專利名稱：：亞基因組特異性等位基因在棉花中的差異表達(dá)及其用途的制作方法亞基因組特異性等位基因在棉花中的差異表達(dá)及其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，更具體地，涉及分子生物學(xué)技術(shù)用于文造產(chǎn)纖維植物(特別是棉花植物)和/或加速對此類含纖維植物的培育的用途。本發(fā)明提供了改造纖維品質(zhì)的方法和手段，例如，增加纖維長度(特別是棉絨纖維長度)或用于減少絨毛(fuzz)纖維的長度。本發(fā)明還提供了在多個棉花品種和相關(guān)祖先植物中鑒定與纖維長度相關(guān)的分子標(biāo)記的方法。此外，本發(fā)明提供了具有纖維優(yōu)先或纖維選擇性表達(dá)模式的植物啟動子。啟動子還被暫時調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
：棉花提供了很多用于紡織工業(yè)的高品質(zhì)纖維。對棉花纖維特征進(jìn)行修飾使其更好地適應(yīng)工業(yè)需求，是通過經(jīng)典方法或通過對棉花植物的基因組遺傳改造來進(jìn)行培育中的重大努力。世界范圍內(nèi)種植的棉花中大約卯％都是陸地棉(GW^/;/w/m/^sw似附L.),而海島棉(Go^v尸/w附6flM&rtM)占大約8%。和大多數(shù)開花植物一樣，棉花的基因組被認(rèn)為已經(jīng)歷了一個或多個多倍體化事件，并且已通過將分歧基因組在共有的核中連起來而進(jìn)化過。棉花商業(yè)主要由兩種"AD"四倍體物種的改進(jìn)形式(陸地棉和海島棉(Gm^/7,'m附6flMfl&rtseL.))占主導(dǎo)。四倍體棉花被認(rèn)為在大約1-2百萬年前于新世界(NewWorld)形成，其通過母本舊世界(OldWorld)"A"基因組分類群類似的草棉(Gte^/7/m/^/^flce"附)和親本新世界"D"基因組分類群類似的雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)或扣W以棉((7仍sypZ"附g0s5j/7/o1Vfes)之間的雜交形成。野生的A基因組二倍體和AD四倍體棉屬(G仍w/;/w附)分類群產(chǎn)生可紡纖維。一種A基因組二倍體物種，樹棉(Qw矽/7/"附"/^wew附)，在亞洲仍被廣為培育和培養(yǎng)。其密切相關(guān)并且可能的祖先一一A基因組二倍體物種草棉(G".)也產(chǎn)生可紡纖維。雖然D基因組二倍體的種子是被柔毛的(pubescent),但是不能產(chǎn)生可紡纖維。還沒有種植來自其它認(rèn)可的二倍體棉屬基因組(B、C、E、F和G)的分類群。人類強(qiáng)有力的定向選擇一貫以來產(chǎn)生了具有比A基因組二倍體栽培種更高產(chǎn)量和/或品質(zhì)特征的AD四倍體棉花。對陸地棉(G./^>^1,"附)(AADD)的選擇性培育強(qiáng)調(diào)最大產(chǎn)量，而海島棉((.6Mfl^rtw)(AADD)則以其纖維優(yōu)秀的長度、強(qiáng)度和精細(xì)度見長(Jiang等人1998-ProcNatlAcadSciUSA.1998April14;95(8):4419—4424)。棉花纖維是在開花期或恰在開花之前從胚珠外珠被表皮啟動的單細(xì)胞。之后，纖維迅速延伸大約3周，這之后它們轉(zhuǎn)而進(jìn)行強(qiáng)烈的次生細(xì)胞壁纖維素合成。纖維細(xì)胞僅在其基底末端(basalends)與下面的種皮相互連接，溶質(zhì)、水和其它分子經(jīng)由胞間連絲或質(zhì)膜流入。Ruan等人2001(PlantCell13:47-63)展示了纖維延伸期間胞間連絲的暫時閉合。Ruan等人2004(PlantPhysiology-巻136:第4104-4113頁)對纖維長度有所不同的不同棉花基因型的胞間連絲閉合持續(xù)時間進(jìn)行了比較，并且發(fā)現(xiàn)胞間連絲閉合的持續(xù)時間和纖維長度之間有正相關(guān)。此外，顯微證據(jù)表明，纖維基底處胼胝質(zhì)沉積和降解與胞間連絲閉合和重開的時才;i^目關(guān)。此外，纖維中的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因(GhGhicl)(令胼月Et^降解)與纖維基底處胞間連絲的重開相關(guān)。W02005/017157描述了在產(chǎn)纖維植物(例如棉花)中通過改變纖維延伸期(如Ruan等人2001所述)調(diào)節(jié)纖維長度的方法和手段?？赏ㄟ^干擾纖維細(xì)胞基底處胞間連絲中的胼月氏質(zhì)沉積來增加或減少纖維延伸期。此外，通過遺傳工程修飾纖維，以含有僅在纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)和/或僅從特定纖維發(fā)育階段開始表達(dá)的啟動子也是令人感興趣的。WO2004/018620涉及編碼內(nèi)源棉花幾丁質(zhì)酶及其下述啟動子的經(jīng)分離的核酸分子，所述啟動子在次生壁沉積期間優(yōu)先在纖維中表達(dá)。還《^開了核酸分子編碼的多肽，將經(jīng)分離的核酸分子與啟動子連接起來的DNA構(gòu)建體，并入有DNA構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞、植物或植物種子。文獻(xiàn)還涉及將經(jīng)分離的啟動子與第二DNA連接起來的DNA構(gòu)建體以及含有所述DNA構(gòu)建體的表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞、植物或植物種子。還公開了賦予針對昆蟲和真菌的抗性、調(diào)節(jié)纖維的纖維素含量的方法以及在次生壁沉積期間優(yōu)先在纖維中表達(dá)基因的方法。具有下述備選啟動子可能是有用的，所述啟動子將在次生壁沉積期間驅(qū)動優(yōu)先和/或強(qiáng)烈地在纖維中發(fā)生的基因表達(dá)，即，例如從次生壁沉積的啟動到其終止或者例如從成熟階段開始，強(qiáng)烈且持續(xù)地表達(dá)(例如，>其最大活性的50%)。次生壁沉積的啟動被定義為由于含有超過40%(w/w)纖維素的新的壁物質(zhì)的合成，任何細(xì)胞的干重/單位表面積開始增加或棉花纖維的干重/單位長度開始增加的時間。在陸地棉的棉花纖維的情況下，當(dāng)棉花植物在典型條件下于溫室中或田間(日間溫度26-34。C,夜間溫度20-26。C,光強(qiáng)度超過或等于1000愛因斯坦/nWs,有足夠的水和礦物質(zhì)營養(yǎng))生長時，這預(yù)計在14-17DPA之間發(fā)生。在陸地棉的棉花纖維的情況下，次生細(xì)胞壁形成的終點和成熟期的開始通常在35DPA左右。此外，具有下述備選啟動子可能是有用的，所述啟動子將驅(qū)動僅在或優(yōu)先在纖維中發(fā)生的基因表達(dá)，同時排除或最小化在其它組織中的表達(dá)。下文在不同實施方案、實施例、圖和權(quán)利要求中描述的本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)纖維長度的改進(jìn)方法和手段，這通過在特定時間點減少或增加纖維細(xì)胞基底處的胼胝質(zhì)沉積來實現(xiàn)。下文描述的本發(fā)明還提供了纖維特異性和/或纖維優(yōu)先性的啟動子和啟動子區(qū)域。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了纖維細(xì)胞優(yōu)先性的啟動子，其包含選自以下核苷酸序列的核苷酸序列a)核苷酸序列，其包含SEQIDNo9的第2149位核苷酸至第2307位核苷酸的核普酸序列；b)核普酸序列，其包含SEQIDNo10的笫3109位核苷酸至第3269位核苷酸的核苷酸序列；c)核苷酸序列，其包含與a)或b)提到的任何核苷酸序列具有至少70%，優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90%，特別是至少95%序列同一性或者更特別是與a)或b)提到的任何核苷酸序列相同的核苷酸序列；或d)核苷酸序列，其包含大約150bp至大約1000bp的DNA片段的核苷酸序列，所述DNA片段能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有a)、b)或c)提到的核苷,列的DNA片段雜交。纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子可包含SEQIDNo9的第465位至第2307位的核苷酸序列；或SEQIDNo9的第1374位至第2307位的核苷酸序列；或SEQIDNo9的第1531位至第2307位的核苷酸序列；或SEQIDNo10的第1397位至第3269位的核苷酸序列；或SEQIDNo10的第2371位至第3269位的核苷酸序列；或SEQIDNo10的第2718位至第3269位的核苷斷列。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了下述纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域，其包含本文所述的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，還包含SEQID9的第2308位核普酸至第2409位核苷酸或第3270位至第3372位核苷酸的核苦酸序列。在本發(fā)明的還一實施方案中，提供了包含下述有效相連的DNA區(qū)域的嵌合基因a)本文所述的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子b)異源DNA區(qū)域，其編碼感興趣的生物活性RNA;以及c)轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號。生物活性RNA可編碼感興趣的蛋白，例如，N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選地，NodC型的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)、纖維素合酶、蔗糖合酶(優(yōu)選地，C型的蔗糖合酶)、蔗糖磷酸合酶或p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶。生物活性RNA還可以是抑制性RNA或沉默RNA，例如核酶、微小RNA、雙^C夾RNA,特別是被耙向以下調(diào)內(nèi)源棉花基因(例如，(3-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶木聚糖合酶(cslF)、木葡聚糖合酶(cslD)或1,3-1,4葡聚糖合酶(cslC))ii表達(dá)的。本發(fā)明還提供了包含此類嵌合基因的植物細(xì)胞和植物(例如棉花植物)及其種子。還提供了在其細(xì)胞中包含根據(jù)權(quán)利要求11至15中任意一項所述的嵌合基因的植物種子。本發(fā)明還提供了在產(chǎn)纖維植物(例如棉花植物)的纖維細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)生物活性RNA的方法，所述方法包括下述步驟向植物的細(xì)胞提供根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因，并種植所述植物。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的纖維特異性和/或纖維優(yōu)先性啟動子用于在產(chǎn)纖維植物(例如棉花植物)的纖維細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)生物活性RNA的用途。