專利名稱：哺乳動物配子和胚胎培養(yǎng)基添加劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可提供細(xì)胞培養(yǎng)有效環(huán)境地培養(yǎng)基。更明確地說，本發(fā)明涉及精制培養(yǎng)基添加劑，其含有從非常規(guī)途徑制得的成分，當(dāng)加入培養(yǎng)基中可避免現(xiàn)有培養(yǎng)基的問題。
背景技術(shù)：
多年以來，哺乳動物胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑一直從動物體液、特別是從血清取得。盡管血清型培養(yǎng)基添加劑對培養(yǎng)特定類型的細(xì)胞和組織有一定功效，但是也有不足之處。血清型培養(yǎng)基添加劑對細(xì)胞培養(yǎng)來說不理想，主要原因之一是此培養(yǎng)基可能受到動物體液中雜質(zhì)、毒素、感染源的污染。另外，由于采血動物不同，生活環(huán)境各異，所以獲得的體液成分和濃度都不一樣。人們已經(jīng)認(rèn)識到，血清型培養(yǎng)基一個重要方面是培養(yǎng)基中要求有高分子物質(zhì)的存在。在一項(xiàng)模擬血清型產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)中，研究者試圖加入合成高分子物質(zhì)如聚乙烯醇來替代血清中的高分子物質(zhì)，如白蛋白。然而，由于血清是大量不確定的化學(xué)物質(zhì)，從培養(yǎng)基中去除血清并試圖只用大分子替代來生產(chǎn)培養(yǎng)基，其效果并不理想或由于多種原因根本無效，因?yàn)榕囵B(yǎng)基缺乏必要的成分。
因此，需要和基于血液制品的培養(yǎng)基添加劑一樣有效的培養(yǎng)基添加劑，同時消除潛在的污染源。此外，還需要標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。發(fā)明概述
本發(fā)明描述了一種新的基于生理的成分完全明確的哺乳動物胚胎細(xì)胞和配子培養(yǎng)基添加劑。這種培養(yǎng)基添加劑可用于體外受精培養(yǎng)基、胚胎移植培養(yǎng)基和用于哺乳動物移植前胚胎冷藏培養(yǎng)基，同時也可用作胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑或用于本領(lǐng)域已知其他相似培養(yǎng)基。本發(fā)明添加劑含有重組人白蛋白(rHA)、發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖和/或檸檬酸鹽及其組合物。在培養(yǎng)基中加入這種添加劑可產(chǎn)生與加入從血液純化的血清白蛋白同樣的培養(yǎng)效果。發(fā)明詳述
這種添加劑用于培養(yǎng)基時，可包含任何合適濃度的重組人白蛋白(rHA)。如本文詳述，使用rHA比使用天然存在人血清白蛋白(HAS)有很多優(yōu)點(diǎn)。
典型地，當(dāng)添加劑含有rHA，添加劑可按培養(yǎng)基總體積按比例加入，含量在約0.1mg/ml到20.0mg/ml之間。在一個實(shí)施方案中，按培養(yǎng)基總體積加入約0.5mg/ml到5.0mg/ml的rHA。
加入發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖(HYN)可增強(qiáng)添加劑的作用。在培養(yǎng)基添加劑中加入發(fā)酵HYN經(jīng)證明有效。
本文所用的短語“增加配子或胚胎細(xì)胞生存力”是指包括促進(jìn)培養(yǎng)胚胎發(fā)育到胚泡階段、體外提高透明帶孵化能力、和/或比較于在同樣的培養(yǎng)基中不含有本發(fā)明添加劑，用含有本發(fā)明添加劑進(jìn)行胚胎培養(yǎng)時，胚胎在胚胎培養(yǎng)基中的整體生存力提高。
并且，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中加入發(fā)酵HYN可顯著提高胚泡的冷藏存活率。使用發(fā)酵HYN相比較于使用天然存在的溫血脊椎動物來源的HYN(如純化自雞冠或臍帶)有若干優(yōu)點(diǎn)。使用發(fā)酵HYN相比較于使用天然存在的溫血脊椎動物來源的HYN，控制不同來源以及批次的HYN的安全性和穩(wěn)定性的能力顯著提高。
如果含有發(fā)酵HYN時，則發(fā)酵HYN含量按培養(yǎng)基總體積計(jì)通常為0.1mg/ml到5.0mg/ml濃度。在一個實(shí)施方案中，加入了按培養(yǎng)基總體積計(jì)算約0.125mg/ml到約1.0mg/ml的發(fā)酵HYN。
