多芽培養(yǎng)物的異源核酸或基因編碼具有原卟啉原氧化酶(PPO)活性的多肽。參見例如美國專利NO.5,767,373；5,939,602；6,023,012；和6,084,155，其公開內(nèi)容在此全文引入以供參考。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化到雙子葉多芽培養(yǎng)物的核酸或基因編碼具有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)活性的多肽。參見例如美國專利NO.5,767,378和5,994,629，在此全文引入以供參考)。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化到雙子葉多芽培養(yǎng)物的核酸或基因編碼具有木糖異構(gòu)酶(xyIA)活性的多肽。再一優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化到雙子葉多芽培養(yǎng)物的核酸或基因編碼具有GUS活性的多肽。
異源核酸通過上述任何方法有效轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞、質(zhì)體和/或植物以后，一般通過一種或多種篩選方法鑒定具有異源基因成功表達(dá)或提高的表達(dá)的細(xì)胞和植物，以進(jìn)一步培養(yǎng)并再生植物。
″篩選″一般是指鑒定具有已經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的異源基因表達(dá)的細(xì)胞和/或植物。通常進(jìn)行篩選，來選擇轉(zhuǎn)化成功的種子(即轉(zhuǎn)基因種子)，以進(jìn)一步載培及植物增殖(即生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物)。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化子的能力，選擇或篩選標(biāo)志基因通常與目的異源基因一起轉(zhuǎn)化植物。在這種情況下，人們于是常常通過將細(xì)胞、種子、植物或幼苗暴露于一種或多種選擇試劑，從而分析可能的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。例如，可能在選擇條件下篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、種子或植物，例如種子或幼苗在包含選擇性試劑(例如甘露糖或抗生素(例如潮霉素、卡那霉素或巴龍菌素)的培養(yǎng)基中生長，成功轉(zhuǎn)化的植物已經(jīng)轉(zhuǎn)化了編碼對上述選擇性試劑抗性的基因。另外，使用其它方法(例如將轉(zhuǎn)化了除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)化的植物暴露于除草劑，例如上述PPO抑制劑或BASTA)篩選細(xì)胞、種子、植物或植物組織的目的標(biāo)志基因。另外使用陽性選擇方法，例如編碼具有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)活性的核酸。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的多個(gè)培養(yǎng)物在包含抗生素和/或甘露糖的植物生長培養(yǎng)基中生長，從而選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，人們可能希望利用選擇或篩選標(biāo)志基因，與表達(dá)的目的核酸序列同時(shí)或以外。″標(biāo)志基因″是給予表達(dá)該標(biāo)志基因的細(xì)胞不同表型的基因，從而使該轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)別于沒有該標(biāo)志的細(xì)胞。這種基因可能編碼選擇或篩選標(biāo)志，這取決于該標(biāo)志是否賦予可供化學(xué)方法，即利用選擇性試劑(例如除草劑、抗生素等)進(jìn)行‘選擇’的特性，或其只不過是可以通過觀察或檢驗(yàn)，即‘篩選’而鑒定的特性(例如R-座位特性)。合適標(biāo)志基因的許多實(shí)例為本領(lǐng)域所知，可以用于實(shí)踐本發(fā)明。選擇性標(biāo)志基因可能是轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的唯一異源基因，或者可能于轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)化并表達(dá)的另一異源基因之外表達(dá)。選擇性標(biāo)志基因用于鑒定和選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。選擇性標(biāo)志基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)，以及賦予除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼改變的對除草劑不敏感的靶蛋白質(zhì)、或者編碼在除草劑作用之前使其在植物中降解或解毒的酶，參見DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987)；DeBlock等人，PlantPhysiol.91，691(1989)；Fromm等人，BioTechnology 8，833(1990)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，603(1990)。例如，利用編碼突變靶酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)、已經(jīng)獲得甘膦(glyphosphate)或磺酰脲類除草劑抗性。利用編碼解毒相應(yīng)除草劑的膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細(xì)菌基因，已經(jīng)獲得草胺磷、溴苯腈(bromoxynil)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)抗性。選擇性標(biāo)志基因包括而不限于下列酶的編碼基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(Fraley等人，CRC Critical Reviews in Plant Science 4，1(1986))；氨氰水合酶(Maier-Greiner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氫吡啶二羧酸合酶(Pert等人，BioTechnology 11，715(1993))；bar基因(Toki等人，PlantPhysiol.100，1503(1992)；Meagher等人，Crop Sci.36，1367(1996))；色氨酸脫羧酶(Goddijn等人，Phant Mol.Biol 22，907(1993))；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NEO；Southern等人，J.Mol.Appl.Gen.1，327(1982))；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT或HYG；Shimizu等人，Mol.Cell.Biol.6，1074(1986))；二氫葉酸還原酶(DHFR)；膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987))；2，2-二氯丙酸脫鹵素酶(Buchanan-Wollatron等人，J.Cell.Biochem.13D，330(1989))；乙酰羥酸合酶(Anderson等人，美國專利NO.4,761,373；Haughn等人，Mol.Gen.Genet.221，266(1988))；5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA；Comai等人，Nature 317，741(1985))；鹵代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker等人，WO87/04181)；乙酰輔酶A羧化酶(Parker等人，Plant Physiol.92，1220(1990))；二氫蝶酸合酶(Sull；Guerineau等人，Plant Mol.Biol.15，127(1990))；以及32kDa光合體系II多肽(psbA；Hirschberg等人，Science 222，1346(1983))。