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的DNA分子，其包含編碼下述蛋白的核苦^列，所述蛋白包含編碼p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶并且與SEQIDNo11或SEQIDNo12的M酸序列具有至少95%序列同一性、優(yōu)選相同的氨基酸序列；經(jīng)分離的DNA分子，其包含選自SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3和SEQIDNo4的核苦酸序列，或經(jīng)分離的DNA分子，其包含選自下述的核苷酸序列SEQIDNo9的第2410-2443位的核苷酸序列和SEQII)No9的第2556-3499位核苷酸序列或SEQIDNo10的第3373至3406位核普酸序列和SEQIDNo10的第3501-4444位核苷酸序列。這些經(jīng)分離的DNA分子可用于分離纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子或啟動子區(qū)域。本發(fā)明還提供了分離纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域的方法，所述方法包括下述步驟-鑒定編碼下述RNA轉(zhuǎn)錄本的基因組片段，可從所述RNA轉(zhuǎn)錄本合成下述cDNA，所述cDNA包含SEQIDNo1、SEQIDNo2、SEQIDNo3或SEQIDNo4或其功能等價物的核苷酸序列；-分離編碼下述蛋白的核苷酸序列上游的DNA區(qū)域，所述蛋白具有SEQIDNo11或SEQIDNo12或其功能等價物的氨基酸。本發(fā)明還提供了通過此方法獲得的纖維選擇性啟動子和啟動子區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了在產(chǎn)纖維植物中改變纖維性質(zhì)的方法，特別是增加棉花植物的纖維長度，所述方法包括向棉花植物的細(xì)胞中引入嵌合基因，所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA元件U)可植物表達(dá)的啟動子，優(yōu)選地，控制在纖維細(xì)胞中優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的可植物表達(dá)的啟動子，例如，來自棉花的纖維特異性P微管蛋白啟動子、來自棉花的纖維特異性肌動蛋白啟動子、來自棉花的脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的纖維特異性啟動子、來自棉花的擴(kuò)展蛋白基因的啟動子或來自棉花幾丁質(zhì)酶基因的啟動子或本文所述的啟動子；(b)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，當(dāng)其^皮轉(zhuǎn)錄時，其產(chǎn)生下述生物活性RNA分子，所述分子能降低產(chǎn)纖維植物內(nèi)源的P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的表達(dá)，所述p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶涉及從胞間連絲去除胼胝質(zhì)，以及(c)3，末端區(qū)域，其包含在植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號，所述方法特征在于，僅內(nèi)源P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的特定亞基因組等位基因的表達(dá)被下調(diào)。在一種優(yōu)選的實施方案中，p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因包含在棉花植物的D亞基因組中。包含在D亞基因組中的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的可表征為具有SEQIDNo10第3407-3500位的核普酸序列的內(nèi)含子序列的存在；或可祐束征為翻譯起始密碼子下游大約326個核苷酸處(不包括翻譯起始密碼子)核苷酸序列AAGATC的存在。方便地，包含在D亞基因組中的(5-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因可這樣來表征用具有SEQIDNo5和SEQIDNo6的核苷酸序列的寡核脊酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用Ahvl限制性酶消化后，對大約538bp的片段和大約118bp的片段的鑒定。P-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因還可編碼包含SEQIDNo12的氨基^f列的蛋白或者其中所述基因包含SEQIDNo2的核苷^列。棉花植物可以是陸地才帛(Go^y//w附/^mm似附)。生物活性RNA可以是良義RNA,其包含與SEQIDNo3的核苷^列互補(bǔ)序列具有至少94%序列同一性的至少19個核苷酸，或者生物活性RNA可以是正義RNA,其包含與SEQIDNo3的核普酸序列具有至少94%序列同一性的至少19個核苷酸，或者生物活性RNA可以是雙鏈RNA分13子，其包含與SEQIDNo3的核苷酸序列互補(bǔ)序列具有至少94%序列同一性的至少19個核普酸和與所述至少19個核苦酸的互補(bǔ)序列基本上相似的互補(bǔ)RNA鏈。優(yōu)選地，提到的19個核苦酸包含特異于圖2所示的D亞基因組Ghglucl基因的至少一個核苷酸。在才艮據(jù)本發(fā)明的另一實施方案中，雙鏈RNA是從包含SEQIDNo15、SEQIDNo16、SEQIDNo20或SEQIDNo21的核苷酸序列的前孩t小RNA加工的孩史小RNA。本發(fā)明還提供了減少產(chǎn)纖維植物的纖維長度的方法，所述方法包括下述步驟將嵌合基因引入產(chǎn)纖維植物的細(xì)胞，其中，所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA片段(a)根據(jù)權(quán)利要求lb、5、6或7的可植物表達(dá)的啟動子；(b)DNA區(qū)域，其編碼p-l，3-葡聚糖酶蛋白，例如，具有下述M斷列的蛋白，所述^J^麟列與SEQIDNo11或SEQIDNo12的氨基^列具有至少95%的序列同一性；以及(c)3'末端區(qū)域，其包含在植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺香化信號。本發(fā)明的另一實施方案涉及本文所述的嵌合基因或包含此類嵌合基因的產(chǎn)纖維植物或產(chǎn)纖維植物的細(xì)胞。在又一實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本文所述的方法生產(chǎn)的纖維。附圖簡述圖1:對來自陸地棉的亞基因組D和亞基因組A的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的啟動子序列的比對。亞基因組A的啟動子的核苦酸序列(上面的序列)對應(yīng)于SEQIDNo9的第1460位至第2408位的核苷酸序列。亞基因組D的啟動子的核苦酸序列(下面的序列)對應(yīng)于SEQIDNo10的第2372位至3372位的核普酸序列。核苷酸序列的差異由灰色的盒表示。另苦酸的破折號來表示。兩條啟動子區(qū)域間的總體同源性為大約71%的序列同一性。圖2:對來自陸地棉的亞基因組D和亞基因組A的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的編碼區(qū)域(沒有內(nèi)含子)的比對。亞基因組A等位基因的編碼區(qū)域的核苷酸序列(上面的序列)對應(yīng)于SEQIDNo9的第2410位至2443位和第2556-3499位的核普酸序列。亞基因組D等位基因的編碼區(qū)域的核苷酸序列(下面的序列)對應(yīng)于SEQIDNo10的第3373位至3406位和笫3501-4444位的核苷,列。核苦酸序列的差異由灰色的盒表示。另一啟動破折號來表示。兩條啟動子區(qū)域間的總體同源性為大約97%的序列同一性。圖3:對來自陸地棉的亞基因組D和亞基因組A的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的內(nèi)含子序列的比對。上面的序列對應(yīng)于亞基因組A等位基因內(nèi)含子的核苷M列，而下面的序列對應(yīng)于亞基因組D等位基因內(nèi)含子的核苷餅列。圖4:對亞基因組A等位基因(上面的序列，對應(yīng)于SEQIDNo11)和亞基因組D等位基因(下面的序列，對應(yīng)于SEQIDNo12)編碼的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的#^*列的比對。圖5:對SEQIDNo1至4的從第201至211位核苦酸的核香,列的比對。p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的僅亞基因組A等位基因核苷^列中存在的J/wl限制性酶識別位點被下劃線并以斜體示出。圖6:纖維生長曲線(圖A)與P-l,3-內(nèi)切葡聚糖酶基因(QG/"cl)(圖B)之間的關(guān)聯(lián)。來自陸地棉的(發(fā)育中)纖維的cDNA文庫的DNA被提取并均衡(叫ualized)。使用寡核苷酸引物SE002和SE003(SEQIDNo5和6)來擴(kuò)增PCR片段，用Alwl來消化。針對A-基因組變體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生了3條片段(479bp+118bp+59bp),而針對D-基因組變體的僅產(chǎn)生了2條片段(538bp+118bp)。圖7:通過RT-PCR，對棉花葉、根和莖中GhGluel的表達(dá)分析。對從棉花葉、根和莖提取的RNA進(jìn)行RT-PCR分析，以檢測葡聚糖酶1或蛋白質(zhì)磷酸酶2A(pp2A)的表達(dá)。用來自Invitrogen的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem)來進(jìn)行第一鏈cDNA合成。道l:100bp梯度；道2:棉花葉RNA樣品+Glucl特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道3:棉花葉RNA樣品+Glucl特異性引物-逆轉(zhuǎn)錄酶；道4:棉花根RNA樣品+Glucl特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道5:棉花根RNA樣品+Glucl特異性引物-逆轉(zhuǎn)錄酶；道6:棉花莖RNA樣品+Glucl特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道7:棉花莖RNA樣品+Glucl特異性引物畫逆轉(zhuǎn)錄酶；道8:基因組DNA(Fibermax400ng)+Glucl特異性引物；道9:100bp梯度；道10:棉花葉RNA樣品+pp2A特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道ll:棉花葉RNA樣品+pp2A特異性引物-逆轉(zhuǎn)錄酶；道12:棉花根RNA樣品十pp2A特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道13:棉花根RNA樣品+pp2A特異性引物-逆轉(zhuǎn)錄酶；道14:棉花莖RNA樣品十pp2A特異性引物+逆轉(zhuǎn)錄酶；道15:棉花莖RNA樣品+pp2A特異性引物-逆轉(zhuǎn)錄酶；道16:100bp梯度；道17:陽性對照RNA(隨試劑盒提供的)。實施方式詳述本發(fā)明基于出人意料的發(fā)現(xiàn)纖維特異性的P-l,3-內(nèi)切葡聚糖酶基因()的A和D亞基因組特異性等位基因的表達(dá)時機(jī)至少在陸地棉中有所不同。雖然D亞基因組特異性等位基因表達(dá)的啟動與迅速延伸期(開花后大約14至17天(下文中稱為"DPA，，))相關(guān)聯(lián)，但A亞基因組的表達(dá)的啟動卻延遲到纖維成熟后期(大約35-40DPA)開始，這取決于生長條件。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及對新穎的纖維特異性啟動子的鑒定，所述啟動子在來自迅速延伸期(rapidelongationphase)末的纖維細(xì)胞或來自纖維成熟期啟動的纖維細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。