專(zhuān)利名稱(chēng)：用作神經(jīng)變性疾病診斷的鐵調(diào)節(jié)蛋白-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)變性疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。更具體而言，發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)節(jié)蛋白-2(IRP-2)形式在關(guān)鍵半胱氨酸殘基處不能氧化，是神經(jīng)變性疾病包括但不限于阿爾茨海默病的診斷物。
背景技術(shù)：
神經(jīng)變性疾病殃及全世界幾百萬(wàn)人。例如，在美國(guó)阿爾茨海默病(AD)是繼心臟病、癌癥、中風(fēng)之后第4位最常見(jiàn)的死因。目前僅在美國(guó)就影響超過(guò)4百萬(wàn)人，在今后40年由于人口老化預(yù)計(jì)其數(shù)量將加倍。除高齡和唐氏綜合征之外，發(fā)展為神經(jīng)變性疾病的唯一相同危險(xiǎn)因素是存在陽(yáng)性家族史。目前，研究人員正在進(jìn)行遺傳連鎖分析，以確定引起神經(jīng)變性疾病的致病基因，然而，對(duì)這類(lèi)疾病的生物化學(xué)機(jī)制的了解尚處于初期。
然而，最近越來(lái)越懷疑是腦鐵調(diào)節(jié)的干擾引起幾種形式的神經(jīng)變性疾病，如AD(Gerlach等人，J.Neurochem.63793-807(1994))。在腦中，鐵代謝受?chē)?yán)格控制。過(guò)量的鐵導(dǎo)致毒性，而太少則影響代謝。所有組織都通過(guò)鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP-1)和鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP-2)的作用調(diào)節(jié)鐵離子的攝取。最近的發(fā)現(xiàn)揭示，這些鐵調(diào)節(jié)蛋白，特別是IRP-2，與在阿爾茨海默病患者中觀察到的鐵穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)。(Smith等人，Brain Research，788232-236(1998))。
例如在缺鐵細(xì)胞中觀察到IRP-2水平升高。由于這種升高，IRP-2與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA的3’引發(fā)非翻譯區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是一種促進(jìn)鐵攝取的蛋白質(zhì)。另外，IRP-2還阻止與編碼鐵蛋白的HnRNA的5’帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，阻斷結(jié)合，隨后阻止翻譯。實(shí)際上，存在高水平的IRP-2利于鐵的攝取。另一方面，如果細(xì)胞含有過(guò)量的鐵，IRP-2快速降解，鐵攝取立即降低。于是，身體通過(guò)調(diào)節(jié)IRP-2的降解達(dá)到鐵穩(wěn)態(tài)。(Van Buskirk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，81722-725(1984))。需要更多地了解IRP-2降解的誘導(dǎo)。
盡管文獻(xiàn)中有大量通過(guò)MRI定量腦鐵的報(bào)道(Scheffler等人，Magn Reson Med.，42(5)829-36(1999)；Vymazal等人，J Neurol Sci.，134 Suppl19-26(1995)；Quast等人，Magn Reson Imaging，11(4)465-71(1993))，但是沒(méi)有廣泛接受的方法或標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有關(guān)于人的標(biāo)準(zhǔn)化的或驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。例如，探索顳葉和海馬體積改變速度的差異的系列縱向研究，證明是比分別測(cè)定更有效的診斷輔助方法。利用MR成像技術(shù)連續(xù)發(fā)現(xiàn)AD患者中顳葉萎縮。定量和連續(xù)測(cè)定局部腦鐵的能力在神經(jīng)變性疾病個(gè)體的診斷和預(yù)期治療的監(jiān)測(cè)方面具有潛在的用途。
順磁形式的鐵對(duì)MR圖像有許多影響。這些影響包括T2*加權(quán)梯度回波圖像中幅度和相位圖象的信號(hào)改變、T2加權(quán)和擴(kuò)散加權(quán)自旋回波圖中的信號(hào)改變，以及T1加權(quán)圖像中的信號(hào)增強(qiáng)。在鐵含量較高的灰質(zhì)中(如中央溝)，鐵起T1減少造影劑的作用。
腦鐵的一個(gè)主要來(lái)源是鐵蛋白的鐵形式，它在腦鐵的貯存和利用中起重要作用。每個(gè)鐵蛋白分子由在不同染色體上編碼的不同比例的H(重)和L(輕)鏈亞基組成，在鐵蛋白分子的功能中起不同的作用。富含H的鐵蛋白在鐵的螯合方面有效，在鐵利用率高、鐵貯存少的器官中占多數(shù)，而富含L的鐵蛋白在鐵的成核方面有效，與鐵的貯存有關(guān)。在腦中，不同細(xì)胞型含有與其功能作用相符合的鐵蛋白的同種型。鐵蛋白具有獨(dú)特的磁性特性，被認(rèn)為是鐵誘導(dǎo)的MR組織弛豫時(shí)間改變的主要原因。腦中鐵蛋白的量10倍于轉(zhuǎn)鐵蛋白的量，每個(gè)鐵蛋白分子都有螯合可達(dá)4500個(gè)鐵原子的能力。鐵蛋白貯存于少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的髓磷脂中。巨噬細(xì)胞能將鐵蛋白轉(zhuǎn)化為血鐵黃素——使T2*加權(quán)MRI圖像中信號(hào)改變的另一種強(qiáng)順磁性物質(zhì)。盡管眾所周知，但鐵蛋白的MRI特征尚未搞清。預(yù)期的R2的場(chǎng)依賴(lài)性是靜態(tài)場(chǎng)的平方。相反，所有證據(jù)都提示，R2隨場(chǎng)強(qiáng)線(xiàn)性改變。此外，一般發(fā)現(xiàn)弛豫時(shí)間太高，無(wú)法用簡(jiǎn)單的順磁性來(lái)解釋。最近一篇論文提到鐵蛋白的弛豫，R1為2.19+/-0.05/s/mgFe/g，該值與其它測(cè)定相符(Gossuin等人，Magn Reson Med，43(2)237-43(2000))。
腦鐵的第二個(gè)主要來(lái)源是游離鐵。捕獲的鐵也存在其它的來(lái)源，但其濃度較小。與相位測(cè)定、腦鐵的R2或R2’數(shù)據(jù)和其它量值相符，基底神經(jīng)節(jié)含有比大腦半球和白質(zhì)更多的可染色鐵。根據(jù)尸檢腦鐵測(cè)定，老人紅核中的鐵水平為2μg/gm，而蒼白球中的正常水平約為0.25μg/gm組織。其它發(fā)現(xiàn)包括阿爾茨海默病和帕金森病的海馬中鐵貯存升高，年齡增長(zhǎng)后灰質(zhì)中鐵蛋白增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞的鐵水平不變。
嘗試用動(dòng)物(Fenzi等人，J Magn Reson Imaging，13(3)392-6(2001))和人(Bonkovsky等人，Radiology，212(1)227-34(1999)；Bartzokis等人，Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)，46(4)821-33(2000))的強(qiáng)磁場(chǎng)結(jié)果定量腦鐵。盡管趨勢(shì)清楚地證明當(dāng)鐵含量升高時(shí)R2也升高，但結(jié)果難以預(yù)測(cè)。例如，F(xiàn)enzi表示，模型上R2的斜率為10-30/s(mg/gm Fe)，不含鐵時(shí)R2為40/s。然而，在體內(nèi)150/s的單T2對(duì)應(yīng)于1.5-3.5mg Fe/gm濕重的范圍，范圍太寬而無(wú)法成為臨床值。類(lèi)似地，Bonkovsky的數(shù)據(jù)表明，單信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量對(duì)應(yīng)于低濃度時(shí)的2/mg/gm干肝，和高于1/mg/g干肝濃度時(shí)的5/mg/gm干肝。
Ordidge和他的研究小組(Mizkeil等人，Magn Reson Imaging，15(10)1113-9(1997))證明，關(guān)鍵信息在于R2’而不是R2。R2的一個(gè)問(wèn)題是由于能改變T2并使關(guān)于局部鐵的信息混雜的其它影響。盡管黑質(zhì)中的鐵局部增多，但長(zhǎng)回波信號(hào)反常地恢復(fù)，隨著鐵含量升高，R2’持續(xù)升高。Ordidge等人發(fā)展了一種測(cè)定R2’的方法，盡管存在使信號(hào)移相并產(chǎn)生假高R2’值的背景場(chǎng)變化。切片選擇方向的局部區(qū)域用不同的切片選擇梯度通過(guò)多次重復(fù)掃描來(lái)補(bǔ)償。
Gelman等人測(cè)定了R2和R2’效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)(Radiology，213(1)135-40(1999))R2的斜率為60/s/mg濕重，截距為12.7或T2約80ms，R2’的斜率為50/s/mg濕重，截距為2.7(一個(gè)可能的推測(cè)是，這種非零截距可能代表血紅素鐵的作用)，例如，蒼白球的R2’為12/sec。實(shí)際上，大量論文證明了基底神經(jīng)節(jié)和肝臟中鐵的T2和T2*效應(yīng)。此外也用擴(kuò)散機(jī)制描述鐵的信號(hào)損失。最近，有關(guān)于在靜態(tài)或慢擴(kuò)散方案和快擴(kuò)散方案中旋轉(zhuǎn)移相的理論。在評(píng)價(jià)平行纖維(Hajnal等人，J Comput Assist Tomogr.，16(4)506-13(1992)和測(cè)定腦氧含量(An和Lin，J Cereb Blood Flow Metab.，20(8)1225-36(2000))時(shí)，具有這種獨(dú)特特征。
T2*測(cè)定和R2’定量現(xiàn)在被認(rèn)為是腦鐵測(cè)定的最佳方法。Gillet等人(J Neurol Sci.，168(1)21-7(1999))采用3D梯度回波結(jié)構(gòu)，在11.7T的場(chǎng)強(qiáng)時(shí)TE＝9ms，幾乎恰好相當(dāng)于是我們?cè)?.5T時(shí)用于最佳相差圖像的值。在建立的具有AD神經(jīng)病理標(biāo)志(包括老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié))的小鼠模型中，在基底前腦膽堿能結(jié)構(gòu)，如Meynert的基底中，可見(jiàn)鐵，而在AD的蒼白球中發(fā)現(xiàn)高鐵含量。
最可能發(fā)展為AD的健忘個(gè)體在發(fā)展為癡呆之前，具有被稱(chēng)作輕度認(rèn)知障礙或輕度認(rèn)知缺陷綜合征(MCI)的病癥。MCI的鑒別根據(jù)在于對(duì)于個(gè)體的年齡和教育水平而言異常的記憶損害。盡管不是所有的MCI個(gè)體都發(fā)展為AD，但MCI能作為AD早期發(fā)作的一種潛在標(biāo)志。一些研究人員提出，MCI可視為初期AD，診斷為MCI的個(gè)體可通過(guò)藥物治療好轉(zhuǎn)(Sramek等人，Ann Pharmacother，34(10)1179-88(2000))。因此，MCI篩查對(duì)于早期AD干預(yù)和/或AD預(yù)防是有益的。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一種純化或分離的核酸，其含有編碼對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2氨基酸殘基136-216的肽環(huán)的序列，在該肽環(huán)中該序列具有一個(gè)突變，該突變干擾了該肽環(huán)中存在的半胱氨酸殘基氧化的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列可至少含有SEQ.ID.Nos.3、5、7、9、11、13、15之一。優(yōu)選地，該核酸序列編碼含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的序列的肽。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，純化或分離的多肽含有編碼對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2氨基酸殘基136-216的肽環(huán)的序列，在該肽環(huán)中該序列具有一個(gè)突變，該突變干擾了該肽環(huán)中存在的半胱氨酸殘基氧化的能力。IRP-2蛋白可含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的序列。優(yōu)選地，IRP-2蛋白選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的序列。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及這種突變多肽在制備用于診斷神經(jīng)變性疾病的探針中的用途，并涉及制備可與該突變多肽上存在的表位結(jié)合的抗體，其中該抗體不能與野生型IRP-2蛋白或其片段交叉反應(yīng)。該突變體可有一個(gè)半胱氨酸殘基的置換或缺失。此外，制備步驟也可包括培養(yǎng)產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種確定需要神經(jīng)變性疾病治療或預(yù)防的患者的方法，包括從該患者獲得含多核苷酸或蛋白質(zhì)的生物樣品；制備一種探針，該探針選自可與野生型或突變IRP-2蛋白相互作用的探針，和可與編碼野生型或突變IRP-2蛋白的多核苷酸相互作用的探針；在允許探針與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的條件下，使生物樣品與該探針接觸；檢測(cè)與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的探針的量；通過(guò)用生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)確定探針的存在與否，確定患者為需要神經(jīng)變性疾病治療或預(yù)防的患者。優(yōu)選地，該方法包括測(cè)定探針是否與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用。更優(yōu)選地，該探針選自核酸、蛋白質(zhì)和擬肽。此外，與多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的探針量的檢測(cè)包括采用選自熒光激活細(xì)胞分選(FACs)、免疫沉淀、Western印跡、免疫層析、抗體染色和雜交測(cè)定的技術(shù)。此外，神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗體，它能與含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)特異結(jié)合。優(yōu)選地，該抗體能與含有該蛋白質(zhì)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽特異結(jié)合，該蛋白質(zhì)有一個(gè)半胱氨酸殘基的突變。更優(yōu)選地，該抗體是一種單克隆抗體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種純化或分離的抗體，它能與突變IRP-2蛋白特異結(jié)合，但不能與野生型IRP-2蛋白特異結(jié)合，其中該突變IRP-2蛋白在對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.2的氨基酸序列的肽環(huán)中含有一個(gè)突變。
另一方面，本發(fā)明涉及一種區(qū)別病人的輕度認(rèn)知缺陷綜合征(MCI)與其它形式癡呆的方法，包括對(duì)患者進(jìn)行核磁共振成像(MRI)，用以定量和/或監(jiān)測(cè)腦鐵，腦鐵的異常水平或分布表明存在MCI。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面涉及IRP-2基因突變產(chǎn)生耐受體內(nèi)降解從而干擾鐵穩(wěn)態(tài)的IRP-2蛋白形式這一發(fā)現(xiàn)。某些突變?cè)贗RP-2的肽環(huán)內(nèi)發(fā)生，其中關(guān)鍵的半胱氨酸殘基經(jīng)歷依賴(lài)鐵的氧化事件，這啟動(dòng)了降解過(guò)程。
實(shí)施方案包括編碼突變IRP-2蛋白的核酸、突變IRP-2蛋白和這些分子的片段。另外，實(shí)施方案還包括與編碼突變IRP-2蛋白或其片段的核酸互補(bǔ)的核酸，和可與突變IRP蛋白或其片段結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，此處所述的互補(bǔ)核酸用來(lái)特異性檢測(cè)編碼突變IRP-2蛋白的核酸，及區(qū)別編碼突變IRP-2蛋白的核酸與編碼野生型IRP-2蛋白的核酸。類(lèi)似地，此處所述的優(yōu)選抗體用來(lái)特異性檢測(cè)突變IRP-2，及區(qū)別突變IRP-2蛋白與野生型IRP-2蛋白。
此處所述的幾種試驗(yàn)可用于檢測(cè)編碼IRP-2蛋白的核酸或IRP-2蛋白本身或這些分子的片段中是否存在突變。因此，與編碼野生型和/或突變IRP-2蛋白或其片段的核酸互補(bǔ)的核酸序列和可與野生型和/或突變IRP-2蛋白上的表位結(jié)合的抗體用作神經(jīng)變性疾病(包括但不限于阿爾茨海默病)的離體標(biāo)志。因此，此處所述的診斷實(shí)施方案涉及基于核酸和基于蛋白質(zhì)的測(cè)定和包括這些測(cè)定的試劑盒，用來(lái)檢測(cè)生物樣品(例如含外周血細(xì)胞的樣品)中編碼野生型和/或突變IRP-2蛋白的核酸或IRP-2蛋白。自動(dòng)診斷測(cè)定技術(shù)，如標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞分析技術(shù)和陣列技術(shù)，能被此處所述的一些實(shí)施方案采用。例如，流式細(xì)胞分析能使用檢測(cè)野生型或突變IRP-2蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，以快速確定患者是否易患神經(jīng)變性疾病，如阿爾茨海默病。
基于載體的測(cè)定，如ELISA、免疫層析和免疫條紋(immunostrip)測(cè)定，也能用來(lái)檢測(cè)野生型和/或突變IRP-2蛋白的存在與否。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，可與編碼野生型和/或突變IRP-2蛋白的核酸結(jié)合的探針或可與突變或野生型IRP-2蛋白結(jié)合的抗體與載體結(jié)合，用來(lái)篩查生物樣品，從而進(jìn)行神經(jīng)變性疾病的診斷。
另外，神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的診斷也能用與載體結(jié)合的野生型和/或突變IRP-2蛋白或其片段實(shí)現(xiàn)。因此，使固定的IRP-2蛋白或其片段接觸含有循環(huán)抗體的生物樣品，利用第二種檢測(cè)分子(例如標(biāo)記的抗-IgG抗體)能確定是否存在抗突變或野生型IRP-2蛋白的抗體。存在抗突變IRP-2抗體表明易患神經(jīng)變性疾病。
可以預(yù)期，在健康個(gè)體中，由IRP-2的氨基酸殘基136-216構(gòu)成的肽環(huán)處發(fā)生的依賴(lài)鐵的氧化修飾啟動(dòng)了IRP-2降解，因而啟動(dòng)了鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。這種依賴(lài)鐵的氧化修飾該肽環(huán)內(nèi)的三個(gè)關(guān)鍵半胱氨酸殘基，產(chǎn)生氨基丙二酸。向氨基丙二酸的轉(zhuǎn)化處于遍在蛋白化階段，發(fā)出IRP-2蛋白體降解的信號(hào)。相反，可以預(yù)期，患神經(jīng)變性疾病(如阿爾茨海默病)的個(gè)體在IRP-2基因中含有使IRP-2蛋白不能進(jìn)行氧化修飾或氧化修飾水平下降的突變。一些個(gè)體也可含有多個(gè)梯度的IRP-2蛋白，其中一些IRP-2蛋白不能進(jìn)行依賴(lài)鐵的氧化，一些IRP-2蛋白經(jīng)歷適度的依賴(lài)鐵的氧化，其它IRP-2蛋白經(jīng)歷正常水平的依賴(lài)鐵的氧化。通過(guò)監(jiān)測(cè)突變和野生型IRP-2蛋白和/或編碼這些分子的核酸的水平，能進(jìn)行神經(jīng)變性疾病的預(yù)后。
實(shí)施方案包括編碼耐受體內(nèi)降解的突變IRP-2蛋白、其互補(bǔ)片段和至少含有一個(gè)突變的這些蛋白質(zhì)的片段的核酸。所希望的是，這些核酸編碼在對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2序列的氨基酸殘基136-216的肽環(huán)內(nèi)含有突變的蛋白質(zhì)。編碼野生型IRP-2肽環(huán)一個(gè)區(qū)域的189個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段在序列表中列出(SEQ.ID.No.1)。編碼人野生型IRP-2的全長(zhǎng)cDNA序列在SEQ.ID.No.17中列出，可見(jiàn)Guo等人，J.Biol.Chem.270 16529(1995)，在此引用作為參考。另外，編碼大鼠野生型IRP-2的全長(zhǎng)cDNA序列在SEQ.ID.No.19中列出，可見(jiàn)Guo等人，J.Biol.Chem.270 16529(1995)，在此引用作為參考。當(dāng)提及野生型IRP-2核酸時(shí)，根據(jù)本文內(nèi)容，是指包括SEQ.ID.No.17和/或18中列出的，或者在Guo等人，J.Biol.Chem.270 16529(1995)中所見(jiàn)的野生型IRP-2分子，在此引用作為參考。
優(yōu)選地，核酸實(shí)施方案至少含有一個(gè)突變，該突變使得對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2氨基酸殘基136-216的肽環(huán)內(nèi)的半胱氨酸殘基不能進(jìn)行依賴(lài)鐵的氧化。該突變可能包括該肽環(huán)內(nèi)半胱氨酸殘基的置換或缺失，或干擾肽環(huán)的三維結(jié)構(gòu)從而阻止依賴(lài)鐵的氧化的突變。SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15中公開(kāi)了編碼突變IRP-2蛋白肽環(huán)的一個(gè)區(qū)的幾種核酸的序列。
某些核酸實(shí)施方案是編碼突變IRP-2的基因組DNA、RNA和cDNA、其互補(bǔ)序列或至少含有一個(gè)突變的這些分子的片段。一些實(shí)施方案在該肽環(huán)內(nèi)包含大量導(dǎo)致多個(gè)置換和/或缺失的突變(例如，使一個(gè)以上半胱氨酸置換和/或缺失的突變)。優(yōu)選地，核酸實(shí)施方案含有如序列表所示的核苷酸序列(SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15及其互補(bǔ)序列和/或其片段)。編碼人、哺乳動(dòng)物和其它生物的突變IRP-2的核酸序列也是實(shí)施方案，以及獲得這些序列的方法。核酸實(shí)施方案可以改變、突變或變化，使得這種改變、突變或變化導(dǎo)致保守氨基酸置換。
此處所述的多肽實(shí)施方案涉及耐受體內(nèi)降解的突變IRP-2形式，和至少有一個(gè)突變的這些蛋白質(zhì)的片段。所希望的是，這些多肽在對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2的氨基酸殘基136-216的肽環(huán)內(nèi)含有一個(gè)突變，這使該分子對(duì)體內(nèi)降解具有穩(wěn)定性(例如，對(duì)蛋白體降解的穩(wěn)定性)。對(duì)應(yīng)于野生型IRP-2肽環(huán)一個(gè)區(qū)的63個(gè)核酸長(zhǎng)的肽在序列表中列出(SEQ.ID.No.2)。人野生型IRP-2的全長(zhǎng)氨基酸序列在SEQ.ID.No.18中列出，可見(jiàn)Guo等人，J.Biol.Chem.270 16529(1995)，在此引用作為參考。另外，大鼠野生型IRP-2的全長(zhǎng)氨基酸序列在SEQ.ID.No.20中列出，可見(jiàn)Guo等人，J.Biol.Chem.27016529(1995)，在此引用作為參考。當(dāng)提及野生型IRP-2蛋白時(shí)，根據(jù)本文內(nèi)容，是指包括SEQ.ID.No.17和/或18中列出的，或者在Guo等人，J.Biol.Chem.270 16529(1995)中所見(jiàn)的野生型IRP-2蛋白，在此引用作為參考。
優(yōu)選地，多肽實(shí)施方案至少含有一個(gè)突變，它干擾對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2氨基酸殘基136-216的肽環(huán)內(nèi)半胱氨酸殘基的依賴(lài)鐵的氧化。這種突變可能包括該區(qū)域內(nèi)半胱氨酸殘基的置換或缺失，或干擾肽環(huán)三維結(jié)構(gòu)從而影響IRP-2的依賴(lài)鐵的氧化的突變。一些實(shí)施方案在該肽環(huán)內(nèi)包含多個(gè)突變(例如，一個(gè)以上的半胱氨酸突變)。SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16中列出了幾種突變IRP-2肽。
多肽實(shí)施方案也包括序列表中所示的部分或完整氨基酸序列(SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16)和這些分子的功能相當(dāng)物，包括但不限于含有非保守氨基酸置換的SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的多肽和類(lèi)似于這些分子的擬肽。其它實(shí)施方案包括制備此處所述多肽的方法，和可與這些多肽結(jié)合的分子。實(shí)施方案也包括，例如可識(shí)別野生型和/或突變IRP-2的多克隆和單克隆抗體。優(yōu)選的抗體可與突變IRP-2上的表位結(jié)合，但不與野生型IRP-2上的表位結(jié)合，反之亦然，從而區(qū)別這兩種分子。提供了生產(chǎn)此處所述的單克隆和多克隆抗體的新方法。