還包括編碼氯霉素(Herrera-Estrella等人，EMBO J.2，987(1983))；氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等人，Nature 303，209(1983)；Meijer等人，Plant Mol.Biol.16，807(1991))；潮霉素(Waldron等人，Plant Mol.Biol.5，103(1985)；Zhijian等人，Plant Science 108，219(1995)；Meijer等人，Plant Mol.Bio.16，807(1991))；鏈霉素(Jones等人，Mol.Gen.Genet.210，86(1987))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等人，Transgenic Res.5，131(1996))；博萊霉素(Hille等人，Plant Mol.Biol.7，171(1986))；磺胺(Guerineau等人，Plant Mot.Bio.15，127(1990)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等人，Science 242，419(1988))；2，4-D(Streber等人，BioiTechnology7，811(1989))；膦絲菌素(DeBlock等人，EMBO J.6，2513(1987))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5，131(1996))抗性的基因。
以上所列選擇性標(biāo)志基因并非意在限制。任何選擇性標(biāo)志基因可以用于本發(fā)明。
為了另外證實(shí)轉(zhuǎn)化植物的種子或者由該種子再生的植物中存在異源核酸或″轉(zhuǎn)基因″，可以進(jìn)行多種分析。這些分析包括，例如分子生物學(xué)分析，諸如Southern和Northern印跡以及PCR；生物化學(xué)分析，例如利用免疫學(xué)方法(ELISA和Western印跡)或酶的功能，檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在；以及利用植物成分分析，例如葉或根的分析。雖然Southern印跡和PCR可能用來檢測所述基因，但并不提供該基因是否正在表達(dá)的信息。通過特異性鑒定所引入基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或者評價(jià)其表達(dá)所致表型變化，可能評價(jià)異源基因的表達(dá)。分析特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和鑒定，可能利用蛋白質(zhì)的物理-化學(xué)、結(jié)構(gòu)、功能或其它性質(zhì)。獨(dú)特的物理-化學(xué)或結(jié)構(gòu)特性使能利用電泳方法(例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦)或者利用層析技術(shù)(例如離子交換或凝膠排阻層析)分離并鑒定蛋白質(zhì)。各個(gè)蛋白質(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使得有可能利用特異性抗體(例如ELISA分析)檢測其存在。可能使用特異性更高的方法組合，例如Western印跡，其中使用抗體定位已通過電泳技術(shù)分離的各個(gè)基因產(chǎn)物?？赡苁褂昧硗獾募夹g(shù)，例如純化后氨基酸測序，以完全證實(shí)目的產(chǎn)物的身份。盡管這些技術(shù)使用最為普遍，其它方法為本領(lǐng)域已知，并且可能另外使用。
本發(fā)明的一個(gè)特殊優(yōu)勢在于，利用多芽培養(yǎng)物或外植體而非單芽培養(yǎng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高了難以轉(zhuǎn)化的植物的轉(zhuǎn)化效率。效率是指目的異源核酸成功轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的百分比，與異源核酸轉(zhuǎn)化不成功的植物或植物細(xì)胞的百分比相比較。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化效率高于約1％，更優(yōu)選高于4％，更加優(yōu)選高于10％，最優(yōu)選高于30％。轉(zhuǎn)化效率定義為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的外植體數(shù)目與靶外植體數(shù)目的比值。
包含本發(fā)明的異源核酸(例如包含本發(fā)明的異源核酸或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞)的轉(zhuǎn)基因植物，以及該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代，也是本發(fā)明的一個(gè)方面。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)為有用的栽培品種的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。眾所周知供植物組織離體培養(yǎng)以及許多情況下再生為整個(gè)植株的技術(shù)。本發(fā)明另一方面為包含上述核酸的轉(zhuǎn)基因植物組織、植物或種子。優(yōu)選實(shí)施方案中，利用本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化外植體不是嵌合的，或者只有小部分轉(zhuǎn)化外植體是嵌合的。這優(yōu)選通過延長高細(xì)胞分裂素處理時(shí)間，或提高甘露糖選擇的嚴(yán)謹(jǐn)性，或這兩種方法而實(shí)現(xiàn)。(參見以下實(shí)施例5)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過選擇或篩選鑒定，并在此處提供的支持再生的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后可能使成長為植物。植物優(yōu)選在生長室或溫室中成熟。植物取決于初始組織，于轉(zhuǎn)化子鑒定約6周-10個(gè)月以后再生。再生期間，細(xì)胞可能在組織培養(yǎng)容器的固體培養(yǎng)基中生長。該容器的說明性實(shí)施方案為培養(yǎng)皿和Plant Cons。再生植物到達(dá)芽和根發(fā)育階段以后，可能轉(zhuǎn)移到溫室，進(jìn)一步生長和檢驗(yàn)。如上提供的再生植物的種子和后代植物是本發(fā)明的一個(gè)方面。因此，術(shù)語″種子″是指包含轉(zhuǎn)化植物的種子，以及轉(zhuǎn)化植物的后代產(chǎn)生的種子。本發(fā)明的植物不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，而且包括本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生的植物的后代。
一個(gè)實(shí)施方案中，首先轉(zhuǎn)化的多芽培養(yǎng)物在選擇性培養(yǎng)基中生長，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物成熟時(shí)去除所有未轉(zhuǎn)化組織，從而制備本發(fā)明再生的轉(zhuǎn)基因植物。選擇完成以后，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物產(chǎn)生的芽轉(zhuǎn)入優(yōu)選包含芽伸長培養(yǎng)基的容器中；這種培養(yǎng)基為本領(lǐng)域已知，并如下所述。如果愿意，在基于MS的克隆培養(yǎng)基中可能克隆轉(zhuǎn)化的芽(例如另外包含甘露糖的上述生長培養(yǎng)基)。另外，將芽或克隆轉(zhuǎn)入如下所述或可能由熟練技術(shù)人員確定的合適的生根培養(yǎng)基中，單個(gè)芽或克隆則可能成功生根。
