本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種柱頭外露基因鑒定和分子標記輔助育種的分子鑒定方法。

背景技術：

柱頭外露是指棉花中花器官的一種突變性狀。表現(xiàn)為植株現(xiàn)蕾后不久（一般12~20天），柱頭伸出，高出花冠，而雄蕊仍被包裹在花冠內，直到開花雄蕊才露出散粉，而且上半部（柱頭基部）雄蕊花藥往往表現(xiàn)壞死，導致柱頭授粉困難，成鈴率很低。由于柱頭外露的特性，這種種質也稱雌雄異熟系。這種突變體往往出現(xiàn)于棉花的海陸雜交后代中。前人研究結果表明柱頭外露性狀受2對隱性基因控制，即柱頭外露性狀攜帶基因型為ob1ob1ob2ob2，其中任一位點攜帶顯性基因則表型為野生型（正?；ǎ?。

由于柱頭外露材料自交率低，可不去雄雜交授粉，簡化制種工序，從而比人工去雄制種降低成本約40%以上；另外，從雜交種育種的雄性不育三系配套的角度，柱頭外露系可一系兩用，同時作為保持系和不育系，因此其在棉花的雜種優(yōu)勢利用上具有較大的應用價值。但是，在傳統(tǒng)依靠表型鑒定得育種程序中，由于每次回交轉育后都需要進行自交鑒定，以確柱頭外露基因在轉育和改良過程中沒有丟失，而柱頭外露受兩對隱性基因控制，柱頭外露單株在分離群體出現(xiàn)的概率較低，從而需要耗費大量的棉田、人力和財力。采用常規(guī)育種技術選育和改良柱頭外露材料需要較長年限。因此，如何通過分子標記輔助選擇方法穩(wěn)定可靠又快速簡便的進行柱頭外露材料的選育和改良成為本發(fā)明的關鍵核心。

分子標記直接從DNA水平反映出核苷酸序列的差異，它不受發(fā)育階段、環(huán)境因素以及基因是否表達的影響，具有數(shù)量非常豐富，遺傳穩(wěn)定等特點。目前，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，分子標記檢測技術已經(jīng)發(fā)展出幾十種技術可用于分子標記的篩選，比較常用的有RFLP 、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，隨著分子標記技術的不斷發(fā)展和應用，目前，國內外已經(jīng)越來越多的將各種分子標記技術應用在作物育種材料的分子標記輔助選擇育種中。等位基因特異擴增(AS-PCR)是指等位基因特異引物可以分別與野生型和突變型結合,進行特異擴增得到等位基因特異PCR產(chǎn)物，用以開發(fā)基因的功能標記。目前在其他作物中已有很多基于AS-PCR 的基因功能標記被開發(fā)出來。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種；解決了現(xiàn)有技術所存在等的技術問題。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術方案：本棉花柱頭外露基因的分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟（1）：對棉花柱頭外露基因進行DNA提?。?/p>

步驟（2）：以棉花柱頭外露基因ob1的序列特征為依據(jù)設計引物，

第一正向引物 5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’ （SEQ ID No.1），

第一反向引物 5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’ （SEQ ID No.2），

以SEQ ID No.1所示第一正向引物和SEQ ID No.2所示第一反向引物對步驟（1）得到的DNA進行PCR擴增，95℃預變性2min，94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

步驟（3）：以棉花柱頭外露基因ob2的序列特征為依據(jù)設計引物，

第二正向引物 5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’ （SEQ ID No.3），

第二反向引物 5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’ （SEQ ID No.4），

以SEQ ID No.3所示第二正向引物和SEQ ID No.4所示第二反向引物對步驟（1）得到的DNA進行PCR擴增，95℃預變性2min，94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

步驟（4），對步驟（2）和（3）得到的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測并采用銀染的方法染色，若步驟（2）產(chǎn)物在255出現(xiàn)特異性條帶，而步驟（3）產(chǎn)物在153bp處無擴增條帶，而且僅在145bp處有特異擴增條帶，則同時含有ob1和ob2基因，表現(xiàn)柱頭外露。

作為優(yōu)選，棉花柱頭外露基因進行DNA提取的具體方法為：

取棉花材料真葉期幼嫩葉片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于離心管中，然后向離心管中加入1000μlDNA提取液，混勻后，65℃水浴30min，且每間隔10min輕搖下；

水浴結束后，再向離心管中加入800μl苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，混合均勻后，離心分離；

吸取上清液，加入2μl濃度為10mg/ml RNase酶，混勻后，37℃水浴30min；然后再加入1000μl苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，混合均勻后，離心分離；

取上清液，加入體積為上清液體積0.7倍的異丙醇，靜置30min，絮狀DNA成團析出；

將絮狀DNA取出，用體積濃度為70%的乙醇浸泡，浸泡兩次，每次10min，再用無水乙醇浸泡過夜后，倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入ddH2O，溫室溶解2h，測定濃度后稀釋到25ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選，所述的DNA提取液中含有：0.05M Tris-Cl，0.01 M EDTA，2% SDS，1% PVP，0.5%山梨醇，0.705M NaCl和1% β-巰基乙醇，pH值為8.0，高壓滅菌；其中，1% β-巰基乙醇為使用前加入，體系中的%代表體積分數(shù)。