加入檸檬酸鹽可進(jìn)一步增強(qiáng)添加劑的作用。在一個實(shí)施方案中，檸檬酸鹽和rHA都加入本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑，因?yàn)榱钊梭@奇地意外發(fā)現(xiàn)將檸檬酸鹽加入含有rHA的培養(yǎng)基添加劑后，使得rHA幾乎復(fù)制了HSA或牛血清白蛋白(BSA)的特性。檸檬酸鹽的加入對培養(yǎng)細(xì)胞有進(jìn)一步增強(qiáng)作用?？梢允褂糜糜诒绢I(lǐng)域已知培養(yǎng)基的任何檸檬酸鹽，包括但不限于檸檬酸膽堿、檸檬酸鈣、檸檬酸、檸檬酸鈉及其組合物。在一個實(shí)施方案中，使用檸檬酸鈉。檸檬酸鹽加入濃度按培養(yǎng)基總體積計(jì)算約0.1mM到約5.0mM。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)培養(yǎng)基總體積，加入檸檬酸鹽的濃度約0.1-1.0mM。
本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑包含任何有用組合的rHA、發(fā)酵HYN和/或檸檬酸鹽。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑和加入本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基不含非重組高分子或純化自動物來源的高分子物質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑和加入本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基不含非重組HSA或非發(fā)酵HYN。
本發(fā)明涉及上述培養(yǎng)基添加劑、含有所述培養(yǎng)基添加劑的培養(yǎng)基、所述培養(yǎng)基添加劑的生產(chǎn)方法、含有所述培養(yǎng)基添加劑的試劑盒和應(yīng)用本文所述培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)胚胎的方法。
本發(fā)明包括一種培養(yǎng)細(xì)胞材料的方法，在一個實(shí)施方案中培養(yǎng)胚胎，所述方法應(yīng)用本文所述培養(yǎng)基添加劑，在培養(yǎng)開始時加入所述培養(yǎng)基添加劑，或以補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)方式加入。而且，培養(yǎng)基添加劑成分可在培養(yǎng)基生產(chǎn)的不同時期一起或分別加入。
本發(fā)明添加劑可加入本領(lǐng)域已知的任何合適的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中，包括但不限于胚胎培養(yǎng)基、胚胎移植培養(yǎng)基和來源于任何哺乳動物種類胚胎冷藏培養(yǎng)基(包括冷藏和玻璃化程序)以及干細(xì)胞培養(yǎng)基。任何可支持胚胎或細(xì)胞生長發(fā)育的培養(yǎng)基都可應(yīng)用，例如包括碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基、Hepes緩沖或MOPS緩沖培養(yǎng)基或磷酸緩沖鹽水。培養(yǎng)基的例子有G1.2/G2.2、KSOM/KSOMaa、M16、SOF/SOFaa、MTF、P1、Earle’s、Hams F-10、M2、Heps-G1.2、PBS和/或Whitten’s。(Gardner和Lane，1999；Embryo Culture Systems；Handbook of In Vitro Fertilization，CRC Press，EditorsTrounson AO andGardner DK，2nd edition，Boca Raton，pp205-264.)。
rHA的生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個實(shí)施方案中，rHA從產(chǎn)生人白蛋白的遺傳修飾酵母菌中得到。一種用酵母制備rHA的方法參閱美國專利第5,612,197號。
發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖(HYN)可用本領(lǐng)域已知任何方法得到。一種方法是對馬鏈球菌進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。透明質(zhì)酸糖胺多糖是天然存在的聚合物，由連續(xù)的二糖單位N-乙酰葡萄糖胺和D-葡糖醛酸組成。透明質(zhì)酸糖胺多糖在體內(nèi)廣泛分布。發(fā)酵HYN分子量一般為2.3×106kD。用鏈球菌生產(chǎn)HYN本領(lǐng)域眾所周知的，可使用任何已知方法，包括在Cifonelli JA，Dorfman A中公開的方法。A族鏈球菌生物合成透明質(zhì)酸The uridine nucleotides of groups A Streptococcus.J.Biological Chemistry 1957；228547-557；Kjems E，Lebech K.Isolationof hyaluronic acid from cultures of streptococci in a chemically definedmedium.Acta Path.Microbiol.Scand.1976(Sect.B)；84162-164；Markovitz A，et al.The biosynthesis of hyaluronic acid by group AStreptococcus.J.Biological Chemistry 1959；234(9)2343-2350。