利用上述標(biāo)準(zhǔn)方法，可能篩選利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化成功的植物。為了產(chǎn)生改進(jìn)的植物和種子系，可能不斷篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物的轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列的持續(xù)存在，這是本發(fā)明的另一方面。理想的轉(zhuǎn)基因核酸序列可能因而轉(zhuǎn)入(即基因滲入或近親交配)其它遺傳品系，例如某些原種或具有商業(yè)價(jià)值的品系或品種。將理想的核酸序列基因滲入植物遺傳品系的方法，可能通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行，包括傳統(tǒng)的繁殖、原生質(zhì)體融合、核移植以及染色體轉(zhuǎn)移。繁殖方法和技術(shù)為本領(lǐng)域已知，并闡述于例如J.R.Welsh，F(xiàn)undamentals of Plant Genetics and Breeding(John Wiley and Sons，New York，(1981))；Crop Breeding(D.R.Wood，ed.，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin，(1983))；O.Mayo，The Theory of Plant Breeding，Second Edition(Clarendon Press，Oxford，England(1987))；以及Wricke和Weber，Quantitative Genetics and SelectionPlant Breeding(Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986))。利用這些以及本領(lǐng)域其它技術(shù)，本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和近交品系可能用來生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的雜交植物和作物(例如雜交南瓜和糖用甜菜)，其雜交植物也是本發(fā)明的一個(gè)方面。
提供以下實(shí)施例以解釋本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)化南瓜種子消毒和發(fā)芽利用鑷子從干種子中仔細(xì)移開南瓜(西葫蘆、Cucurbita pepo.L.)的成熟胚。然后將其置于50ml一次性離心管，15％Clorox溶液(V/V)表面消毒15min。消毒期間，將管子置于旋轉(zhuǎn)器中，200rpm(每分鐘200轉(zhuǎn))搖動。用無菌水漂洗3次后，將胚再浸于無菌水中20min。不時(shí)用手搖動管子，以去除圍繞胚的薄膜。消毒后，成熟胚在補(bǔ)加4.0mg/L-BA的基于MS(Murashige和Skoog，1962)的培養(yǎng)基中發(fā)芽，在培養(yǎng)間于23-26℃暗處生長。
制備外植體子葉葉柄 發(fā)芽3天后，除去發(fā)芽幼苗的下胚軸和2/3的子葉。包含子葉節(jié)、芽尖以及剩余子葉的子葉葉柄外植體然后轉(zhuǎn)入芽增殖(SM)培養(yǎng)基中，25℃光下生長。SM培養(yǎng)基包含MS鹽、維生素B5、2-4mg/L BA-，并用約4g/L(或約0.4％w/v)PhytagelTM凝固。
SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-10天以后，仔細(xì)除去伸長的下胚軸和子葉的過多組織，從芽尖區(qū)域分離用來轉(zhuǎn)化的子葉葉柄。子葉葉柄用于轉(zhuǎn)化之前，還可以在SM培養(yǎng)基中另外再培養(yǎng)3-14天。
芽尖 從發(fā)芽的幼苗或小植株上切離包含芽原體、葉原體、新葉和部分下胚軸的頂生或腋生分生組織。其于SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，25℃光下生長，每兩周繼代培養(yǎng)一次。在首次繼代培養(yǎng)后，芽尖外植體就可以轉(zhuǎn)化了。繼代培養(yǎng)物幾次后，其還可以用作供轉(zhuǎn)化的外植體。
土壤桿菌菌株和質(zhì)粒根癌土壤桿菌菌株，例如EHA101、LBA4404、GV3101和K6(ATCC# 55964)，用于基因轉(zhuǎn)移，EHA101(Hood等人，1986.JBacteriology 168129-1301)用作優(yōu)選菌株。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pNOV2105包含由修飾的Smas基因啟動子驅(qū)動的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)編碼序列(Ni等人，(1995)Plant J.7661-676)。Smas(甘露堿合酶)啟動子來源于根癌土壤桿菌，通過ocs增強(qiáng)子區(qū)增殖而增強(qiáng)。基因終止于nos 3’區(qū)。它也包含編碼β-葡糖醛酸酶(GUS，Jefferson等人(1986)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 838447-8451)的大腸桿菌uidA基因。GUS編碼序列內(nèi)已經(jīng)放置gus內(nèi)含子(Vancanneyt等人(1990)Mol.Gen.Genet 220(2)245-250)。基因由Smas啟動子驅(qū)動，并終止于nos 3’區(qū)。用于轉(zhuǎn)化的土壤桿菌于包含合適抗生素(50mg/L卡那霉素、100mg/L壯觀霉素以及100mg/L羧芐青霉素)的Bacto瓊脂凝固的YP培養(yǎng)基中(5g/L酵母抽提物、10g/L蛋白胨以及5g/L NaCl，pH6.8)培養(yǎng)。細(xì)菌保持28℃。
接種和共培養(yǎng)采用三種方法將土壤桿菌接種到外植體。
方法1 利用接種環(huán)從BactoTM瓊脂凝固的細(xì)菌平板收集2-3日齡的根癌土壤桿菌集落。就在土壤桿菌接種外植體之前或期間，利用外科刀片或針，反復(fù)造成子葉葉柄的分生組織區(qū)或者頂生及腋生芽尖分生組織培養(yǎng)物的表面創(chuàng)傷。創(chuàng)傷之前在靶區(qū)域表面上施加土壤桿菌，或者在創(chuàng)傷處理前將土壤桿菌″粘貼″在刀片或針上，進(jìn)行細(xì)菌接種。創(chuàng)傷之后，液態(tài)的土壤桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基(例如All培養(yǎng)基，其中包含SM培養(yǎng)基加上200-600mg/L乙酰丁香酮(acetosyringone)，取決于外植體的大小，約為1μl-6μl)立刻施加于創(chuàng)面，數(shù)量取決于外植體的大小，為1-6μL。利用無菌濾紙除去創(chuàng)傷組織表面上過量的土壤桿菌和All培養(yǎng)基。短時(shí)間風(fēng)干后，感染的外植體轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(例如ACC培養(yǎng)基，其中包含All培養(yǎng)基以及約20g/L蔗糖和30g/L葡萄糖)，22℃黑暗中培育2-4天。
方法2 從YP平板收集2-3日齡根癌土壤桿菌聚集物，與25-50ul All培養(yǎng)基混合。接種前，細(xì)菌在室溫下放置30min。在創(chuàng)傷前，將少量誘導(dǎo)的根癌土壤桿菌混合物施加給子葉柄的分生組織區(qū)、或者頂生和腋生芽尖的分生組織培養(yǎng)物，進(jìn)行細(xì)菌感染。另外，利用涂有土壤桿菌聚集物的刀片或針創(chuàng)傷靶區(qū)域，進(jìn)行細(xì)菌感染。短時(shí)間風(fēng)干后，感染的外植體轉(zhuǎn)入ACC共培養(yǎng)培養(yǎng)基。