診斷實(shí)施方案(包括診斷試劑盒)用來(lái)確定生物(例如昆蟲(chóng)、動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和人)患神經(jīng)變性疾病的傾向。優(yōu)選地，診斷實(shí)施方案用來(lái)確定有阿爾茨海默病危險(xiǎn)的患者?；诤怂岷突诘鞍踪|(zhì)的診斷都包括于本發(fā)明的方面。也就是說(shuō)，某些診斷實(shí)施方案利用可與診斷核酸或蛋白質(zhì)相互作用的探針，通過(guò)檢測(cè)該診斷核酸或蛋白質(zhì)的存在與否，確定患神經(jīng)變性疾病的傾向。診斷核酸可以是，例如編碼野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的核酸。診斷蛋白質(zhì)可以是，例如野生型或突變IRP-2蛋白或其片段。根據(jù)本文內(nèi)容，術(shù)語(yǔ)“探針”指可與診斷核酸或診斷蛋白質(zhì)或其片段相互作用的分子。“探針”的例子包括至少與野生型或突變IRP-2核酸序列(例如人或大鼠IRP-2)的片段互補(bǔ)的核酸，和可與野生型或突變IRP-2蛋白序列(例如人或大鼠IRP-2)上存在的表位相互作用的抗體。優(yōu)選的探針與野生型診斷核酸或診斷蛋白質(zhì)特異相互作用，但不與突變的診斷核酸或診斷蛋白質(zhì)相互作用，反之亦然。
例如，一些診斷實(shí)施方案涉及與載體結(jié)合的試驗(yàn)，測(cè)定野生型或突變IRP-2或其片段與生物樣品中存在的抗體相互作用的能力。所希望的是，野生型或突變IRP-2或其片段以多聚體的方式排列于載體上。優(yōu)選實(shí)施方案包括在對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2的氨基酸殘基136-216的肽環(huán)內(nèi)含有一個(gè)突變的IRP-2或其片段，該突變使IRP-2具有穩(wěn)定性。最優(yōu)選地，與用來(lái)產(chǎn)生多聚劑的載體結(jié)合的IRP-2或其片段至少含有一個(gè)突變，該突變干擾肽環(huán)內(nèi)的半胱氨酸殘基進(jìn)行依賴(lài)鐵的氧化的能力。
實(shí)施方案也包括能用來(lái)確定神經(jīng)變性疾病患者或有患神經(jīng)變性疾病危險(xiǎn)的患者的診斷試劑盒。這些診斷試劑盒可包含與編碼野生型或突變IRP-2蛋白的核酸互補(bǔ)的核酸，或能結(jié)合野生型或突變IRP-2蛋白的抗體(通稱(chēng)為“探針”)。另外，診斷試劑盒也能包含多種用于固定樣品的載體、試劑、酶、檢測(cè)化學(xué)試劑和說(shuō)明。
此處所述的一些診斷方法用于鑒定導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病如AD的鐵代謝缺陷。例如，通過(guò)檢測(cè)編碼IRP-2蛋白的核酸或IRP-2蛋白本身的多態(tài)性，能確定有患神經(jīng)變性疾病危險(xiǎn)的患者。其它診斷方法包括檢測(cè)異常含量或水平的編碼突變IRP-2蛋白的核酸或突變IRP-2。通過(guò)監(jiān)測(cè)IRP-2蛋白不同多態(tài)形式的水平，能進(jìn)行神經(jīng)變性疾病的預(yù)后。通過(guò)一種方法，獲得野生型IRP-2與IRP-2的每種突變形式(或編碼這些分子的核酸)之比，并且根據(jù)與來(lái)自健康和患病個(gè)體的相同比例的對(duì)比分析，進(jìn)行神經(jīng)變性疾病的預(yù)后。另外，也能獲得野生型IRP-2與總突變形式之比，用來(lái)確定患者是否具有患神經(jīng)變性疾病的危險(xiǎn)。下一部分更詳細(xì)地描述了幾種核酸實(shí)施方案。
編碼突變IRP-2多肽的核酸。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)突變IRP-2蛋白家族，能根據(jù)存在至少一個(gè)干擾分子氧化和同時(shí)降解的突變來(lái)鑒定它們。本發(fā)明的核酸實(shí)施方案包括編碼突變IRP-2蛋白及其片段的核苷酸。例如，一些實(shí)施方案包括編碼這些分子的基因組DNA、RNA和cDNA。編碼突變IRP-2蛋白的核酸能存在于多種不同的生物中，包括但不限于昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的核苷酸序列包括，例如(a)序列表中所示的DNA序列(SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15)；(b)編碼序列表所示氨基酸序列(SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16)的核苷酸序列；(c)在嚴(yán)格條件下可與序列表中所示DNA序列(SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15)的互補(bǔ)序列雜交的任一核苷酸序列，例如，在50℃下，在0.5M NaHPO4、7.0％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中與濾紙結(jié)合的DNA雜交，在50℃下用0.2×SSC/0.2％SDS洗滌；(d)在低嚴(yán)格條件下(例如，在37℃下在0.5M NaHPO4、7.0％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中雜交，在37℃下用0.2×SSC/0.2％SDS洗滌)可與編碼序列表中所示氨基酸序列(SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16)的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的任一核苷酸序列。
本發(fā)明的實(shí)施方案也包括從其它生物(例如植物、霉菌、酵母、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳動(dòng)物)中分離的突變IRP-2核酸，無(wú)論該生物是天然存在的還是工程化的。分離其它種的突變IRP-2核酸的方法在下文描述。實(shí)施方案也包括上述序列的片段、修飾、衍生物和變體。例如，希望的實(shí)施方案包括含有突變IRP-2核酸特有的至少9個(gè)連續(xù)堿基的核酸，或與之互補(bǔ)的序列，本發(fā)明的優(yōu)選片段包含突變IRP-2核酸所特有的至少9個(gè)連續(xù)堿基，或與之互補(bǔ)的序列。就此而言，核酸實(shí)施方案可含有9個(gè)至約100個(gè)連續(xù)核苷酸。例如，本發(fā)明的一些DNA片段包括含有突變IRP-2核酸特有的少于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225和240個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸，優(yōu)選地含有SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15的序列或其互補(bǔ)片段提供的區(qū)域。然而優(yōu)選地，核酸實(shí)施方案含有SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15特有序列或其互補(bǔ)片段的至少12、13、14、15、16、17、18或19個(gè)連續(xù)核苷酸。更優(yōu)選地，核酸實(shí)施方案含有SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15特有序列或其互補(bǔ)片段的至少20-30個(gè)連續(xù)核苷酸。
核酸實(shí)施方案也能通過(guò)突變改變，如對(duì)編碼功能相當(dāng)分子的序列進(jìn)行置換、添加或缺失。由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，在一些實(shí)施方案中能使用編碼與SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16所示基本相同的突變IRP-2氨基酸序列的其它DNA序列。包括但不限于含有突變IRP-2核酸的全部或特有部分的核酸序列，或與突變IRP-2核酸的全部或特有部分的核酸，它們由于編碼序列內(nèi)功能相當(dāng)氨基酸殘基(從而產(chǎn)生沉默改變)或功能不相當(dāng)?shù)陌被釟埢?從而產(chǎn)生可檢測(cè)改變)的不同密碼子置換而改變。
上述核酸序列具有生物技術(shù)和診斷用途，例如，用于核酸雜交測(cè)定、Southern和Northern印跡分析等和神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病)的預(yù)后。利用序列表SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15中公開(kāi)的核酸序列，能設(shè)計(jì)并通過(guò)寡核苷酸合成生產(chǎn)與野生型和/或突變IRP-2核酸互補(bǔ)的探針。希望的探針含有與SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列，與SEQ.ID.No.1相比是這些分子特有的。這些探針能用來(lái)篩查來(lái)自同生物(例如植物、霉菌、真菌、酵母、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳動(dòng)物)的cDNA或基因組文庫(kù)，以分離核酸實(shí)施方案的天然來(lái)源。篩查能通過(guò)濾紙雜交進(jìn)行，例如，使用雙份濾紙。標(biāo)記探針優(yōu)選地至少含有一種核酸序列的15-30個(gè)堿基對(duì)，該序列與SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15的核酸序列互補(bǔ)，與SEQ.ID.No.1相比是這些分子特有的。當(dāng)cDNA文庫(kù)與標(biāo)記序列來(lái)源于不同的生物類(lèi)型時(shí)，使用的雜交洗滌條件優(yōu)選地是較低嚴(yán)格性。
對(duì)于突變IRP-2核酸的克隆，例如，能在37℃下在0.5MNaHPO4、7.0％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中雜交過(guò)夜，在37℃下用0.2×SSC/0.2％SDS洗滌。低嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，根據(jù)文庫(kù)和標(biāo)記序列來(lái)源的具體生物可預(yù)測(cè)地改變。這些條件的指南，參見(jiàn)例如Sambrook等人，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港出版社，N.Y.；Ausubel等人，1989，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，Green Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.。
此外，與突變或野生型IRP-2核酸或其部分互補(bǔ)的核酸序列能用來(lái)通過(guò)常規(guī)寡核苷酸合成制備寡核苷酸引物，用于采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其它酶介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)的分離和診斷程序。利用根據(jù)此處公開(kāi)的突變IRP-2基因產(chǎn)物的氨基酸序列設(shè)計(jì)的兩條簡(jiǎn)并寡核苷酸引物組，通過(guò)PCR，能從目的生物分離突變IRP-2核酸。反應(yīng)的模板可以是經(jīng)mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，例如，mRNA從已知或認(rèn)為表達(dá)突變IRP-2 RNA的生物的細(xì)胞或組織制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多種PCR技術(shù)。關(guān)于PCR技術(shù)的綜述，見(jiàn)“遺傳工程分子克隆”，White B.A.編寫(xiě)，《分子生物學(xué)方法》67Humana Press，Totowa(1997)，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考，和書(shū)名為《PCR方法與應(yīng)用》的出版物(1991，冷泉港出版社)，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。
對(duì)于mRNA的擴(kuò)增，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR(RT-PCR)，或如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,770(其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考)所述兩步使用一種酶，都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另一種技術(shù)包括使用反轉(zhuǎn)錄酶不對(duì)稱(chēng)缺口連接酶鏈反應(yīng)(RT-AGLCR)，如Marshall R.L.等人(PCR Methods and Applications 480-84，1994)所述，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。簡(jiǎn)言之，用標(biāo)準(zhǔn)方法從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源中分離RNA。用擴(kuò)增片段5’端特異的寡核苷酸引物作為第一鏈合成的引物，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，用鳥(niǎo)嘌呤對(duì)得到的RNA/DNA雜合體“加尾”。然后用RNAse H消化該雜合體，用poly-C引物引發(fā)第二鏈合成。于是，擴(kuò)增片段上游的cDNA序列容易地分離下來(lái)?？梢圆捎玫目寺〔呗缘木C述見(jiàn)，例如Sambrook等人，1989，同上。
在這些擴(kuò)增方法的任一種中，將欲擴(kuò)增的序列任一端上的引物添加到適當(dāng)制備的核酸樣品中，同時(shí)添加dNTP和熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶、Pfu聚合酶或Vent聚合酶。樣品中的核酸變性，引物與樣品中的互補(bǔ)核酸序列特異雜交。雜交的引物然后延伸。之后啟動(dòng)另一循環(huán)的變性、雜交和延伸。循環(huán)重復(fù)多次，產(chǎn)生在引物位點(diǎn)之間含有該核酸序列的擴(kuò)增片段。PCR在幾篇專(zhuān)利中有進(jìn)一步的描述，包括美國(guó)專(zhuān)利4,683,195、4,683,202和4,965,188，其公開(kāi)內(nèi)容在此引用作為參考。
選擇引物，使之與突變IRP-2核酸特有的SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15核酸序列的一部分基本互補(bǔ)，從而使引物之間的序列擴(kuò)增。優(yōu)選地，引物長(zhǎng)度為16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)核苷酸。穩(wěn)定雜合體的形成取決于DNA的解鏈溫度(Tm)。Tm取決于引物長(zhǎng)度、溶液的離子強(qiáng)度和G+C含量。引物的G+C含量越高，解鏈溫度越高，因?yàn)镚:C對(duì)由三個(gè)H鍵保持，而A:T對(duì)只有兩個(gè)。本發(fā)明的擴(kuò)增引物的G+C含量?jī)?yōu)選地為10-75％，更優(yōu)選地為35-60％，最優(yōu)選地為40-55％。在特定測(cè)定條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定引物的合適長(zhǎng)度。
引物的間距與將要擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度有關(guān)。在本發(fā)明內(nèi)容中，含有編碼突變IRP-2核酸片段的核酸序列的擴(kuò)增片段大小可為至少約25bp-35kb。25-100bp的擴(kuò)增片段是一般的，50-200bp的片段是優(yōu)選的，200-300bp的片段是十分優(yōu)選地。應(yīng)當(dāng)理解，擴(kuò)增引物可以是允許突變IRP-2核酸區(qū)域特異擴(kuò)增的任一序列的引物，例如，能包含修飾如限制位點(diǎn)以利于克隆。
能亞克隆并測(cè)序PCR產(chǎn)物，以確保擴(kuò)增的序列是突變IRP-2基因的序列。然后可通過(guò)多種方法用PCR片段分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，能夠標(biāo)記擴(kuò)增的片段，并用來(lái)篩查cDNA文庫(kù)，如噬菌體cDNA文庫(kù)。此外，也能用標(biāo)記片段通過(guò)基因組文庫(kù)篩查分離基因組克隆。來(lái)自多種不同生物(特別是人類(lèi))的基因組克隆的鑒定和表征有助于設(shè)計(jì)診斷試驗(yàn)和用于治療和預(yù)防神經(jīng)變性疾病的臨床方案。
此外，也能用從懷疑或已知含有突變IRP-2等位基因的生物中獲得的DNA構(gòu)建基因組文庫(kù)，或能用來(lái)自已知或懷疑表達(dá)突變IRP-2等位基因的組織的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。然后可標(biāo)記正常IRP-2基因或其任何合適的片段，作為探針用于鑒定這些文庫(kù)中的相應(yīng)突變IRP-2等位基因。然而優(yōu)選地，探針與這些突變分子特有的SEQ.ID.No.3、5、7、9、11、13、15序列互補(bǔ)。然后可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法，純化含有突變IRP-2基因序列的克隆，并進(jìn)行序列分析。
另外，也能從懷疑或已知攜帶這種突變等位基因的生物中已知或懷疑表達(dá)突變IRP-2等位基因的組織分離RNA，例如，用該RNA合成的cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。這樣，由推斷的突變細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物能夠表達(dá)，并用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)結(jié)合抗野生型或突變IRP-2基因產(chǎn)物抗體進(jìn)行篩選(篩選技術(shù)參見(jiàn)，例如Harlow，E.和Lane編寫(xiě)，1988，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港出版社，冷泉港)。利用常規(guī)抗體篩選技術(shù)，能從不同生物的表達(dá)文庫(kù)分離野生型和/或突變IRP-2蛋白。如果IRP-2突變產(chǎn)生功能改變的表達(dá)基因產(chǎn)物(例如半胱氨酸的氧化減少)，一組抗突變IRP-2蛋白的多克隆抗體可與突變基因產(chǎn)物高效反應(yīng)。能夠按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法，純化通過(guò)與這些標(biāo)記抗體反應(yīng)檢測(cè)的文庫(kù)克隆，并進(jìn)行序列分析。
實(shí)施方案也包括(a)含有上述任一種突變IRP-2編碼序列和/或其互補(bǔ)序列(即反義)的DNA載體；(b)含有上述任一種突變IRP-2編碼序列的DNA表達(dá)載體，該序列與引導(dǎo)克隆序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接；(c)含有上述任一種突變IRP-2編碼序列的遺傳工程宿主細(xì)胞，該序列與引導(dǎo)克隆序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接。這些重組構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制。此外，重組構(gòu)建體也能整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。這些重組多核苷酸一般含有通過(guò)人工操作半合成或合成產(chǎn)生的突變IRP-2基因組或cDNA多核苷酸。因此，此處提供了含有突變IRP-2序列及其互補(bǔ)序列的重組核酸，它們不是天然存在的。
盡管能使用如天然存在時(shí)的編碼突變IRP-2蛋白的核酸或含有與突變IRP-2基因互補(bǔ)的序列的核酸，但是它們經(jīng)常由于缺失、置換或插入而改變，并可伴有人類(lèi)不存在的序列。在此使用時(shí)，調(diào)節(jié)元件包括但不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)表達(dá)的其它元件。這些調(diào)節(jié)元件包括但不限于巨細(xì)胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體A的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子和酵母α-交配因子的啟動(dòng)子。
另外，也能改造重組突變IRP-2核酸序列及其互補(bǔ)序列，以改變蛋白質(zhì)的加工或表達(dá)。例如，但絕非限制，突變IRP-2基因能與啟動(dòng)子序列和/或核糖體結(jié)合部位組合，或信號(hào)序列能插入編碼序列上游，以使蛋白質(zhì)分泌，從而利于收獲或生物利用。另外，特定核酸也能在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區(qū)中產(chǎn)生變異，和/或形成新的限制位點(diǎn)或破壞現(xiàn)有的限制位點(diǎn)，或更有利于體外修飾。能夠采用本領(lǐng)域周知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson等人，J.Biol.Chem.，2536551(1978)，在此引用作為參考)。
此外，編碼其它蛋白質(zhì)或其它蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的核酸也能與編碼突變IRP-2核酸的核酸連接，產(chǎn)生融合蛋白。編碼融合蛋白實(shí)施方案的核苷酸能編碼，例如，與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或肽(例如谷胱甘肽；Ig Fc域，可提高產(chǎn)生的融合蛋白的穩(wěn)定性和半衰期；或能用作標(biāo)記物的酶、熒光蛋白、發(fā)光蛋白，例如綠色熒光蛋白(“GFP”))融合的全長(zhǎng)突變IRP-2蛋白、截短的突變IRP-2蛋白或突變IRP-2蛋白的肽片段。融合蛋白也可用作生物技術(shù)工具，如下文所述。下一部分描述了幾種多肽實(shí)施方案和制備這些分子的方法。
突變IRP-2多肽突變IRP-2多肽、這些分子的片段和類(lèi)似于這些分子的化學(xué)試劑，包括但不限于擬肽、修飾的IRP-2蛋白及其衍生物或變體，也是實(shí)施方案。突變IRP-2多肽可天然存在，或通過(guò)遺傳工程存在于大量生物中(例如植物、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、其它動(dòng)物、貓、狗、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物)。
上一部分描述的編碼突變IRP-2蛋白或其片段的核酸能用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)操作，產(chǎn)生表達(dá)突變IRP-2蛋白或突變IRP-2蛋白片段的重組構(gòu)建體。這些多肽或其衍生物包括但不限于其一級(jí)氨基酸序列為基本如序列表所示的所有氨基酸序列(SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16)，和長(zhǎng)度至少為3個(gè)氨基酸的SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的片段，包括功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢鎿Q序列內(nèi)的殘基，而產(chǎn)生沉默改變的序列。SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的序列的優(yōu)選片段至少為3個(gè)氨基酸，包含突變IRP-2蛋白特有的氨基酸序列，包括功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢鎿Q序列內(nèi)的殘基，從而產(chǎn)生沉默改變的序列。突變IRP-2肽片段的長(zhǎng)度例如可以短于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100個(gè)氨基酸，只要該肽含有與SEQ.ID.No.2相比，突變IRP-2核酸特有的氨基酸。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括，根據(jù)任一種標(biāo)準(zhǔn)(包括但不限于不能氧化、不能遍在蛋白化、對(duì)蛋白體降解保持穩(wěn)定的能力)判斷，與SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16所述的核苷酸序列編碼的突變IRP-2蛋白功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。這些功能相當(dāng)?shù)耐蛔僆RP-2蛋白包括但不限于上述突變IRP-2核苷酸序列編碼的氨基酸序列內(nèi)氨基酸殘基的添加或置換，但導(dǎo)致沉默改變，從而產(chǎn)生功能相當(dāng)?shù)幕虍a(chǎn)物。例如，實(shí)施方案包括SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的突變IRP-2多肽和SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的片段內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被置換為具有類(lèi)似極性的另一種氨基酸的突變IRP-2蛋白，作為功能相當(dāng)物，產(chǎn)生沉默改變。序列內(nèi)氨基酸的置換物可選自該氨基酸所屬類(lèi)別的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