此類啟動子具有下述用處，例如，用于產(chǎn)生新穎生物分子的嵌合基因(例如編碼增強(qiáng)的XET、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、根腫脹(RSW)突變體基因、著色、塑料、纖維素消化性、新穎的細(xì)胞壁復(fù)合物/性質(zhì))在纖維發(fā)育后期的表達(dá)。啟動子還可用16于指導(dǎo)20、30、40DPA時纖維中的基因表達(dá)；例如，在棉花纖維發(fā)育后期(20、30、40DPA)幾丁質(zhì)的產(chǎn)生，或者用于40DPA時纖維中的基因表達(dá)，例如，在棉花纖維發(fā)育的非常后期(40DPA)幾丁質(zhì)的產(chǎn)生。才艮據(jù)本發(fā)明的啟動子還可用于指導(dǎo)CesA基因在40DPA的表達(dá)，用于增強(qiáng)的纖維素生物合成以及增強(qiáng)的纖維性質(zhì)，或用于產(chǎn)生內(nèi)源棉花基因的被指導(dǎo)為階段特異性沉默的生物活性RNA，例如，沉默p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶，以使得纖維生長更長。啟動子還可用于嵌合基因(編碼例如胼胝質(zhì)合酶)的階段特異性表達(dá)，以改變纖維性質(zhì)和品質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明涉及對纖維特異性P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的一種亞基因組特異性等位基因表達(dá)的沉默，特別是沉默D-亞基因組特異性等位基因，以防止胼胝質(zhì)降解，以及由此增加迅速纖維延伸期和纖維長度，例如，棉花中的，特別是陸地棉中的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的一種實施方案，本發(fā)明提供了纖維特異性和/或纖維優(yōu)先性啟動子片段，所述片段可分離自棉花，特別是陸地棉物種，并且，其存在于編碼纖維特異性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶(具有包含SEQIDNo11、12、7或8的M酸序列或其變體的氨基酸序列)的核酸序列的上游。在本文中使用時，術(shù)語"啟動子"指在轉(zhuǎn)錄起始期間被DNA依賴性的RNA聚合酶識別并結(jié)合(直接或間接)的任何DNA。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點和用于轉(zhuǎn)錄起始因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點，啟動子可包含多種其它位點(例如增強(qiáng)子)，這些位點上可結(jié)合基因表達(dá)調(diào)控蛋白。術(shù)語"調(diào)控區(qū)域，，在本文中使用時表示參與驅(qū)動轉(zhuǎn)錄和控制(即調(diào)控)給定DNA序列(例如編碼蛋白或多肽的DNA)轉(zhuǎn)錄的水平和時機(jī)的任何DNA。例如，5，調(diào)控區(qū)域(或"啟動子區(qū)域")是位于編碼序列上游(即，5')的DNA序列，其包含啟動子和5，非翻譯前導(dǎo)序列。3'調(diào)控區(qū)域是位于編碼序列下游(即3，)的DNA序列，其包含合適的轉(zhuǎn)錄3，末端形成(和/或調(diào)控)信號，包括一個或多個聚腺苷化信號。術(shù)語"基因"表示包含下述DNA區(qū)域("轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域")的任何DNA片段，所述DNA區(qū)域在合適調(diào)控區(qū)域(例如可植物表達(dá)的啟動子區(qū)域)控制下在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為RNA分子(例如mRNA)。基因由此可包含若干有效相連的DNA片段，例如啟動子、5'非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)域和3，非翻譯區(qū)域(包含聚腺苷化位點)。內(nèi)源植物基因是在植物物種中天然發(fā)現(xiàn)的基因。嵌合基因是在植物物種中正常情況下不會發(fā)現(xiàn)的任何基因，或者任何這樣的基因其中啟動子天然狀態(tài)下并不與轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域("異源"DNA區(qū)域)的部分或全部或基因的至少一個其它調(diào)控區(qū)域相連。術(shù)語"基因表達(dá)"指這樣的過程，其中，在調(diào)控區(qū)域(特別是啟動子)控制下的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為生物活性RNA，即，能與另一核酸相互作用或能被翻譯為生物活性多肽或蛋白質(zhì)的RNA。當(dāng)基因表達(dá)的終產(chǎn)物是生物活性RNA，例如反義RNA或核酶時，基因被說成是編碼RNA的。當(dāng)基因表達(dá)的終產(chǎn)物是功能活性或生物活性蛋白質(zhì)或多肽的時候，基因就被說成是編碼蛋白質(zhì)的。在關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的DNA表達(dá)的方面，術(shù)語"纖維選擇性"或"纖維細(xì)胞選擇性"或"纖維特異性，，或"纖維細(xì)胞特異性"指DNA在植物(例如棉花植物)纖維細(xì)胞中的高度特異性表達(dá)(對于實際目的而言)("纖維細(xì)胞-選擇性")。換句話說，DNA在不同于纖維細(xì)胞的組織中的轉(zhuǎn)錄水平低于檢測或非常低(相對每微克總RNA低于大約0.2皮克(picogrammes))。在關(guān)于沖艮據(jù)本發(fā)明的DNA表達(dá)的方面，術(shù)語"纖維優(yōu)先性"或"纖維細(xì)胞優(yōu)先性"指這樣的表達(dá)才莫式，其中DNA主要在纖維細(xì)胞或纖維中表達(dá)，但是可在植物的其它組織中鑒定到表達(dá)。優(yōu)選地，在纖維細(xì)胞中的表達(dá)是在其它組織中的表達(dá)的大約2至大約IO倍高。SEQIDNo9和SEQIDNo10的核普斷列代表分別編碼A亞基因組和D亞基因組的纖維選擇性p-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的基因組DNA分子的核苷酸序列。SEQIDNo9的轉(zhuǎn)錄起始位點已被確定為第2308位，而SEQIDNol0的轉(zhuǎn)錄起始位點已被確定為第3270位。因此，在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了具有SEQIDNo9的第1位核苷酸至第2307或2308位核苷酸的核苷酸序列的纖維選擇性啟動子；在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了具有SEQIDNo10的第1位核苷酸至第3269或3270位核苷酸的核苷酸序列的纖維選擇性啟動子。SEQIDNo9的核普酸序列的翻譯起始位點已被確定為位于第2410至2412位的ATG密碼子。編碼P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的A亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子的5，非翻譯區(qū)域因此具有SEQIDNo9的第2308位核苷酸至第2409位核苷酸的核普酸序列。A亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子區(qū)域因此是包含SEQIDNo9的第1至2409位核苷酸的啟動子區(qū)域。類似地，SEQIDNo10的核普酸序列的翻譯起始位點已^皮確定為位于第3373至3375位的ATG密碼子。編碼卩-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的D亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子的5，非翻譯區(qū)域因此具有SEQIDNo10的第3270位核苦酸至第3372位核苷酸的核苦酸序列。D亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子區(qū)域因此是包含SEQIDNo10的第1至3372位核苦酸的啟動子區(qū)域。對SEQIDNo9和SEQIDNo10的纖維選擇性啟動子區(qū)域的比對(圖1)揭示了ATG翻譯起始密碼子上游大約1000個核苷酸的核苷酸序列間的一般序列同源性，特別是在ATG翻譯起始密碼子上游大約150個核苷酸的區(qū)域中。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了這樣的纖維選擇性啟動子，其包含SEQIDNo9的第2149位核苷酸至第2307位核苷酸的核苷酸序列，或包含SEQIDNo10的第3109位核普酸至第3269位核苦酸的核苷酸序列。不言而喻，啟動子或啟動子區(qū)域可被包含在較大的核苷酸序列中。纖維細(xì)胞選擇性啟動子區(qū)域因此可被確定為編碼SEQIDNo9或10示出的mRNA編碼的蛋白的笫一個氮基酸的密碼子上游(即，位于其5，)的區(qū)域。此類啟動子區(qū)域可以至少在起始密碼子上游大約400至500bp,至少大約1000bp,至少1200bp，至少大約1300bp或者至少大約1500至2000bp。為方便而言，優(yōu)選地，此類啟動子區(qū)域不延伸超過起始密碼子上游大約3000至5000bp。片段大小可部分由方便的限制性位點的存在來確定。例如，對于編碼p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的A亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子區(qū)域而言，可以方便地克隆大約1945bp的片段(SEQIDNo9的第465位核苷酸至第2409位核苷酸)。合適的限制性酶的存在允許方便地產(chǎn)生大約1036bp(SEQIDNo9的第1374核苷酸至第2409位核苷酸)或大約879bp(SEQIDNo9的第1531位核苷酸至第2409位核苷酸)的啟動子區(qū)域。對于編碼p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的D亞基因組等位基因的纖維選擇性啟動子區(qū)域而言，可以方便地克隆大約1976bp的片段(SEQIDNo10的第1397位核苷酸至第3372位核普酸)。合適的限制性酶的存在允許方便地產(chǎn)生大約1002bp(SEQIDNo10的第1397核苷酸至第3372位核苷酸)或大約655bp(SEQIDNo10的第2371位核苷酸至第3372位核苦酸)的啟動子區(qū)域。還應(yīng)當(dāng)清楚，可以從其它棉花植物或棉花祖先植物中分離出等價的纖維選擇性啟動子或啟動子區(qū)域。為達(dá)到此目的，可使用本文所述的啟動子片段作為探針，鑒定下述其它植物中在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交的核普酸序列，從而從其它棉花植物，例如海島棉(包括所謂的PIMA品種)或從其它品種分離啟動子片段。"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"在本文中使用時表示如果在探針和把序列之間有至少95。/。以及優(yōu)選至少97。/。的序列同一性，那么一般來說將發(fā)生雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在包含50%曱酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖和20jag/ml變性的經(jīng)剪切載體DNA(例如鮭精DNA)的溶液中過夜孵育，接著在0.1xSSC中于大約65°C洗雜交支持物(support)。