另一些化合物可加入本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑中。這些物質(zhì)包括生長因子，因?yàn)椴溉閯游锱咛ズ图?xì)胞通常具有許多生長因子受體，加入這些生長因子可增加培養(yǎng)物質(zhì)的生長率。這些生長因子包括但不限于胰島素，典型用量為0.1-100ng/ml；IGF II，一般用量為0.1-100ng/ml；EGF，典型用量為0.1-100ng/ml；LIF，典型用量為5-1000U/ml；PAF，典型用量為0.1-500μM；及其組合物。所有用量均按培養(yǎng)基添加劑要加入的培養(yǎng)基總體積計(jì)算。
培養(yǎng)基添加劑的制備有兩種方式，一種是獨(dú)立制備培養(yǎng)基添加劑，在培養(yǎng)基制成后加入其中，另一種方法是將所述培養(yǎng)基添加劑各成分在培養(yǎng)基制備過程中直接加入到培養(yǎng)基中。
舉例來說，本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑可如下獨(dú)立制備。培養(yǎng)基添加劑rHA可制成儲備液，加入水、鹽水或培養(yǎng)基制成濃度為50-500mg/ml的濃儲備液，通常為250mg/ml?；蛘?，配制250mg/ml的儲備液溶液。發(fā)酵HYN可用水、鹽水或培養(yǎng)基制成10-500mg/ml的濃儲備液，通常為500mg/ml。通過在瓶中加入水、鹽水或培養(yǎng)基并在溶液中加適量HYN制得。然后劇烈振搖或用攪拌棒混和使HYN溶解?？稍?ml溶液中加入500mg HYN制備500ng/ml溶液。檸檬酸鹽可加入水、鹽水或培養(yǎng)基制備5-500mM的濃儲備液，通常為500mM。對于500mM的儲備液，可在10ml溶液中加入0.9605g檸檬酸。rHA、發(fā)酵HYN和檸檬酸鹽儲備液一起加入制備單一添加劑溶液，然后將其加入最終培養(yǎng)基中得到100×濃儲備液。10ml培養(yǎng)基中加入100μl添加劑即可。
rHA粉或儲備液可直接加入培養(yǎng)基中。下述實(shí)施方案僅僅是舉例性說明。250mg/ml的儲備液100μl加入9.9ml培養(yǎng)基中。發(fā)酵HYN粉或儲備液可直接加入培養(yǎng)基中。作為粉末，1.25mg HYN可加入10ml培養(yǎng)基中。或者125μl的1％儲備液可加入9.9ml培養(yǎng)基中。檸檬酸鹽粉或儲備液可直接加入培養(yǎng)基中。作為粉末，9.6mg可加入100ml培養(yǎng)基中；或者100μl50mM的儲備液可加入9.9ml培養(yǎng)基中。
本文引用的所有專利和公開出版物通過引用結(jié)合到本文中。
本文所述所有范圍包括所述范圍限度內(nèi)的所有組合或分組合；因此，“約0.1mg/ml到約20.0mg/ml”包括約0.125mg/ml到約11.5mg/ml、約1.0mg/ml到約15.0mg/ml等。
本發(fā)明培養(yǎng)基添加劑解決了幾個存在于本領(lǐng)域哺乳動物細(xì)胞、組織、胚胎和其他相關(guān)細(xì)胞物質(zhì)的培養(yǎng)問題。當(dāng)前培養(yǎng)基存在的一個問題是，培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞物質(zhì)、尤其是胚胎可能受到高分子血液制品如人白蛋白中存在的朊病毒和/或內(nèi)毒素的污染。本發(fā)明添加劑的一個優(yōu)點(diǎn)是，它排除了使用血液制品培養(yǎng)胚胎和其他哺乳動物細(xì)胞物質(zhì)帶來的潛在污染。
當(dāng)前培養(yǎng)基存在的另一個問題是，當(dāng)使用血液制品如血清白蛋白或其他天然存在物質(zhì)時，標(biāo)準(zhǔn)化這些培養(yǎng)基十分困難。不僅如此，當(dāng)培養(yǎng)基中血液制品的天然存在的不確定因素和污染物被排除之后，本發(fā)明使得更容易純化最終培養(yǎng)產(chǎn)物。