突變IRP-2多肽能利用本領(lǐng)域周知的技術(shù)通過(guò)化學(xué)合成法(如固相肽合成)制備，如下所述Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149(1964)，Houghten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825132(1985)，Stewart和Young，《固相肽合成》，Pierce Chem Co.，Rockford，IL(1984)，Creighton，1983，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子原理》，W.H.Freeman & Co.，N.Y.，在此引用作為參考。這些多肽能夠合成為在氨基端含或不含甲硫氨酸。突變IRP-2蛋白及其片段能用作天然、純化的突變IRP-2蛋白和突變IRP-2蛋白片段的生物活性或免疫替代物。
突變IRP-2蛋白能夠化學(xué)合成，但利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)能更有效地生產(chǎn)這些多肽。這些方法能用來(lái)構(gòu)建含有突變IRP-2核苷酸序列(例如適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào))的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。此外，能夠編碼突變IRP-2核苷酸序列的RNA也能利用合成儀化學(xué)合成。參見(jiàn)，例如，《寡核苷酸合成》中所述的技術(shù)，1984，Gait，M.J.編寫(xiě)，IRL Press，Oxford，在此引用作為參考。
在幾個(gè)實(shí)施方案中，突變IRP-2蛋白和突變IRP-2蛋白片段在細(xì)胞系中表達(dá)。例如，使一些細(xì)胞表達(dá)SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的IRP-2多肽或SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16的片段。含有這些實(shí)施方案的序列、構(gòu)建體、載體、克隆和其它物質(zhì)方便地可以是富含或分離的形式。在此使用時(shí)，“富含的”是指物質(zhì)的濃度至少是天然濃度(例如)的約2、5、10、100或1000倍，有利的是0.01％(重量)，優(yōu)選地至少約0.1％(重量)。也涉及約0.5％、1％、5％、10％和20％(重量)的富含制劑。術(shù)語(yǔ)“分離的”需要從原始環(huán)境(例如，在天然存在時(shí)，指天然環(huán)境)中取出該物質(zhì)。例如，活動(dòng)物中存在的天然存在的多核苷酸不是分離的，但與天然系統(tǒng)中的一些或全部物質(zhì)分開(kāi)的相同多核苷酸是分離的。這些序列是純化形式也是有利的。術(shù)語(yǔ)“純化的”不需要絕對(duì)純凈；而是一個(gè)相對(duì)定義。例如，分離的蛋白質(zhì)通常純化為根據(jù)考馬斯染色為電泳同質(zhì)的。特別涉及將原材料或天然物質(zhì)純化至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選地2或3個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選地4或5個(gè)數(shù)量級(jí)。
能用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)突變IRP-2蛋白和突變IRP-2蛋白片段。當(dāng)突變IRP-2蛋白或突變IRP-2蛋白片段是可溶性衍生物時(shí)，如果肽或多肽不是分泌的，則可從培養(yǎng)物中回收，即從宿主細(xì)胞中回收，如果肽或多肽由細(xì)胞分泌，則可從培養(yǎng)基中回收。然而，表達(dá)系統(tǒng)也包括原位(即錨定于細(xì)胞膜上)表達(dá)突變IRP-2蛋白和突變IRP-2蛋白片段或其功能相當(dāng)物的工程宿主細(xì)胞。從這些表達(dá)系統(tǒng)中純化或富集突變IRP-2蛋白或其片段能用適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┖椭F(tuán)和本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，當(dāng)不僅保持突變IRP-2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特征重要，而且評(píng)價(jià)生物活性也重要時(shí)，能使用這些工程宿主細(xì)胞本身。
能夠使用的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于微生物，如用含IRP-2核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)；用含突變IRP-2核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(如酵母屬、畢赤酵母屬)；用含突變IRP-2序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或用含突變IRP-2核苷酸序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或攜帶重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其含有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子，痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)的突變IRP-2基因產(chǎn)物的預(yù)期用途能方便地選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)要生產(chǎn)大量這種蛋白質(zhì)，用于生產(chǎn)抗野生型或突變IRP-2蛋白或抗野生型或突變IRP-2蛋白片段的抗體時(shí)，例如，引導(dǎo)易于純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達(dá)的載體是希望的。這類(lèi)載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，EMBO J.，21791(1983)，其中突變IRP-2蛋白或突變IRP-2蛋白片段編碼序列片段能分別連接到載體中，與lacZ編碼區(qū)符合閱讀框，從而產(chǎn)生融合蛋白)；pIN載體(Inouye & Inouye，NucleicAcids Res.，133101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.，2645503-5509(1989))；等等。也能用pGEX載體將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。這些融合蛋白通常是可溶的，通過(guò)吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠，隨后在谷胱甘肽存在下洗脫，能夠從裂解的細(xì)胞中純化。pGEX載體設(shè)計(jì)為含有凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)，使得克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物能從GST部分上釋放。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)外源基因的表達(dá)。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)。突變IRP-2蛋白或突變IRP-2蛋白片段核酸序列能分別克隆到病毒的非必需區(qū)(例如多角體基因)內(nèi)，置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體啟動(dòng)子)控制下。編碼序列的成功插入將使多角體基因失活，產(chǎn)生未包封的重組病毒(即缺乏由多角體基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。然后用這些重組病毒感染草地夜蛾細(xì)胞，插入的基因在其中表達(dá)(例如，見(jiàn)Smith等人，J.Virol.46584(1983)；Smith，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,215,051)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，能采用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。如果用腺病毒作為表達(dá)載體，目的核苷酸序列能與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物(例如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列)連接。然后可通過(guò)體外或體內(nèi)重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組非必需區(qū)(例如E1或E3區(qū))中將產(chǎn)生能在感染宿主中表達(dá)IRP-2基因產(chǎn)物的活重組病毒。(例如，見(jiàn)Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659(1984))。特異起始信號(hào)也是插入的突變IRP-2核苷酸序列有效翻譯所需的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。如果完整的IRP-2基因或cDNA(含有其自身的起始密碼子和相鄰序列)插入適當(dāng)表達(dá)載體中，則不需要其它的翻譯控制信號(hào)。
然而，如果只插入突變IRP-2蛋白編碼序列的一部分，應(yīng)當(dāng)提供外源翻譯控制信號(hào)，也許包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應(yīng)當(dāng)與希望的編碼序列的閱讀框同相，以確保整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是多種來(lái)源的，可以是天然和合成的。含有適當(dāng)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等能提高表達(dá)效率(見(jiàn)Bittner等人，Methods in Enzymol.，153516-544(1987))。
另外，也能選擇宿主細(xì)胞株，其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或以希望的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對(duì)于蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要。不同的宿主細(xì)胞具有特有的和特異的翻譯后加工機(jī)制和蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的修飾。能選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確修飾和加工。為此可使用真核宿主細(xì)胞，它們具有用于一級(jí)轉(zhuǎn)錄物的適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器。這類(lèi)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
對(duì)于重組蛋白的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，能構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的細(xì)胞系。優(yōu)于使用含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，能用受適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)和選擇性標(biāo)記控制的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。外源DNA導(dǎo)入后，工程細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后換為選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記提供選擇抗性，并使細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合到染色體中，生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化灶，然后克隆并增殖為細(xì)胞系。該方法可方便地用于構(gòu)建表達(dá)野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的細(xì)胞系。
能使用大量選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11223(1977))、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Cell 22817(1980))基因能分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中。抗代謝物抗性也能用作篩選下列基因的基礎(chǔ)提供氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567(1980)；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；提供霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))；提供氨基糖甙G418抗性的neo(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501(1981))；和提供潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30147(1984))。
此外，利用對(duì)于所表達(dá)的融合蛋白特異的抗體也能容易地純化任何融合蛋白。例如，Janknecht等人所述的系統(tǒng)能方便地純化人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白(Janknecht等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-8976(1991))。在該系統(tǒng)中，目的基因亞克隆到痘苗重組質(zhì)粒中，使得該基因的開(kāi)放閱讀框與6個(gè)組氨酸殘基組成的氨基端尾翻譯融合。重組痘苗病毒感染的細(xì)胞的提取物加至Ni2+次氮基乙酸-瓊脂糖柱上，用含咪唑的緩沖液選擇性洗脫含組氨酸尾的蛋白質(zhì)。
突變IRP-2基因產(chǎn)物或其片段也能在植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物中表達(dá)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。幾乎所有植物和昆蟲(chóng)種都能表達(dá)這些分子。希望的含野生型或突變IRP-2或其片段的轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)包括，例如芥屬(Arabadopsis)、玉米和衣藻屬(Chlamydomonas)。希望的含野生型或突變IRP-2或其片段的昆蟲(chóng)系統(tǒng)包括，例如黑尾果蠅(D.Melanogaster)和秀麗線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)。任何種的動(dòng)物，包括但不限于兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、小型豬、山羊、狗、貓和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，例如狒狒、猴和黑猩猩，都能用來(lái)生產(chǎn)突變IRP-2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因生物希望地顯示突變IRP-2蛋白或其片段的種系轉(zhuǎn)移。某些轉(zhuǎn)基因生物顯示存在的一個(gè)或多個(gè)IRP-2基因完全敲除或點(diǎn)突變。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基136-216的IRP-2肽環(huán)內(nèi)，優(yōu)選地在SEQ.ID.No.2所示的區(qū)域內(nèi)，在半胱氨酸殘基處至少含有一個(gè)點(diǎn)突變。最優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)施方案含有類(lèi)似于SEQ.ID.No.4、6、8、10、12、14、16所示突變IRP-2片段的突變。
優(yōu)選地利用本領(lǐng)域周知的任何技術(shù)向動(dòng)物中導(dǎo)入突變IRP-2轉(zhuǎn)基因，產(chǎn)生原始轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系，或敲除或替換原有的IRP-2基因。這些技術(shù)包括但不限于原核顯微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,873,191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因向種系內(nèi)的轉(zhuǎn)移(Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-6152(1985))；胚胎干細(xì)胞中的基因打靶(Thompson等人，Cell 56313-321(1989))；胚胎的電穿孔(Lo，Mol Cell.Biol.31803-1814(1983))；和精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等人，Cell 57717-723(1989))；等等。這些技術(shù)的綜述見(jiàn)Gordon，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.115171-229(1989)，在此引用作為參考。
本發(fā)明涉及在所有細(xì)胞中均攜帶突變IRP-2轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及在某些而不是全部細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，即嵌合動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因能整合為單一轉(zhuǎn)基因或串聯(lián)體，例如頭-頭串聯(lián)或頭-尾串聯(lián)。例如，也能按照Lasko等人(Lasko，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896232-6236(1992))所述，將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞型中，并在其中激活。這種細(xì)胞型特異激活所需的調(diào)節(jié)序列取決于特定目的細(xì)胞型，是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。
當(dāng)希望將突變IRP-2基因轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源突變IRP-2基因的染色體部位時(shí)，優(yōu)選基因打靶。簡(jiǎn)言之，當(dāng)采用這種技術(shù)時(shí)，設(shè)計(jì)含有與內(nèi)源突變IRP-2基因同源的某些核苷酸序列的載體，用于通過(guò)與染色體序列同源重組整合到內(nèi)源突變IRP-2基因的核苷酸序列中，并破壞其功能。例如，也能按照Gu等人(Gu等人，Science 265103-106(1994))所述，將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞型中，從而只滅活此細(xì)胞型中的內(nèi)源突變IRP-2基因。這種細(xì)胞型特異滅活所需的調(diào)節(jié)序列取決于特定目的細(xì)胞型，是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。
待產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，例如，即能利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定重組突變IRP-2基因的表達(dá)。最初的篩選能用Southern印跡分析或PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)，用來(lái)分析動(dòng)物組織，測(cè)定是否發(fā)生轉(zhuǎn)基因整合。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平也能用以下技術(shù)測(cè)定，包括但不限于從動(dòng)物獲得的細(xì)胞的Northern印跡分析、原位雜交分析和RT-PCR。表達(dá)突變IRP-2基因的細(xì)胞樣品也能用突變IRP-2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異性抗體免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。
除了天然存在的多肽實(shí)施方案外，產(chǎn)生更希望的細(xì)胞反應(yīng)的衍生或修飾的分子也屬于本發(fā)明的范圍。例如，衍生的突變IRP-2分子可包括這樣一種工程多肽一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基摻入蛋白質(zhì)中，促進(jìn)形成經(jīng)受更強(qiáng)氧化的衍生物。向多肽中導(dǎo)入半胱氨酸殘基能用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
其它實(shí)施方案包括類(lèi)似于突變IRP-2多肽的擬肽。肽生物生產(chǎn)中使用的天然存在的氨基酸都有L-構(gòu)型。使用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型的氨基酸的不同組合，能用常規(guī)合成法制備合成肽。模擬特定肽(如寡肽)的構(gòu)象和希望的特征的合成化合物，在發(fā)現(xiàn)并消除不希望的特征，如柔性(構(gòu)象喪失)和鍵斷裂后，稱(chēng)為“擬肽”(參見(jiàn)，例如，Spatola，A.F.，《氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)與生物化學(xué)》(Weistein，B編寫(xiě))第7卷，267-357，Marcel Dekker，紐約(1983)，它描述了亞甲基硫代生物電子等排體[CH2S]在內(nèi)啡肽類(lèi)似物中作為酰胺替代的用途；Szelke等人，《肽結(jié)構(gòu)與功能，第18屆美國(guó)肽研討會(huì)匯編》(Hruby和Rich編)；579-582，PierceChemical Co.，Rockford III.(1983)，它描述了在來(lái)自血管緊張肽原的6-13八肽中的Leu-Val酰胺鍵處含有亞甲基氨基[CH2NH]和羥基乙烯基[CHOHCH2]生物電子等排體的腎素抑制劑。
擬肽的設(shè)計(jì)和合成一般包括從希望的肽(例如最可能模擬的肽)的氨基酸序列和構(gòu)象數(shù)據(jù)(例如，幾何數(shù)據(jù)，如鍵長(zhǎng)和鍵角)開(kāi)始。然后用這些數(shù)據(jù)確定應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)成擬肽的幾何學(xué)。本領(lǐng)域周知進(jìn)行該步驟的大量方法與技術(shù)，可使用其中任何一種(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)armer，P.S.，《藥物設(shè)計(jì)》(Ariens，E.J.編)第10卷，119-143(AcademicPress，紐約，倫敦，多倫多，悉尼，舊金山)(1980)；Farmer等人，TIPS，9/82，362-365；Verber等人，TINS，9/85，392-396；Kaltenbronn等人，J.Med.Chem.33838-845(1990)；Spatola，A.F.，《氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)與生物化學(xué)》，第7卷，267-357，第5章，“肽骨架修飾含酰胺鍵替代的肽的結(jié)構(gòu)-活性分析。構(gòu)象約束與關(guān)系”(B.Weisten編；Marcell Dekker紐約出版)(1983)；Kemp，D.S.，“擬肽與肽中β-折疊和α-螺旋成核的模板方法”Tibech，第8卷，249-255(1990))。其它描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,288,707；5,552,534；5,811,515；5,817,626；5,817,879；5,821,231；5,874,529。下一部分描述了抗野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的抗體的制備和用途。
