本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學領域，涉及一種與肺鱗癌輔助診斷相關的血清miRNA標志物及其應用。

背景技術：

肺癌(Lung Cancer)是當前全球最常見的惡性腫瘤之一。在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居首位。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85％。其中，肺鱗癌是NSCLC中最常見的亞型之一。雖然外科治療目前是肺鱗癌首選和最主要的治療方法，并且能對早期的肺鱗癌患者達到治愈的目的，但由于肺鱗癌患者早期臨床表現無明顯特異性，在我國早期診斷率仍較低。目前，低劑量CT檢查(Low-dose computed tomography(LDCT))是較為推薦的用于肺癌及肺部結節(jié)的篩查。但由于如高誤報率，潛在的過度診斷可能，過高的成本以及可能造成的輻射暴露危害等原因導致其使用受到一定限制。目前臨床應用最為廣泛的腫瘤標志物，如squamous cell carcinoma antigen(SCC)，carcinoembryonic antigen(CEA),neuronspecific enolase(NSE)and Cyfra 21-1，也缺乏一定的靈敏性和特異性。隨著基因組學、蛋白組學以及代謝組學等生物技術的發(fā)展，越來越多的生物標志物已被發(fā)現或研究。因此，發(fā)現新的能夠早期診斷肺鱗癌的標記物指日可待，從而促進肺鱗癌早期干預和治療，延長病人的生存期。

微小RNA(miRNAs)是一類長度在22個左右的核苷酸的小非編碼RNA分子，其通過轉錄后調控廣泛參與了各種生命活動過程，包括腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉移等。研究發(fā)現，miRNA的表達在腫瘤中有不同程度的上調和下調，為其能夠作為一種新興的腫瘤標志物奠定了基礎。已有研究發(fā)現，游離的miRNA能夠穩(wěn)定存在于外周血中，并且可以作為診斷腫瘤的無創(chuàng)標志物。多項研究表明，循環(huán)miRNA在胃癌、乳腺癌、結直腸癌等腫瘤中具有潛在診斷價值。因此，本研究利用Exiqon miRNAqPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相對定量法，通過對大樣本的肺鱗癌血清的研究，旨在尋找對肺鱗癌具有潛在診斷價值的血清miRNA。并對這些miRNA在肺鱗癌組織中以及外周血清外泌體中的表達進行驗證，以進一步明確其與肺鱗癌的關系。若根據這類miRNA設計針對于肺鱗癌的診斷試劑盒，將會推動我國肺鱗癌的診治水平，也為將來對肺鱗癌的進一步研究提供思路。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種與肺鱗癌輔助診斷相關的血清miRNA標志物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述血清miRNA標志物及其引物在制備肺鱗癌輔助診斷試劑盒以及在制備治療肺鱗癌的藥物中的應用。

本發(fā)明的又一目的在于提供用于肺鱗癌輔助診斷和治療的試劑盒及藥物。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種與肺鱗癌輔助診斷相關的血清miRNA標志物，該標志物為miR-106a-5p(AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG),miR-20a-5p(UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)和miR-93-5p(CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG)中的一種或多種。該血清miRNA標志物優(yōu)選為miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中兩種或兩種以上的組合，進一步優(yōu)選為miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p三種miRNA所組成的組合。

上述的血清miRNA標志物在輔助診斷肺鱗癌中的應用。

上述的血清miRNA標志物在制備肺鱗癌輔助診斷試劑盒或治療肺鱗癌藥物中的應用。

一種與肺鱗癌輔助診斷相關的血清miRNA標志物的引物，該引物包含miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中的一種或多種miRNA的引物；優(yōu)選為包含血清miRNA中miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物；進一步優(yōu)選為包含血清miRNA中miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p三種miRNA的引物。

上述的引物在輔助診斷肺鱗癌或制備肺鱗癌輔助診斷試劑盒中的應用。

一種肺鱗癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中的一種或多種miRNA；優(yōu)選為用于檢測血清miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中兩種或兩種以上miRNA；進一步優(yōu)選為用于檢測血清中的miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p三種miRNA。