方法3 在感染當(dāng)天，將2-3日齡的細(xì)菌聚集物懸浮于All培養(yǎng)基中，或者細(xì)菌在YP液體培養(yǎng)基中生長過夜，然后在感染前重懸于All培養(yǎng)基中，制備用于感染的根癌土壤桿菌懸浮液。前一種情況下，懸浮液在使用前，于慢速振蕩器上搖動或用手輕搖0.5-3小時(shí)。根癌土壤桿菌的終濃度調(diào)整為0.2-2.0×109cfu(集落形成單位)。為了感染，將外植體浸入根癌土壤桿菌懸浮液中，并用刀片或針創(chuàng)傷靶區(qū)域。感染后，用濾紙吸干外植體上過量的液體，外植體風(fēng)干30-60min，直到表面無可見液體。感染的外植體然后轉(zhuǎn)入ACC培養(yǎng)基共培養(yǎng)。
芽增殖和選擇在ACC培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2-4天后，感染的外植體轉(zhuǎn)入芽增殖/選擇培養(yǎng)基(MSS)，25℃光下生長兩周。每隔兩周，進(jìn)行后續(xù)的繼代培養(yǎng)和選擇。對于每個(gè)繼代培養(yǎng)，選擇甘露糖抗性的綠芽塊，切成小塊，轉(zhuǎn)入新鮮的MSS培養(yǎng)基。MSS培養(yǎng)基由SM培養(yǎng)基和抗生素組成，有或沒有甘露糖。后續(xù)選擇過程中，MSS培養(yǎng)基中的甘露糖的濃度從0g/L逐漸提高到2g/L、3g/L和4g/L，而蔗糖的濃度從30g/L減少到25g/L、然后到20g/L。
植物再生培養(yǎng)甘露糖中生長的芽塊，在包含2-4g/L甘露糖和0.5-4mg/L6-芐基-氨基嘌呤(BA或6-BAP)的MSS培養(yǎng)基中形成新克隆。為了促進(jìn)芽的伸長，芽塊生長于有或沒有0.5mg/L BA的MSS培養(yǎng)基中。芽在不含BA的MSS培養(yǎng)基或含有1mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)的MSS培養(yǎng)基中生根。生根的芽轉(zhuǎn)入土壤，在溫室中生長成熟。轉(zhuǎn)基因植物自花傳粉和/或與非轉(zhuǎn)基因植物異花傳粉，產(chǎn)生T1子代。采集T1轉(zhuǎn)基因子代分析，用于產(chǎn)生T2轉(zhuǎn)基因子代。
植物分析GUS組織化學(xué)分析 按照J(rèn)efferson的方法(Plant Mol Bio.Rep.5，387-405(1987))，轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏慕M織或器官在GUS底物中37℃溫育過夜。為有助于觀察葉組織中的GUS表達(dá)，如果需要，利用70％乙醇從組織中提取葉綠素。對子代的根和未成熟胚進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析，篩選包含gus基因的轉(zhuǎn)基因子代。利用卡方檢驗(yàn)(Chi square test)進(jìn)行子代中轉(zhuǎn)基因的分離分析。
ELISA分析 收集轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的葉子樣本，進(jìn)行ELISA加/減分析，證實(shí)PMI酶的存在。
轉(zhuǎn)基因的整合 分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏目侱NA。利用Southern印跡分析，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因在植物基因組中的整合。EHA101(pNOV2105)轉(zhuǎn)化的結(jié)果概括于表1。
表1實(shí)驗(yàn)外植體數(shù)目 PMI+和GUS+ ％表達(dá)(GUS+外植體數(shù)目)1 200 2 12 50 1 23 200 3 1.55 150 4 2.76 200 2110.57 100 4 4利用本發(fā)明所述多芽轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化南瓜的效率介于1％-10.5％。在轉(zhuǎn)基因南瓜植物的葉、葉柄、根、莖、芽、花藥、花冠、花萼、花絲、花蜜、花粉粒、柱頭、花柱、胚珠、子房表皮以及未成熟胚中觀察到強(qiáng)的GUS活性。Southern印跡分析證實(shí)pmi基因整合到轉(zhuǎn)基因植物的基因組中。GUS組織化學(xué)分析確認(rèn)，轉(zhuǎn)基因(GUS)在子代中遺傳。進(jìn)行卡方分析檢查子代中轉(zhuǎn)基因(GUS)的分離。結(jié)果表明，GUS基因在自花傳粉子代(T1)中按3∶1比例分離，在與非轉(zhuǎn)基因植物異花傳粉的子代中按1∶1比例分離。選擇一個(gè)自花受粉T1植物的六個(gè)T2子代，供進(jìn)一步分析。從六個(gè)T2植物收集了總共136個(gè)胚，分析GUS和PMI基因的存在。結(jié)果全部陽性，證實(shí)恢復(fù)純合事件。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)化西瓜成熟的西瓜種子(西瓜，Citrullus lanatus(Thumb.)Mansf.)發(fā)芽，如實(shí)施例1所述制備多芽培養(yǎng)物。用于西瓜轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化步驟和培養(yǎng)基，包括土壤桿菌感染、共培養(yǎng)、選擇再生植物，如實(shí)施例1所述進(jìn)行。攜帶pNOV2105的根癌土壤桿菌EHA101的轉(zhuǎn)化結(jié)果如表2所示。如實(shí)施例1所述，在大部分營養(yǎng)性以及繁殖性器官和組織中觀察到強(qiáng)的GUS活性。在自花傳粉的轉(zhuǎn)基因西瓜植物子代中也觀察到GUS活性的表達(dá)。
表2實(shí)驗(yàn)外植體數(shù)目 轉(zhuǎn)基因PMI+/GUS+％表達(dá)1 50uidA36實(shí)施例3轉(zhuǎn)化甜瓜利用鑷子除去甜瓜(香瓜，Cucumis melo L)種子的種皮，種子用70％乙醇1min、然后1％鹽酸化物10min消毒。種子用無菌水漂洗3-4次，播種在半量無激素的MS培養(yǎng)基中，每平板10粒種子。種子在22-24℃發(fā)芽，于3000-4000勒克斯(lux)16小時(shí)，黑暗中8小時(shí)。7天后，分離幼苗的子葉和葉柄，轉(zhuǎn)入MS30培養(yǎng)基(MS鹽、30g/L蔗糖)。轉(zhuǎn)化前1天，在普通管子中將50μl貯存液轉(zhuǎn)移到包含抗生素的5ml LB培養(yǎng)基中，開始根癌土壤桿菌培養(yǎng)。培養(yǎng)物28℃、150rpm培育至少17小時(shí)。
轉(zhuǎn)化當(dāng)天，將1.2-1.5ml土壤桿菌過夜培養(yǎng)物加到包含子葉的平板中(土壤桿菌終濃度2×108cfu/ml)。在子葉柄的分生組織位點(diǎn)造成小切口(創(chuàng)傷)。土壤桿菌+外植體的平板轉(zhuǎn)入真空干燥器中。通過真空泵施加真空1分鐘。維持真空15分鐘。15分鐘后，緩慢釋放真空。土壤桿菌懸浮液浸透平板。平板中加入MS30，用MS30液體洗滌外植體。從平板中吸出MS30，外植體在無菌濾紙上干燥。外植體置于BM4.5+0.5mg/L BAP(BM4.5B)，每平板20-30個(gè)外植體。平板于21-23℃、1500-2000lux培育16小時(shí)，然后黑暗中8小時(shí)，共5天。共培養(yǎng)5天后，外植體轉(zhuǎn)入包含甘露糖、0.5mg/L BA、0.125mg/L嘧啶醇以及1.5mg/L AgNO3的選擇培養(yǎng)基，每平板10個(gè)外植體。平板置于24℃、2000-2500lux下16小時(shí)，然后置于黑暗中8小時(shí)，每2-2.5周轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中。0.5mm及更大的芽轉(zhuǎn)入包含MS鹽、0.1mg/L NAA、3mg/L AgNO3以及200mg/L氨噻肟頭孢菌素和100mg/L萬古霉素的BMM-c培養(yǎng)基。每2-3周將芽轉(zhuǎn)入新鮮的BMM-c培養(yǎng)基中。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)化向日葵向日葵(向日葵，Helianthus annuus L.)種子如實(shí)施例1所述發(fā)芽。利用實(shí)施例1所述培養(yǎng)基，從原始芽尖或未成熟花序制備多芽培養(yǎng)物。未成熟花序取自溫室生長的幼植物或者離體培養(yǎng)的芽尖。用攜帶pNOV2105的根癌土壤桿菌EHA 101轉(zhuǎn)化多芽培養(yǎng)物。感染4周后，在多芽培養(yǎng)物中觀察到強(qiáng)的GUS活性。按照實(shí)施例1所述選擇和芽增殖步驟，再生轉(zhuǎn)基因植物。結(jié)果概括于表3。