抗-IRP-2抗體待IRP-2蛋白或其部分合成或表達(dá)及分離或純化后，能用分離或純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體或此兩者。根據(jù)本文內(nèi)容，術(shù)語(yǔ)“抗體”可包括多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段和由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。可識(shí)別突變或野生型IRP-2蛋白或其片段的抗體具有許多用途，包括但不限于生物技術(shù)用途、治療/預(yù)防用途和診斷用途。
為生產(chǎn)抗體，能通過(guò)注射突變或野生型IRP-2蛋白或保留免疫原性的任一部分、片段或寡肽，免疫不同宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠等。根據(jù)宿主種，能用不同佐劑提高免疫應(yīng)答。這類(lèi)佐劑包括但不限于弗氏、礦物膠，如氫氧化鋁，和表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油狀乳劑、匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)也是有用的佐劑。
用來(lái)誘生特異性抗體的肽可含有至少包含3個(gè)氨基酸，優(yōu)選地至少10-15個(gè)氨基酸的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼突變或野生型IRP-2蛋白片段的短氨基酸片段與另一種蛋白質(zhì)(如匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH))的片段融合，產(chǎn)生該嵌合分子的抗體。盡管能通過(guò)對(duì)小鼠注射對(duì)應(yīng)于突變或野生型IRP-2蛋白序列的合成3-mer、10-mer和15-mer肽生產(chǎn)特異識(shí)別突變或野生型IRP-2蛋白的抗體，但利用重組突變或野生型IRP-2蛋白或其片段能生產(chǎn)更加多樣的一組抗體。
為了生產(chǎn)突變或野生型IRP-2蛋白或其片段的抗體，從轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離基本較純的蛋白質(zhì)。例如，通過(guò)用Amicon過(guò)濾裝置濃縮，將終制品中的多肽濃度調(diào)節(jié)到μg/ml較低的水平。然后能如下制備目的多肽的單克隆或多克隆抗體單克隆抗體能用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體分子的任何一種技術(shù)制備。包括但不限于最早由Koehler和Milstein(Nature 256495-497(1975))描述的雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，Immunol Today 472(1983)；Cote等人，Proc Natl Acad Sci 802026-2030(1983))和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，《單克隆抗體與癌癥治療》，Alan R.Liss Inc，紐約N.Y.，77-96(1985))。另外，也能使用為生產(chǎn)“嵌合抗體”而發(fā)展的技術(shù)，即，小鼠抗體基因與人類(lèi)抗體基因剪接，獲得具有適當(dāng)抗原特異性和生物活性的分子(Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 816851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature 312604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314452-454(1985))。此外，為生產(chǎn)單鏈抗體而描述的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778)也適用于生產(chǎn)對(duì)于突變或野生型IRP-2蛋白特異的單鏈抗體?？贵w也能生產(chǎn)在淋巴細(xì)胞群體中誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生，或者篩查重組免疫球蛋白文庫(kù)或一組高特異性結(jié)合試劑，如Orlandi等人，ProcNatl Acad Sci 863833-3837(1989)，Winter G.和Milstein C，Nature349293-299(1991)所公開(kāi)的。
也能生產(chǎn)含有突變或野生型IRP-2蛋白或其片段的特異結(jié)合部位的抗體片段。例如，這些片段包括但不限于能通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段，能通過(guò)還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。此外，也能構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)，以便快速、簡(jiǎn)單地鑒定具有希望的特異性的單克隆Fab片段(Huse W.D.等人，Science2561275-1281(1989))。
利用一種方法，單克隆抗體如下制備。簡(jiǎn)言之，用產(chǎn)生所選蛋白質(zhì)或肽的少量微生物重復(fù)接種小鼠數(shù)周。殺死小鼠，分離脾臟的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。在聚乙二醇存在下脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，該系統(tǒng)在含氨基喋呤的選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)上培養(yǎng)破壞過(guò)量的未融合細(xì)胞。稀釋成功融合的細(xì)胞，稀釋等份置于微孔板孔中，培養(yǎng)物繼續(xù)生長(zhǎng)。利用免疫測(cè)定法(例如，最早由Engvall，E.，Meth.Enzymol.70419(1980)所述的ELISA，及其衍生方法)檢測(cè)孔上清液中的抗體，鑒定抗體產(chǎn)生克隆。能擴(kuò)增選擇的陽(yáng)性克隆，收獲其單克隆抗體產(chǎn)物備用。單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)程序如Davis，L.等人，《分子生物學(xué)基本方法》Elsevire，紐約，21-2節(jié)所述。
含有一種蛋白質(zhì)的異源表位的抗體的多克隆抗血清能通過(guò)用上述表達(dá)蛋白質(zhì)或其衍生的肽免疫合適的動(dòng)物制備，這些蛋白質(zhì)或肽可以不修飾或修飾，以提高免疫原性。有效的多克隆抗體生產(chǎn)受與抗原和宿主種有關(guān)的多種因素影響。例如，小分子比其它的更傾向于低免疫原性，可能需要使用載體和佐劑。由于接種部位和劑量不同，宿主動(dòng)物也可能不同，不足或過(guò)量的抗原都可導(dǎo)致抗血清效價(jià)降低。在多個(gè)皮內(nèi)部位施用小劑量(ng水平)抗原似乎是最可靠的。一種有效的兔免疫方案可見(jiàn)Vaitukaitis，J.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.33988-991(1971)。
能以固定間隔進(jìn)行加強(qiáng)注射，根據(jù)半定量測(cè)定，例如，用針對(duì)已知濃度抗原的瓊脂雙免疫擴(kuò)散測(cè)定，當(dāng)抗體效價(jià)開(kāi)始下降時(shí)，收集抗血清。參見(jiàn)，例如Ouchterlony，O.等人，《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》第19章，D.Wier編寫(xiě)，Blackwell(1973)?？贵w的穩(wěn)定濃度通常為0.1-0.2mg/ml血清(約12μM)?？寡迮c抗原的親和力根據(jù)制作的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線(xiàn)確定，如Fisher，D.，《臨床免疫學(xué)手冊(cè)》第二版第42章(Rose和Friedman編寫(xiě))Amer.Soc.For Microbiol.，Washington，D.C.(1980)所述。按照任何一種方法制備的抗體制劑都可在測(cè)定生物樣品中攜帶抗原物質(zhì)的濃度的定量免疫測(cè)定中使用；它們也可半定量或定量使用(例如，確定生物樣品中是否存在突變或野生型IRP-2蛋白的診斷實(shí)施方案)。下文列出了制備抗氧化和還原形式的野生型和突變IRP-2的抗體的一個(gè)實(shí)例。下一節(jié)描述了幾種評(píng)價(jià)野生型和突變IRP-2核酸和蛋白的性質(zhì)的IRP-2表征試驗(yàn)。實(shí)施例1描述一種用來(lái)制備和篩選野生型和突變IRP-2特異性抗體的方法，實(shí)施例2描述一種用來(lái)制備和篩選野生型IRP-2特異性抗體的類(lèi)似方法。
IRP-2表征試驗(yàn)術(shù)語(yǔ)“IRP-2表征試驗(yàn)”或“IRP-2功能試驗(yàn)”或“功能試驗(yàn)”包括直接或間接評(píng)價(jià)細(xì)胞中野生型或突變IRP-2核酸或蛋白的存在和野生型或突變IRP-2蛋白與膜結(jié)合、與另一種分子(例如遍在蛋白)相互作用和/或經(jīng)受依賴(lài)鐵的氧化和蛋白體降解的能力的試驗(yàn)。
一些功能試驗(yàn)包括采用多聚劑的結(jié)合試驗(yàn)。多聚劑的一種形式涉及含有置于載體上的野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的產(chǎn)品。這些多聚劑以達(dá)到足夠親和力的形式或方法產(chǎn)生野生型或突變IRP-2蛋白或其片段。含有野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的多聚劑通過(guò)將希望的多肽與大分子載體連接獲得?！拜d體”可以是載體、蛋白質(zhì)、樹(shù)脂、細(xì)胞膜或用來(lái)連接或固定這些分子的任一種大分子結(jié)構(gòu)。固體載體包括但不限于反應(yīng)皿孔壁、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纖維素帶、膜、微粒如乳膠顆粒、動(dòng)物細(xì)胞、Duracyte_、人工細(xì)胞等。野生型或突變IRP-2蛋白或其片段也能與無(wú)機(jī)載體，如二氧化硅材料(例如硅膠、沸石、硅藻土或氨化玻璃)連接，例如，通過(guò)載體上的羥基、羧基或氨基和活性基團(tuán)以共價(jià)鍵連接。
在幾種多聚劑中，大分子載體具有疏水表面，通過(guò)疏水非共價(jià)作用可與野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的一部分相互作用。有時(shí)，載體的疏水表面是一種聚合物，如塑料或疏水基團(tuán)連接的其它任何聚合物，如聚苯乙烯、聚乙烯或聚乙烯基類(lèi)。另外，野生型或突變IRP-2蛋白或其片段能與包括蛋白質(zhì)和寡糖/多糖(例如纖維素、淀粉、糖原、殼聚糖或氨化sepharose)在內(nèi)的載體共價(jià)結(jié)合。在后面這些多聚劑中，分子上的活性基團(tuán)，如羥基或氨基，用來(lái)連接載體上的活性基團(tuán)，以產(chǎn)生共價(jià)鍵。其它多聚劑包括含有化學(xué)激活的其它活性基團(tuán)、以便結(jié)合野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的載體。例如，使用溴化氰激活的基質(zhì)、環(huán)氧樹(shù)脂激活的基質(zhì)、硫凝膠或硫丙基凝膠、硝基苯氯甲酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺氯甲酸酯鍵，或過(guò)環(huán)氧乙烷丙烯酸載體(Sigma)。
此外，在某些實(shí)施方案中，考慮脂質(zhì)體或脂雙層(天然或合成的)作為載體，野生型或突變IRP-2蛋白或其片段通過(guò)脂質(zhì)體工程技術(shù)與膜表面連接，或摻入膜中。通過(guò)一種方法，脂質(zhì)體多聚體載體含有暴露于表面的野生型或突變IRP-2蛋白或其片段。疏水域能與野生型或突變IRP-2蛋白或其片段連接，以便與膜相互作用。
也涉及在野生型或突變IRP-2蛋白或其片段與載體之間插入接頭，如適當(dāng)長(zhǎng)度的接頭(例如，構(gòu)建的類(lèi)似于λ噬菌體柔性區(qū)的“λ接頭”)，以使目的多肽有更大的柔性，從而克服載體存在的任何空間障礙。引起或不引起最佳細(xì)胞反應(yīng)的接頭的合適長(zhǎng)度可通過(guò)在本文詳述的試驗(yàn)中用不同接頭篩查野生型或突變IRP-2蛋白或其片段來(lái)確定。
在其它實(shí)施方案中，上述多聚體載體能連接多聚化野生型或突變IRP-2蛋白或其片段，產(chǎn)生“多聚化的多聚體載體”。例如，利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)串聯(lián)偶聯(lián)兩個(gè)或多個(gè)多肽，能獲得多聚化配體。野生型或突變IRP-2蛋白或其片段的多聚形式對(duì)于許多用途可能是有利的，因?yàn)樗鼈兙哂蝎@得較高親和力的試劑的能力。在構(gòu)成多聚化試劑的各個(gè)域之間摻入接頭或間隔區(qū)，如柔性λ接頭，對(duì)于某些實(shí)施方案也是有利的。插入適當(dāng)長(zhǎng)度的λ接頭能使分子具有更大的柔性，并且能克服空間障礙。類(lèi)似地，在多聚化野生型或突變IRP-2蛋白或其片段與載體之間插入接頭能產(chǎn)生更大的柔性，并限制載體表現(xiàn)的空間障礙。利用隨野生型或突變IRP-2蛋白或其片段上的表位的抗體不同而不同的接頭篩選野生型或突變IRP-2蛋白或其片段，能確定適當(dāng)長(zhǎng)度的接頭。實(shí)施例3描述一種將按照實(shí)施例1或2制備的抗-IRP抗體與珠連接的方法。
因此，鑒定可與野生型或突變IRP-2蛋白或其片段相互作用的試劑的幾種方法使用與載體結(jié)合的上述試劑。在獲得與載體結(jié)合的試劑后，例如，使分子(例如抗體或遍在蛋白)接觸與載體結(jié)合的試劑，直接(例如，利用標(biāo)記抗體或遍在蛋白)或間接(例如，利用針對(duì)抗-IRP-2抗體或遍在蛋白的標(biāo)記抗體)測(cè)定其結(jié)合。在某些試驗(yàn)中，希望氧化或還原與載體結(jié)合的野生型或突變IRP-2，之后使其接觸結(jié)合配偶體如遍在蛋白。這種氧化能在足夠濃度的鐵(例如FeCl3)存在下完成，但技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解氧化與載體結(jié)合的IRP-2蛋白或其片段的其它多種方法。Iwai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，954924(1998)描述了一種氧化IRP-2的方法，在此引用作為參考。
在一種表征試驗(yàn)中，例如，將載體結(jié)合的突變IRP-2肽進(jìn)行氧化和遍在蛋白化的能力與載體結(jié)合的野生型IRP-2肽進(jìn)行氧化和遍在蛋白化的能力相比較。通過(guò)一種方法，在50:M FeCl3和10mM DTT存在下，在20∶1反應(yīng)混合液(25mM Hepes-NaOH，pH7.2和40mMKCl)中，以0.1:g/:l蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行載體結(jié)合的IRP-2的氧化，37℃15-30分鐘。在某些實(shí)施方案中，希望使用1mM的Tris-羧乙基-膦(TCEP)代替DTT還原二硫化物。特別是，當(dāng)希望是還原的IRP-2時(shí)，優(yōu)選地，在不含鐵的反應(yīng)混合液中使用1mM TCEP，37℃15-30分鐘。
得到氧化和/或還原的IRP-2后，體外遍在蛋白化測(cè)定能如下進(jìn)行。氧化和/或還原的載體結(jié)合的野生型或突變IRP-2添加到400:gRD4 S100裂解液、5mM MgCl2、2mM ATP、2mM DTT、6:g遍在蛋白、25mM Tris-Cl(pH7.6)和60mM KCl中，5分鐘。加入冰冷的含1％NP-40、0.5％去氧膽酸鹽、50mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl和0.1％SDS的緩沖液終止反應(yīng)。用該緩沖液洗滌載體結(jié)合的偶聯(lián)物3次；在洗滌之間以1500×g離心珠。珠在2×Laemmeli緩沖液中煮沸10分鐘，在適當(dāng)SDS PAGE(例如6％-15％)上分離。分離的蛋白質(zhì)通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移到膜上，利用親和純化的多克隆或單克隆抗遍在蛋白抗體，通過(guò)Western印跡法能證實(shí)遍在蛋白的存在。該試驗(yàn)可證實(shí)氧化的和還原的突變和野生型IRP-2與遍在蛋白相互作用的能力。
利用另一種方法氧化載體結(jié)合的野生型和突變IRP-2肽(例如暴露于H2O2或鐵)，測(cè)定載體結(jié)合的試劑與放射標(biāo)記的遍在蛋白相互作用的能力。對(duì)照包括用TCEP還原的載體結(jié)合的試劑。例如，載體結(jié)合的野生型和突變IRP-2蛋白的等份在含有蛋白酶和異肽酶抑制劑混合物(5mM EDTA，10μM氯高鐵血紅素，1mM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氯，1mM E-64，2μg/ml抑酶肽和10mM碘乙酰胺)的50mMTris-HCl(pH7.6)中暴露于0.02M、0.05M、0.07M和0.1M H2O25、10、15、30分鐘。然后，使試驗(yàn)終體積為50μl，含有50mM Tris-HCl(pH7.6)，5mM MgCl2，1mM DTT，2mM AMP-PNP，2μg125I-遍在蛋白，約106cpm，1μM遍在蛋白醛和30μl載體結(jié)合的IRP-2(約10mg蛋白質(zhì)/ml)。
在37℃下溫育20分鐘后，載體結(jié)合的IRP-2-遍在蛋白偶聯(lián)物以1500×g離心30秒，用50mM Tris-HCl(pH7.6)，5mM MgCl2，1mMDTT，2mM AMP-PNP洗滌。洗滌重復(fù)3次。與載體結(jié)合的IRP-2相關(guān)的放射性能通過(guò)閃爍法測(cè)定。該方法直接檢測(cè)能與突變或野生型IRP-2多肽結(jié)合的遍在蛋白的量。
此外，也能通過(guò)添加50μl 2×Laemmli緩沖液并在100℃下煮沸10分鐘終止上述反應(yīng)。隨后，在15％SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)。通過(guò)電印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍上，干燥該膜。膜暴露于膠片2-4天，隨后用抗-IRP-2抗體進(jìn)行Northern印跡分析。例如，可用與金或辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體完成結(jié)合抗體的檢測(cè)。這樣，遍在蛋白和IRP-2蛋白都可檢測(cè)。遍在蛋白偶聯(lián)物的水平也能通過(guò)放射自顯影照片密度測(cè)定法定量。
另外也能進(jìn)行基于細(xì)胞的表征試驗(yàn)。例如，能轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，使之表達(dá)突變和/或野生型IRP-2蛋白(參見(jiàn)，例如Samaniego等人，J.Biol.Chem.26930904(1994)，在此引用作為參考，關(guān)于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞表達(dá)野生型IRP-2的方法)。篩選轉(zhuǎn)化子后，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞等份置于氧化應(yīng)激下。一種方法是，通過(guò)將培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的濃度提高到400:g/ml引發(fā)氧化應(yīng)激。另一種方法是，在含0.1mM H2O2、不含血清和酚紅的培養(yǎng)基中30分鐘，實(shí)現(xiàn)對(duì)氧化應(yīng)激的暴露。立即收集細(xì)胞，或在H2O2或不含鐵的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使它們從氧化應(yīng)激中恢復(fù)。除了培養(yǎng)基中不含H2O2或鐵之外，與暴露細(xì)胞幾乎完全一樣地處理對(duì)照細(xì)胞。細(xì)胞暴露于H2O2或鐵之后的生存力可通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鹽染色監(jiān)測(cè)。也能測(cè)定還原谷胱甘肽的水平。此外，也能按照廠商說(shuō)明，用生物發(fā)光體細(xì)胞測(cè)定試劑盒(Sigma)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的ATP水平。
在暴露于0.1mM H2O2或鐵30分鐘后收集細(xì)胞，在含有蛋白酶和異肽酶抑制劑混合物(5mM EDTA，10μM氯高鐵血紅素，1mM 4-(2-氨乙基)苯磺酰氯，1mM E-64，2μg/ml抑酶肽和10mM碘乙酰胺)的50mM Tris-HCl(pH7.6)中勻漿。在SDS-PAGE(8％)分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素后，用親和純化的遍在蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體探針雜交該印跡，隨后與125I-蛋白A溫育。遍在蛋白和遍在蛋白偶聯(lián)物通過(guò)放射自顯影檢測(cè)，并通過(guò)圖像分析定量。
此外也可收集細(xì)胞并在50mM Tris，1mM DTT(pH7.6)中勻漿。細(xì)胞上清液中的遍在蛋白偶聯(lián)物活性定量為催化內(nèi)源蛋白質(zhì)底物與外源125I-標(biāo)記的遍在蛋白形成偶聯(lián)物的能力。該試驗(yàn)在50μl終體積中進(jìn)行，含有50mM Tris-HCl(pH7.6)，5mM MgCl2，1mM DTT，2mM AMP-PNP，2μg125I-遍在蛋白，約106cpm，1μM遍在蛋白醛，和30μl細(xì)胞上清液(10mg蛋白質(zhì)/ml)。添加30μl細(xì)胞上清液開(kāi)始反應(yīng)。在37℃下溫育20分鐘后，加入50μl 2×Laemmi緩沖液終止反應(yīng)。在100℃下煮沸10分鐘后，經(jīng)15％SDS-PAGE分離20μl混合液中的蛋白質(zhì)。進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其中AMP-PNP替換為4.5單位的己糖激酶和12mM 2-去氧葡糖。干燥凝膠后，暴露于膠片2-4天。遍在蛋白偶聯(lián)物的水平能通過(guò)放射自顯影照片密度測(cè)定法定量。利用上述表征試驗(yàn)，能輕易地測(cè)定突變和野生型IRP-2蛋白進(jìn)行氧化和遍在蛋白化的能力(參見(jiàn)，Shang等人，J.Biol.Chem.27223086(1997)，在此引用作為參考，關(guān)于適于IRP-2-遍在蛋白偶聯(lián)物分析的多種遍在蛋白測(cè)定法)。
根據(jù)此處公開(kāi)內(nèi)容，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些試驗(yàn)?zāi)苡脕?lái)評(píng)價(jià)所選擇的不同IRP-2蛋白形式對(duì)于蛋白體降解的能力，并提出與神經(jīng)變性疾病有關(guān)的IRP-2形式。在下面的內(nèi)容中，描述了幾個(gè)診斷實(shí)施方案。
診斷實(shí)施方案診斷實(shí)施方案一般能根據(jù)是基于核酸還是基于蛋白質(zhì)的試驗(yàn)來(lái)歸類(lèi)。一些診斷試驗(yàn)檢測(cè)IRP-2核酸或蛋白質(zhì)中導(dǎo)致氧化、遍在蛋白化和蛋白體降解異常的突變或多態(tài)性。其它診斷試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)與患病生物中的突變和/或野生型IRP-2 RNA或蛋白水平相似的待測(cè)生物中的突變和/或野生型IRP-2 RNA或蛋白水平，或通過(guò)檢測(cè)與患病生物中的突變和/或野生型IRP-2 RNA或蛋白水平不同的待測(cè)生物中的突變和/或野生型IRP-2 RNA或蛋白水平，鑒定并區(qū)別氧化、遍在蛋白化和蛋白體降解的缺陷。
另外也涉及含有下列實(shí)施方案所述的試劑和方法的試劑盒的生產(chǎn)，以便快速檢測(cè)和確定神經(jīng)變性疾病。該診斷試劑盒可包含核酸探針或抗體或其組合，它特異檢測(cè)突變或野生型IRP-2核酸或蛋白或核酸探針或抗體或其組合，它們能用來(lái)測(cè)定野生型或突變IRP-2的RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)水平。這些試劑盒的檢測(cè)成分一般與一種或多種下列試劑一起提供。一般也提供能吸附或以其它方式結(jié)合DNA、RNA或蛋白質(zhì)的載體?？刹捎玫妮d體包括硝酸纖維素膜、尼龍或衍生尼龍，其特征在于攜帶正電取代基的陣列。也能提供一種或多種限制酶、對(duì)照試劑、緩沖液、擴(kuò)增酶、非人類(lèi)多核苷酸，如小牛胸腺或鮭精DNA，以及描述如何用試劑盒工具診斷神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病)的一套說(shuō)明。
基于核酸的有效診斷技術(shù)包括但不限于直接DNA測(cè)序、Southern印跡分析、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、RNAse保護(hù)試驗(yàn)、點(diǎn)印跡分析、核酸擴(kuò)增和這些方法的組合。這些分析的起點(diǎn)是從生物樣品中分離或純化的核酸。應(yīng)當(dāng)理解，患者血液是合適的生物樣品。此外，如果用診斷試驗(yàn)確定突變或多態(tài)性IRP-2的存在與否，則任何DNA來(lái)源都能用作生物樣品，包括但不限于毛發(fā)、頰細(xì)胞和皮膚細(xì)胞。使用對(duì)應(yīng)于編碼氨基酸殘基的DNA側(cè)翼區(qū)域的引物，從樣品中提取核酸，并利用對(duì)應(yīng)于編碼氨基酸殘基的DNA側(cè)翼區(qū)的引物，通過(guò)DNA擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，這些氨基酸殘基被認(rèn)為是引起氧化、遍在蛋白化和蛋白體降解缺陷的多態(tài)性，因而提供神經(jīng)變性疾病的預(yù)后。