本發(fā)明排除了使用生物蛋白時涉及的因有不確定因素，生物蛋白經(jīng)常受到其他分子的污染，并且這些蛋白的不同制劑、相同制劑不同批次之間差異巨大。因此，使用重組分子如rHA使得生理性培養(yǎng)基的制備以標(biāo)準(zhǔn)化方式進(jìn)行。這些制劑不含內(nèi)毒素、朊病毒并且與現(xiàn)在使用的培養(yǎng)基相比有更好的生理相容性。當(dāng)前的培養(yǎng)基包含其他合成高分子如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮，這些分子不能執(zhí)行重要的生理功能如結(jié)合生長因子，因此，使用這些培養(yǎng)基可導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞物質(zhì)培養(yǎng)效果較次。
可根據(jù)下述實(shí)施例更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易知道，本發(fā)明的具體組合物、方法和結(jié)果僅僅是說明性的，并不意味著對本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例實(shí)施例1
培養(yǎng)基G1.2/G2.2用下表1所示濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基。初步實(shí)驗(yàn)考察了用rHA替代純化自血液的白蛋白對培養(yǎng)基中遠(yuǎn)系繁殖小鼠胚胎發(fā)育的影響。受精卵在3種不同rHA濃度之一條件下培養(yǎng)4天。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，在G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。陰性對照組不用蛋白處理，陽性對照組使用5mg/mlHSA(血液制品)處理。結(jié)果見下表2。
表1儲備液A和B1.分別稱量各成分放入一個100ml燒瓶中。2.加50ml水(Extreme H2O或Biowittaker)。3.充分混和至所有成分溶解。4.再加入50ml水。5.混和均勻。6.使用0.2μm濾膜濾過。7.儲藏于4攝氏度。儲備液C-T1.稱量組分放入一個10ml試管。2.加10ml水(Extreme H2O或Biowittaker)。3.混和均勻至溶解。4.使用0.2μm濾膜濾過。5.儲藏于4攝氏度。胚胎培養(yǎng)基制備-部分IEDTA儲備液1.稱量0.029gEDTA放入一個10ml試管。2.稱量0.4gNaOH放入另一個10ml試管。3.將10ml水(Extreme H2O或Biowittaker)加入NaOH中，混和至溶解。4.將220μlNaOH加入EDTA中。5.混和至溶解。6.將9.8ml水加入EDTA中。7.將90ml水加入100ml燒瓶。8.將10mlEDTA溶液加入90ml水中。9.使用0.2μm濾膜濾過。10.儲藏于4攝氏度。
表2*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
對培養(yǎng)胚胎發(fā)育來講，rHA在至少1.25-2.5mg/ml濃度范圍內(nèi)可以取代HAS。實(shí)施例2
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。
初步實(shí)驗(yàn)考察了用HYN替代純化自血液的白蛋白對培養(yǎng)遠(yuǎn)系繁殖小鼠胚胎發(fā)育的影響。受精卵在4種不同HYN濃度之一條件下培養(yǎng)4天。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，在G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。陰性對照組不用蛋白處理。結(jié)果見下表3。
表3*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
發(fā)酵HYN在至少0.125到0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)可刺激小鼠胚胎發(fā)育。實(shí)施例3
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察了用rHA及發(fā)酵HYN替代純化自血液的白蛋白對培養(yǎng)遠(yuǎn)系繁殖小鼠胚胎發(fā)育的影響。受精卵培養(yǎng)4天。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，在G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。結(jié)果見下表4。
表4*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
使用rHA和發(fā)酵HYN一起培養(yǎng)，可顯著提高內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(ICM)的發(fā)育。因?yàn)镮CM發(fā)育與發(fā)育成活胚胎的能力線性相關(guān)，％ICM增加可能意味著生存力提高。實(shí)施例4