作為優(yōu)選，所述的混合溶劑中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。

作為優(yōu)選，所述的離心分離的速度為12000rpm，時間為10min。

作為優(yōu)選，所述步驟（2）具體方法如下：

取1μl濃度為25ng/μl的DNA溶液與9μl PCR反應液混合，進行PCR反應；其中，PCR反應液中含有以下物質：10×PCR Buffer 1.0μl，10mM dNTPs 0.2μl，25mM MgCL2 0.8μl，10mM SEQ ID No.1所示第一正向引物0.5μl，10mM SEQ ID No.2所示第二反向引物0.5μl，2U/μl TaqDNA聚合酶0.2μl和ddH2O 5.8μl。

作為優(yōu)選，步驟（4）具體方法如下：

向步驟（2）和（3）得到的擴增產(chǎn)物中分半加入2μl溴酚藍混勻，制備濃度為6%（質量比）的聚丙烯酰胺凝膠，在1×TBE的電泳緩沖液中電泳檢測；電泳結束后采用銀染的方法進行染色，具體步驟如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸餾水快速洗兩遍，在顯色液中顯色5min，直至條帶清晰為止；蒸餾水速洗兩遍，放入終止液中終止反應；若步驟（2）產(chǎn)物在255出現(xiàn)特異性條帶，而步驟（3）產(chǎn)物在153bp處無擴增條帶，而且僅在145bp處有特異擴增條帶，則為柱頭外露；若缺少任一特異性條帶，則不表現(xiàn)為柱頭外露。作為優(yōu)選，所述的電泳檢測的電泳電壓為220伏，電流為164毫安，時間為50min。

作為優(yōu)選，所述的固定液為40ml體積濃度為95%的乙醇、2ml的純乙酸和358ml的蒸餾水的混合溶液；所述的染色液的制備方法為將0.6g硝酸銀溶于 300ml蒸餾水，即得；所述的顯色液的制備方法為先將6g氫氧化鈉和5ml甲醛加入400ml蒸餾水中混合均勻后，再加入3ml的濃度為0.2%（質量比）硫代硫酸鈉溶液，混合均勻，即得；所述的終止液的制備方法為將3g碳酸鈉溶于400ml蒸餾水，即得。

與現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

（1）速度快：基因特異標記鑒定對輔助選育柱頭外露基因的棉花品系具有重要作用。在柱頭外露的回交轉育過程中，涉及大量的自交鑒定等試驗，并且需要調查大量的外部性狀，需要投入大量的時間、人力和物力，且易受環(huán)境因素影響，因此，常規(guī)手段并不能完全準確、真實地反映柱頭外露材料的遺傳情況。本發(fā)明只需提供棉花材料的種子或葉片，提取DNA后，用基因特異引物對進行分子標記鑒定，利用相應分子鑒定體系可以很快地鑒定出柱頭外露基因，同時利用本發(fā)明可以在柱頭外露育種的分子標記輔助選擇過程中有效跟蹤柱頭外露基因的存在與否，免去自交鑒定，從而極大加快柱頭外露選育和改良過程。

（2）準確率高：本發(fā)明的基因特異標記具有簡單、穩(wěn)定可靠、重復性好等優(yōu)點，很容易通過PCR快速擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。本發(fā)明利用一對基因特異引物對柱頭外露進行鑒定，其與柱頭外露性狀完全共分離，可靠性高，且分子鑒定不受環(huán)境因素的影響，真正從DNA水平上鑒定柱頭外露的遺傳情況，提高了準確性。

（3）實用簡單：本發(fā)明鑒定柱頭外露基因和分子標記輔助選擇育種的整個程序只是幾次機械式的加樣過程，易于操作，具有很好的商業(yè)化應用前景。

總之，本發(fā)明提供的基因特異標記及其引物能夠快速鑒定攜帶柱頭外露基因的棉花品系，其鑒定方法簡單實用，其鑒定結果準確可靠，所以本發(fā)明提供的基因特異標記及其引物能夠快速有效的輔助棉花育種，對推動育種進程起了決定性的作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基因特異引物在基因位置的示意圖；其中，虛線方框內區(qū)域為ob1和ob2相對于野生型基因缺失片段。

圖2為本發(fā)明柱頭外露材料及其后代的基因特異標記分析；其中， M：marker，1：陸地棉標準系“TM-1”，2：海島棉DH系“3-79”，3：柱頭外露材料“CS-B18”，其為以TM-1染色體組為背景，染色體18被3-79相應染色體代換的染色體代換系，4-43：從(TM-1×CS-B18)×CS-B18的BC1F1群體中隨機選取的40株柱頭外露單株，箭頭為特異條帶。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