一種肺鱗癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒中含有血清miRNA中miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中的一種或多種miRNA的引物；優(yōu)選為含有血清miRNA中miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物；進一步優(yōu)選為含有血清miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p三種miRNA的引物。

該試劑盒還可以包括PCR技術常用試劑，如逆轉錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等；還可以含有標準品和/或對照品。

本發(fā)明所涉及的與肺鱗癌診斷相關的血清miRNA標志物miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p中的每種miRNA的序列均已公開，但是將各miRNA標志物單獨或進行組合作為肺鱗癌輔助診斷標志物需要本領域技術人員付出創(chuàng)造性勞動。各miRNA標志物的擴增引物均可通過市場購買獲得，本發(fā)明實施例中使用的血清miRNA標志物的引物為購自廣州銳博公司所合成生產的特異性miRNA莖環(huán)RT-PCR引物。

具體地說，本發(fā)明解決問題的技術方案包括：(1)建立統(tǒng)一標準的標本庫和數據庫：以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)血清miRNA差異表達譜分析：分析肺鱗癌和正常對照人群中差異表達的血清miRNA，并對差異表達miRNAs進行進一步大樣本多階段驗證。(3)通過多階段的驗證，明確這些miRNA診斷肺鱗癌的能力。(4)血清miRNA診斷試劑盒的研制：根據肺鱗癌患者與正常人群血清中的差異表達miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒，實現對肺鱗癌患者的無創(chuàng)輔助診斷。(4)分析這些miRNA在肺鱗癌組織以及外泌體中的表達情況，揭示這些miRNA與肺鱗癌的關系，為將來研制可能與這些miRNA相關的治療肺鱗癌的藥物提供依據。

本發(fā)明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學資料、臨床資料，并采用了Exiqon miRNAqPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。

具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：

1.研究樣本選擇：初治、未行手術以及放化療干預且經病理確認為肺鱗癌的患者。正常對照為在醫(yī)院進行體檢的正常人群。

2.Exiqon miRNAqPCR panel芯片初篩：利用TRIZOL-LS試劑對血清混合樣本進行RNA提取，并進行qRT-PCR操作獲得初篩結果。

3.訓練集、驗證集：利用AM1556試劑盒(ABI公司)對每個血清樣本進行RNA提取，通過逆轉錄反應得到cDNA樣品，加入PCR引物和SYBR Green熒光染料進行PCR反應。4.利用TRIZOL-LS試劑提取肺鱗癌和癌旁組織中的RNA，ExoQuick試劑盒(SBI公司)和AM1556試劑盒(ABI公司)提取外泌體中的RNA，通過qRT-PCR的方法，檢測miRNA在組織以及外泌體中的表達差異。

5.統(tǒng)計分析：運用χ²檢驗、配對t檢驗以及非參數秩和檢驗比較miRNA表達水平在不同研究組中的差異。通過計算ROC曲線分析證實血清miRNA的診斷價值。

本發(fā)明研究組目前通過對肺鱗癌病人的外周血清中的miRNA進行系統(tǒng)的表達分析，現已發(fā)現了一組3個具有臨床診斷潛能的肺鱗癌血清microRNA標記物(miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p)。

本發(fā)明的有益效果：

1.相較于傳統(tǒng)的腫瘤標志物，血清miRNA作為新型的生物標志物，具有穩(wěn)定性好、微創(chuàng)易獲取、靈敏性和特異性高的特點。這類分子標志物的開發(fā)利用將為包括腫瘤在內的各種疾病的診斷以及進一步治療提供新的方向。

2.研究者通過Exiqon miRNAqPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的絕對定量法，對肺鱗癌和正常對照人群血清中的差異表達miRNA進行嚴密、多階段的驗證和評價。證實了這組miRNA作為診斷肺鱗癌的無創(chuàng)標記物的可靠性以及可重復性。