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)考察了用rHA及發(fā)酵HYN替代純化自血液的白蛋白對轉(zhuǎn)入受體小鼠后遠(yuǎn)系繁殖小鼠胚胎發(fā)育的影響。受精卵培養(yǎng)4天，然后在胚泡階段轉(zhuǎn)入受體母鼠。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后放入G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。結(jié)果見下表5。
表5
使用rHA和發(fā)酵HYN一起培養(yǎng)，對培養(yǎng)胎兒發(fā)育與含有添加劑HSA(血液制品)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的作用相同。實(shí)施例5
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基，檸檬酸鹽以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定在培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加rHA、發(fā)酵HYN及檸檬酸鹽是否可增進(jìn)培養(yǎng)小鼠胚胎發(fā)育。在檸檬酸鹽存在或不存在情況下用rHA及HYN自受精卵培養(yǎng)胚胎48h。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。結(jié)果見下表6。
表6*與無檸檬酸鹽培養(yǎng)基具有顯著性差異，P＜0.05。
在含rHA和發(fā)酵HYN培養(yǎng)基中加入檸檬酸鹽可顯著增強(qiáng)胚胎發(fā)育。實(shí)施例6
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基，檸檬酸鹽以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定在培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加rHA、發(fā)酵HYN及檸檬酸鹽是否可增進(jìn)培養(yǎng)小鼠胚胎發(fā)育。在檸檬酸鹽存在或不存在情況下用rHA及HYN自受精卵培養(yǎng)胚胎48h。胚胎在37℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2培養(yǎng)，培養(yǎng)體積10胚胎20μl培養(yǎng)基。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后放入G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。結(jié)果見下表7。
表7*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
由表7結(jié)果可見，加入檸檬酸鹽可顯著增強(qiáng)胚胎發(fā)育。實(shí)施例7
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基，檸檬酸鹽以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。
初步實(shí)驗(yàn)在母牛體內(nèi)考察了用rHA或發(fā)酵HYN或rHA與發(fā)酵HYN一起替代純化自血液的白蛋白(牛血清白蛋白，BSA)對培養(yǎng)受精卵發(fā)育的影響。受精卵培養(yǎng)6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2于500μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后放入G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時。結(jié)果見下表8。
表8*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
使用rHA和發(fā)酵HYN一起培養(yǎng)，對培養(yǎng)牛胎兒發(fā)育的作用與在含BSA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同。實(shí)施例8
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基，檸檬酸鹽以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。