表3實(shí)驗(yàn) 外植體數(shù)目 轉(zhuǎn)基因PMI+/GUS+％表達(dá)1 7 uidA7 1002 10 uidA10 100實(shí)施例5轉(zhuǎn)化糖用甜菜種子消毒和發(fā)芽糖用甜菜(甜菜，Beta vulgaris L.)的種子利用濃硫酸破皮10分鐘。徹底漂洗種子，去除剩余的硫酸以后，種子在水中浸泡過夜。次日利用20％ Clorox(商品供應(yīng))邊搖邊進(jìn)行表面消毒15分鐘。然后，種子用無菌水漂洗5次，風(fēng)干6小時(shí)，然后在無菌培養(yǎng)條件下接種到種子發(fā)芽培養(yǎng)基(GM)中。一個(gè)實(shí)施例中，包含的GM含有Murashige和Skoog(MS)鹽(Sigma Chemicals，St.Louis，Mo.)以及30g/L蔗糖。GM中也包含維生素B5(也得自Sigma Chemicals)、肌醇(100mg/L)、泛酸(1mg/L)和3.6g/L Phytagel，作為具有細(xì)胞分裂素樣功能的植物生長調(diào)節(jié)劑。細(xì)胞分裂素水平一般處于0.5mg/L-5mg/L典型范圍內(nèi)，通常介于1.0-2.0mg/L之間。至于糖用甜菜的種子，還加入生長素抑制劑TIBA。
芽分生組織培養(yǎng)物的切離和起始切下7-14日齡幼苗的芽尖，接種芽增殖培養(yǎng)基(SMM)中。在這種情況下，SMM包含Murashige和Skoog鹽、30g/L蔗糖、維生素B5和8g/L Phytagel。此外，SMM包含至少一種細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)劑，例如BA、激動素、2-ip或玉米素，一般位于約1-10mg/L濃度范圍內(nèi)，通常位于2-6mg/L濃度范圍內(nèi)。還加入另外的生長調(diào)節(jié)劑，例如GA，以及生長素樣功能的生長調(diào)節(jié)劑，例如IAA、NAA和2，4-D。
芽尖由頂生和腋生芽分生組織區(qū)、葉原基、下胚軸的3-4mm以及被切斷以減少其進(jìn)一步延長的子葉組成。接種后每7-10天，去除任何新伸長的葉子物質(zhì)以后，將靶外植體在新鮮SMM中繼代培養(yǎng)。多芽靶外植體一般在弱光強(qiáng)度(10-30，μEinsteins)、日長12-16小時(shí)、20℃下培養(yǎng)。4-6周后，多芽培養(yǎng)物類似緊密的花結(jié)，就可以轉(zhuǎn)化了。
多芽培養(yǎng)物的接種和培育利用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化多芽培養(yǎng)物。帶有質(zhì)粒pAD1289和pNOV2105(包含PMI選擇性標(biāo)志基因和GUS scorable標(biāo)志基因)的根癌土壤桿菌菌株EHA101，在由5g/L酵母抽提物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl和15g/L BactoagarTM組成的固體培養(yǎng)基中，28℃生長2-3天。質(zhì)粒pNOV1508包含pmi基因，其由改變的SMas啟動子驅(qū)動，終止于nos 3’區(qū)。它還包含雙突變的鼠耳芥屬PPO基因(參見美國專利6,084,155)，其由鼠耳芥屬UBQ3(內(nèi)含子)啟動子(參見Norris等人，Plant Molecular Biology 21，895-906(1993))驅(qū)動，終止于35S 3’區(qū)。轉(zhuǎn)化前一天，除去任何保持伸長的葉子物質(zhì)，準(zhǔn)備供接種的多芽培養(yǎng)物。
為了開始接種，利用無菌環(huán)將單個(gè)集落的根癌土壤桿菌在原始YP培養(yǎng)平板上收集一起。為了實(shí)際接種每個(gè)靶外植體，無菌刮刀浸入收集的根癌土壤桿菌集落，并用來在每個(gè)目標(biāo)的頂生和腋生分生組織區(qū)作切口。接種步驟之后，某些實(shí)驗(yàn)中立即將大約4-6μl MSMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS鹽、2g/L葡萄糖、MES和200μM乙酰丁香酮)施加于每個(gè)目標(biāo)的創(chuàng)面上。為了引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)生芽分生組織的細(xì)胞中，努力刺穿盡可能多的分生組織區(qū)中心。一般依次處理10-20個(gè)靶培養(yǎng)物，然后使其在層流凈化罩無菌條件下風(fēng)干10分鐘。風(fēng)干處理之后，處理的靶外植體移到MSCC共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(MS鹽、維生素B5、2mg/LBA、30g/L蔗糖、200μM乙酰丁香酮)。處理的外植體然后在MSCC培養(yǎng)基中培育，22℃連續(xù)黑暗培養(yǎng)2-3天。
靶標(biāo)培養(yǎng)和選擇接種和共培養(yǎng)后，在施加甘露糖選擇壓力至少兩天以前，多芽外植體轉(zhuǎn)入含有2mg/L BA和合適的抗生素的新鮮SMM培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)化后逐漸提高甘露糖量(2g/L-20g/L)、并降低蔗糖量(26g/L-0g/L)，選擇轉(zhuǎn)化的組織。逐步增加甘露糖選擇水平，從2g/L甘露糖+26g/L蔗糖到3g/L甘露糖+24g/L蔗糖，然后4g/L甘露糖+22g/L蔗糖，繼之以5g/L甘露糖+20g/L蔗糖以及6g/L甘露糖+18g/L蔗糖。多芽培養(yǎng)物大小持續(xù)生長，每次繼代培養(yǎng)仔細(xì)分離，以促進(jìn)足夠的選擇壓力。轉(zhuǎn)化以后維持BA水平2mg/L一般16-20周，以繼續(xù)于選擇條件下擴(kuò)增芽分生組織。這期間以后，BA水平降為0.25mg/L，4-6周后撤銷，以促進(jìn)芽伸長。不斷從原始靶外植體垂死的非轉(zhuǎn)化部分移開成活的轉(zhuǎn)化組織區(qū)域，再仔細(xì)分離成活部分，以促進(jìn)嚴(yán)謹(jǐn)性選擇。選擇和芽再生一般進(jìn)行約10-30周的時(shí)間。幼芽出現(xiàn)時(shí)，將它們分開，并在最有效選擇轉(zhuǎn)化芽的選擇條件下分離。
轉(zhuǎn)化芽的伸長一旦幼芽達(dá)到大約0.5-1.5cm，將其轉(zhuǎn)入包含芽伸長培養(yǎng)基(降低細(xì)胞分裂素水平，從而增強(qiáng)發(fā)育芽的伸長)的GA7’s中，有或沒有上述甘露糖選擇。芽伸長培養(yǎng)基包含MS鹽、維生素B5、30％蔗糖和PhytagelTM(7.5g/L)。伸長培養(yǎng)基中加入低水平細(xì)胞分裂素，一般介于0.1-1.0mg/L。糖用甜菜施用的最適細(xì)胞分裂素為0.5mg/L激動素。
轉(zhuǎn)化植物的再生在含有5-20g/L甘露糖的基于MS的克隆培養(yǎng)基中克隆轉(zhuǎn)化芽。有時(shí)希望多個(gè)芽來自于一個(gè)原始的轉(zhuǎn)基因芽，為此，在基本MS培養(yǎng)基中聯(lián)合使用細(xì)胞分裂素和生長素，誘導(dǎo)克隆化。低水平的兩種生長調(diào)節(jié)劑一般介于0.1mg/L-0.5mg/L。對于糖用甜菜，使用MS鹽和30g/L蔗糖、0.2mg/L激動素、0.1mg/L NAA以及7g/LPhytagelTM。