其它雜交和洗滌條件是7>知的，并且在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarbor,NY(1989)，特別是第11章中有例示。從其它棉花植物或棉花祖先植物中分離的這些等價纖維選擇性啟動子可代表變體啟動子，其中一個或多個核苷酸已通過取代、缺失或插入而被20替代。根據(jù)本發(fā)明的變體纖維選擇性啟動子還可合成產(chǎn)生。圖l顯示了對來自陸地棉的A和D亞基因組的纖維選擇性啟動子的比對和變化位置，其中核苦酸序列可明顯改變，而不會對纖維選擇性轉(zhuǎn)錄起始能力造成顯著影響，這用灰色的盒來示出。從圖l及其圖例，還可明顯看出，兩條示例纖維選擇啟動子片段間的總體序列同一性可低至大約71%序列同一性。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了這樣的纖維選擇性啟動子和啟動子區(qū)域，其包含與本文所述的纖維選擇性啟動子和啟動子區(qū)域具有至少70%或至少80%或至少卯％或至少95%的序列同一性的核苷酸序列。就本發(fā)明的目的而言，兩條相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的"序列同一性"(表示為百分比)指兩條被最優(yōu)對齊的序列中具有相同殘基的位置的數(shù)量(x100)除以比較的位置數(shù)量?？瘴?即，比對中，在一條序列中存在殘基而在另一條中不存在殘基的位置)被認(rèn)為是具有不相同殘基的位置。對兩條序列的比對是通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch1970)來進(jìn)行的?？?吏用標(biāo)準(zhǔn)軟件程序(例如GAP,其是WisconsinPackageVersion10.1(GeneticsComputerGroup,Madision,Wisconsin,USA)的一部分)，使用缺省計分矩陣(其中空位產(chǎn)生罰分為50和空位延伸罰分為3),來方便地進(jìn)行上述計算機(jī)輔助的序列比對。應(yīng)當(dāng)清楚，參照相應(yīng)DNA分子的核苷酸序列來定義RNA分子的核苷酸序列時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都應(yīng)當(dāng)被替換為尿嘧啶(U)。提到RNA還是DNA分子將從本申請的上下文中清楚可見。可以通過將此類DNA分子與編碼易于計分的標(biāo)記的編碼區(qū)域(例如，P-葡糖醛酸糖苷酶基因)有效相連，將此類嵌合基因引入產(chǎn)纖維植物，并分析標(biāo)記在纖維細(xì)胞中的表達(dá)才莫式(優(yōu)選地，纖維發(fā)育期間)(與標(biāo)記在植物其它部分中的表達(dá)模式相比較)，來方便地測試鑒定或產(chǎn)生的啟動子或啟動子區(qū)域的纖維選擇性表達(dá)能力不言而喻，本發(fā)明的啟動子和啟動子區(qū)域還可包含已知能提高轉(zhuǎn)錄效率的其它元件，例如增強(qiáng)子、內(nèi)含子等。此外，示例的纖維選擇性啟動子區(qū)域的示例性5，UTR序列在核普酸序列上相當(dāng)相似，預(yù)計5，UTR序列是可互換的。本發(fā)明還包括下述DNA分子，其包含與編碼生物活性RNA、肽或蛋白質(zhì)的一個或多個異源區(qū)域有效相連的本發(fā)明的纖維選擇性啟動子或啟動子區(qū)域。本發(fā)明的啟動子可用于表達(dá)任何期望的異源編碼區(qū)域?？墒褂帽景l(fā)明的啟動子來表達(dá)的其它編碼蛋白的DNA分子的例子包括但不限于同源和異源的纖維素合酶(CesA基因)，天然和突變形式的均可(Arioli等人，"MolecularAnalysisofCelluloseBiosynthesisinArabidopsis，"Science,279:717-720(1998);Holland等人，"AComparativeAnalysisofthePlantCelluloseSynthase(CesA)GeneFamily,"PlantPhysio.，123:1313-1324(2000));可調(diào)節(jié)纖維素的碳分配的基因(Delmer,"CelluloseBiosynthesisinDevelopingCottonFibers"在A.S，Basra(編著),CottonFibers:DevelopmentalBiologyQualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第85-112頁(1999)中)，例如蔗糖合酶(Amor等人，"AMembrane-AssociatedFormofSucroseSynthaseandItsPotentialRoleSynthesisofCelluloseandCalloseinPlants,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:9353-9357(1995))、蔗糖磷酸合酶(Haigler等人，"TransgenicCottonOver-ExpressingSucrosePhosphateSynthaseProducesHigherQualityFiberswithIncreasedCelluloseContentandHasEnhancedSeedCottonYield"Abstract477.在ProceedingsofPlantBiology2000,7月15-19，Sanl)iego，CA.AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville,MD，(2000))、UDPG畫焦礴酸化酶(Waffler和Meier,"EnzymeActivitiesinDevelopingCottonFibers,"PlantPhvsiol.Biochem.32:697-702(1994))、無機(jī)焦碌酸酵(pyrophosphosphatase)(Geigenberger等人，"OverexpressionofPyrophosphataseLeadstoIncreasedSucroseDegradationandStarchSynthesis,IncreasedActivitiesofEnzymesforSucrose-StarchInterconversions，andIncreasedLevelsofNucleotidesinGrowingPotatoTubers,"Planta，205:428-437(1998))、己糖激酶(Smeekens,"SugarRegulationofGeneExpression"Curr.Op.PlantBiol"1:230-234(1998))和轉(zhuǎn)化酶(Sturm和Tang,"TheSucrose-CleavingEnzymesofPlantsareCrucialforDevelopment,Growth,andCarbonPartitioning,"TrendsPlantSci.，4:401407(1999));可能影響纖維素的分子性質(zhì)和生物物理性質(zhì)(包括多聚化程度、結(jié)晶程度、」微晶大小和樣i原纖維定向)的基因(即，編碼蛋白(包括共結(jié)晶蛋白聚合物或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及多糖合成和其它酶)的基因)(Delmer,"CelluloseBiosynthesis:ExcitingTimesforaDifficultFieldofStudy,"Ann.Rev.PlantPhysio,Mol.Biol.50:245-276(1999);Delmer，"CelluloseBiosynthesisinDevelopingCottonFibers.在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology,QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第85-112頁(1999);Hsieh，"StructuralDevelopmentofCottonFibers.在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology,QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第137-166頁(1999));能延長延伸生長和/或改變次生壁沉積程度或時機(jī)的轉(zhuǎn)錄因子，例如MYB基因(Wilkins和Jernstedt，"MolecularGeneticsofDevelopingCottonFibers.在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology.QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第231-270頁(1999));影響植物激素合成和改變纖維性質(zhì)的基因(John,"GeneticEngineeringStrategiesforCottonFiberModification.在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology,QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第271-289頁(1999));針對細(xì)胞骨架元件或細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(可能影響纖維性質(zhì))的基因(Seagull,"CytoskeletalInvolvementinCottonFiberGrowthandDevelopment,"Micron,24:643-660(1993));用于脂類合成或?qū)赡芨淖兡ば再|(zhì)以及由此改善纖維品質(zhì)(包括在脅迫環(huán)境條件下)的酶進(jìn)行修飾的基因(Haigler，"TheCrystallinityofCottonCelluloseinRelationtoCottonImprovement,"Pro"CottonFiberCellulose:Structure.FunctionandUtilizationConference,NationalCottonCouncilofAmerica:Memphis,TN.，第211-225頁(1992));可能通過增加或減少的活性來延長或增加次生壁沉積期間的延伸生長的酶，例如，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、擴(kuò)展蛋白或液泡ATP酶(Wilkins和Jernstedt，"MolecularGeneticsofDevelopingCottonFibers.