后續(xù)實(shí)驗(yàn)在母牛體內(nèi)考察了用rHA在含有不含檸檬酸鹽的情況下替代純化自血液的白蛋白(牛血清白蛋白，BSA)對培養(yǎng)受精卵發(fā)育的影響。受精卵培養(yǎng)6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2于500μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后放入G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時。結(jié)果見下表9。
表9*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
添加rHA和檸檬酸鹽一起培養(yǎng)，對母牛胎兒發(fā)育的作用與含有BSA的培養(yǎng)基培養(yǎng)相同。實(shí)施例9
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。rHA以250mg/ml儲備液200μl加入9.8ml培養(yǎng)基，發(fā)酵HYN以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基，檸檬酸鹽以×100儲備液100μl加入10ml培養(yǎng)基。
后續(xù)實(shí)驗(yàn)在母牛體內(nèi)考察了在rHA和檸檬酸鹽中加入發(fā)酵HYN對培養(yǎng)受精卵發(fā)育及隨后使其冷藏能力的影響。受精卵培養(yǎng)6到7天。胚胎在38.5℃、6％CO2∶5％O2∶89％N2于500μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)。胚胎在G1.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時后放入G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時。胚泡進(jìn)行染色確定細(xì)胞數(shù)或冷藏然后解凍評價(jià)存活率。結(jié)果見下表10。
表10*不同上標(biāo)表示顯著性差異，P＜0.05。
培養(yǎng)基中添加rHA、檸檬酸鹽和發(fā)酵HYN，可顯著提高胚泡凍融存活能力。實(shí)施例10
培養(yǎng)基G1.2/G2.2如實(shí)施例1所述用濃儲備液制得。
本實(shí)驗(yàn)考察了在rHA和HYN存在下培養(yǎng)CF1小鼠胚胎對胚胎凍融存活能力的影響。CF1小鼠胚胎培養(yǎng)到胚泡階段并評價(jià)了發(fā)育情況和凍融程序的存活能力。
表11*與HAS具有顯著性差異，P＜0.05。
從這些結(jié)果可清楚地看到，與用HSA培養(yǎng)胚泡相比，用rHA或rHA和HYN一起培養(yǎng)可顯著增加融化后胚泡孵育率(P＜0.05)。
冷藏后培養(yǎng)長出胚泡能力也做了評定。ICM和TE的生長以數(shù)字0-3表示，0表示沒有生出而3表示充分生長。證實(shí)生長與生存力相關(guān)(Lane和Gardner，1997)。
表12*與HAS具有顯著性差異，P＜0.05。
由表12可知，相比較于用人血清白蛋白培養(yǎng)胚胎，在含rHA或HYN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎可使ICM發(fā)育程度提高。實(shí)施例11
本實(shí)施例說明了含有rHA、HYN和檸檬酸鹽的培養(yǎng)基使得冷藏的額外胚泡成功膨脹。
在本實(shí)施例中，捐贈的冷藏人原核胚胎融化后在培養(yǎng)基G1.3中培養(yǎng)48小時，然后，根據(jù)美國專利申請第09/201,594號內(nèi)容進(jìn)行下述變化，在G2.3培養(yǎng)基中培養(yǎng)。G1.2-G1.3培養(yǎng)基中含1.0到1.8濃度的MgSO4及1.8-1.0濃度的CaCl2。G2.2-G2.3培養(yǎng)基的變化情況與G1培養(yǎng)基變化情況相同，都加入半濃度的必需氨基酸，沒有煙酰胺、肌醇和葉酸。
兩種培養(yǎng)基都添加2.5mg/ml rHA和0.125mg/ml HYN。胚胎冷藏溶液為4.5％甘油、0.1M蔗糖(10min)，然后為9％甘油和0.2M蔗糖(7min)。將胚胎放入-6℃冷藏機(jī)，接種并保持10min，然后每分鐘降溫0.5℃直至-32℃。將胚胎投入液氮中。融化后立即將胚胎在500nl新鮮G2.3培養(yǎng)基中各自培養(yǎng)4小時，之后分別放入10μl G2.3中過夜培養(yǎng)。所有培養(yǎng)條件均為5％O2∶6％CO2∶89％N2。500nl培養(yǎng)基樣本冷藏并使用超顯微熒光分析。還檢測了融化胚胎對蔗糖和丙酮酸鹽的攝入。
表13實(shí)施例12
本實(shí)施例應(yīng)用了Gardner等1988和Schoolcraft 1999概述的IVA方案。
本實(shí)施例說明了含rHA、HYN和檸檬酸鹽的培養(yǎng)基對人胚胎發(fā)育的有益作用。
表1權(quán)利要求