將單個(gè)芽或克隆轉(zhuǎn)入包含MS基本培養(yǎng)基(其中補(bǔ)加一種或兩種生長素，例如0.5mg/L-5mg/L IBA或NAA)的生根培養(yǎng)基，順利生根。在一個(gè)實(shí)施例中，生根培養(yǎng)基包含5mg/L IBA、0.5mg/L NAA以及大約5-20g/L甘露糖。發(fā)現(xiàn)5g/L PhytagelTM是支持根發(fā)育的合適膠凝劑。
轉(zhuǎn)化結(jié)果利用多芽培養(yǎng)物為外植體，獲得糖用甜菜的高效轉(zhuǎn)化。
利用包含pNOV2105的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化糖用甜菜多芽培養(yǎng)物，其結(jié)果如表4所示。利用組織化學(xué)分析，檢測轉(zhuǎn)化的糖用甜菜植物的GUS表達(dá)。利用PMI ELISA+/-分析，確定PMI基因的表達(dá)。
表4
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，利用包含pNOV1508(包含PMI選擇性標(biāo)志基因以及突變的鼠耳芥PPO基因的質(zhì)粒)的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化糖用甜菜多芽培養(yǎng)物，34個(gè)外植體當(dāng)中的18個(gè)產(chǎn)生PMI+植物。利用Northern分析進(jìn)一步分析該P(yáng)MI+轉(zhuǎn)基因糖用甜菜植物，表明其中7個(gè)還表達(dá)突變的鼠耳芥PPO基因。該表達(dá)PPO的植物按農(nóng)田施用水平噴灑PPO抑制劑除草劑，其中若干顯示特別高的除草劑抗性。T1種子繁殖選擇兩個(gè)PPO轉(zhuǎn)基因事件。通過PMI ELISA和PMI基因的Southern分析，證實(shí)這些是轉(zhuǎn)基因事件。表明每一事件包含PMI基因的多拷貝整合。生根的T0植物轉(zhuǎn)入土壤，于21℃、60％濕度、16小時(shí)日長/8小時(shí)黑夜的溫室條件下生長5-6周。觀察到植物正常發(fā)育表型以后，T0植物轉(zhuǎn)入春化作用條件下(4℃、16小時(shí)白天/8小時(shí)黑夜)16周，然后適應(yīng)14℃ 2周。適應(yīng)水土后，轉(zhuǎn)基因植物返回溫室條件，觀察到花的正常發(fā)育。轉(zhuǎn)基因植物自花傳粉，以及與非轉(zhuǎn)基因植物異花傳粉，繁殖種子。順利產(chǎn)生T1種子，然后采集并在土壤中播種發(fā)芽。通過PMI ELISA分析，證實(shí)T1幼苗包含PMI基因。通過5個(gè)T1植物各個(gè)事件的Southern分析，證實(shí)PMI和PPO轉(zhuǎn)基因共同整合。
排除嵌合體采用另外的步驟減少產(chǎn)生嵌合(部分轉(zhuǎn)基因)的轉(zhuǎn)化植物的可能性。一個(gè)步驟將延長高濃度細(xì)胞分裂素(2mg/L)處理時(shí)間到8-16周，以持續(xù)刺激芽分生組織增殖培養(yǎng)物于選擇壓力下的應(yīng)答。另一步驟將提高甘露糖選擇的嚴(yán)謹(jǐn)性(例如，選擇時(shí)將甘露糖從5g/L逐步提高到10g/L)。在利用包含pNOV2105的EHA101轉(zhuǎn)化糖用甜菜多芽培養(yǎng)物的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分析GUS表達(dá)的36個(gè)外植體當(dāng)中的35個(gè)(97％)產(chǎn)生了完全轉(zhuǎn)基因的芽(參見下表5)。
表5
實(shí)施例6利用芽尖、葉或其它植物組織的分生組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化質(zhì)體構(gòu)建糖用甜菜質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體擴(kuò)增并改變甜菜(Beta vulgaris)質(zhì)體基因組的trnV和rpsl2/7基因間區(qū)域，以插入嵌合基因。從糖用甜菜質(zhì)體基因組PCR擴(kuò)增1559bp區(qū)域(1-1560位，GenBank登錄號AB032426)，在525位插入Pstl位點(diǎn)。利用以下引物對，從甜菜(B.vulgaris)總DNA首先進(jìn)行536bp的PCR擴(kuò)增Bv16-MluI(5’TTC TTA CGC GTT ACT CACCCG 3’，SEQ ID NO1)具有天然MluI限制性位點(diǎn)(下劃線)，以及Bv16S-PstI(5’AAACTG CAGAAA GAA GTC CCG GCT CCA AGT 3’，SEQ ID NO2)引入PstI位點(diǎn)(下劃線)。利用以下引物對，進(jìn)行第二次1049bp的PCR擴(kuò)增Bvrpsl2-BHI(5’AAAGGA TCCAAA TTGACG GGT TAG TGT G 3’，SEQ ID NO3)引入BamHI限制性位點(diǎn)(下劃線)，以及Bvrpsl2-PstI(5’AAA CTG CAG TCG CAC TAT TAC GGATAC GAA 3’，SEQ ID NO4)引入PstI位點(diǎn)(下劃線)。兩個(gè)PCR反應(yīng)均利用Pfu熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，在Perkin Elmer熱循環(huán)儀上，按照廠家推薦(Perkin Elmer/Roche，Branchburg，NJ)進(jìn)行，如下所述95℃ 5分鐘，繼之以35個(gè)循環(huán)95℃ 1分鐘/50℃ 1分鐘/72℃ 1分鐘，然后72℃ 10分鐘。利用MluI和PstI消化536bp擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生代表糖質(zhì)體trnV側(cè)翼序列的525bp MluI/PstI片段。利用PstI和BamHI消化1049bp擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生代表糖用甜菜rps12/7側(cè)翼序列的1034bp BamHI/PstI片段。
利用MluI和BamHI切割煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pAT238(PCT WO00/20612 Novartis，國際
公開日04/13/00)，分離3.3kbMluI/BamHI載體片段。該片段在三方(three-way)反應(yīng)中與525bp MluI/PstI片段和1034bp BamHl/PstI連接，產(chǎn)生糖用甜菜轉(zhuǎn)化載體pEBcpSBeet主鏈。得到的質(zhì)粒包含嵌合的煙草∷糖用甜菜∷煙草質(zhì)體trnV和rpsl2/7基因間座位，1559bp糖用甜菜序列的trnV一側(cè)為414bp、rpsl2/7一側(cè)為39bp煙草質(zhì)體序列。賦予壯觀霉素抗性、由煙草psbA啟動子驅(qū)動的嵌合aadA基因，插入糖用甜菜序列先前產(chǎn)生的PstI位點(diǎn)。在rpsl2/7側(cè)翼區(qū)方向上具有aadA盒的質(zhì)?？寺?pEBSB1)，用于其后的糖用甜菜多芽轉(zhuǎn)化。
糖用甜菜質(zhì)體轉(zhuǎn)化如實(shí)施例5所述，糖用甜菜的多芽培養(yǎng)物來源于芽尖。轟擊前一天，靶外植體或切為4塊(由上至下切割外植體)，或保持為完整的目標(biāo)外植體。
轟擊當(dāng)天，將糖用甜菜靶外植體(整體或切塊)轉(zhuǎn)入含12％蔗糖的SMM培養(yǎng)基。將外植體置于靶平板的中心，以最大限度進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。外植體切塊的切面向上，以最大限度將基因轉(zhuǎn)入外植體的內(nèi)部細(xì)胞。消毒的微粒包被前述糖用甜菜質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pEBSB1。 DNA微粒制備和轟擊方法與廠家所述規(guī)程相似。