在A.S,Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiologyQualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第231-270頁(1999));針對可能留在纖維網(wǎng)眼(lumen)中或整合進(jìn)細(xì)胞壁以增加纖維強(qiáng)度或改變其紡織性質(zhì)的蛋白或塑料聚合物的基因(John,"GeneticEngineeringStrategiesforCottonFiberModification,"在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology.QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第271-289頁(1999);Guda等人，"HyperexpressionofanEnvironmentallyFriendlySyntheticPolymerGene,"BiotechnologYLetters,17:745-750(1995));針對植物細(xì)胞壁基質(zhì)生物合成酶或其調(diào)控蛋白的基因，使得其它碳水化合物可以被整合進(jìn)細(xì)胞壁并且改變纖維性質(zhì)(Haigler，"TheRelationshipBetweenPolymerizationandCrystallizationinCelluIoseBiogenesis，"在C.H.Haigler和P.Weimer編著，BiosynthesisandBiodegradationofCellulose,NewYork:MarcelDekker，第99-124頁(1991);Andrawis等人，"CottonFiberAnnexins:APotentialRoleintheRegulationofCalloseSynthase,"PlantJ"3:763-772(1993));針對單寧、木栓質(zhì)或染料等分子的、可能向纖維賦予有價值的顏色的基因(Ryser，"CottonFiberInitiationandHistodifferentiation，"在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology.QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第1-46頁(1999));針對角質(zhì)、木栓質(zhì)或蠟等分子的、可能改變棉花纖維的吸收性和強(qiáng)度的基因(May,"GeneticVariationinFiberQuality,"在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology,QualityImprovement,andTextile24Processing,TheHaworthPress,NewYork,第183-230頁(1999);Ryser，"CottonFiberInitiationandHistodifferentiation，"在A.S.Basra(編著)，CottonFibers:DevelopmentalBiology.QualityImprovement,andTextileProcessing,TheHaworthPress,NewYork,第1—46(1999));以及針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的基因，例如Rac,其可調(diào)節(jié)纖維發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變(Ddmer等人，"GenesEncodingSmallGTP-BindingProteinsAnalogoustoMammalianracarePreferentiallyExpressedinDevelopingCottonFibers,"Mol.Gen.Genet"248:43-51(1995))。特別優(yōu)選的蛋白編碼區(qū)域是N-乙酰葡糖胺合酶編碼區(qū)域，如例如WO2006/136351所述，或蔗糖合酶基因，如WO2002/45485或EP06015433.3(通過引用并入本文)所述。生物活性RNA還可編碼所謂的反義RNA、正義RNA、雙鏈RNA，如WO99/53053所述，或可編碼合成的微小RNA分子，其是根據(jù)本領(lǐng)域公知的規(guī)則，將所述分子設(shè)計來下調(diào)產(chǎn)纖維植物細(xì)胞中包含的其它基因或者甚至是以產(chǎn)纖維植物為食的病原體或有害生物中包含的基因的表達(dá)。活性RNA的方法，所述方法包括下述步驟將包含本文所述的纖維選擇性啟動子或啟動子區(qū)域(與編碼生物活性RNA分子的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域有效相連)的DNA分子引入產(chǎn)纖維植物的纖維細(xì)胞。在本發(fā)明的第二個方面，提供了在產(chǎn)纖維植物中改變纖維的纖維長度的方法，這是通過特異性改變編碼纖維選擇性的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的亞基因組等位基因之一的表達(dá)來實現(xiàn)的。如上文所述，對表達(dá)的這種改變可防止或增強(qiáng)在纖維細(xì)胞基底處堵住胞間連絲的胼胝質(zhì)的降解，由此增加或減少迅速纖維延伸期以及纖維長度，例如在棉花中，特別是在陸地棉中。對纖維長度的調(diào)節(jié)還可影響纖維的強(qiáng)度和其它品質(zhì)或性質(zhì)。因此，本發(fā)明還涉及通過本文所述的方法來改變纖維性質(zhì)或纖維的品質(zhì)。在本發(fā)明第二方面的一種實施方案中，提供了增加棉花植物(特別是陸地棉植物)纖維長度的方法，這通過向所述棉花植物的細(xì)胞中引入嵌合25基因來實現(xiàn)，其中，所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA元件a.可植物表達(dá)的啟動子b.轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，當(dāng)其,皮轉(zhuǎn)錄時，其產(chǎn)生下述生物活性RNA分子，所述分子能降低D基因組中包含的纖維選擇性|3-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)，以及c.3，末端區(qū)域，其包含在所述植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苦化信號。如本發(fā)明的發(fā)明人所揭示的，棉花植物纖維細(xì)胞中P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)增加(以前被報道為與胞間連絲的重開相關(guān)，以及標(biāo)志著迅速纖維延伸期的末尾)是特異性地由于D亞基因組特異性等位基因在該時間的表達(dá)啟動導(dǎo)致的，而A亞基因組特異性等位基因僅在纖維發(fā)育的后期表達(dá)，至少在陸地棉中是這樣。因此，WO2005/017157所述的方法可被進(jìn)一步改進(jìn)(至少針對陸地棉而言)，這通過特異性地改變編碼纖維選擇性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的特定亞基因組等位基因的表ii^莫式來實現(xiàn)。如本文所述，可以以多種方式來識別編碼纖維選擇性p-l,3-內(nèi)切葡聚糖酶的D亞基因組特異性等位基因。從不同棉花植物的D亞基因組以及從具有D樣基因組的二倍體棉花祖先植物分離編碼纖維選擇性(M，3-內(nèi)切葡聚糖酶的(基因組)核酸揭示A-亞基因組等位基因中的內(nèi)含子在內(nèi)含子序列中具有大約18nt長的插入(見圖3)，而其在D-亞基因組等位基因的內(nèi)含子序列中不存在。此外，對編碼區(qū)域(cDNA;圖2)的核苷酸序列和被編碼的氨基^列(圖4)的比較揭示了A和D-亞基因組等位基因和被編碼的蛋白質(zhì)間的大量特征性不同，這由圖中灰色的盒示出。非常方便地，可以通過多態(tài)性來區(qū)分A和D亞基因組等位基因，這導(dǎo)致A亞基因組等位基因的基因組克隆中翻譯起始密碼子下游大約326個核苷酸處存在Alwl限制性酶識別位點，而在編碼纖維選擇性P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的D亞基因組等位基因中并不存在。用于區(qū)分A和D亞基因組等位基因(都在基因組DNA或cDNA水平上)的一種可能的方法是PCR擴(kuò)增，其中使用cDNA或基因組DNA作為模板，并且使用具有SEQIDNo5和6的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，之后再用Alwl限制性酶來消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。對于兩種亞基因組等位基因而言，通過PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物均為大約656bp，當(dāng)PCR產(chǎn)物產(chǎn)生自D-亞基因組等位基因模板時，其被切割為538和118bp的片段，而擴(kuò)增自A-亞基因組等位基因模板的通過PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物被切割為分別為476bp、118bp和59bp的三條片段。118bp的存在用作為內(nèi)對照，用于限制性酶反應(yīng)正確發(fā)揮功能。本領(lǐng)域可獲得若干種方法，來生產(chǎn)沉默RNA分子，即，當(dāng)表達(dá)的時候，降低特定基因或基因的組的表達(dá)的RNA分子，包括所謂的"正義"或"反義"RNA技術(shù)。因此，在一種實施方案中，編碼抑制性RNA分子的嵌合基因基于所謂的反義技術(shù)。換句話說，嵌合基因的編碼區(qū)域包含纖維選擇性(5-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的核苷酸序列的互補(bǔ)序列的至少19或20個連續(xù)核苷酸的核苷^列?？赏ㄟ^將包含來自纖維選擇性(5-1,3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的至少19或20個核苷酸的DNA片段(按照本申請別處所迷分離或鑒定的)以反方向與可植物表達(dá)的啟動子和3'末端形成區(qū)域(涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺香化)有效相連，來構(gòu)建此類嵌合基因。在另一實施方案中，編碼抑制性RNA分子的嵌合基因基于所謂的共阻遏技術(shù)。換句話說，嵌合基因的編碼區(qū)域包含纖維選擇性P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的核苷酸序列的至少19或20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列?？赏ㄟ^將包含來自纖維選擇性p-l,3-內(nèi)切葡聚糖酶基因的至少19或20個核苷酸的DNA片段以正向與可植物表達(dá)的啟動子和3，末端形成區(qū)域(涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化)有效相連，來構(gòu)建此類嵌合基因。上述嵌合基因降低纖維選擇性p-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因表達(dá)的效率可被進(jìn)一步增強(qiáng)，這通過將導(dǎo)致異常的、未聚腺苷化的抑制性RNA分子表達(dá)或者導(dǎo)致抑制性RNA分子駐留在細(xì)胞核中的DNA元件包括進(jìn)去來實現(xiàn)適于該目的的一種此類DNA元件是編碼自剪接核酶的DNA區(qū)域，如WO00/01133(通過引用并入本文)所述。適于該目的的另一此類DNA元27件是編碼RNA核定位或駐留信號的DNA區(qū)域，如作為WO03/076619公開的PCT/AU03/00292(通過引用并入本文)所述。下調(diào)感興趣基因表達(dá)的一種方便并且非常有效的方法使用了所謂的雙鏈RNA(dsRNA)或干擾RNA(RNAi)，如例如WO99/53050(通過引用并入本文)所述。在該技術(shù)中，RNA分子被引入植物細(xì)胞，其中所述RNA分子能在至少大約19至大約21個核苷酸上形成雙鏈RNA區(qū)域，并且其中，該雙鏈RNA區(qū)域的一條鏈在核苷酸序列上與耙基因大致相同("正義區(qū)域")，而另一條鏈在核苷酸序列上與耙基因的互補(bǔ)序列或與正義區(qū)域的互補(bǔ)序列大致相同("反義區(qū)域")。預(yù)計對于耙基因表達(dá)的沉默而言，19個連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列可具有一處錯配，或者正義和反義區(qū)域可有一個核苷酸不同。為實現(xiàn)對此類RNA分子或編碼嵌合基因的構(gòu)建，可以4吏用WO02/059294描述的栽體。