1.一種哺乳動物培養(yǎng)基添加劑，它包含重組人白蛋白和發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖，其中所述添加劑增強(qiáng)用含所述添加劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)的配子或胚胎細(xì)胞的生存力。
2.權(quán)利要求1的添加劑，它還包含檸檬酸鹽。
3.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述添加劑不含一種或多種以下組分非重組大分子、非重組人白蛋白、溫血脊椎動物來源的透明質(zhì)酸糖胺多糖以及它們的各種組合。
4.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述重組人白蛋白加入培養(yǎng)基時，其濃度范圍為約0.5mg/ml到約5.0mg/ml。
5.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖加入培養(yǎng)基時，其濃度范圍為約0.1mg/ml到約1.0mg/ml。
6.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述檸檬酸鹽加入培養(yǎng)基時，其濃度范圍為約0.1mM到約1.0mM。
7.權(quán)利要求1的添加劑，它還包含可支持胚胎或細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基選自G1.2/G2.2、KSOM/KSOMaa、M16、SOF/SOFaa、MTF、P1、HTF、Earle’s、Hams F-10、M2、Hepes-G1.2、Whitten’s和PBS。
8.權(quán)利要求7的添加劑，其中所述可支持細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基支持胚胎發(fā)育。
9.權(quán)利要求7的添加劑，其中所述可支持細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基支持哺乳動物干細(xì)胞發(fā)育。
10.一種哺乳動物培養(yǎng)基，它包含重組人白蛋白和可支持細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求10的哺乳動物培養(yǎng)基，它還包含檸檬酸鹽。
12.權(quán)利要求10的哺乳動物培養(yǎng)基，它還包含發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖。
13.權(quán)利要求11的哺乳動物培養(yǎng)基，它還包含發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖。
14.權(quán)利要求12的哺乳動物培養(yǎng)基，其中所述發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖按所述哺乳動物培養(yǎng)基總體積計(jì)的濃度范圍為約0.1mg/ml到約1.0mg/ml。
15.權(quán)利要求11的哺乳動物培養(yǎng)基，其中所述檸檬酸鹽按所述培養(yǎng)基總體積計(jì)的濃度范圍為約0.1mM到約1.0mM。
16.權(quán)利要求10的哺乳動物培養(yǎng)基，其中所述重組人白蛋白按所述培養(yǎng)基總體積計(jì)的濃度范圍為約0.5mg/ml到約5.0mg/ml。
17.一種哺乳動物培養(yǎng)基，它包含發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖和可支持細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基。
18.權(quán)利要求17的哺乳動物培養(yǎng)基，它還包含檸檬酸鹽。
19.權(quán)利要求17的哺乳動物培養(yǎng)基，其中所述發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖按所述培養(yǎng)基總體積計(jì)的濃度范圍為約0.1mg/ml到約1.0mg/ml。
20.權(quán)利要求18的哺乳動物培養(yǎng)基，其中所述檸檬酸鹽按所述培養(yǎng)基總體積計(jì)的濃度范圍為約0.1mM到約1.0mM。
21.一種制備哺乳動物培養(yǎng)基添加劑的方法，該方法包括向水、鹽水或培養(yǎng)基中加入重組人白蛋白制得哺乳動物培養(yǎng)基添加劑。
22.權(quán)利要求21的哺乳動物培養(yǎng)基添加劑制備方法，它還包括加入發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖。
23.權(quán)利要求21的哺乳動物培養(yǎng)基添加劑制備方法，它還包括加入檸檬酸鹽。