轟擊后，將糖用甜菜外植體放回SMM培養(yǎng)基中2天。然后將糖用甜菜轉(zhuǎn)入含250mg/L壯觀霉素的SMM培養(yǎng)基中，進(jìn)行選擇。兩周以后，將組織轉(zhuǎn)入包含500mg/L壯觀霉素的SMM培養(yǎng)基中，連續(xù)選擇。選擇1-2個(gè)月以后，在白色組織中出現(xiàn)壯觀霉素抗性的綠芽，進(jìn)行分析。
煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化分生組織培養(yǎng)物來源于煙草的葉組織，培養(yǎng)基中包含至少一種細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)劑，例如BAP，濃度范圍大約0.5-5mg/L，優(yōu)選1-2mg/L。分生組織培養(yǎng)物還來源于煙草植物的其它部分。也包括另外的生長調(diào)節(jié)劑，例如NAA。除植物調(diào)節(jié)劑以外，培養(yǎng)基包含MS鹽、維生素B5、30g/L蔗糖以及3g/L瓊脂，pH大約5.8。
轟擊當(dāng)天，將分生組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，置于平板中心，以最大限度進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。消毒的微粒包被煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pAt238(參見國際申請NO.PCT WO00/20612)。DNA微粒制備和轟擊方法與廠家所述規(guī)程相似。
轟擊兩天后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入包含500mg/L壯觀霉素的選擇性培養(yǎng)基。選擇大約4周以后，白色組織中出現(xiàn)抗性綠芽。這些初級的抗性芽組織定期繼代培養(yǎng)于包含500mg/L壯觀霉素的新鮮培養(yǎng)基中。
選擇3個(gè)月以后，利用PCR分析兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中17個(gè)獨(dú)立事件的aadA基因以及質(zhì)體整合。證實(shí)14個(gè)事件包含aadA，并且質(zhì)粒整合到其質(zhì)體基因組中。
番茄質(zhì)體轉(zhuǎn)化在包含至少一種細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)劑(例如玉米素、BAP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)番茄組織(例如子葉、葉、芽尖等)的各種外植體，以誘導(dǎo)分生組織培養(yǎng)物。細(xì)胞分裂素濃度范圍大約0.5-5mg/L，優(yōu)選1-2mg/L。也包括另外的生長調(diào)節(jié)劑，例如IAA、NAA。除植物調(diào)節(jié)劑以外，培養(yǎng)基包含MS鹽、維生素B5、30g/L蔗糖以及7.5g/LPhytagar，pH5.8。
轟擊當(dāng)天，將分生組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，置于平板中心，以最大限度進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。消毒的微粒包被有質(zhì)體DNA，其中包含側(cè)接選擇性標(biāo)志基因(以及目的基因)的番茄或煙草同源序列。DNA微粒制備和轟擊方法與廠家所述規(guī)程相似。
轟擊兩天后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入包含500mg/L壯觀霉素的選擇性培養(yǎng)基。選擇幾周以后，白色組織中將出現(xiàn)抗性綠芽。獲得的芽繼續(xù)在壯觀霉素選擇性培養(yǎng)基中生長，并包含轉(zhuǎn)化的質(zhì)體。
上文說明本發(fā)明，不應(yīng)理解為對其限制。本發(fā)明由以下權(quán)利要求定義，等效于其中包括的權(quán)利要求。
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法<130>S-31514A<140><141><150>US 60/224,934<151>2000-08-11<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>1ttcttacgcg ttactcaccc g 21<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>2aaactgcaga aagaagtccc ggctccaagt 30<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>3aaaggatcca aattgacggg ttagtgtg28<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>4aaactgcagt cgcactatta cggatacgaa 30Case S-31514A權(quán)利要求
1.產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的雙子葉植物的方法，包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)難以轉(zhuǎn)化的雙子葉植物的組織，以從該組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物；(b)將核酸引入多芽培養(yǎng)物的細(xì)胞中，從而產(chǎn)生包含該核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的組織為分生組織。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的分生組織切離自芽尖、腋芽或花分生組織。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的組織為愈傷組織。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物是葫蘆科或藜科的一員。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物選自糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、甜瓜、西瓜、南瓜、蕓苔屬和胡椒。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物為糖用甜菜、南瓜、甜瓜或西瓜。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的組織切自植物幼苗的芽尖。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述的生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中的濃度介于大約0.01mg/L至大約25mg/L。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸通過微粒轟擊、或者利用屬于土壤桿菌屬的細(xì)菌而引入細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸包含與該雙子葉植物異源的核酸。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸包含編碼具有PPO活性的多肽的基因。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸包含編碼具有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)活性的多肽的基因。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸包含編碼具有木糖異構(gòu)酶(xylA)活性的多肽的基因。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核酸包含編碼具有GUS活性的多肽的基因。