3.研究者發(fā)現miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p在肺鱗癌患者中的表達明顯高于正常對照組。同時，miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p在肺鱗癌患者組織以及血清外泌體中的表達也高于正常對照。這些結果將給未來研究這些miRNA對于肺鱗癌的機制以及針對這些miRNA對于肺鱗癌的治療提供新的思路。

附圖說明

圖1：實驗流程圖

圖2：在肺鱗癌血清中高表達的3個miRNA*:P<0.001

圖3：對所獲得的miRNA進行ROC曲線分析

a：訓練集，測試集和驗證集的合集；b：訓練集；c：測試集；d:驗證集。

圖4：3個miRNA在肺鱗癌組織中的表達情況*:P<0.05,**P<0.001

圖5：3個miRNA在肺鱗癌患者血清外泌體中的表達情況*:P<0.001

具體實施方式

發(fā)明人于2012年至2015年從南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收集了大量的肺鱗癌患者和正常體檢人群的靜脈血清樣品，通過對樣品資料的整理，從中選擇了100例肺鱗癌和108例正常對照的樣本作為Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和后續(xù)一系列qRT-PCR驗證的實驗樣品。同時還留取了32例肺鱗癌組織和36例癌旁組織。所選擇的患者血清樣本均來自于初治、未行手術以及放化療干預且經病理確認為肺鱗癌的病人。并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學資料、臨床資料。

參照流程圖(圖1)，從肺鱗癌以及正常對照血清樣本中隨機選擇了30例肺鱗癌樣本以及10例正常對照，并且分別混合成了3例肺鱗癌血清混合樣本和1個正常混合樣本(一個混合樣本由10例200ul血清樣本匯合形成2ml的樣本)。對這4例混合樣本進行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和分析，具體步驟參照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的說明書：

1.血清抽提

取出血清樣品，樣品化凍后3000x g離心5min去除一些碎片及一些不溶成分。轉移250ul上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZOL-LS后，劇烈震蕩5s。

2.兩相分離

勻漿后樣品于15到30℃孵育5分鐘。每1ml的TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下13,000g離心15分鐘。

3.RNA沉淀

將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為：1ml TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加0.5ml的異丙醇和5ul的糖元。4℃靜置半小時，讓RNA盡可能的析出。于4℃13,000g離心15分鐘。

4.RNA清洗

移去上清液，每1ml TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。靜置10分鐘，然后4℃下10000g離心5分鐘。

5.重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。

6.測量濃度：

通常能得到～5μg RNA/50ml血清。

7.cDNA合成

(1)稀釋模板RNA：使用DEPC水將20－25ng模板RNA稀釋至14ul(終濃度為1.492－1.786ng/μl)。

(2)準備反應液：將5×Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震蕩混勻。Enzyme mix置于-20℃冰盒，使用前輕彈混勻后置于冰上。所有試劑均離心后使用。

(3)配置反應液：配置下表中的反應液

(4)混合并離心試劑：震蕩或者抽吸混勻反應液后離心，以保證所有溶液徹底混合均勻。

(5)逆轉錄反應及熱失活：將反應液于42℃溫育60分鐘后，于95℃溫育5分鐘以失活逆轉錄酶。

8.Real-Time PCR

試劑：

Nuclease free water(Exiqon)

SYBR^TM Green master mix(Exiqon)

cDNA模板

ROX(Invitrogen)

miRNA PCR ARRAY(Exiqon)

儀器：

ABI PRISM7900 system(Applied Biosystems)

(1)準備Real-time PCR試劑：將制備的cDNA模板，DEPC水和SYBR^TM Green master mix置于冰上溶解15-20分鐘。

(2)稀釋cDNA模板：將RT反應獲得的cDNA模板用nuclease free water稀釋110倍(例如，向20μl反應液中加入2180ul nuclease free water)。