24.一種制備哺乳動物培養(yǎng)基添加劑的方法，該方法包括向水、鹽水或培養(yǎng)基中加入發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖制得哺乳動物培養(yǎng)基添加劑。
25.權(quán)利要求24的哺乳動物培養(yǎng)基添加劑制備方法，它還包括加入檸檬酸鹽。
26.一種哺乳動物培養(yǎng)基添加劑的試劑盒，它包括
(a)一種或多種選自以下的組分哺乳動物培養(yǎng)基、重組人白蛋白、發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖、檸檬酸鹽以及它們的各種組合；
(b)本試劑盒的使用說明書。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述試劑盒包括哺乳動物培養(yǎng)基，該哺乳動物培養(yǎng)基不含一種或多種以下組分非重組大分子、非重組人白蛋白和非發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖。
28.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述說明書指導(dǎo)如何制備不含一種或多種以下組分的培養(yǎng)基非重組大分子、非重組人白蛋白和非發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖。
29.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述說明書指導(dǎo)如何制備包含一種或多種以下組分的哺乳動物培養(yǎng)基按所述培養(yǎng)基總重量計(jì)，含量約0.5mg/ml到約5.0mg/ml的重組人白蛋白、約0.1mg/ml到約1.0mg/ml的發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖、濃度約0.1mM到約1.0mM的檸檬酸鹽及其各種組合。
30.一種哺乳動物培養(yǎng)基，其基本組成為
(a)可支持哺乳動物細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基；
(b)重組人白蛋白，其含量為約0.1mg/ml到約20.0mg/ml；
(c)發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖，其含量為約0.1mg/ml到約5.0mg/ml；
(d)檸檬酸鹽，其濃度約0.1mM到約5.0mM。
31.權(quán)利要求30的培養(yǎng)基，其中可支持胚胎或細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基選自G1.2/G2.2、KSOM/KSOMaa、M16、SOF/SOFaa、MTF、P1、HTF、Earle’s、Hams F-10、M2、Hepes-G1.2、Whitten’s和PBS。
32.權(quán)利要求30的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基不含一種或多種以下組分非重組大分子、非重組人白蛋白、溫血脊椎動物來源的透明質(zhì)酸糖胺多糖以及它們的各種組合。
33.一種哺乳動物培養(yǎng)基添加劑，其基本組成的
(a)重組人白蛋白，其含量為約0.125mg/ml到約20.0mg/ml；
(b)發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖，其含量為約0.1mg/ml到約5.0mg/ml；
(c)檸檬酸鹽，其濃度約0.1mM到約5.0mM。
34.一種提高胚胎細(xì)胞生存力的方法，該方法包括在權(quán)利要求10的哺乳動物培養(yǎng)基中進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，其中所述胚胎生存力得到提高。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對培養(yǎng)哺乳動物配子和胚胎組織有用的添加劑和培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基包括至少一種重組人白蛋白、發(fā)酵透明質(zhì)酸糖胺多糖和檸檬酸鹽。由于所述培養(yǎng)基成分通過非常規(guī)途徑生產(chǎn)，所以培養(yǎng)基中不含病毒、朊病毒和內(nèi)毒素等污染成分。此外，由于培養(yǎng)基完全明確，避免了成分變動，從而使得哺乳動物細(xì)胞發(fā)育不受影響并且使得實(shí)驗(yàn)研究可進(jìn)行有意義的對比。
文檔編號C12N5/08GK1446256SQ0181380
公開日2003年10月1日 申請日期2001年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月9日
發(fā)明者D·K·加納, M·T·拉尼 申請人:維特羅萊夫公司