從待測(cè)個(gè)體中獲得足量的DNA后，即能用幾種方法檢測(cè)IRP-2多態(tài)性。直接DNA測(cè)序，無(wú)論是手工測(cè)序還是自動(dòng)熒光測(cè)序，都能檢測(cè)這些序列變化。另一種方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性測(cè)定(SSCA)(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862776-2770(1989)，在此引用作為參考)。然而該方法不能檢測(cè)所有序列變化，特別是在DNA片段大小超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)時(shí)，但能優(yōu)化檢測(cè)大多數(shù)DNA序列變化。
檢測(cè)靈敏度降低是一個(gè)缺點(diǎn)，但SSCA可能引起的通量提高使其成為進(jìn)行突變檢測(cè)的直接測(cè)序的有吸引力的可行備選方法。然后對(duì)在SSCA凝膠上遷移率改變的片段測(cè)序，以確定DNA序列變化的確切性質(zhì)?；跈z測(cè)兩條互補(bǔ)DNA鏈間錯(cuò)配的其它方法包括夾板變性凝膠電泳(CDGE)(Sheffield等人，Am.J.Hum.Genet.49699-706(1991))、異源雙鏈分析(HA)(White等人，Genomics 12301-306(1992))和化學(xué)錯(cuò)配切割(CMC)(Grompe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865855-5892(1989))。關(guān)于當(dāng)前使用的檢測(cè)DNA序列變化的方法的綜述可見(jiàn)Grompe，Nature Genetics 5111-117(1993)。
下面描述了7種眾所周知的基于核酸的方法，用于證實(shí)多態(tài)性的存在。只是出于舉例目的，而非限制本發(fā)明的任何方面，這些方法包括(1)單鏈構(gòu)象分析(SSCA)(Orita等人)；(2)變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell等人，Nucl.AcidsRes.182699-2705(1990)和Sheffield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86232-236(1989))，均在此引用作為參考；(3)RNAse保護(hù)試驗(yàn)(Finkelstein等人，Genomics 7167-172(1990)，Kinszler等人，Science 2511366-1370(1991))，均在此引用作為參考；(4)可識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)的用途，如大腸桿菌mutS蛋白(Modrich，Ann.Rev.Genet.25229-253(1991))，在此引用作為參考；(5)等位基因特異的PCR(Rano和Kidd，Nucl.Acids Res.178392(1989)，在此引用作為參考)，包括使用3，端可與多態(tài)性雜交的引物，如果不存在多態(tài)性，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；(6)耐擴(kuò)增突變系統(tǒng)(ARMS)，如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?332435和Newton等人，Nucl.Acids Res.172503-2516(1989)所公開(kāi)的，在此引用作為參考；(7)時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(TTGE)，如U.S./E.G.報(bào)告2103中Bio-Rad所述，在此引用作為參考。
在SSCA、DGGE、TTGE和RNAse保護(hù)試驗(yàn)中，當(dāng)存在多態(tài)性時(shí)，出現(xiàn)一條新的電泳帶。SSCA和TTGE可檢測(cè)由于序列改變導(dǎo)致單鏈分子內(nèi)堿基配對(duì)不同因而遷移率不同的帶，這可通過(guò)電泳檢測(cè)。RNAse保護(hù)包括將突變多核苷酸切割為兩個(gè)或多個(gè)較小的片段。DGGE用變性梯度凝膠檢測(cè)序列遷移率的差異。在等位基因特異的寡核苷酸測(cè)定(ASOs)(Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80278-282(1983))中，設(shè)計(jì)一種寡核苷酸檢測(cè)特異序列，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)存在與否進(jìn)行測(cè)定。在mutS試驗(yàn)中，蛋白質(zhì)只與在多態(tài)性與非多態(tài)性序列的異源雙鏈體中含有核苷酸錯(cuò)配的序列結(jié)合。錯(cuò)配是指雜交的核酸雙鏈體，其中兩條鏈不是100％互補(bǔ)。缺乏總同源性是由于從生物樣品獲得的擴(kuò)增子中存在一種或多種多態(tài)性，例如，與非多態(tài)性鏈雜交的。錯(cuò)配檢測(cè)能用來(lái)檢測(cè)DNA或mRNA中的點(diǎn)突變。盡管這些技術(shù)比測(cè)序靈敏度低，但它們易于對(duì)大量生物樣品進(jìn)行，并適于陣列技術(shù)。
在某些實(shí)施方案中，可鑒別編碼野生型IRP-2與編碼突變IRP-2的多核苷酸的核酸探針以規(guī)則的陣列與載體結(jié)合，其中該核酸探針與載體上彼此不重疊的不同區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選地，這種規(guī)則陣列設(shè)計(jì)為“可編址的”，在此記錄探針的不同位置，并能作為測(cè)定程序的一部分接近。這些探針與載體在不同的已知位置連接。了解每個(gè)核酸探針的精確位置使這些“可編址的”陣列特別可用于結(jié)合測(cè)定。然后用常規(guī)方法(例如放射或熒光)標(biāo)記來(lái)自幾種生物樣品的核酸，標(biāo)記樣品在允許雜交的條件下添加到陣列上。
如果樣品中的核酸與陣列上的探針雜交，將在載體上對(duì)應(yīng)于雜合體位置的位置處檢測(cè)到信號(hào)。由于每種標(biāo)記樣品的種類(lèi)已知，添加標(biāo)記樣品的載體區(qū)域已知，因此能快速確定多形變體的存在。利用高通量診斷或檢測(cè)分析領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，這些方法可自動(dòng)化。
另外也能使用與上述相反的一種方法。生物樣品中存在的核酸可置于載體上，以產(chǎn)生可編址的陣列。優(yōu)選地，樣品置于載體上不重疊的已知位置。應(yīng)用與編碼多態(tài)性的核酸互補(bǔ)的標(biāo)記核酸探針，并檢測(cè)陣列上對(duì)應(yīng)于放置生物樣品的位置處是否有信號(hào)，檢測(cè)每種樣品中是否存在具有希望的多態(tài)性的核酸。因?yàn)樯飿悠返姆N類(lèi)及其在陣列上的位置已知，能快速鑒定多態(tài)性變體。利用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，這些方法也可自動(dòng)化。
本發(fā)明此方面能使用本領(lǐng)域周知的任何可編址陣列技術(shù)。多核苷酸陣列的一個(gè)具體實(shí)施方案稱(chēng)為GenechipTM，在美國(guó)專(zhuān)利5,143,854、PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O 90/15070和92/10092中概述。這些陣列一般用機(jī)制合成法或光導(dǎo)合成法生產(chǎn)，它們包括光能法(photolithographic)和固相寡核苷酸合成法的組合(Foodor等人，Science，251767-777(1991))。一般稱(chēng)為“極大規(guī)模固相聚合物合成”(VLSPISTM)的技術(shù)的發(fā)展，使得在固體載體上固定寡核苷酸陣列成為可能，其中探針一般固定于芯片固體表面的高密度陣列中。美國(guó)專(zhuān)利5,143,854和5,412,087和PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O 90/15070、WO 92/10092和WO 95/11995中提到了VLSPISTM技術(shù)的實(shí)例，它們描述了通過(guò)如光導(dǎo)合成技術(shù)等的技術(shù)形成寡核苷酸陣列的方法。在旨在產(chǎn)生固定于固體載體上的核苷酸陣列的設(shè)計(jì)策略中，發(fā)展了其它呈現(xiàn)策略，以在芯片上排列和顯示寡核苷酸陣列，試圖使雜交模式和診斷信息最大化。PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O 94/12305、WO 94/11530、WO97/29212和WO 97/31256公開(kāi)了這些呈現(xiàn)策略的實(shí)例。
本領(lǐng)域技術(shù)人員周知多種標(biāo)記物和偶聯(lián)技術(shù)，能在多種核酸測(cè)定中使用。產(chǎn)生用于雜交或PCR的標(biāo)記核酸有幾種方法，包括但不限于寡標(biāo)記、切口平移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增。此外，為了生產(chǎn)mRNA探針，也能將編碼IRP-2的核酸能克隆到載體中。這些載體在本領(lǐng)域中周知，可以購(gòu)得，能用來(lái)通過(guò)添加適當(dāng)RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和標(biāo)記核苷酸，在體外合成RNA探針。許多公司，如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和U.S.Biochemical Corp(ClevelandOhio)，供應(yīng)商品試劑盒和這些方法的方案。合適的報(bào)道分子或標(biāo)記物包括放射性核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光或發(fā)色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。
如上簡(jiǎn)述，RNAse保護(hù)法是適用于陣列技術(shù)的錯(cuò)配切割技術(shù)的一個(gè)實(shí)例。優(yōu)選地，該方法包括使用與多態(tài)性IRP-2序列互補(bǔ)的標(biāo)記核酸探針(riboprobe)。然而，該方法可包括使用與含有野生型基因的IRP-2序列互補(bǔ)的標(biāo)記核酸探針。從生物樣品中分離、擴(kuò)增的核酸探針和mRNA或DNA退火(雜交)，隨后用RNAse A酶消化，這能檢測(cè)雙鏈RNAse結(jié)構(gòu)中的錯(cuò)配。如果用RNAse A檢測(cè)到錯(cuò)配，則樣品中不含多態(tài)性變體，酶在錯(cuò)配位點(diǎn)切割并破壞核酸探針。因此，當(dāng)在電泳凝膠基質(zhì)上分離退火的RNA時(shí)，如果檢測(cè)到錯(cuò)配并被RNAse A切割，將得到比全長(zhǎng)雙鏈RNA(核酸探針)和mRNA或DNA小得多的RNA產(chǎn)物。
核酸探針的互補(bǔ)體也能分散于陣列上，并在變性剩余的任何雜合體后用Rnase A消化產(chǎn)物嚴(yán)格探針雜交。在這種情況下，如果檢測(cè)到錯(cuò)配并且探針被Rnase A破壞，陣列上的互補(bǔ)體將與降解的RNA在嚴(yán)格條件下退火。DNA探針能以一種類(lèi)似的方式通過(guò)酶或化學(xué)切割檢測(cè)錯(cuò)配。參見(jiàn)，例如Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA854397(1988)；Shenk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72989(1975)；Novack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83586(1986)。也能根據(jù)錯(cuò)配雙鏈體相對(duì)于配對(duì)雙鏈體的電泳能力的改變檢測(cè)錯(cuò)配(參見(jiàn)，例如Cariello，Human Genetics 42726(1988)，在此引用作為參考)。在雜交前，能利用上述任一種技術(shù)，PCR擴(kuò)增來(lái)自待測(cè)生物的對(duì)應(yīng)于多態(tài)性IRP-2區(qū)域的mRNA或DNA。
利用常規(guī)試驗(yàn)也能檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品中是否存在IRP-2多態(tài)性或野生型序列。例如，能用對(duì)IRP-2多態(tài)性有免疫反應(yīng)性的抗體篩查生物樣品，確定神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病)的傾向。另外，也能用區(qū)別野生型IRP-2與突變IRP-2的抗體確定一種生物沒(méi)有神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病)的傾向。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用抗體從溶液中免疫沉淀IRP-2的野生型或突變形式，或者用抗體與Western或免疫印跡上的野生型或突變IRP-2反應(yīng)。優(yōu)選的診斷實(shí)施方案也包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫放射測(cè)定(IRMA)和免疫酶測(cè)定(IEMA)，包括采用單克隆和/或多克隆抗體的夾心測(cè)定。David等人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,376,110和4,486,530中描述了典型夾心測(cè)定，在此引用作為參考。其它實(shí)施方案采用美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,290,678、5,604,105、5,710,008、5,744,358和5,747,274中公開(kāi)的免疫條紋技術(shù)，在此引用作為參考。
在另一種優(yōu)選的基于蛋白質(zhì)的診斷中，本發(fā)明的抗體以規(guī)則陣列與載體結(jié)合，其中大量抗體與載體上彼此不重疊的不同區(qū)域結(jié)合。如基于核酸的測(cè)定一樣，基于蛋白質(zhì)的陣列是規(guī)則的陣列，它被設(shè)計(jì)為“可編址的”，以便記錄不同的位置，并能作為測(cè)定程序的一部分接近。這些探針在不同的已知位置與載體連接。了解每個(gè)核酸探針的精確位置使這些“可編址的”陣列特別可用于結(jié)合測(cè)定。例如，一種可編址的陣列可包含一種載體，該載體含有的幾個(gè)區(qū)域與特異識(shí)別特定IRP-2蛋白并能區(qū)別突變和野生型IRP-2蛋白的大量抗體探針連接。
因此，從生物樣品獲得蛋白質(zhì)，并用常規(guī)方法(例如放射、比色或熒光)標(biāo)記。在允許結(jié)合的條件下將標(biāo)記樣品添加到陣列上。如果樣品中的蛋白質(zhì)與陣列上的抗體探針雜交，則在載體上對(duì)應(yīng)于抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物的位置處能檢測(cè)到信號(hào)。由于每種標(biāo)記樣品的種類(lèi)已知，添加標(biāo)記樣品的載體區(qū)域已知，因此能快速確定其存在、濃度和/或表達(dá)水平。即，利用已知濃度的標(biāo)記的突變或野生型IRP-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)，研究人員能精確測(cè)定特定待測(cè)樣品中IRP-2蛋白的蛋白質(zhì)濃度，也能估計(jì)特定IRP-2蛋白形式的表達(dá)水平。也能利用常規(guī)密度測(cè)定法更精確地測(cè)定特定IRP-2蛋白的濃度或表達(dá)水平。利用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，這些方法可自動(dòng)化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，也能使用與上述相反的一種方法。生物樣品中存在的蛋白質(zhì)可置于載體上，產(chǎn)生可編址的陣列。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)樣品置于載體上不重疊的已知位置。利用可識(shí)別突變或野生型IRP-2蛋白特異性表位的標(biāo)記抗體探針，檢測(cè)每種樣品中是否存在編碼突變或野生型IRP-2蛋白的蛋白質(zhì)。因?yàn)樯飿悠返姆N類(lèi)及其在陣列上的位置已知，能快速確定特定多態(tài)性的存在、濃度和/或表達(dá)水平。
即，利用已知濃度的標(biāo)記的突變和/或野生型IRP-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)，研究人員能精確測(cè)定樣品中IRP-2蛋白的濃度，根據(jù)此信息也能估計(jì)特定IRP-2蛋白形式的表達(dá)水平。也能利用常規(guī)密度測(cè)定法更精確地測(cè)定特定IRP-2蛋白的濃度或表達(dá)水平。利用高通量診斷分析領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)，這些方法也可自動(dòng)化。如上詳述，本發(fā)明此方面能采用本領(lǐng)域周知的任何可編址陣列技術(shù)，并在芯片上顯示蛋白質(zhì)陣列，以使抗體結(jié)合模式和診斷信息最大化。
在另一種診斷實(shí)施方案中，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,290,678、5,604,105、5,710,008、5,744,358和5,747,274(在此引用作為參考)中公開(kāi)的免疫條紋技術(shù)適于遞呈可用野生型或突變IRP-2蛋白抗體識(shí)別的抗原。然后用這些抗原遞呈免疫條紋分析生物樣品中是否存在不同IRP-2蛋白形式的抗體。盡管野生型或突變IRP-2肽或蛋白是這些實(shí)施方案優(yōu)選的抗原，但也能使用類(lèi)似于這些分子的擬肽。這些基于擬肽的實(shí)施方案可能具有更強(qiáng)的蛋白酶抗性，可以加上條紋，并用于許多用途。優(yōu)選地，生產(chǎn)基于擬肽的IRP-2陣列(例如，含有類(lèi)似于野生型和突變IRP-2蛋白的擬肽的基因芯片)，用于篩查大量生物樣品。
在另一個(gè)優(yōu)選方法中，從懷疑具有神經(jīng)變性疾病危險(xiǎn)的患者獲取血樣，利用針對(duì)野生型IRP-2蛋白和/或突變IRP-2蛋白上的表位的抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。可以使用利用熒光標(biāo)記第二抗體(例如熒光蛋白偶聯(lián)的山羊抗人IgG)的標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞分析技術(shù)和可購(gòu)得的細(xì)胞固定和透化試劑盒(PermaCyte-FP)。因此，重懸浮的細(xì)胞與抗-IRP-2抗體和二級(jí)抗體反應(yīng)，免疫復(fù)合物通過(guò)，之后進(jìn)行FACS。監(jiān)測(cè)細(xì)胞的熒光分布和量。利用野生型和/或突變IRP-2蛋白特異性抗體，能快速確定不同形式IRP-2蛋白的存在和含量。
如上所述，IRP-2分子中多態(tài)性的存在或檢測(cè)能提供對(duì)神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病)的診斷。其它實(shí)施方案包括制備含有對(duì)于IRP-2特定多態(tài)性變體特異的檢測(cè)成分(如抗體)的診斷試劑盒。該檢測(cè)成分一般與一種或多種下列試劑一起提供。通常也提供能吸收或以其它方式結(jié)合RNA或蛋白質(zhì)的載體。用于此目的的適當(dāng)載體包括但不限于硝酸纖維素膜、尼龍或衍生尼龍，其特征在于攜帶正電取代基的陣列，和GeneChipsTM或其相當(dāng)物。試劑盒中也可配備一種或多種酶，如逆轉(zhuǎn)錄酶和/或Taq聚合酶，以及dNTP、緩沖液或非人類(lèi)多核苷酸，如小牛胸腺或鮭精DNA。試劑盒測(cè)定結(jié)果可由衛(wèi)生人員或診斷實(shí)驗(yàn)室解釋。此外，也能生產(chǎn)診斷試劑盒，出售給私人進(jìn)行自我診斷。
除了根據(jù)IRP-2 DNA、mRNA或蛋白質(zhì)中是否存在多態(tài)性診斷疾病外，一些與IRP-2氧化、遍在蛋白化和蛋白體降解缺陷有關(guān)的神經(jīng)變性疾病是由突變和野生型IRP-2水平下降引起的。通過(guò)監(jiān)測(cè)IRP-2特定形式的表達(dá)水平，例如，能進(jìn)行診斷或確定疾病狀態(tài)。即，許多神經(jīng)變性疾病起因于劑量效應(yīng)，其中仍含過(guò)多的不能進(jìn)行氧化的突變IRP-2。因此，通過(guò)測(cè)定不同IRP-2表達(dá)水平的比例(例如IRP-2表達(dá)模式)，能進(jìn)行健康或疾病的預(yù)后。
因此，確定來(lái)自健康個(gè)體及患神經(jīng)變性疾病個(gè)體的不同樣品的IRP-2表達(dá)水平。這些數(shù)值能記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中，并且可與從待測(cè)個(gè)體獲得的值比較。另外，健康和患病個(gè)體的不同樣品中的IRP-2表達(dá)比例或模式也記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中。這些分析被稱(chēng)為“疾病狀態(tài)譜”，通過(guò)比較一種疾病狀態(tài)譜(例如健康或患病個(gè)體的)與待測(cè)個(gè)體的疾病狀態(tài)譜，醫(yī)生能快速診斷是否患有疾病。含有數(shù)名神經(jīng)變性疾病患者的IRP-2表達(dá)值的數(shù)據(jù)庫(kù)是有價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)，能用它來(lái)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。這樣，標(biāo)準(zhǔn)與生物值之間的偏差就確定了疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度。
上述基于核酸和基于蛋白質(zhì)的診斷技術(shù)能用來(lái)檢測(cè)組織中IRP-2RNA或蛋白的水平或含量或表達(dá)比。通過(guò)定量Northern雜交，原位分析、免疫組化、ELISA、基因芯片陣列技術(shù)、PCR和Western印跡，例如，能快速確定特定IRP-2(野生型或突變的)RNA或蛋白的含量或表達(dá)水平，并從此信息確定表達(dá)比。例如，一種診斷方法包括將大量IRP-2同種型的表達(dá)水平比例與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的方法。為了實(shí)施此方法，獲得神經(jīng)變性疾病患者的生物樣品和正常個(gè)體的生物樣品。然后，測(cè)定樣品中兩種或多種IRP-2蛋白(例如野生型和突變IRP-2)或編碼IRP-2蛋白的核酸的表達(dá)水平，并分析野生型和突變IRP-2表達(dá)比與神經(jīng)變性疾病之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性能用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定，包括t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。
在測(cè)定不同IRP-2分子的水平后，即可將信息記錄于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上，如硬盤(pán)、軟盤(pán)、DVD驅(qū)動(dòng)器、zip驅(qū)動(dòng)器等。在記錄并形成包含所研究的不同IRP-2分子表達(dá)水平的數(shù)據(jù)庫(kù)后，利用一種用來(lái)比較不同IRP-2分子的表達(dá)水平的比較程序獲得表達(dá)比。在第一次比較中，例如，得到野生型IRP-2與突變IRP-2之比。另外，希望的比較可包括但不限于多種形式的突變IRP-2之間和/或與野生型IRP-2之比。實(shí)施例描述了氧化和還原野生型和突變IRP-2特異的抗體的制備。本發(fā)明另一方面涉及一種利用核磁共振成像(MRI)測(cè)定和/或監(jiān)測(cè)不同體內(nèi)狀態(tài)的腦鐵(非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵(NTB)、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵(TBI)和高分子量復(fù)合物，包括鐵蛋白和血鐵黃素)的方法。高分辨率3D梯度回波成像、去除背景場(chǎng)效應(yīng)的相位成像(SWI)(了解T2*信號(hào)損失)和利用特殊自旋回波/梯度回波成像方法提取磁化率結(jié)合，可對(duì)腦鐵進(jìn)行絕對(duì)定量。
A.高分辨率3D梯度回波成像獲得對(duì)小局部場(chǎng)磁化率效應(yīng)的敏感性需要用長(zhǎng)回波時(shí)間成像?？諝?組織界面引起的背景場(chǎng)效應(yīng)使得與這些區(qū)域相鄰的組織的信號(hào)在長(zhǎng)回波時(shí)間內(nèi)顯著損失。如前所述，用極小的三維像素(voxel)能減少沿三維像素的移相，使得背景(或其它)場(chǎng)的相位變化減至小于2π。這種操作使信號(hào)明顯恢復(fù)，當(dāng)過(guò)濾圖像時(shí)，信噪比恢復(fù)到較高分辨率。這些結(jié)果不同于用較低分辨率獲得的結(jié)果。該方法稱(chēng)為轉(zhuǎn)換器效應(yīng)，即MR采集法固有的特殊非線(xiàn)性。在1.5T時(shí)長(zhǎng)達(dá)120ms的回波時(shí)間的相位圖像代表一種顯示組織間磁化率差異的方法。靜脈結(jié)構(gòu)、灰質(zhì)/白質(zhì)磁化率差異和基底神經(jīng)節(jié)中的鐵用這種改良方法可見(jiàn)。