因此，在本發(fā)明的一種實施方案中，提供了用于增加產(chǎn)纖維植物(例如棉花)的纖維長度的方法，所述方法包括下述步驟將嵌合基因引入產(chǎn)纖維植物的細(xì)胞，其中所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA元件(a)可植物表達(dá)的啟動子，優(yōu)選地，控制優(yōu)先在纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的可植物表達(dá)的啟動子；(b)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，當(dāng)其被轉(zhuǎn)錄時，其產(chǎn)生下述雙鏈RNA分子，所述分子能特異性降低纖維選擇性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶亞基因組等位基因的表達(dá)，且所述RNA分子包含第一和第二RNA區(qū)域，其中，i)所述第一RNA區(qū)域包含與所述亞基因組等位基因的核苦酸序列具有至少大約94%序列同一性的至少19個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；ii)所述第二RNA區(qū)域包含與所述第一RNA區(qū)域的至少19個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；iii)所述第一和第二RNA區(qū)域能威基配對，以在所述第一和第二區(qū)域的至少19個連續(xù)核普酸之間形成雙鏈RNA分子；以及(c)3，末端區(qū)域，其包含在植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號。笫一或第二RNA區(qū)域(正義或反義區(qū)域)的長度可從大約19個核普酸(nt)至多達(dá)與參與胼胝質(zhì)去除的內(nèi)源基因的長度(以核普酸計)相等的長度。正義或反義核苷酸序列的總長度因此可以是至少25nt，或者至少大約50nt，或者至少大約100nt，或者至少大約150nt，或者至少大約200nt，或者至少大約500nt。預(yù)計，正義或反義核苷酸序列的總長沒有上限。但是就實際原因(例如，嵌合基因的穩(wěn)定性)而言，預(yù)計正義或反義核香^列的長度應(yīng)當(dāng)不超過5000nt，特別應(yīng)當(dāng)不超過2500nt，其可限于大約1000nt。應(yīng)當(dāng)預(yù)計到，正義或反義區(qū)域的總長越長，這些區(qū)域和纖維選擇性P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因或其互補(bǔ)序列中相應(yīng)序列之間的序列同一性的需求的嚴(yán)謹(jǐn)度就越低。優(yōu)選地，感興趣的核酸應(yīng)當(dāng)與相應(yīng)耙序列具有至少大約75%的序列同一性，特別地，至少大約80%,更特別地，至少大約85%，相當(dāng)特別地，大約90%，尤其是大約95%，更尤其大約100%，相當(dāng)尤其地，與靼序列或其互補(bǔ)序列的相應(yīng)部分相同。但是，優(yōu)選地，感興趣的核酸總是包括與耙核酸的相應(yīng)部分具有100%序列同一性的大約19個連續(xù)核香酸(特別地，大約25nt，更特別地，大約50nt,尤其大約100nt,相當(dāng)尤其地，大約150nt)的序列。優(yōu)選地，為計算序列同一性和"&計相應(yīng)的正義或反義序列，應(yīng)當(dāng)對空位數(shù)量最小化，特別是對于較短的正義序列來說。根據(jù)本發(fā)明的編碼dsRNA的嵌合基因可包含內(nèi)含子，例如異源內(nèi)含子，其位于例如正義和反義RNA區(qū)域間的間隔序列中(根據(jù)WO99/53050(通過引用并入本文)的公開內(nèi)容)。對于本發(fā)明來說優(yōu)選地，反義、正義或雙鏈RNA分子包括的靶特異性基因序列包含至少一個，并且優(yōu)選更多個特異于其表達(dá)將被下調(diào)的亞基因組等位基因的核苷酸。此類特異性核苷酸至少在圖2中通過灰色的盒示出。在優(yōu)選的實施方案中，生物活性RNA#1特異性改造，以下調(diào)纖維選擇性的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因(GhGlucl)的D-亞基因組等位基因。在另一優(yōu)選的實施方案中，生物活性RNA凈皮特異性改造，以下調(diào)纖維選擇性的P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因(GhGlucl)的A-亞基因組等位基因。使用合成的微小RNA用于下調(diào)特定基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，提供了靶基因的非常高的序列特異性，因此允許方^更地在密切相關(guān)的等位基因之間辨別其表達(dá)將被下調(diào)的耙基因。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，生物活性RNA或沉默RNA或抑制性RNA分子可以是被設(shè)計、合成和/或調(diào)節(jié)來靶向產(chǎn)纖維植物(例如棉花植物)中的特異性亞基因組等位基因并導(dǎo)致其切割的微小RNA分子，所述等位基因優(yōu)選是纖維選擇性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的D-亞基因組等位基因。已經(jīng)描述了多種方法，用于產(chǎn)生和使用針對特定乾基因的miRNA(包括但不限于Schwab等人，(2006，PlantCell,18(5):1121-1133)，WO2006/044322,WO2005/047505,EP06009836，它們通過引用并入本文)。通常，對存在的miRNA骨架在耙基因識別部分進(jìn)行修飾，使得產(chǎn)生的miRNA現(xiàn)在能指導(dǎo)RISC復(fù)合物切割從耙核酸轉(zhuǎn)錄的RNA分子?？蓪iRNA骨架進(jìn)行修飾或合成，使得miRNA現(xiàn)在包含編碼纖維選擇性(3-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的核苷#列(例如序列表中列出的序列)的亞基因組等位基因之一的21個連續(xù)核苷酸，并且允許根據(jù)下文所述的規(guī)則的錯配。因此，在一種實施方案中，本發(fā)明提供了下調(diào)表達(dá)或增加植物對于不利生長條件的抗性的方法，所述方法包括下述步驟a.將嵌合基因引入所述植物的細(xì)胞，所述嵌合基因包含下迷有效相連的DNA區(qū)域i.可植物表達(dá)的啟動子；ii.DNA區(qū)域，當(dāng)其引入植物細(xì)胞并在其中轉(zhuǎn)錄時，所述區(qū)域^^口工為miRNA，其中所述miRNA能識別并指導(dǎo)對植物的纖維選擇性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的一種亞基因組等位基因而非另一種亞基因組等位基因的mRNA的切割；以及iii.任選地，涉及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化的3，DNA區(qū)域。提到的祐力口工為miRNA的DNA區(qū)域可包含與纖維選擇性p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的至少21個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列，其中允許下述錯配中的一處或多處a.miRNA5，末端的核香酸與RNA分子中相應(yīng)核苷酸序列間的一處錯配；b.miRNA第l位至第9位核苷酸中任意一個與RNA分子中相應(yīng)核苷^f列之間的一處錯配；c.miRNA的第12位至第21位核苷酸中的任意一個與RNA分子中相應(yīng)核苷酸序列之間的三處錯配，但不超過兩處連續(xù)錯配。在本文中使用時，"miRNA"是長度為大約20至22個核苷酸的RNA分子，其可被栽入RISC復(fù)合物中，并指導(dǎo)對另一RNA分子的切割，其中，這另一RNA分子包含與miRNA分子的核苷酸序列基本上互補(bǔ)的核苷,列，其中可存在下述錯配中的一處或多處a.所述miRNA5，末端的核苷酸與靼RNA分子中相應(yīng)核苷酸序列間的一處錯配；b.所述miRNA第l位至第9位核苷酸中任意一個與靶RNA分子中相應(yīng)核苷酸序列之間的一處錯配；c.所述miRNA的第12位至第21位核苷酸中的任意一個與乾RNA分子中相應(yīng)核苷酸序列之間的三處錯配，但不超過兩處連續(xù)錯配。d.在miRNA的第10和第11位不允許錯配(所有miRNA位置都是從miRNA分子5，末端開始示出的)。miRNA是通過蛋白質(zhì)(例如DCL蛋白質(zhì))從"前miRNA"分子來加工的，所述蛋白是存在于任何植物細(xì)胞中并被裝栽到RISC復(fù)合物上的，其可在那兒指導(dǎo)對靶RNA分子的切割。在本文中使用時，"前miRNA"分子是大約100至大約200個核苷酸的RNA分子，優(yōu)選地，大約100至大約130個核苷酸，其可采用下述二級結(jié)構(gòu)，所述二級結(jié)構(gòu)包含雙鏈RNA莖和單鏈RNA環(huán)，還在雙鏈RNA莖中包含miRNA的核苷酸序列(及其互補(bǔ)序列)。優(yōu)選地，miRNA及其互補(bǔ)序列位于miRNA雙鏈RNA莖游離末端的大約10至大約20個核苦酸31處。單鏈環(huán)區(qū)域的序列和長度并非關(guān)鍵，其可相當(dāng)大程度地變化，例如，長度上30至50nt之間。合成的前-miRNA的一個例子在圖1中示出。優(yōu)選地，未成對和成對RNA結(jié)構(gòu)間自由能的差別在-20至-60kcal/摩爾之間，特別地，大約-40kcal/摩爾。miRNA和miRNAA之間的互補(bǔ)性無須完美，可以忍耐未配對核苷酸的大約1至3個凸起(bulge)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域傳統(tǒng)的計算機(jī)算法(例如mFOLD)來預(yù)測RNA分子采用的二級結(jié)構(gòu)。通過5，末端互補(bǔ)性的程度，來確定來自前miRNA的雙鏈RNA莖的特定鏈(其被通過DCL活性釋放并且裝載到RISC復(fù)合物上)，其中，在其5，末端涉及被切割的dsRNA莖的不同鏈的核苷酸之間的氫結(jié)合最少的鏈被裝栽到R1SC復(fù)合物上，并將決定靶RNA分子降解的序列特異性。但是，如果經(jīng)驗上來自特定的合成前miRNA分子的miRNA分子不具有功能性(因為"錯誤的"鏈被裝載到RISC復(fù)合物上)，將立刻顯而易見；該問題可通過將miRNA分子的位置與其在前miRNA分子的dsRNA莖的各鏈上的互補(bǔ)序列相交換來解決。如本領(lǐng)域已知的，A和U之間的結(jié)合涉及兩個氫鍵或G和U之間涉及兩個氫鍵的結(jié)合要比G和C之間涉及三個氫鍵的結(jié)合弱。天然存在的miRNA分子可被包含在它們的天然存在的前-miRNA分子中，但是他們還可被引入已有的前-miRNA分子骨架，這通過將從此類已有的前-miRNA分子正常加工得到的miRNA分子的核苷酸序列換成感興趣的另一miRNA的核苷酸序列來實現(xiàn)。前-miRNA的骨架還可以是完全合成的。類似地，合成的miRNA分子可被包含在已有的前-miRNA分子骨架或合成的前-miRNA骨架中，或從其加工而來。前-miRNA分子(以及由此還有miRNA分子)可被方便地引入植物細(xì)胞，這通過向植物細(xì)胞提供包含可植物表達(dá)的啟動子的基因來實現(xiàn)，所述啟動子與轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生前-miRNA分子的DNA區(qū)域有效相連?？芍参锉磉_(dá)的啟動子可以是與前-miRNA分子天然相關(guān)的啟動子，或者其可以是異源啟動子。用于對GhGlucl基因的D-亞基因組等位基因的表達(dá)進(jìn)行特異性下調(diào)的合適miRNA和前微小RNA分子示于序列表編號SEQIDNo15、16、32用于對GhGlucl基因的A-亞基因組等位基因的表達(dá)進(jìn)行特異性下調(diào)的合適miRNA和前微小RNA分子示于序列表編號SEQIDNo13、14、17、18和19中。