Tris-Cl：三羥甲基氨基甲烷-鹽酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl]；EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid); SDS: 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate);PVP: 聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)

所有試劑購買自：生工生物工程（上海）股份有限公司；純度為：分析純。

1 、DNA提取

步驟1，取含柱頭外露的海島棉品種新海18、陸地棉標準系TM-1以及在TM-1×新海18的F2群體中隨機選取的30株柱頭外露單株共32個材料，于田間生長的5片真葉期取幼嫩葉片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于2ml的離心管中；加入1000μlDNA提取液，漩渦混勻后，65℃水浴30min，間隔10min左右輕搖下；所述的DNA提取液中含有：0.05M Tris-Cl，0.01 M EDTA，2% SDS，1% PVP，0.5%山梨醇，0.705M NaCl和1% β-巰基乙醇，pH值為8.0，高壓滅菌；其中，1% β-巰基乙醇為使用前加入，體系中的%代表體積分數(shù)；

水浴結束后，加入800μl體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，上下顛倒混勻至不分層，12000rpm離心10min；

吸取上清液轉移到另一2ml離心管中，加入2μl 10mg/ml RNase酶，混勻后37℃水浴30min；然后加入1000μl體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶劑，上下顛倒混勻至不分層，12000rpm離心10min；

用剪口槍頭吸取上清液轉移到另一2ml離心管中，加入0.7倍體積異丙醇緩慢搖動幾次，靜置30min，絮狀DNA成團析出；用剪口槍頭吸取DNA轉移至盛有70%乙醇的2ml硅化離心管中，浸泡兩次，每次十分鐘，再無水乙醇浸泡過夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入200μl ddH2O，溫室溶解2h，測定濃度后稀釋到25ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆?，得到DNA樣品。

2 基因特異標記：

以棉花柱頭外露基因ob1的序列特征為依據(jù)設計引物，

第一正向引物 5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’ （SEQ ID No.1），

第一反向引物 5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’ （SEQ ID No.2），

以SEQ ID No.1所示第一正向引物和SEQ ID No.2所示第一反向引物對步驟（1）得到的DNA進行PCR擴增，95℃預變性2min，94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

步驟（3）：以棉花柱頭外露基因ob2的序列特征為依據(jù)設計引物，

第二正向引物 5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’ （SEQ ID No.3），

第二反向引物 5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’ （SEQ ID No.4），

以SEQ ID No.3所示第二正向引物和SEQ ID No.4所示第二反向引物對步驟（1）得到的DNA進行PCR擴增，95℃預變性2min，94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

PCR反應液中含有以下物質：10×PCR Buffer 1.0μl，10mM dNTPs 0.2μl，25mM MgCL2 0.8μl，10mM SEQ ID No.1所示正向引物0.5μl，10mM SEQ ID No.2所示反向引物0.5μl，2U/μl TaqDNA聚合酶0.2μl和ddH2O 5.8μl。

擴增結束后，在步驟（2）、（3）擴增產(chǎn)物中加入2μl溴酚藍混勻，制備濃度為6%（質量比）的聚丙烯酰胺凝膠，在1×TBE的電泳緩沖液中電泳檢測，電泳電壓為220伏，電流為164毫安，時間為50min；電泳結束后采用銀染的方法進行染色，具體步驟如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸餾水快速洗兩遍，在顯色液中顯色5min，直至條帶清晰為止；蒸餾水速洗兩遍，放入終止液中終止反應；若步驟（2）產(chǎn)物在255出現(xiàn)特異性條帶，而步驟（3）產(chǎn)物在153bp處無擴增條帶，而且僅在145bp處有特異擴增條帶，則為柱頭外露；若缺少任一特異性條帶，則不表現(xiàn)為柱頭外露。

其中，所述的固定液為40ml體積濃度為95%的乙醇、2ml的純乙酸和358ml的蒸餾水的混合溶液；所述的染色液的制備方法為將0.6g硝酸銀溶于 300ml蒸餾水，即得；所述的顯色液的制備方法為先將6g氫氧化鈉和5ml甲醛加入400ml蒸餾水中混合均勻后，再加入3ml的濃度為0.2%（質量比）硫代硫酸鈉，混合均勻，即得；所述的終止液的制備方法為將3g碳酸鈉溶于400ml蒸餾水，即得。

結果如圖1、圖2所示，43個材料以ob01引物對（SEQ ID No. 1和2）進行擴增，在255bp有特征帶，41個柱頭外露類型材料都擴增出特征帶。43個材料以ob2引物對（SEQ ID No. 3和4）進行擴增，在145bp有特征帶，41個柱頭外露類型材料都擴增出特征帶。

其中序列表:

SEQ ID No.1

5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’；

SEQ ID No.2

5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’；

SEQ ID No.3

5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’；

SEQ ID No.4

5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’。

本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。

SEQ ID No.1

5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’；

SEQ ID No.2

5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’；

SEQ ID No.3

5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’；

SEQ ID No.4

5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’