B.相位成像和去除背景場(chǎng)效應(yīng)使用相位成像是開(kāi)始估計(jì)腦組織間存在順磁性(或反磁性)差異的一種自然方法。MR圖像中的相位根據(jù)_＝γΔBT得出，其中γ是回磁比，ΔB是一種組織與另一種組織的磁場(chǎng)改變，t是測(cè)定數(shù)據(jù)的時(shí)間(通常是回波時(shí)間TE)。
顯示這些差異的問(wèn)題是由于空氣/組織界面的背景場(chǎng)效應(yīng)的額外相位效應(yīng)引起的。研制了一種高通量相位濾波器來(lái)除去和要是低空間頻率的背景場(chǎng)效應(yīng)。這種處理技術(shù)顯著改善了相位圖像。該方法已經(jīng)成功用于在功能腦激活過(guò)程中對(duì)腦氧飽和度和氧飽和度的更小改變作圖(即，對(duì)于用于這些實(shí)驗(yàn)的特定3D序列，我們能容易地測(cè)量小至0.03ppm的改變，誤差為0.002)。這意味著，對(duì)于0.025的p值，用該程序能測(cè)量小至0.004的磁化率差異(使用的程序?yàn)?分鐘，3D梯度回波法，TE＝40ms，分辨率為0.5×1.0×2.0mm3)。二次收集這些數(shù)據(jù)并平均，或者平均多次采集的值，以及將數(shù)據(jù)過(guò)濾為較低分辨率，能提高靈敏度。
另一種除去所有線(xiàn)性相位效應(yīng)的方法是使用雙回波法。根據(jù)由背景相位效應(yīng)預(yù)期的相位的簡(jiǎn)單線(xiàn)性依賴(lài)性，用第一回波的相位預(yù)測(cè)第二回波的相位。當(dāng)?shù)谝换夭ǖ南辔沪忙TE1乘以TE2/TE1預(yù)測(cè)γΔBTE2，并從第二回波相位減去預(yù)測(cè)的相位時(shí)(通過(guò)復(fù)雜除法實(shí)現(xiàn))，修正圖像的預(yù)期相位為零，超過(guò)與兩隔(two-compartment)模型有關(guān)的任何非線(xiàn)性效應(yīng)，其中相位效應(yīng)不只是簡(jiǎn)單的相加。該方法允許分離小局部像素效應(yīng)。
C.了解T2*信號(hào)損失最近，對(duì)偶極場(chǎng)(其來(lái)源是三維象素內(nèi)含的小體積)引起的球面三維像素的信號(hào)損失進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。在信號(hào)特征中，長(zhǎng)回波時(shí)間能誘發(fā)明顯的振蕩(即，性質(zhì)上非指數(shù)的信號(hào)改變)。在試圖定量T2*加權(quán)成像中的信號(hào)損失中，發(fā)展了一種理論，可在存在磁化率改變的隨機(jī)分布小局部來(lái)源時(shí)預(yù)測(cè)信號(hào)特征。具體而言，信號(hào)改變?cè)诮咏鼤r(shí)間起點(diǎn)處實(shí)際上不是指數(shù)的，在中間(和長(zhǎng))時(shí)域是指數(shù)。該理論能用來(lái)提取隨機(jī)來(lái)源的體積磁化率，以及三維像素內(nèi)的體積分?jǐn)?shù)。該方法的確切定量性質(zhì)未對(duì)一組隨機(jī)結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。
研究了腦中T1弛豫的依賴(lài)性，表明腦正面區(qū)域的灰質(zhì)T1最長(zhǎng)，而靠近運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的區(qū)域T1值最小。該區(qū)域的灰質(zhì)與白質(zhì)對(duì)比降低。相同區(qū)域的相位測(cè)定顯示相位與鐵含量之間有強(qiáng)相關(guān)性，在運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中最大。本發(fā)明涉及相位與腦鐵含量(是年齡的函數(shù))之間的相關(guān)性。
D.利用特殊自旋回波/梯度回波成像方法提取磁化率為了說(shuō)明背景場(chǎng)在切片或三維像素上的不均一性不是由顯微鏡作用引起的，并消除對(duì)rf脈沖設(shè)計(jì)的任何依賴(lài)性，定義了特殊組織梯度回波和自旋回波采集方法。在自旋回波周?chē)杉幌盗刑荻然夭?，如下除去背景?chǎng)效應(yīng)。最后的梯度回波除以第一個(gè)梯度回波圖像，生成在三維像素上沒(méi)有移相的T2加權(quán)圖像的相當(dāng)圖像。T2已知后，消除T2對(duì)多梯度回波的影響，只留下由T2’引起的原始改變(磁化率的局部來(lái)源引起的信號(hào)改變)。信號(hào)依賴(lài)性可顯示在時(shí)間上具有平方特性，當(dāng)擬合時(shí)，能定量提取磁矩和來(lái)源的體積含量。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，為了研究人和動(dòng)物，在1.5T和4.7T下進(jìn)行MR成像。小至0.004ppm的磁化率差異能用3D梯度回波法測(cè)量，TE＝40ms，分辨率為0.5×1.0×2.0mm3(需要5分鐘掃描時(shí)間)。達(dá)到4.7T，利用小鼠腦表面溝回，獲得約8倍的SNR，三維像素大小減至0.5mm×0.5mm×0.5mm。如果數(shù)據(jù)采集40分鐘，三維像素大小能減至0.25mm×0.25mm×0.25mm，這不是該方案成功的臨界點(diǎn)，但在區(qū)別小鼠腦結(jié)構(gòu)中有益。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及稱(chēng)作模型(phantom)的物質(zhì)的核磁圖像分析(MRI)，它具有已知的磁化率，用于驗(yàn)證MRI以特定幾何學(xué)正確定量鐵含量的能力?？紤]三個(gè)不同的圖形第一，簡(jiǎn)單試管與主磁場(chǎng)平行和垂直地成像；第二，薄平面成像；第三，代表腦實(shí)質(zhì)中許多褶皺的彎曲薄平面成像。這些平面用聚酯薄膜膠片產(chǎn)生，以分離2-3mm厚的層，模擬人腦。這些模型的大小為每邊10cm，模擬人腦，也能適當(dāng)調(diào)節(jié)和填補(bǔ)模型。瓊脂糖凝膠用作填充物，涂以一系列不同濃度的幾種不同的載鐵化合物(首先100nmol/gm，然后從500nmol/gm開(kāi)始，以500nmol/gm的增量，增至2000nmol/gm，共4倍)，用來(lái)模擬腦鐵。用試管形測(cè)定每一成分的磁化率，因?yàn)樵谶@些條件下，幾何圖形對(duì)相位的影響已經(jīng)確定。具體而言，準(zhǔn)備4個(gè)不同的模型類(lèi)型，包括a)FeCl-，b)FeSO4，c)鐵蛋白，d)血鐵黃素。模型實(shí)驗(yàn)可研究鐵濃度對(duì)隨機(jī)系統(tǒng)的影響(預(yù)期低濃度對(duì)信號(hào)損失有指數(shù)影響，而預(yù)期高濃度有更高的幾何依賴(lài)性)。然而，腦結(jié)構(gòu)和鐵濃度似乎沒(méi)有如同溝回相位的一般幾何影響，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)均一，不依賴(lài)于發(fā)生的折疊。這表明為低濃度，因此，是不依賴(lài)于目標(biāo)形態(tài)校正相位的一種簡(jiǎn)單方法。這些實(shí)驗(yàn)?zāi)茉?.5T和4.7T下進(jìn)行，以確保有線(xiàn)性行為，并且從一個(gè)場(chǎng)強(qiáng)到下一個(gè)不需特別校正。因此，模型的成像允許將從MR圖像獲得的磁化性值與每個(gè)模型內(nèi)的已知鐵濃度相關(guān)。能夠測(cè)試具有不同形態(tài)、含有不同濃度的不同鐵分子的模型。在施行前，利用此模型，對(duì)人在1.5T下、對(duì)動(dòng)物在4.7T下進(jìn)行程序優(yōu)化。本發(fā)明涉及一種用于動(dòng)物和人的鐵定量方法，用于監(jiān)測(cè)阿爾茨海默病腦中鐵隨時(shí)間的改變。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及對(duì)積累腦鐵并證實(shí)患神經(jīng)變性疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠的核磁共振圖像分析，用于驗(yàn)證MRI技術(shù)。編碼鐵調(diào)節(jié)蛋白-2(IRP-2)缺失的工程轉(zhuǎn)基因小鼠已知積累顯著水平的神經(jīng)元鐵(La Vaute 2001)。轉(zhuǎn)基因小鼠在6個(gè)月以?xún)?nèi)發(fā)作神經(jīng)變性癥狀，一般表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、前庭功能障礙、震顫和體位異常(La Vaute2001)。優(yōu)選地，小鼠保持于24小時(shí)光-暗日程，可自由獲得固形食物和水。此外，觀察小鼠的皮膚、口粘膜、行為和神經(jīng)指征，每周稱(chēng)重一次。對(duì)顯示異常行為的動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。以選擇的間隔，通過(guò)異氟醚吸入(4％誘發(fā)，1％保持)麻醉動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)成像，然后置于MRI相容的立體定向裝置中。連續(xù)監(jiān)測(cè)直腸溫度，用置于動(dòng)物下的溫水盤(pán)管保持37±0.5℃。
為了用優(yōu)化MRI程序精確關(guān)聯(lián)新的成像發(fā)現(xiàn)，對(duì)4組小鼠成像。本發(fā)明涉及根據(jù)含量和位置監(jiān)測(cè)小鼠腦組織中的鐵調(diào)節(jié)蛋白，包括IRP-2。分組為a)對(duì)照(C57bl/c)，b)Ireb2+/+，c)Ireb2+，d)Ireb2-/-小鼠。分組可提供腦內(nèi)鐵積累(及其不同形式)的作用的綜述。以前的工作證明，這些小鼠的腦鐵含量逐漸升高，直到18個(gè)月大。利用優(yōu)化的程序，小鼠在1、3、6、9、12、18個(gè)月時(shí)連續(xù)成像，以了解腦鐵的空間和時(shí)間沉積。開(kāi)始時(shí)的成像組較大，足夠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出6只動(dòng)物進(jìn)行定量組織化學(xué)，這可絕對(duì)驗(yàn)證腦(和其它組織)中鐵的不同形式，并將成像數(shù)據(jù)與實(shí)際鐵水平相關(guān)聯(lián)，局部鐵水平和成像數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，以最終了解神經(jīng)變性疾病的基礎(chǔ)。
在成像之前，用足量異氟醚麻醉小鼠，防止MR圖像上的移動(dòng)偽影。用配有柱管的Bruker Avance 4.7T成像儀進(jìn)行成像。磁場(chǎng)均勻后，用700ms的弛豫時(shí)間和20ms的回波時(shí)間(TE)獲得自旋回波T1加權(quán)探查(scout)，在冠向、徑向和橫向采集兩次和3個(gè)切片。10個(gè)切片，每個(gè)2mm厚，間隔2mm，在海馬(前囟后約4mm)和梨狀皮質(zhì)(前囟水平)水平放置于探查圖像上。采集自旋回波擴(kuò)散加權(quán)和多回波T2加權(quán)數(shù)據(jù)組。對(duì)于冠狀切片，用于擴(kuò)散加權(quán)程序的參數(shù)是2200/100ms(TR/TE)，采集兩次，45mm視野(FOV)，128×128矩陣。以Z方向施加擴(kuò)散梯度。利用b＝1000s/mm2的值計(jì)算表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADC)圖。多回波T2加權(quán)程序參數(shù)包括3000/40ms(TR/TE)和每40ms間隔6束回波，3-5個(gè)切片采集一次。
ADC圖根據(jù)方程ADC＝In(So/Sn)/b確定，其中Sn是DW圖像的平均強(qiáng)度，So是相應(yīng)擴(kuò)散未加權(quán)圖像的平均強(qiáng)度{6032}。計(jì)算圖中每個(gè)像素的ADC。高ADC值在DW圖中顯示為亮點(diǎn)。目標(biāo)區(qū)(ROI)的ADC計(jì)算為特定區(qū)域內(nèi)所有像素的ADC的平均值。T2圖由6回波T2程序生成。然后利用方程M(t)＝Mo(1-e-t/T2)，根據(jù)與數(shù)據(jù)的非線(xiàn)性最小平方曲線(xiàn)擬合，計(jì)算T2馳豫常數(shù)，其中Mo是衰減前的初始磁化值，t是回波時(shí)間(ms)，T2是自旋-自旋馳豫時(shí)間。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及對(duì)每只小鼠切片之前的一個(gè)切片進(jìn)行的圖像分析，其中海馬下方能看到卷曲。該位置近似地對(duì)應(yīng)于前囪-3.60mm，使每一目標(biāo)區(qū)域(ROI)的截面最大。利用CheshireTM圖像處理軟件(Hayden Image Processing Group，Waltham，MA)概述并分析ROI，由第二名研究人員證實(shí)。雙側(cè)ROI包括小腦扁桃(和相關(guān)的核)、梨狀皮質(zhì)(包括鼻外和鼻周皮質(zhì))、海馬、夾肌后皮質(zhì)(包括動(dòng)力和軀體感覺(jué)皮質(zhì))和丘腦。兩個(gè)像素寬度分開(kāi)海馬和夾肌后ROI。橫穿海馬底部畫(huà)線(xiàn)，延伸穿過(guò)皮質(zhì)，為夾肌后ROI的下邊緣劃界。梨狀和小腦扁桃ROI彼此毗連，向上、向下延伸相同的距離。中間2-4個(gè)像素分開(kāi)丘腦與扁桃樣ROI，使橫向腦室的信號(hào)作用最小。一個(gè)5×5像素正方形居于丘腦中心。對(duì)于3D梯度回波圖像，估計(jì)切片周?chē)那衅畔ⅰ?br> 盡管從模型數(shù)據(jù)中提取鐵的能力是有希望的，但固有的分歧混淆了動(dòng)物(和人)腦中鐵的定量。為了化學(xué)鑒別鐵的類(lèi)型，嘗試了經(jīng)MRI測(cè)得的組織與鐵蛋白鐵之間、β-淀粉樣噬斑周?chē)奘杉?xì)胞與游離鐵的相對(duì)磁化率。腦鐵用相位和T2’成像定量，與在小鼠腦中組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)的相比較。眾所周知，在靠近噬斑的血管之中和周?chē)F。MR圖像與小鼠模型的腦鐵改變有關(guān)，具有檢測(cè)早期噬斑形成的能力。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在完成MRI分析后，對(duì)4只小鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集腦和血液組織，貯存、加工，用于免疫組織化學(xué)和鐵化學(xué)，補(bǔ)充MRI研究，并與之結(jié)合了解IRP-2在腦鐵代謝中的作用。CO2窒息后從小鼠中取出血液和腦組織。合并每組的血液，處理分離白細(xì)胞，獲得血清樣品，于-70℃凍存。將腦分開(kāi)成右半球和左半球，按濕重記錄重量，將每只動(dòng)物的一個(gè)半腦隨機(jī)置于plp(4％緩沖福爾馬林溶液)中，另一半置于冷凍保護(hù)劑中凍存。冷凍的腦組織切片，前(水平1)、中(水平2)、后(水平3)每第3個(gè)切片置于聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上。大腦皮質(zhì)、側(cè)腦室、胼胝體和尾狀殼存在干水平1切片中，大腦皮質(zhì)、丘腦、第三腦室和海馬存在于水平2切片中，小腦、髓質(zhì)、第四腦室和錐體束存在于水平3切片中。由每個(gè)半腦制備33個(gè)5-10μm切片(一式三份1個(gè)H&E，1個(gè)凋亡，1個(gè)對(duì)鐵蛋白鐵分布的普魯士藍(lán)染色，7個(gè)利用抗-IRP-1、抗-IRP-2、抗鐵蛋白、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、β-淀粉樣遍在蛋白和血鐵黃素進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué))。其它3個(gè)30μm切片(每個(gè)腦水平1個(gè))稱(chēng)重(濕重)，置于排空的冷凍袋中，處理基本鐵含量。
對(duì)于小鼠組織的H&E和凋亡測(cè)定，來(lái)自三個(gè)腦水平中每一個(gè)的5-10μm組織切片用H&E染色，進(jìn)行組織的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。一組腦組織切片用Green等人，2001所述改良的Apodirect試驗(yàn)標(biāo)記。利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的熒光素(FITC)-偶聯(lián)的BrdU向核酸游離3’端添加，根據(jù)DNA損傷估計(jì)腦組織中的晚期凋亡事件。簡(jiǎn)言之，組織在-20℃的70％乙醇中固定15分鐘。固定的組織用PBS重新水合5分鐘，與試劑盒提供的TdT混合物、反應(yīng)緩沖液和FITC-BrdU溫育。組織與DNA標(biāo)記混合物在室溫(22-24℃)下溫育過(guò)夜，洗滌，并用碘化丙錠(PI)/RNAse復(fù)染30分鐘，洗滌，并用permafluor保護(hù)，用蓋玻片覆蓋。用如下所述的激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)器(LSC)(CompuCyte，Cambridge，MA)定量FITC-BrdU摻入。
對(duì)于冷凍小鼠組織切片的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記，如上凋亡測(cè)定所述固定組織(Green等人，1995；Green等人，2001)。固定的組織用一級(jí)抗體(抗Irp-1、抗Irp-2、抗鐵蛋白、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、α-淀粉樣遍在蛋白和血鐵黃素)標(biāo)記。與一級(jí)抗體/抗血清在40℃下溫育16小時(shí)，隨后用含0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗滌。不直接與熒光分子偶聯(lián)的抗體然后用alexa-488、alexa-594、Cy-2或Cy-5抗小鼠或兔IgG抗體在25℃下標(biāo)記最少4小時(shí)的溫育時(shí)間。在二級(jí)抗體溫育結(jié)束前，根據(jù)雙標(biāo)記物和/或共聚焦顯微鏡作為分析終點(diǎn)的能力，加入DAPI(1μg/ml)或碘化丙錠(PI，5μg/ml)10分鐘。用PBST洗滌除去過(guò)量的二級(jí)抗體和核復(fù)染劑，組織用permafluor和蓋玻片保護(hù)，避光干燥，之后進(jìn)行定量分析(如前所述的LSC和共聚焦顯微鏡檢)和照相。通過(guò)對(duì)照切片與非免疫血清和二級(jí)抗體或單獨(dú)的二級(jí)抗體溫育測(cè)定非特異性熒光。
對(duì)于小鼠組織中特異蛋白質(zhì)(包括IRP-2)的定量，對(duì)熒光標(biāo)記的小鼠組織進(jìn)行激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)(LSC)。LSC以O(shè)lympus BX50為基礎(chǔ)，配有氬離子、氦-氖和UV激光，進(jìn)行六色分析。有4個(gè)傳感器，在掃描過(guò)程中同時(shí)以標(biāo)稱(chēng)對(duì)應(yīng)于0.5微米空間間隔的625 000Hz進(jìn)行數(shù)字化。熒光能量由接目鏡收集，由部分鍍銀的鏡片反射，使CCD相機(jī)對(duì)細(xì)胞攝像，并通過(guò)掃描透鏡引導(dǎo)至掃描鏡。二色性鏡和光學(xué)干涉濾鏡由4個(gè)光放大電子管支持，每一個(gè)都能檢測(cè)特定范圍的熒光波長(zhǎng)。數(shù)字記錄熒光值和x，y坐標(biāo)，在計(jì)算機(jī)中存儲(chǔ)為FCS文件。所分析的組織根據(jù)標(biāo)記的核勾畫(huà)輪廓?？蛇x擇多種門(mén)控參數(shù)，包括收集關(guān)于信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比細(xì)胞大小、細(xì)胞數(shù)量(面積、周長(zhǎng)、計(jì)數(shù)等)的信息的參數(shù)。用對(duì)照陽(yáng)性和陰性樣品優(yōu)化方案設(shè)置和顯示參數(shù)，存儲(chǔ)優(yōu)化的方案和顯示文件，用于掃描復(fù)制切片。
對(duì)于LSC定量的特異蛋白質(zhì)的定位，對(duì)小鼠組織進(jìn)行共聚焦顯微鏡分析。多種蛋白質(zhì)具有與其功能性質(zhì)相符合的不連續(xù)位置，因此，通過(guò)共聚焦顯微鏡分析(Altura等人，2001)進(jìn)行特異蛋白質(zhì)的細(xì)胞/亞細(xì)胞定位能獲得較好的理解。熒光標(biāo)記的組織切片用基于Olympus IX-70的BioRad-1024共聚焦顯微鏡進(jìn)行三維成像。切片用低倍(4-20×)放大、0.5μm z級(jí)獲得上述蛋白質(zhì)的總體分布，用高倍(40-100×)放大獲得細(xì)胞/亞細(xì)胞定位。
對(duì)于小鼠組織的鐵定量，通過(guò)普魯士藍(lán)染色(鐵)估計(jì)鐵的分布，通過(guò)自動(dòng)光譜分析估計(jì)總鐵。對(duì)石蠟包埋的切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，使用標(biāo)準(zhǔn)方法的靈敏改良法(Moos和Mollgard，1993)，包括亞鐵氰化鉀(2.5％)與鹽酸(2.5％)在室溫下混合20分鐘，用過(guò)氧化氫漂洗，細(xì)胞核用PI復(fù)染。
對(duì)于MR成像數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用一維ANOVA對(duì)每一動(dòng)物進(jìn)行雙側(cè)目的區(qū)(ROI)的左右對(duì)比。然后進(jìn)行雙尾student t檢驗(yàn)(p＜0.05時(shí)顯著，p＜0.01時(shí)非常顯著)，比較每一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照值與實(shí)驗(yàn)值。
為了從MR成像數(shù)據(jù)中提取相對(duì)鐵含量，本發(fā)明涉及一種使用高分辨率3D梯度回波程序的成像方法。當(dāng)分辨率是目標(biāo)大小的1-2倍時(shí)，所研究的大多數(shù)磁化率特征最佳成像。由于此原因，對(duì)人腦使用下列參數(shù)TR＝67ms，TE＝40ms，分辨率為0.5×1.0×2.0mm3，掃描時(shí)間為5分鐘。小結(jié)構(gòu)如300-500微米級(jí)的小靜脈和基底神經(jīng)節(jié)中小于1mm3的鐵沉淀由于信號(hào)消除性質(zhì)和在圖像上的相位效應(yīng)而在圖像上可見(jiàn)。對(duì)微像素效應(yīng)的這種強(qiáng)靈敏度使SWI如此強(qiáng)烈。如上所述，掃描40分鐘，小鼠腦中能集中0.25×0.25×0.25mm3的分辨率。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于隨機(jī)系統(tǒng)，像素大小不重要，為了更快的成像和較佳的SNR，能使用較大的像素。對(duì)上述模型測(cè)試梯度回波程序，測(cè)定是鐵濃度函數(shù)和分辨率函數(shù)的相位，以確保測(cè)量標(biāo)度不變。
由于灰質(zhì)與白質(zhì)間的鐵濃度差在40s時(shí)表現(xiàn)為約20度，對(duì)應(yīng)于約0.1ppm，進(jìn)行模型、動(dòng)物、人體的相位誤差分析。如果幅度圖像中的SNR僅為15∶1，則相位的標(biāo)準(zhǔn)差為0.06弧度(4°或0.002ppm)或約10％誤差。然后可設(shè)想估計(jì)大于3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的磁化率差異，其對(duì)應(yīng)于0.006ppm，p＝0.005。通過(guò)平均改善數(shù)據(jù)能用兩種方法實(shí)現(xiàn)。第一，根據(jù)需要的分辨率，獲得更多的數(shù)據(jù)，或過(guò)濾數(shù)據(jù)。例如，如果較低分辨率足夠，則用較低的分辨率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)提高SNR，能顯著改善每個(gè)單位時(shí)間的SNR。例如，用0.5×1.0×2.0mm3的分辨率和TE＝40ms進(jìn)行MR掃描需要5分鐘獲得并產(chǎn)生上述數(shù)值。然而，如果1×2×2mm3的分辨率足夠，則掃描需要一半的時(shí)間，而產(chǎn)生高2倍的SNR。因此，如果使用相同的5分鐘，SNR的提高是2sqrt(2)，相當(dāng)于在高8倍的場(chǎng)強(qiáng)下成像。在模型和動(dòng)物中，分辨率可為0.25微米至1mm。
對(duì)于人類(lèi)研究，對(duì)前5名正常人和5名年齡相當(dāng)?shù)陌柎暮Ｄ颊呤褂脦捉M成像參數(shù)。為了測(cè)定體內(nèi)靈敏度，包括40、80和120ms的回波時(shí)間。為了研究是像素大小的函數(shù)的靈敏度，分辨率可為0.5×0.5×1.0mm3-1×1×2mm3。在較高分辨率的圖像上，將數(shù)據(jù)過(guò)濾為較低分辨率的圖像，使每個(gè)方向降低2倍，與較低分辨率的數(shù)據(jù)相比較。該方法的原理包括相對(duì)于較低分辨率掃描，Gibbs環(huán)減少，場(chǎng)不均勻性的影響降低，可檢查標(biāo)度不變性的影響。
絕對(duì)鐵含量能從MR成像數(shù)據(jù)中提取。隨著鐵濃度升高，預(yù)測(cè)T2’值線(xiàn)性提高。使用如下所述的多回波、梯度/自旋回波組合。生成TE＝80ms的自旋回波結(jié)構(gòu)。關(guān)于此回波時(shí)間，采集一系列相同極性的31束回波(每2.5ms一束回波)。下面的理論(更多細(xì)節(jié)見(jiàn)xx、xy和xz)已經(jīng)在理論上預(yù)測(cè)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一組隨機(jī)球體的信號(hào)特征(已知凝集為球形的鐵的近似值，特別是假如使用高像素)如下得出S(t)＝ρ(1-λ)exp(-0.41(tδω)2) tδω＜1.5和S(t)＝ρ(1-λ)exp(-itΔω)exp(-R2’abs(t-ts)) tδω＞1.5其中δω＝γ4π(M-Mo)/3，R2′＝1.21λδω，ts＝1/(1.21δω)和Δω＝-0.16λδω.