在本文中使用時，術(shù)語"可植物表達(dá)的啟動子"表示能控制(起始)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的DNA序列。這包括植物來源的任何啟動子，還包括能指導(dǎo)在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的非植物來源的任何啟動子，即，病毒或細(xì)菌來源的某些啟動子，例如CaMV35S，地三葉病毒啟動子No4或No7或T-DNA基因啟動子等。這樣的啟動子，其驅(qū)動有效相連的DNA區(qū)域在纖維細(xì)胞和下面的表皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄至比在植物其它組織或細(xì)胞中更高的水平。此類啟動子包括來自棉花的來自纖維特異性P-微管蛋白基因的啟動子(如WO0210377所述)、來自棉花的來自纖維特異性肌動蛋白基因的啟動子(如WO0210413所述)、來自棉花的纖維特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的啟動子(如US5792933所述)、來自棉花的擴(kuò)展蛋白基因的啟動子(WO9830698)或來自棉花中幾丁質(zhì)酶基因的啟動子(US2003106097)或US6259003或US6166294中描述的纖維特異性基因的啟動子。還可使用本文所述的纖維選擇性啟動子。對于某些應(yīng)用而言，減少產(chǎn)纖維植物(例如棉花植物)中纖維長度可能是有好處的。例如，減少棉花植物中絨毛纖維的量，由此留下更多能量和材料用于在棉花植物中摻入棉絨纖維將是有好處的。這可方便地通過在纖維細(xì)胞發(fā)育的早期階段在纖維細(xì)胞中(過)表達(dá)p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶來實現(xiàn)，例如使用本文所述的、在迅速延伸期末尾表達(dá)的纖維選擇性啟動子來實現(xiàn)。本發(fā)明還包括本文所述的嵌合基因以及包含這些嵌合基因的植物、種子、組織以及從此類植物產(chǎn)生的纖維。還可通過分離出編碼具有弱酶活性的變體蛋白或不再編碼功能性P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的D-亞基因組等位基因變體，來增加或改變棉花中的纖維品質(zhì)和纖維長度或其它纖維性質(zhì)。用于轉(zhuǎn)化植物的方法是本領(lǐng)域公知的，這與本發(fā)明并不太相關(guān)。用于轉(zhuǎn)化棉花植物的方法也是本領(lǐng)域公知的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化已被描述過，例如，在美國專利5,004,863或美國專利6,483,013中，在例如WO92/15675中報道了通過粒子轟擊進(jìn)行的棉花轉(zhuǎn)化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，以穩(wěn)定方式或以瞬時方式，將根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因引入植物。嵌合基因可被引入植物，或可在植物細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生，如例如EP1339859所述?？赏ㄟ^在棉花植物(可由其獲得胚胎發(fā)生性愈傷組織)進(jìn)行轉(zhuǎn)化來引入嵌合基因，所述植物例如Coker312、Coker310、Coker5AcalaSJ誦5、GSC25110、FIBERMAX819、Siokra1-3、T25、GSA75、AcalaSJ2、AcalaSJ4、AcalaSJ5、AcalaSJ-C1、AcalaB1644、AcalaB1654-26、AcalaB1654-43、AcalaB3991、AcalaGC356、AcalaGC510、AcalaGAM1、AcalaCl、AcalaRoyale、AcalaMaxxa、AcalaPrema、AcalaB638、AcalaB1810、AcalaB2724、AcalaB4894、AcalaB5002、非Acala"picker"Siokra、"stripper"品種FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBREDAl、CHEMBREDA2、CHEMBREDA3、CHEMBREDA4、CHEMBREDBl、CHEMBREDB2、CHEMBREDB3、CHEMBREDCl、CHEMBREDC2、CHEMBREDC3、CHEMBREDC4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMAS6OROBLANCOPIMA、FIBERMAXFM5013、FIBERMAXFM5015、FIBERMAXFM5017、FIBERMAXFM989、FIBERMAXFM832、FIBERMAXFM966、FIBERMAXFM958、FIBERMAXFM989、FIBERMAXFM958、FIBERMAXFM832、FIBERMAXFM991、FIBERMAXFM819、FIBERMAXFM800、FIBERMAXFM960、FIBERMAXFM966、FIBERMAXFM981、FIBERMAXFM5035、FIBERMAXFM5044、FIBERMAXFM5045、FIBERMAXFM5013、FIBERMAXFM5015、植物。在本文中使用時"棉花"包括陸地棉或海島棉。"棉花祖先植物"包括樹沖帛(G"owj;/;i'Mm)、草棉、雷蒙德、氏沖帛和長專才帛(Gos5^/w7mi本發(fā)明的方法和手段還可用于其它植物物種，例如，大麻、黃麻、亞麻和木質(zhì)植物，包括但不限于術(shù)^屬()、楊屬(i^p"/附)、云杉屬(尸/cefl)、按屬(E"ai(v/加5/7/7.)等。獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可用于傳統(tǒng)培育體系，以產(chǎn)生更多具有相同特征的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，或在相同或相關(guān)植物物種的其它品種中或雜交植物中引入根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因。從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物獲得的種子含有作為穩(wěn)定的基因組插入的本發(fā)明嵌合基因，其也是本發(fā)明所包括的。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了針對P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的抗體，特別是能識別具有SEQIDNo11和12的^&酸序列的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶蛋白的抗體。在本文中使用時，"包含"應(yīng)當(dāng)被解釋為其特指出了提到的特征、整數(shù)、步驟或組分的存在，但是并不排除一種或多種特征、整數(shù)、步驟或組分或它們的組的存在或添加。因此，例如，包含核苷酸序列或^J^,列的核酸或蛋白可包含比實際提到的那些更多的核苷酸或氨基酸，即，其被嵌入更大的核酸或蛋白中。包含功能或結(jié)構(gòu)上確定的DNA區(qū)域的嵌合基因還可包含其它DNA區(qū)域等。下述非限制性實施例描述了對棉花中A和D亞型的兩種P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶和它們的啟動子區(qū)域的鑒定，以及對次生植物細(xì)胞壁合成中表達(dá)和參與時機(jī)的分析。還描述了嵌合基因及其用途，所述嵌合基因用于改變纖維特征、用于在產(chǎn)纖維植物(例如棉花)中的纖維特異性表達(dá)和纖維優(yōu)先性表達(dá)。除非另有指明，在實施例中，所有重組DNA技術(shù)都是按照標(biāo)準(zhǔn)方案來進(jìn)行的，如Sambrook等人(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY和Ausubel等人(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA的第1和2巻所述。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法被描述于PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，由R.D.D.Croy,BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK共同出版。在說明書和實施例全文中，參考序列表中示出的下述序列SEQIDNo1:來自陸地棉FiberMax966，亞型A的p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段SEQIDNo2:來自陸地棉FiberMax966，亞型D的p-l,3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段SEQIDNo3:來自樹棉的|5-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段SEQIDNo4:來自雷蒙德氏棉的|5-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段SEQIDNo5:用于擴(kuò)增卩-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因組片段的反向引物(SE002)SEQIDNo6:用于擴(kuò)增卩-1，3-內(nèi)切葡聚糖酶基因組片段的正向引物(SE003)SEQIDNo7:來自陸地棉FiberMax966,亞型A的(3-1,3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段編碼的M酸序列SEQIDNo8:來自陸地棉FiberMax966，亞型D的卩-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的經(jīng)擴(kuò)增基因組片段編碼的M酸序列SEQIDNo9:來自陸地棉FiberMax966，亞型A的JM，3-內(nèi)切葡聚糖酶的完整基因組克隆的核苷酸序列，其包括啟動子序列SEQIDNo10:來自陸地棉FiberMax966,亞型D的卩-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的完整基因組克隆的核苷酸序列，其包括啟動子序列SEQIDNo11:來自陸地棉FiberMax966，亞型A的完整jM，3-內(nèi)切葡聚糖酶的M,列SEQIDNo12:來自陸地棉FiberMax966，亞型D的完整p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的M^列SEQIDNo13:前-miRAl的核苷,列SEQIDNol4:前-miRAl的核苷酸序列，具有克隆位點SEQIDNo15:前-miRDl的核苷斷列SEQIDNo16:前-miRDl的核苷酸序列，具有克隆位點SEQIDNo17:前-miRA2的核苷i^f列SEQIDNo18:前-miRA2aa的核普斷列SEQIDNo19:前-miRA2aa的核普酸序列，具有克隆位點SEQIDNo20:前-miRD2的核苷餅列SEQIDNo21:前-miRD2的核苷酸序列，具有克隆位點實施例1:在棉花植物和棉花祖先植物中鑒定編碼纖維選擇性p-l，3-葡聚糖酶的A和D-亞基因組特異性等位基因已經(jīng)提出，胼胝質(zhì)涉及在生長中的纖維細(xì)胞中保持膨脹的過程。在纖維和非纖維棉花細(xì)胞之間的橋連結(jié)構(gòu)(作為胞間連絲已知)的基底去除胼胝質(zhì)消除了膨壓。這導(dǎo)致了迅速纖維延伸的終止。