(3)混合所有反應試劑：

A.將PCR板簡單離心后，移去封膜。

B.將110倍稀釋的cDNA模板與2×SYBR Green master mix按照1：1體積比混合。

C.倒置混勻反應液并離心

D.將混合反應液加入板中的每個孔

E.重新封好PCR板

(4)將PCR板簡單低溫離心

(5)Real-time PCR擴增：根據下表中的反應條件進行Real-time PCR擴增和溶解曲線分析。

Real-time PCR循環(huán)條件如下表：

數據分析：采用ΔΔCt方法

使用PCR儀器附帶的軟件進行初步數據分析，獲得原始的Cq值(Cp或Ct，依儀器不同名稱可能不同)。

我們建議使用GenEx qPCR分析軟件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)對數據進行標準和深入的數據分析。

a.計算每個處理組中的每個通路相關基因的ΔCt。

ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1 array

ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 2 array

b.計算2個PCR Array(或兩組)中每個基因的ΔΔCt。

ΔΔCt＝ΔCt(組2)-ΔCt(組1)

備注：通常組1是對照，組2是實驗組。

c.通過2-ΔΔCt計算組2與組1對應基因的表達差異。

在芯片初篩后，得到了如下表中的38個差異表達miRNA(3個肺鱗癌血清混合樣本中相對于正常樣本都超過了1.5倍差異)。

對于初篩得到的38個差異表達miRNA，通過訓練集，測試集和驗證集，采用基于qRT-PCR的相對定量法進行驗證，具體步驟為：

1.血清RNA提取：選用ABI公司血清RNA提取試劑盒(AM1556)，參照試劑盒說明，每個樣本吸取200ul進行提取RNA，并最后用100ul DEPC水進行溶解。

2.cDNA的制備：

1)采用50μL反應體系進行逆轉錄實驗

以上反應體系混勻，瞬時離心后，以下列程序進行反應：

2)上述反應之后再反應體系中再加入如下反應物

3.qPCR

1)采用5μL反應體系，按以下比例進行試驗

反應體系混勻，瞬時離心后，放置于實時定量PCR儀中，以下列程序進行反應：

反應結束后添加溶解曲線。

數據分析：通過Ct值可以獲得每個樣本中的miRNA的相對濃度。利用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，得到了一組在訓練集，測試集和驗證集中均一致于肺鱗癌血清中高表達的3個miRNA：miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p(在訓練集，測試集和驗證集中P值都小于0.05，圖2)。通過這3個miRNA，可以計算每個樣本的ROC曲線。如圖3，這3個miRNA組成的分子標志物能夠很好的區(qū)分肺鱗癌患者和正常人群。

研究組之后進一步檢測了這3個miRNA在肺鱗癌組織以及血清中外泌體的表達，肺鱗癌組織提取RNA利用TRIZOL，外泌體提取試劑盒為ExoQuick試劑盒(SBI公司)。200ul血清所提取出的外泌體用200ul DEPC水重懸后，利用AM1556試劑盒(ABI公司)對外泌體RNA進行提取，步驟同血清RNA提取過程。

運用非參數檢驗分析發(fā)現，miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p在肺鱗癌組織中的表達要高于癌旁組織(圖4)。miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-93-5p在肺鱗癌血清外泌體中的表達亦明顯高于正常人群(圖5)。

試劑盒包括一批血清miRNA qRT-PCR引物，還可以有相應PCR技術所需的常用試劑，如：逆轉錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，熒光探針，RNA酶抑制劑，Taq酶等，可根據具體采用的實驗方法選用，這些常用試劑都是本領域技術人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如定量標化的正常人樣本等)。此試劑盒的價值在于只需要血清而不需要其它組織樣品，通過最精簡的熒光法檢測血清樣本中miRNA的表達含量，來輔助診斷該樣本來源患者的罹患肺鱗癌的可能性。血清miRNA檢測方便，且定量精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導診斷以及進一步的個體化治療。