通過(guò)測(cè)定短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間成分，獲得對(duì)每個(gè)指數(shù)的幅度、(M-M0)(從dw提取)和λ(從R2’提取，因?yàn)棣摩匚粗?的數(shù)字估計(jì)。例如，對(duì)于在MRI中用作對(duì)比劑的磁性顆粒，如AMI 225，δω的值為3.4×10-7/s。利用λ＝2×10-6的體積分?jǐn)?shù)產(chǎn)生82.23/s的R2’，與其它估計(jì)十分一致(數(shù)字模擬80-100s)。當(dāng)磁化率已知時(shí)，R2’能直接用作體積分?jǐn)?shù)λ的量度。對(duì)于ppm級(jí)的更小的磁化率，如反磁或順磁物質(zhì)，δω為ms級(jí)。例如，對(duì)于血細(xì)胞比容為0.4、氧飽和度為55％的靜脈，δω值約為3ms。反之，磁化率越小，δω越長(zhǎng)，在自旋回波之后或之前當(dāng)ts為3-30ms時(shí)，能利用信號(hào)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生信號(hào)損失的來(lái)源的磁化率及其體積含量。因?yàn)闇y(cè)定引起信號(hào)損失的每種成分(鐵蛋白等)的磁化率，所以不使用該特征。然而，對(duì)于直接與R2’有關(guān)的-0.16λδω相位，能進(jìn)行另一種數(shù)字估計(jì)。當(dāng)磁場(chǎng)變化只有一個(gè)原因時(shí)，這種估計(jì)不提供新的信息。然而，如果非血紅素鐵不是唯一原因，而血紅素鐵通過(guò)上述靜脈機(jī)制作用，則這兩者可能不再相關(guān)，測(cè)量的回波的暫時(shí)響應(yīng)將是一條拋物線(xiàn)。據(jù)此，能用兩個(gè)參數(shù)模型從非血紅素鐵中提取血紅素。最后，作為一種實(shí)現(xiàn)方法，用對(duì)比劑以一種已知方法修飾局部磁化率，并重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
上述結(jié)果與T1、T2和擴(kuò)散加權(quán)圖像相比較，用以前的磁場(chǎng)值接觸基值。動(dòng)物模型切片中描述的多回波、自旋回波程序是測(cè)量T1。利用3D可變角方法和常規(guī)2D多IR程序估計(jì)T1值。
對(duì)4個(gè)量度都進(jìn)行完全誤差分析相位、R2’、R2和R1。注意方法間的差異。在許多情況下能發(fā)生信號(hào)恢復(fù)，對(duì)于R1和R2方法，這破壞與鐵的相關(guān)性，但不影響相位或R2’。
消除所有線(xiàn)性相位效應(yīng)的另一種簡(jiǎn)單方法是使用一種雙回波法。根據(jù)由背景相位效應(yīng)預(yù)期的簡(jiǎn)單的相位線(xiàn)性依賴(lài)性，利用第一回波的相位預(yù)測(cè)第二回波的相位。如果第一回波的相位γΔBTE1乘以TE2/TE1預(yù)測(cè)γΔBTE2，并從第二回波相位中減去預(yù)測(cè)的相位(通常通過(guò)復(fù)雜除法完成)，則修正圖像的預(yù)期相位將為零。這用來(lái)估計(jì)與兩隔模型相關(guān)的任何非線(xiàn)性效應(yīng)，其相位效應(yīng)不只是簡(jiǎn)單的相加，并且能分離像素效應(yīng)內(nèi)的小局部。
利用已知的鐵蛋白磁化率估計(jì)方法由血紅素和非血紅素來(lái)源預(yù)期的相位，和由紅核獲得的濃度1450nmol/gm，用多回波空間技術(shù)估計(jì)，以定量血紅素組分。血紅素鐵本身對(duì)血液有振蕩效應(yīng)，但對(duì)游離鐵或鐵蛋白中的鐵沒(méi)有。該技術(shù)對(duì)來(lái)自靜脈血的部分體積效應(yīng)敏感，與鐵在腦實(shí)質(zhì)中均勻分布引起的效應(yīng)截然不同。用血液清零(nulling)技術(shù)進(jìn)行相同的程序。定量來(lái)自于血紅素鐵(如果有的話(huà))及游離鐵或鐵蛋白結(jié)合鐵的相位特征的量?？梢杂靡阎康膶?duì)比劑(相位效應(yīng)為1°/mM/ms的常規(guī)試劑)模擬血液磁化率來(lái)測(cè)定血液的作用。通過(guò)加倍血液的作用，估計(jì)血液本身對(duì)相位的影響。為了解決分辨率和標(biāo)度依賴(lài)性問(wèn)題，對(duì)人類(lèi)能以0.5-2mm，對(duì)動(dòng)物能以0.25-1mm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定像素大小對(duì)測(cè)定是否有任何影響。實(shí)質(zhì)圖像相位或臨界時(shí)間ts的任何改變都是血液作用的標(biāo)志。
可以對(duì)相位特征和相位濾波器去除背景物質(zhì)的能力進(jìn)行研究。使用的濾波器是高通量濾波器，故可導(dǎo)致DC信息丟失。由于磁化率(未深度累及的組織間的差異)的定量是重要的，檢查了提取DC水平相位的能力，并與原始的未濾波數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。為了確保相位的絕對(duì)值，不使用相位差、已知磁化率的參照標(biāo)記。進(jìn)行了動(dòng)物和人的成像。
在本發(fā)明中，利用MR成像監(jiān)測(cè)患者。MR成像對(duì)β-淀粉樣斑早期信息靈敏，與AD中的鐵含量和斑塊及血管改變晚期的變性作用有關(guān)，是一種定量腦鐵的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及AD的早期干預(yù)和/或可能的預(yù)防方法。由于具有AD危險(xiǎn)的患者在出現(xiàn)疾病攻擊性和破壞性前數(shù)月到數(shù)年間顯示輕度認(rèn)知缺陷，包括行為功能和記憶缺陷，故用可提高AD診斷精確度的特異鑒別神經(jīng)心理學(xué)研究和詳細(xì)認(rèn)知檢測(cè)研究AD病例的后續(xù)結(jié)果是有用的。
由于輕度認(rèn)知疾病(MCI)——一種亞癡呆——提示與AD有關(guān)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及MCI患者的目標(biāo)群體。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)心理檢查，診斷的患者通常表現(xiàn)低于參照標(biāo)準(zhǔn)1.0-1.5的標(biāo)準(zhǔn)差，不能用標(biāo)準(zhǔn)檢查確定為癡呆。最近公布了對(duì)老年人MCI早期檢查的原則和實(shí)際建議(Jolles等人，Drugs Aging，7(6)459-79(1995))。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種區(qū)別不同輕度認(rèn)知疾病(MCI)病例的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括靜態(tài)MCI病例與快速發(fā)展為癡呆的MCI病例的鑒別。此外，本發(fā)明還包括一種鑒別癡呆綜合征與能夠手術(shù)治療的疾病的方法。例如，發(fā)展了區(qū)別MCI與通過(guò)分流術(shù)能夠緩解的常壓性腦積水的方法。此外，也發(fā)展了區(qū)別額-顳萎縮和多梗塞癡呆病與AD的方法。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用檢查儀器(包括小型心理狀態(tài)檢查、神經(jīng)生理學(xué)檢查)臨床監(jiān)測(cè)MCI患者的癡呆過(guò)程，支持?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)自聚焦認(rèn)知儀和信息。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及腦病和鐵代謝的相關(guān)性。優(yōu)選地，通過(guò)MRI技術(shù)定量的腦鐵水平與患者癡呆的臨床病程相關(guān)。此外，通過(guò)IRP-2測(cè)定監(jiān)測(cè)的外周血IRP-2水平與患者癡呆的臨床病程相關(guān)。含有水平不規(guī)律的腦鐵或外周IRP-2的患者作為進(jìn)一步研究AD干預(yù)和可能的AD預(yù)防的最佳候選者。
研究中包括100名不同來(lái)源的MCI個(gè)體。50名個(gè)體第一年加入，50名個(gè)體第二年加入。每個(gè)月遇到6-8名新MCI患者的醫(yī)療服務(wù)是主要的患者來(lái)源。第二位的患者來(lái)源包括當(dāng)?shù)氐纳窠?jīng)病學(xué)家和精神科醫(yī)生和電臺(tái)和電視臺(tái)上的公共服務(wù)信息。
電話(huà)接觸和直接醫(yī)療服務(wù)后，對(duì)患者進(jìn)行全面的物理和神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)，包括心理測(cè)試研究，以估計(jì)缺陷水平。這些篩選研究如美國(guó)神經(jīng)學(xué)研究所質(zhì)量分組標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)所述。
進(jìn)入過(guò)程包括與研究合作者電話(huà)談話(huà)或直接的醫(yī)療服務(wù)。第一次訪問(wèn)是在根據(jù)癡呆綜合征郵件調(diào)查表篩選后約見(jiàn)。
按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分組委員會(huì)準(zhǔn)則進(jìn)行受檢者選擇。進(jìn)入研究的標(biāo)準(zhǔn)包括下列1) 年齡＞50歲2) 教育超過(guò)7級(jí)3) 無(wú)主要神經(jīng)病史中風(fēng)、腫瘤、外傷、內(nèi)分泌病或精神病4) 無(wú)神經(jīng)破壞藥物使用史5) 小型心理狀態(tài)測(cè)試評(píng)分≥106) 能給予知情同意7) 富有經(jīng)驗(yàn)的監(jiān)護(hù)人，家族成員每名患者的評(píng)價(jià)在2周內(nèi)完成，包括3個(gè)部分。記錄編號(hào)，并將標(biāo)準(zhǔn)信息——心理測(cè)試得分、血液分析結(jié)果、MRI數(shù)據(jù)——提取為特殊的編碼形式。每?jī)芍芑仡櫼淮螖?shù)據(jù)。所有受檢者都根據(jù)LomaLinda大學(xué)醫(yī)學(xué)中心人類(lèi)研究委員會(huì)和NIH批準(zhǔn)的規(guī)則給予知情同意。
實(shí)施例1IRP-2肽特異性抗體的制備氧化和還原形式的野生型和突變IRP-2肽的特異性抗體如下制備。用常規(guī)分子生物學(xué)方法生產(chǎn)7個(gè)克隆，它們?cè)贗RP-2的氨基酸殘基138-216的肽環(huán)中有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸。“C1A”克隆靠近N端的第一個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.4)?！癈2A”克隆靠近N端的第二個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.6)?！癈3A”克隆靠近N端的第三個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.8)?！癈12A”克隆靠近N端的第一個(gè)和第二個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.10)?！癈23A”克隆靠近N端的第二個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.12)?！癈13A”克隆靠近N端的第一個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.14)?！癈123A”克隆靠近N端的第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸被替換為丙氨酸(SEQ.ID.No.16)。野生型肽序列也在大腸桿菌中重組產(chǎn)生(SEQ.ID.No.2)。
在重組肽分離后，即進(jìn)行氧化或還原。在37℃和50:M FeCl3和10mM DTT存在下，在20:l反應(yīng)混合液(25mM Hepes-NaOH，pH7.2和40mM KCl)中，以0.1:g/:l蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行IPR-2的氧化15-30分鐘。在37℃下，肽在1mM Tris-羧乙基-膦(TCEP)中溫育15-30分鐘，獲得還原形式的肽。獲得氧化和還原的肽后，它們與KLH偶聯(lián)，用來(lái)在小鼠中生產(chǎn)抗體。雜交瘤用常規(guī)方法制備，為生產(chǎn)用來(lái)接種小鼠的肽的特異性抗體篩選克隆。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的野生型肽的抗體在ELISA和Western印跡試驗(yàn)中可識(shí)別SEQ.ID.Nos.2的肽和全長(zhǎng)IRP-2。發(fā)現(xiàn)1∶5000稀釋足夠。也用另一種篩選方法篩選某些抗體。因?yàn)镮RP-2的氧化可能依賴(lài)于半胱氨酸殘基向氨基丙二酸的轉(zhuǎn)化，所以合成含有氨基丙二酸的IRP-2肽。根據(jù)對(duì)氨基丙二酸和天然IRP-2肽的反應(yīng)性篩選克隆。選擇對(duì)氨基丙二酸有反應(yīng)性但對(duì)天然肽無(wú)反應(yīng)性的克隆。根據(jù)本實(shí)施例所述，能制備突變和野生型IRP-2蛋白的抗體。這些抗體能在此處所述的診斷試驗(yàn)中使用，用來(lái)鑒定受檢者患神經(jīng)變性疾病的傾向。下一實(shí)施例描述了用來(lái)制備野生型IRP-2特異性抗體的一種類(lèi)似方法。
實(shí)施例2IRP-2特異性抗體在本實(shí)施例中，提供了一種制備和篩選IRP-2特異性抗體的方法。為了制備該抗體，按照使用說(shuō)明，用RIBI佐劑(Corixa)中的63個(gè)殘基(野生型)的“環(huán)肽”免疫Balb/c小鼠。然后用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)使小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。根據(jù)與環(huán)肽及整個(gè)分子的反應(yīng)性篩選得到的雜交瘤。根據(jù)ELISA(天然分子)和Western印跡分析(變性分子)，6個(gè)克隆為陽(yáng)性。根據(jù)生長(zhǎng)特征和強(qiáng)測(cè)定結(jié)果，選擇其中之一(4G11)進(jìn)行大規(guī)?？贵w生產(chǎn)。
然后進(jìn)行4G11與其它5個(gè)克隆的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，以確定它們是識(shí)別相同的還是不同的表位。只有一個(gè)(14F7)不能明顯抑制4G11的結(jié)合，可能是在不同部位結(jié)合。因此，14F7和4G11-HRP成為捕獲ELISA測(cè)定(下述)的基礎(chǔ)，它也能用來(lái)檢測(cè)生物樣品中的IRP-2。該試驗(yàn)對(duì)低至1mg/ml的濃度敏感，顯示極佳的線(xiàn)性。
捕獲試驗(yàn)如下進(jìn)行。未標(biāo)記抗體用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(Sigma #C-3041)稀釋?zhuān)话阒?-10μg/ml。不同的抗體濃度可能需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，從10μg/ml向下至工作濃度。不會(huì)由于擁擠而阻礙抗原結(jié)合是重要的，選擇發(fā)出強(qiáng)信號(hào)的最低濃度。然后將抗體以每孔約100μl置于以帶(Falcon #3073)覆蓋的Immulon-1平板(Dynex#3355)中，4℃溫育過(guò)夜。
隨后，將平板加熱至室溫，用PBS(w/o tween)(Cellgro，#20-031-CV，稀釋為1×的10×濃縮物)洗孔3次。然后向每孔中添加200μl SuperBlock(Pierce #37515)，倒空，共重復(fù)該步驟3次，阻斷平板。板孔用PBS-Tween(PBS+0.05％ Tween-20，Sigma #P-6585)洗滌3次。向孔中加入稀釋液(對(duì)照)、抗原和標(biāo)準(zhǔn)(約100μl)。使用的稀釋液是載體(10％SuperBlock于PBS-Tween中)。輕拍板孔，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)(搖動(dòng)平板可大大提高測(cè)定靈敏度)。隨后用PBS-Tween洗孔3次。
之后加入約100:l用載體稀釋的HRP-標(biāo)記的檢測(cè)抗體(使用商品時(shí)按照廠商建議，自產(chǎn)抗體根據(jù)經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)稀釋)。輕拍板孔，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)(搖動(dòng)平板可大大提高測(cè)定靈敏度)。隨后用PBS-Tween洗孔3次。向孔中加入約100μl底物(Bio-Rad #172-1067)。開(kāi)蓋反應(yīng)約30分鐘，讀取630nm(參照為490nm)下的吸光度。實(shí)驗(yàn)參數(shù)是，在測(cè)定中，對(duì)于大多數(shù)濃縮抗原，在約30分鐘的溫育時(shí)間內(nèi)獲得約2.0的OD值。當(dāng)摸索捕獲抗體、抗原和檢測(cè)抗體的適當(dāng)稀釋度時(shí)，進(jìn)行“跳棋盤(pán)”試驗(yàn)是有用的。下一個(gè)實(shí)施例描述了將抗-IRP-2抗體與珠連接的一種方法。
實(shí)施例3載體結(jié)合的IRP-2抗體該實(shí)施例描述了一種方法，用來(lái)制備載體結(jié)合的IRP-2抗體，用于流式細(xì)胞分析。用磺基-SMCC修飾約5mg純化的、不含載體(無(wú)其它蛋白質(zhì))的小鼠抗IRP-2單克隆抗體，然后與15mg 2-亞胺硫烷(iminothiolane)修飾的r-藻紅蛋白偶聯(lián)。用Sepharose S-300-HR柱通過(guò)大小排阻層析，使產(chǎn)生的偶聯(lián)物與游離的未偶聯(lián)r-藻紅蛋白和游離的未偶聯(lián)單克隆抗體分離。該方法需要2天完成?？捎玫呐悸?lián)物的終產(chǎn)量約為初始抗體質(zhì)量的50-95％，一般預(yù)期產(chǎn)量＞85％。通過(guò)在山羊抗小鼠包被的7微米珠上捕獲偶聯(lián)物和流式細(xì)胞分析證實(shí)偶聯(lián)成功。
實(shí)施例4白細(xì)胞的制備用68％Percoll通過(guò)密度梯度分離由肝素抗凝的外周血樣品制備單核細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，20ml未稀釋的全血樣品在50ml離心管中的25ml 68％Percoll上分層。然后以800×g離心血液20分鐘。收集界面細(xì)胞，離心沉淀。振蕩破壞細(xì)胞沉淀，用25ml VitaLyse紅細(xì)胞裂解緩沖液(BioErgonomics)裂解，除去殘余的紅細(xì)胞。細(xì)胞用25mlPBS洗滌一次，然后重懸浮為1×107單核細(xì)胞/ml。每次標(biāo)記步驟使用100微升細(xì)胞(1×106)。
為刺激炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基或ActiCyte-LPS培養(yǎng)基(BioErgonomics，St.Paul，MN)中，在5％CO2空氣中37℃溫育20小時(shí)。在后4小時(shí)溫育期間，向培養(yǎng)物中加入高爾基體抑制劑布雷菲德菌素A(10ng/ml)，以抑制細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)胞內(nèi)染色。在溫育期之后，收集細(xì)胞，保留培養(yǎng)上清液進(jìn)行細(xì)胞因子分泌分析。保留細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)。
為了檢測(cè)胞內(nèi)IRP-2蛋白水平的改變或凋亡的誘導(dǎo)，以下列方式進(jìn)行淋巴細(xì)胞的激活。將100萬(wàn)個(gè)單核細(xì)胞重懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基或ActiCyte-LPS培養(yǎng)基(BioErgonomics，St.Paul，MN)中，在5％CO2空氣中37℃溫育48-72小時(shí)。ActiCyte-TC培養(yǎng)基含有抗-CD3抗體和人細(xì)胞因子白介素-1α(IL-1α)和白介素-2(IL-2)。這種培養(yǎng)基通過(guò)T細(xì)胞抗原受體和兩種細(xì)胞因子受體的ε鏈特異激活T淋巴細(xì)胞。
實(shí)施例5熒光染料標(biāo)記的抗-IRP-2抗體1.抗體的熒光染料標(biāo)記為了用FITC標(biāo)記抗體，抗體以5mg/ml的濃度交換到100mMKH2CO3緩沖液(pH9.0)中。以25∶1的摩爾比向抗體中加入FITC(Molecular Probes)(10mg/ml DMF溶液)，在室溫下避光溫育1小時(shí)。用G-25 Sephadex柱從抗體中分離游離的FITC。用2-亞氨硫烷生產(chǎn)藻紅蛋白和Cy5PE偶聯(lián)物，修飾熒光染料和磺基-SMCC，修飾抗體。修飾的蛋白質(zhì)然后在室溫下避光溫育1小時(shí)。通過(guò)Sephacryl S-300-HR柱(Sigma)分離將游離的熒光染料和抗體與熒光染料偶聯(lián)的抗體分離。改變熒光染料與蛋白質(zhì)之比可能是為特定抗體或肽抗原優(yōu)化熒光信號(hào)所必需的。
2.抗-IRP-2抗體和熒光染料標(biāo)記的抗-IRP-2抗體的質(zhì)量控制利用BioErgonomics，Inc.發(fā)展的抗原ELISA和基于微粒的免疫熒光測(cè)定，檢測(cè)抗IRP-2天然、突變肽和完整蛋白質(zhì)的抗體的特異性。生物素標(biāo)記的天然和突變肽或完整IRP-2蛋白與抗生物素蛋白包被的7μm直徑的聚苯乙烯順磁性顆粒結(jié)合，這些顆粒與生物素標(biāo)記的分子高特異性、高親合力地結(jié)合。利用夾心法檢測(cè)新生產(chǎn)的抗體對(duì)各種不同IRP-2肽包被的微粒的特異性。隨后與藻紅蛋白標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig抗體反應(yīng)，檢測(cè)與抗原包被的顆粒結(jié)合的IRP-2特異性抗體。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。產(chǎn)生陽(yáng)性熒光信號(hào)的抗體被認(rèn)為可能是天然或突變肽特異的。在與細(xì)胞或抗原包被的微粒溫育之前，細(xì)胞或抗原包被的顆粒與未標(biāo)記的相同抗體預(yù)溫育，或標(biāo)記抗體與抗原預(yù)溫育，阻斷了抗-IRP-2抗體的特異結(jié)合和熒光性，這證實(shí)了其特異性。
抗原包被的微粒用于前面選擇的IRP-2特異性抗體熒光偶聯(lián)的質(zhì)量控制。根據(jù)抗原包被的微粒的結(jié)合和抗原陽(yáng)性和抗原陰性細(xì)胞群體的胞內(nèi)標(biāo)記，選擇用產(chǎn)生最佳信噪比的藻紅蛋白或Cy5-藻紅蛋白熒光染料最佳地標(biāo)記抗-IRP-2抗體。通過(guò)用未標(biāo)記抗體特異阻斷熒光染料標(biāo)記的抗體，確定IRP-2肽或整個(gè)分子特定表位的抗體的特異性分組。
實(shí)施例6來(lái)自MCI患者的外周血樣品的分析外周血樣品從MCI患者中獲得。血液測(cè)定每年最少進(jìn)行兩次。
1.βAPP表面膜形式表達(dá)的測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞分析測(cè)定研究對(duì)象的βAPP的細(xì)胞表面膜形式的相對(duì)表達(dá)。簡(jiǎn)言之，分離的單核細(xì)胞用βAPP(BoehringerMannheim)N端特異的單克隆抗體22C11染色30分鐘，并用藻紅蛋白偶聯(lián)的CD14染色。與抗體溫育后，細(xì)胞用PBS洗滌一次，除去未結(jié)合的抗體，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。
2.功能細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)的測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞分析測(cè)定待測(cè)對(duì)象的細(xì)胞上功能轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的相對(duì)表達(dá)。簡(jiǎn)言之，分離的單核細(xì)胞用100ng藻紅蛋白偶聯(lián)的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(BioE Inc.)染色15分鐘，用PBS洗滌一次，除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。功能受體(即，實(shí)際上能結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體)的表達(dá)與細(xì)胞熒光強(qiáng)度成正比。
3.循環(huán)白細(xì)胞表達(dá)致炎細(xì)胞因子的測(cè)定在細(xì)菌脂多糖(LPS)存在或不存在下溫育單核細(xì)胞(1×106/ml)20小時(shí)，以測(cè)定致炎細(xì)胞因子白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的基礎(chǔ)和刺激產(chǎn)生。產(chǎn)細(xì)胞因子細(xì)胞的鑒定根據(jù)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分析通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，如IRP-2蛋白的鑒定所述固定并透化細(xì)胞。用PE或Cy5PE標(biāo)記的IL-1α、IL-6和TNF-α特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞。在20小時(shí)溫育過(guò)程中分泌到培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子的量通過(guò)基于流式細(xì)胞分析的定量免疫熒光試驗(yàn)(ImmunoFlow and MultiFlow，BioErgonomics，Inc.，StPaul，MN)測(cè)定。
4.活化單核細(xì)胞中凋亡或壞死的檢測(cè)試驗(yàn)簡(jiǎn)言之，ActiCyte-TC激活的100萬(wàn)個(gè)單核細(xì)胞用PBS洗滌，并用磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白膜聯(lián)蛋白-V-FITC(200ng，Caltag，SouthSan Francisco，CA)和DNA嵌入染料碘化丙錠(4μg)染色。單獨(dú)膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性或膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙錠陽(yáng)性的細(xì)胞分別被認(rèn)為是早期或晚期凋亡的，而單獨(dú)碘化丙錠陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為是壞死的。
5.胞內(nèi)IRP-2環(huán)肽的表達(dá)和IRP-2表達(dá)細(xì)胞的鑒定試驗(yàn)胞內(nèi)IRP-2環(huán)肽的表達(dá)用FITC、PE和Cy5PE偶聯(lián)的抗-IRP-2單克隆抗體通過(guò)流式細(xì)胞分析測(cè)定，以鑒定表達(dá)天然IRP-2蛋白的細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)旨在尋找IRP-2鐵降解域多態(tài)性。洗滌的細(xì)胞(1×106于100μl PBS中)通過(guò)在1ml 1％甲醛中溫育30分鐘固定，表示為熒光標(biāo)記的抗胞內(nèi)IRP-2蛋白抗體的特異結(jié)合。特定抗-IRP-2抗體的陽(yáng)性熒光和特異性的確定根據(jù)與抗原或標(biāo)記抗體預(yù)溫育能特異競(jìng)爭(zhēng)的熒光強(qiáng)度改變來(lái)測(cè)定。特定抗-CD抗體陽(yáng)性的細(xì)胞通過(guò)與類(lèi)似標(biāo)記的同種型對(duì)照抗體或熒光染色被未標(biāo)記抗體特異阻斷的細(xì)胞相比較來(lái)測(cè)定。
6.流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)與患者臨床狀態(tài)的相關(guān)性在具有每名患者數(shù)據(jù)表的不同歸檔系統(tǒng)中，流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)與患者的臨床狀態(tài)有關(guān)。利用方差分析(ANOVA)分析MCI患者組中IRP-2“環(huán)肽”降解篩查的結(jié)果?？蛇M(jìn)一步檢查比較兩個(gè)群體組(AD和老年對(duì)照)中突變IRP-2肽的數(shù)據(jù)。
盡管已經(jīng)參照實(shí)施方案和實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明精神的情況下能進(jìn)行多種修改。因此，本發(fā)明只受下列權(quán)利要求書(shū)的限制。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均引用作為參考。