18.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；將該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；然后將該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
19.權(quán)利要求19的方法，其中所述的至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
20.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；將該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；克隆該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；以及使克隆的芽成熟為轉(zhuǎn)化植物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的克隆的芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該克隆的芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
22.通過權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
23.通過權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的多芽培養(yǎng)物。
24.通過權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物。
25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化植物，其中該植物是表達(dá)具有PMI活性的多肽的南瓜植物。
26.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化植物，其中該植物是表達(dá)具有PMI活性的多肽的甜瓜植物。
27.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化植物，其中該植物是表達(dá)具有PMI活性的多肽的西瓜植物。
28.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化植物，其中該植物是表達(dá)具有PPO活性的多肽的糖用甜菜植物。
29.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子，其中該種子包含轉(zhuǎn)化到多芽培養(yǎng)物的核酸。
30.產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的植物的方法，包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，從該組織產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物；(b)將核酸引入多芽培養(yǎng)物細(xì)胞的質(zhì)體基因組中，從而產(chǎn)生包含該核酸的所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組；以及(c)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化植物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的組織為分生組織。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述的分生組織切自或來源于芽尖、腋芽、或花分生組織、或葉組織。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述的組織為愈傷組織。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述的植物為雙子葉植物。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述的雙子葉植物為糖用甜菜、煙草或番茄。
36.權(quán)利要求30的方法，其中所述的組織切自植物幼苗的芽尖。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述的生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中的濃度介于大約0.01mg/L至大約25mg/L。
40.權(quán)利要求30的方法，其中所述的核酸通過微粒轟擊引入細(xì)胞。
41.權(quán)利要求30的方法，其中所述的核酸包含與所述的雙子葉植物異源的核酸。
42.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；將該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化的芽；然后該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
44.權(quán)利要求30的方法，其中步驟(c)包含選擇包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多芽培養(yǎng)物；該多芽培養(yǎng)物在促進(jìn)芽伸長的條件下生長，產(chǎn)生至少一個(gè)轉(zhuǎn)化的芽；克隆該至少一個(gè)轉(zhuǎn)化芽；以及使該克隆的芽成熟為轉(zhuǎn)化植物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述的克隆的芽在促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基中生長以后，該克隆的芽生長為成熟的轉(zhuǎn)化植物。
46.通過權(quán)利要求30-45中任何一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組。
47.包含權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的質(zhì)體。
48.包含權(quán)利要求46的質(zhì)體基因組的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
49.包含權(quán)利要求48的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物。
50.通過權(quán)利要求49的轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子，其中該種子包含轉(zhuǎn)化到多芽培養(yǎng)物的核酸。
全文摘要
從植物組織(例如人工培養(yǎng)基中的芽尖或腋芽)誘導(dǎo)多芽結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生多芽培養(yǎng)物。然后利用已知的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化這些多芽培養(yǎng)物。隨后從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物。利用該方法可能有效轉(zhuǎn)化的作物包括通常難以轉(zhuǎn)化的植物，例如糖用甜菜、向日葵、大豆、棉花、煙草、番茄、花生、甜瓜、西瓜、南瓜、蕓苔屬(Brassica)和胡椒。
文檔編號C12N15/84GK1452660SQ01815201
公開日2003年10月29日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者張英夫, 鐘衡, E·M·頓德, S·N·柔瑟, 辜唯寧, E·保德勞 申請人:辛根塔參與股份公司