序列表<110>Loma Linda University<120>用作神經(jīng)變性疾病診斷的鐵調(diào)節(jié)蛋白-2(IRP-2)<130>LOMAU.140PR<160>20<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆寡核苷酸<400>1gcaatacaga atgcaccaaa tcctggaggt ggtgacctgc agaaagcagg aaagctctct 60ccacttaaag tgcagcctaa gaagcttccc tgcagaggcc agactacctg ccgaggatct 120tgtgattctg gagaactagg ccgaaactca ggaacatttt cttcgcagat tgagaataca 180cccatcctg 189<210>2<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抗體制備的肽<400>2Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Cys Arg Gly Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60<210>3<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆寡核苷酸<400>3
gcaatacaga atgcaccaaa tcctggaggt ggtgacctgc agaaagcagg aaagctctct 60ccacttaaag tgcagcctaa gaagcttccc gccagaggcc agactacctg ccgaggatct 120tgtgattctg gagaactagg ccgaaactca ggaacatttt cttcgcagat tgagaataca 180cccatcctg 189<210>4<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抗體制備的肽<400>4Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Cys Arg Gly Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60<210>5<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆寡核苷酸<400>5gcaatacaga atgcaccaaa tcctggaggt ggtgacctgc agaaagcagg aaagctctct 60ccacttaaag tgcagcctaa gaagcttccc tgcagaggcc agactaccgc ccgaggatct 120tgtgattctg gagaactagg ccgaaactca ggaacatttt cttcgcagat tgagaataca 180cccatcctg 189<210>6<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抗體制備的肽<400>6Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Ala Arg Gly Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60
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<223>用于抗體制備的肽<400>8Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Cys Arg Gly Ser Ala Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60<210>9<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>克隆寡核苷酸<400>9gcaatacaga atgcaccaaa tcctggaggt ggtgacctgc agaaagcagg aaagctctct 60ccacttaaag tgcagcctaa gaagcttccc gccagaggcc agactaccgc ccgaggatct 120tgtgattctg gagaactagg ccgaaactca ggaacatttt cttcgcagat tgagaataca 180cccatcctg 189<210>10<211>63<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于抗體制備的肽<400>10Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala
1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Ala Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Ala Arg Gly Ser Cys Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile Glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60<210>11<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>用于抗體制備的肽<400>12Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asn Pro Gly Gly Gly Asp Leu Gln Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Leu Ser Pro Leu Lys Val Gln Pro Lys Lys Leu Pro Cys Arg20 25 30Gly Gln Thr Thr Ala Arg Gly Ser Ala Asp Ser Gly Glu Leu Gly Arg35 40 45Asn Ser Gly Thr Phe Ser Ser Gln Ile glu Asn Thr Pro Ile Leu50 55 60<210>13<211>189<212>DNA<213>人工序列<220>
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taccttattg aaacattaaa tgacagttca cataagaagt tcttcgatgt atctaaactt 60ggcaccaagt atgatgttct gccttactca atacgggtct tgttggaagc tgctgtacga 120aattgtgatg gctttttaat gaagaaggaa gatgttatga acattttaga ctggaaaacc 180aaacaaagca atgttgaagt gccctttttc cctgcccgtg ttcttcttca agattttact 240ggaataccag caatggtgga ttttgctgct atgagggagg cagtgaaaac tcttggaggt 300gatcctgaga aagtccatcc tgcttgtccg acagatctta cagttgacca ttctttacaa 360attgacttca gtaaatgtgc aatacagaat gcaccaaatc ctggaggtgg tgacctgcag 420aaagcaggaa agctctctcc acttaaagtg cagcctaaga agcttccctg cagaggccag 480actacctgcc gaggatcttg tgattctgga gaactaggcc gaaactcagg aacattttct 540tcgcagattg agaatacacc catcctgtgt ccttttcatt tgcaaccagt gcctgaacct 600gaaacagtgt taaaaaatca agaagtagaa ttcggcagaa atcgagagag gcttcagttt 660tttaagtgga gttcaagagt tttaaagaat gtggcagtga tccctcctgg aactggaatg 720gctcatcaaa taaacttaga atatttgtca agagtggttt ttgaagaaaa agacctcctc 780ttcccagaca gtgtagtcgg cacagattca cacataacga tggtgaatgg tttagggatt 840ctggggtggg gggttggagg cattgaaaca gaagcagtta tgcttggtct gccagtttct 900cttactttac cagaggtggt tggatgtgag ttaactgggt catcaaaccc ttttgttaca 960tccatagatg ttgttcttgg tattacaaag cacctcaggc aagtaggagt ggctggaaag 1020tttgttgagt tttttggaag tggagtttca caattatcta tagttgatcg aactacaata 1080gcaaacatgt gtccggaata tggtgctatc ctcagctttt tccctgttga caatgtgaca 1140ttaaaacatt tagaacatac aggttttagc aaagccaaac tcgaatcaat ggaaacatac 1200cttaaagctg tgaaattgtt tcgaaatgac cagaattctt caggagaacc tgaatactcc 1260caggtgatcc agattaatct gaattcaata gttccatctg ttagtggtcc aaaaagacct 1320cgggatagag ttgctgtgac agatatgaaa agcgatttcc aggcttgctt aaatgaaaag 1380gttggattta aaggcttcca aattgcagct gaaaaacaaa aggatattgt ctccattcat 1440tatgaaggaa gtgaatataa gctgtctcat ggatcagtgg tcattgctgc agttatcagt 1500tgtaccaata attgcaatcc atctgtcatg cttgctgcag gtcttttggc taaaaaggct 1560gttgaagctg gtctgcgtgt taaaccttat ataagaacaa gtttatctcc aggcagtggg 1620atggttacac attacctcag ttcaagtgga gtattaccat atctaagtaa gcttggattt 1680gaaatcgttg gctatggatg ttcaacttgt gtgggaaata cagcaccctt atcagacgca 1740gttttaaatg cagtaaaaca gggtgatttg gttacctgtg gtaattttat ctggaaaaaa 1800aattttgaag gtcgtctttg tgattgtgtt cgtgccaatt atcttgcctc tccaccctta 1860gtggtagctt atgccatagc aggcacagtg aatatagatt tccagacaga acctttaggt 1920actgacccca ccggcaagaa catttacctg catgatattt ggcctagtcg agaagaagtt 1980catcgagtag aggaagaaca tgttatacta tccatgttta aagcattaaa agataaaata 2040gaaatgggga ataaacggtg gaattcctta gaagcaccgg attcagtttt gtttccatgg 2100gacttaaagt ctacttatat cagatgccct tcattttttg ataaacttac caaagagcca 2160attgcactcc aggctattga aaatgcccat gtcttattat atttgggaga ctctgtcaca 2220acagatcata tatcacctgc aggaagtatc gctaggaata gtgctgccgc taagtatttg 2280acaaacagag gccttacccc tcgtgaattc aactcttacg gagctcgaag aggtaatgat 2340gctgtaatga caagaggcac ttttgcaaat atcaagcttt ttaataagtt tattggaaaa 2400ccagctccta aaacaattca ttttccatca ggacagacgc tagatgtatt tgaggctgca 2460gagctgtacc agaaagaagg tatcccactg attattttag caggaaagaa atatggttca 2520ggaaactcca gagactgggc tgccaaagga ccgtatttac tgggtgtgaa agctgttttg 2580gccgaaagtt atgaaaaaat acacaaagat catttgattg gaattggcat agctccactt 2640cagttccttc caggagaaaa tgcagattcc ttgggcctct ccggtagaga aacattttct 2700ttaacatttc ctgaagaact gtctcctgga attacattga atatacagac aagcactgga 2760aaagtattca gcgtgattgc ttcgtttgaa gatgatgtgg aaataacatt atacaaacat 2820ggaggattat taaactttgt ggcacgaaaa ttctcatagt atctact 2867<210>18<211>952<212>PRT<213>Homo Sapiens<400>18Tyr Leu Ile Glu Thr Leu Asn Asp Ser Ser His Lys Lys Phe Phe Asp1 5 10 15
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Phe Glu Asp Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Lys His Gly Gly Leu Leu930 935 940Asn Phe Val Ala Arg Lys Phe Ser945 950<210>19<211>3770<212>DNA<213>Rattus Norvegicus<400>19tgaggccggc gatggactcc ccaagtgcag gatacacctt tgagtacctt attgaaacat 60taaatggcag ttcacagaag aagttcttca atgtacctaa acttggaggc accaagtatg 120atattctgcc ttactcaata cgggtcctat tggaagctgc tgtacgaaat tgtgatggat 180ttttaatgaa aaaggaagat gttataaata ttttggactg gaaaaccaaa caaagcaatg 240ttgaagtgcc ctttttcccc gcccgtgttg ttcttcaaga tttcactgga ataccggcaa 300tggtggattt tgctgctatg agggaggcaa tgaaaactct tggaggtgat cctaagaaag 360tccaccctgc ctgtccaaca gatctcacag ttgaccactc tttacagatt gacttcagta 420aatgtgcaat acagaatgca ccaaatcctg gaggtggtga cctacagaaa gcaggaaagc 480tctctccact taaagtacag cctaagaagc ttccatgtcg aggccagact acctgccggg 540gatcgtgtga ttctggagaa ctaagccgaa actcaggaac attttcttcg cagattgaga 600atacgcctgt cctgtgtccc tttcatttgc aaccagtgcc tgaacctgag acggtgttaa 660aaaatcaaga agtagaattt ggcagaaatc gagagaggct tcaatttttc aagtggagct 720caggagcttt taagaatgtg gcagtcatcc ctcctggaac tggaatggct catcaagtga 780acttagaaca tttgtcgaga gtagtgtttg aagaagccga cctgctcttc ccagacagcg 840taattggcac agattctcat ataaccatgg tgaatggatt gggaattctt gggtggggag 900ttggaggcat tgagacagag gcagttatgc ttggcctgcc agttactctt actttaccag 960aggtggttgg atgtgagcta actgggtcat ccaatgcttt tgttacatcc atagatattg 1020tcctaggcat tacaaagcac ctcaggcaag taggcgtggc tggaaagttt gttgagttct 1080ttggaagtgg agtttcacaa ttatctattg tcgatagaac tactatagca aacatgtgtc 1140ccgagtatgg tgctatcctc agctttttcc ctgttgacaa tgtgacacta cgacatttag 1200aacatacagg ttttgacaaa accaaacttg agtcaatgga agaatacctt aaagctgtga 1260aattgtttcg aaatgatgag aattcttcag aacctgaata ttctcaggtg atacagatta 1320atctgaattc aatagttgca tctgtcagtg gtccaaaaag gcctcaggat agagttgctg 1380taacagatat gaaaagtgat tttcaggctt gcttaaatga aaaggttgga tttaaaggct 1440tccaagttgc agcagaaaaa caaagtgata ctgtctcagt tcgttatgat ggaagtgagt 1500ataagctgtc ccatgggtcc gtggtcattg ctgcggttat cagctgtacc aataactgca 1560atccatcagt gatgctcgct gcaggtcttt tggctaaaaa ggctgttgaa actggtctac 1620gagttaaacc ttatataaga acaagtttgt ctccaggcag tgggatggtt acacattacc 1680tcagttcaag tggagtgtta ccctacctta gcaagctagg gtttgaaata gttggctatg 1740gatgttcaac gtgtgtagga aatacagcac ctttatcaga agcaattttg aatgcagtaa 1800aacagggtga tttggctacc tgtggagttt tatctggaaa caaaaatttc gaaggtcgtc 1860tttgtgattg tgtccgtgct aattatctcg cctctccacc cttagtggtg gcttacgcca 1920tagcaggcac agtgaatata gatttccaga cagagccatt aggtactgac tctacaggca 1980agaacattta cctgcatgac atttggccta gtcgagaaga agttcatcag atagaagaag 2040aacatgttat tttgtccatg tttaaagcac tgaaagagaa agtagagatg ggaaataaac 2100ggtggaattc cttagacgct ccagattcag tgttgtttcc atgggatgtt aagtctactt 2160acatcagatg cccttcattt tttgataaac ttaccaaaga accagctgca tcccagccta 2220ttgaaaatgc ccatgtcctg ttgtacttgg gagactctgt cactacagac cacatatcac 2280ctgctggaag cattgctagg agcagagctg ctgctaagta cttgacaaac agaggcctta 2340ctccccgaga gttcaactct tatggagctc gaagaggtaa tgatgctgtg atgacaagag 2400gcacgtttgc aaacatcaag ctttttaata agtttattgg gaagccagct cccaaaacaa 2460ttcattttcc atcaggacag acgctcgatg tatttgaagc tgcagaatta taccaaaaag 2520aaggtatccc actgataatt ttagcaggaa aaaaatatgg ttcaggaaat tcaagagact 2580gggctgcgaa aggaccctat ttgctgggtg taaaggctgt tttggctgaa agctatgaaa 2640agatacacaa agatcatttg attggaattg gtatagcacc acttgagttc ctcccaggag 2700
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705 710 715 720Pro Ser Phe Phe Asp Lys Leu Thr Lys Glu Pro Ala Ala Ser Gln Pro725 730 735Ile Glu Asn Ala His Val Leu Leu Tyr Leu Gly Asp Ser Val Thr Thr740 745 750Asp His Ile Ser Pro Ala Gly Ser Ile Ala Arg Ser Arg Ala Ala Ala755 760 765Lys Tyr Leu Thr Asn Arg Gly Leu Thr Pro Arg Glu Phe Asn Ser Tyr770 775 780Gly Ala Arg Arg Gly Asn Asp Ala Val Met Thr Arg Gly Thr Phe Ala785 790 795 800Asn Ile Lys Leu Phe Asn Lys Phe Ile Gly Lys Pro Ala Pro Lys Thr805 810 815Ile His Phe Pro Ser Gly Gln Thr Leu Asp Val Phe Glu Ala Ala Glu820 825 830Leu Tyr Gln Lys Glu Gly Ile Pro Leu Ile Ile Leu Ala Gly Lys Lys835 840 845Tyr Gly Ser Gly Asn Ser Arg Asp Trp Ala Ala Lys Gly Pro Tyr Leu850 855 860Leu Gly Val Lys Ala Val Leu Ala Glu Ser Tyr Glu Lys Ile His Lys865 870 875 880Asp His Leu Ile Gly Ile Gly Ile Ala Pro Leu Glu Phe Leu Pro Gly885 890 895Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gly Leu Ser Gly Arg Glu Val Phe Ser Leu900 905 910Ser Phe Pro Glu Glu Leu Phe Pro Gly Ile Thr Leu Asn Ile Lys Thr915 920 925Ser Thr Gly Lys Glu Phe Ser Val Ile Ala Ala Phe Glu Asn Asp Val930 935 940Glu Ile Thr Leu Tyr Lys His Gly Gly Leu Leu Asn Phe Val Ala Arg945 950 955 960Lys Phe Leu
權(quán)利要求
1.一種純化或分離的核酸，其含有編碼對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2的氨基酸殘基136-216的肽環(huán)的序列，其中該序列在肽環(huán)中有一個(gè)突變，該突變干擾了肽環(huán)中存在的半胱氨酸殘基進(jìn)行氧化的能力。
2.權(quán)利要求1的純化或分離的核酸，其中該核酸序列至少含有SEQ.ID.Nos.3、5、7、9、11、13、15之一。
3.權(quán)利要求1的純化或分離的核酸，其中該核酸序列編碼含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的序列的肽。
4.一種純化或分離的多肽，其含有編碼對(duì)應(yīng)于人野生型IRP-2的氨基酸殘基136-216的肽環(huán)，其中該序列在肽環(huán)中具有一個(gè)突變，該突變干擾了肽環(huán)中存在的半胱氨酸殘基進(jìn)行氧化的能力。
5.權(quán)利要求4的純化或分離的多肽，其中該IRP-2蛋白含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的序列。
6.權(quán)利要求4的純化或分離的多肽，其中該IRP-2蛋白選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16。
7.一種鑒定需要神經(jīng)變性疾病治療或預(yù)防的患者的方法，包括從該患者獲得含多核苷酸或蛋白質(zhì)的生物樣品；制備一種探針，該探針選自可與野生型或突變IRP-2蛋白相互作用的探針，和可與編碼野生型或突變IRP-2蛋白的多核苷酸相互作用的探針；在允許探針與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的條件下，使生物樣品與該探針接觸；檢測(cè)與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的探針的量；通過(guò)用生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)測(cè)定探針的存在與否，確定患者為需要神經(jīng)變性疾病治療或預(yù)防的患者。
8.權(quán)利要求7的方法，其中該探針選自核酸、蛋白質(zhì)和擬肽。
9.權(quán)利要求7的方法，其中與多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用的探針含量的檢測(cè)包括采用選自熒光激活細(xì)胞分選(FACs)、免疫沉淀、Western印跡、免疫層析、抗體染色和雜交測(cè)定的技術(shù)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病。
11.一種制備用于神經(jīng)變性疾病診斷的探針的方法，包括生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求4的多肽；和生產(chǎn)可與突變多肽上存在的表位結(jié)合的抗體，其中該抗體不與野生型IRP-2蛋白或其片段交叉反應(yīng)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該突變體含有半胱氨酸殘基的置換或缺失。
13.權(quán)利要求11的方法，其中該生產(chǎn)步驟包括培養(yǎng)產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞。
14.一種抗體，其能與含有選自SEQ.ID.Nos.4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)特異結(jié)合。
15.權(quán)利要求13的抗體，其中該抗體可與含有該蛋白質(zhì)的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽特異結(jié)合，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)半胱氨酸殘基的突變。
16.權(quán)利要求13的抗體，其中該抗體是一種單克隆抗體。
17.一種純化或分離的抗體，它能特異結(jié)合突變IRP-2蛋白，但不能特異結(jié)合野生型IRP-2蛋白，其中該突變IRP-2蛋白在對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.Nos.2的氨基酸序列的肽環(huán)中含有一個(gè)突變。
18.權(quán)利要求7的方法，其中確定患者為需要神經(jīng)變性疾病治療或預(yù)防的患者包括確定探針是否與生物樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用。
19.一種區(qū)別病人輕度認(rèn)知缺陷綜合征(MCI)與其它形式癡呆的方法，包括對(duì)患者進(jìn)行核磁共振成像(MRI)，以定量和/或監(jiān)測(cè)腦鐵；腦鐵的異常水平或分布表明存在MCI。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)變性疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。更具體而言，發(fā)現(xiàn)在關(guān)鍵半胱氨酸殘基處不能氧化的IRP－2蛋白形式是神經(jīng)變性疾病(包括但不限于阿爾茨海默病(AD))的診斷物。實(shí)施方案包括編碼突變IRP－2蛋白及其片段的核酸、突變IRP－2蛋白及其片段、抗突變IRP－2蛋白及其片段上存在的表位的抗體、制備這些核酸和多肽的方法，以及診斷動(dòng)物神經(jīng)變性疾病(如具有患AD或輕度認(rèn)知缺陷綜合征(MCI)危險(xiǎn)的人)的方法。根據(jù)核磁共振成像(MRI)測(cè)定，人腦中鐵的水平或分布能用來(lái)診斷AD和/或MCI。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1556815SQ01814854
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2001年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月4日
發(fā)明者W·M·克施, W M 克施, L·安頓, 克林, W·J·克林, 勒溫, D-K·康, 洛瓦特, R·L·勒溫, T·A·洛瓦特 申請(qǐng)人:洛馬林達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)中心, 由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國(guó)政府