因此應(yīng)當(dāng)通過延遲對胼胝質(zhì)的去除來增強(qiáng)纖維長度。P-l，3-葡聚糖酶催化p-1，3-0-葡聚糖(胼胝質(zhì))中p-1,3-0-糖苷鍵的水解。當(dāng)胼胝質(zhì)在纖維基底沉積時，G/iG/wcl編碼的纖維特異性P-l，3-葡聚糖酶是無法檢測到的，但在胼胝質(zhì)降解的時候其變得顯而易見。簡言之，胞間連絲閉合看起來在延伸棉花纖維的方面具有重要作用。胼月^t沉積和降解應(yīng)當(dāng)分別參與胞間連絲閉合和重開。GAG/"cl的表達(dá)可通過降解胼胝質(zhì)由此開啟胞間連絲從而在該過程中具有作用(Ruan等人，2004，PlantPhysiology—136:4104-4113)?；?^G7wcl的核苷酸序列(EMBL登錄號D88416X被描述于Ruan等人，2004，PlantPhysiology—136:41044113中)，設(shè)計了2條引物(SE002:ggccgaagccgatcttatctagg(反向引物；SEQIDNo5)和SE003:cggcaacaatcttccatctccag(正向引物；SEQIDNo6)),來擴(kuò)增用于陸地37棉(AD基因組)、樹棉(G.(A基因組)和雷蒙德氏棉(G.m/附o"W)(D基因組)的基因組DNA片段。對這些片段進(jìn)行了測序(見SEQIDNol-4)。對于陸地棉而言，獲得了2條共有序列，對于樹棉而言，獲得了l條共有序列，對于雷蒙德氏棉而言，獲得了l條共有序列。兩條陸地棉序列和兩種二倍體之間多態(tài)性的總覽<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>因此，一種類型的序列對應(yīng)于A基因組序列，另一種類型對應(yīng)于D基因組。在擴(kuò)增的PCR片上進(jìn)行J/wI(識別位點=GGATC)消化，hirsutum或基因組中兩種亞基因組變體均可被區(qū)分(見圖5)。因此，可使用下述方法來區(qū)分GhGlucl的A和D亞基因組等位基因。所使用的引物如下所述a.SE002:GGCCGAAGCCGATCTTATCTAGG(SEQIDNo5)b.SE003:CGGCAACAATCTTCCATCTCCAG(SEQIDNo6)預(yù)計的PCR產(chǎn)物長度為655bp。PCR條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>95。C一5min95。C—1min58。C-1min72。C一2min93。C一30s580C—30s72。C—1minJ72。C—10minx25xPCR擴(kuò)增后，z使用lOft才莫板；l^ilAlwl酶、2^1NEB4限制性緩沖液、7piMQ水進(jìn)行Ahvl消化(在37°C孵育3小時)，來消化PCR片段。在用EtBr染色的1.5%TAE凝膠上分析得到的片段。A亞基因組等位基因特異性PCR片段的預(yù)計條帶大小是479+118+59bp。D亞基因組等位基因特異性PCR片段的預(yù)計條帶大小是538+118bp。實施例2:陸地棉中編碼纖維選擇性p-l，3-葡聚糖酶的A和D亞基因組特異性等位基因的差異表達(dá)和與纖維發(fā)育階段的關(guān)聯(lián)性針對陸地棉來分析纖維生長/發(fā)育模式期間的等位基因特異性表達(dá)。提取從纖維細(xì)胞和種子(5DPA時)和從纖維細(xì)月包(10、15、20和40DPA)產(chǎn)生的cDNA文庫的DNA，對濃度加以均衡，進(jìn)行上文提到的PCR擴(kuò)增。條帶強(qiáng)度的差異對應(yīng)于表達(dá)的相對差異(圖6，道2、4、6、8和10)。包括了陽性對照(基因組DNA,圖6，道12)。按照實施例1所述進(jìn)行Alwl消化，以在GhGlucl基因的2種亞基因組等位基因間進(jìn)行區(qū)分(圖6，道3、5、7、9、11和13)。表達(dá)沖莫式可被總結(jié)為下表5dpa10dpa15dpa20dpa30dpa40dpa//DDA和DA和D在纖維發(fā)育的迅速延伸期(5和10dpa)沒有G7iC7/"cl表達(dá)。因此，39胼胝質(zhì)堵塞沒有降解；細(xì)胞中膨脹沒有釋放，延伸仍繼續(xù)。我們相信，5dpa的模糊條帶表明種子中有一些表達(dá)(纖維中沒有)。在延伸期和次生細(xì)胞壁形成期之間的過渡時(15DPA),C^(7/"cl表達(dá)。迅速延伸停止時，這在細(xì)胞中釋放了膨脹。僅基因的D基因組樣變體表達(dá)。在20DPA時，表達(dá)要比15DPA時多(更強(qiáng)的條帶)。A基因組樣的變體在15和20DPA時不表達(dá)。A基因組樣變體以及D基因組樣變體在30和40DPA時表達(dá)，并可能在成熟或其它纖維性質(zhì)方面發(fā)揮作用。實施例3:分離和鑒定編碼纖維選擇性(5-l，3-葡聚糖酶的A和D-亞基因組特異性等位基因的啟動子區(qū)域用包含GhGlucl的A和D亞基因組特異性等位基因的核苷酸序列的PCR片段來篩選含有陸地棉品種的基因組DNA克隆的BAC文庫。鑒定了4個不同的克隆，每種亞基因組變體2個。鑒定了針對每種等位基因變體的基因組片段的核苷,列，它們被示為SEQIDNo9(A基因組)和SEQI關(guān)o10(D基因組)。對于A基因組變體而言，可在第2278至2281位鑒定出TATA框；在第2308位鑒定出轉(zhuǎn)錄起始位點。5，非翻譯前導(dǎo)序列從第2308位核苷酸延伸至第2409位；翻譯起始密碼子位于第2410-2412位。編碼序列由內(nèi)含子序列(2444-2555)分開的兩個外顯子(nt2410至2443和nt2556至3499)構(gòu)成。翻譯終止密碼子位于第3497至3499位，聚腺苷化位點位于第3624位。對于D基因組變體而言，可在第3242至3245位鑒定出TATA框；在第3270位鑒定出轉(zhuǎn)錄起始位點。5，非翻譯前導(dǎo)序列從第3270位核苷酸延伸至第3372位；翻譯起始密碼子位于第3373-3375位。編碼序列由內(nèi)含子序列(nt3407-3500)分開的兩個外顯子(nt3373-3406和nt3501-4444)構(gòu)成。翻譯終止密碼子位于第4442至4444位，聚腺苷化位點位于第4566位。融合的編碼區(qū)域的核苷酸序列已被比對(圖2)，差異被示出；類似地，內(nèi)含子核苷,列也已被比對(圖3)。圖4顯示了對編碼的蛋白的比對，而圖1顯示了對位于編碼區(qū)域上游的核苷酸序列的比對。實施例4:包含與標(biāo)記基因有效相連的不同纖維選擇性啟動子區(qū)域的嵌合基因構(gòu)建體使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)將下述DNA片段有效相連a.A等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo9的第465位核普酸至第2409位核普酸的核苷酸序列b.p-葡糖酪酸糖苦酶編碼區(qū)域(GUS)c.包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3，35S的片段(下文中示為Glucl-SGA(A1.9))和d.A等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo9的笫1374位核普酸至第2409位核苦酸的核普酸序列e.p-葡糖醛酸糖苷酶編碼區(qū)域(GUS)f.包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3'35S的片段和g.A等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo9的第1531位核苷酸至第2409位核苦酸的核普酸序列h.P-葡糖醛酸糖苷酶編碼區(qū)域(GUS)i.包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3'35S的片段和j.D等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo10的第1397位核苷酸至笫3372位核普酸的核苷酸序列(下文中示為Glucl-SGD(D2.0))k.P-葡糖醛酸糖苷酶編碼區(qū)域(GUS)1.包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3，35S的片段和m.D等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo10的第2371位核苷酸至第3372位核苷酸的核苷酸序列n.p-葡糖醛酸糖香酶編碼區(qū)域(GUS)包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3'35S的片段或o.D等位基因特異性啟動子的核苷酸序列，其包含SEQIDNo10的第2718位核苷酸至第3372位核苷酸的核苷酸序列p.卩-葡糖醛酸糖苦酶編碼區(qū)域(GUS)q.包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號(CaMV)3，35S的片段在存在嵌合選擇性標(biāo)記基因的情況下，將上述嵌合基因分別克隆進(jìn)T-DNA載體，并引入包含卸曱的輔助Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌林。根據(jù)WO00/71733所述的方法，用農(nóng)桿菌菌林來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花。來自這些植物的纖維細(xì)胞和其它組織被組織化學(xué)染色。主要在纖維細(xì)胞和纖維中觀察到了不同嵌合構(gòu)建體的表達(dá)。實施例5:包含與N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)域有效相連的不同纖維選擇性啟動子區(qū)域的嵌合基因構(gòu)建體使用目前的重組DNA技術(shù)，裝配與實施例4的構(gòu)建體相似的構(gòu)建體，但是其中Gus編碼區(qū)域被換為NodC編碼區(qū)域(見WO2006/136531，具體地，其中的SEQID1至9,該文獻(xiàn)通過引用并入本文)，之前是Cab22非翻譯前導(dǎo)序列。在存在嵌合選擇性標(biāo)記基因的情況下，將上述嵌合基因分別克隆進(jìn)T-DNA栽體，并引入包含卸曱的輔助Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌抹。根據(jù)WO00/71733所述的方法，用農(nóng)桿菌菌株來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花。針對帶正電的寡糖的存在，對來自這些植物的纖維細(xì)胞和其它組織進(jìn)行了分析，如WO2006/136531所述。實施例6:通過特異性下調(diào)編碼纖維選擇性p-l，3-葡聚糖酶的D-亞基因組特異性等位基因，來增加陸地棉中的纖維長度使用本領(lǐng)域已知的設(shè)計規(guī)則，設(shè)計了對GhGlucl的A或D亞基因組等位基因變體特異的合成前微小RNA。用于對GhGlucl基因的D-亞基因組等位基因的表達(dá)進(jìn)行特異性下調(diào)的合適miRNA和前微小RNA分子示于序列表編號SEQIDNo15、16、20和21中。用于對GhGlucl基因的A-亞基因組等位基因的表達(dá)進(jìn)行特異性下調(diào)的合適miRNA和前微小RNA分子示于序列表編號SEQIDNo13、14、17、18和19中。如實施例4所述，在CaMV35S啟動子的控制下或在纖維特異性和/或纖維優(yōu)先性啟動子的控制下，克隆了編碼前微小RNA的核苷酸序列。在存在嵌合選擇性標(biāo)記基因的情況下，將上述嵌合基因分別克隆進(jìn)T-DNA栽體，并引入包含卸曱的輔助Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌林。根據(jù)WO00/71733所述的方法，用農(nóng)桿菌菌林來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花。針對增加的纖維長度，對來自這些植物或其后代的纖維進(jìn)行了分析。實施例7:對glucl啟動子對纖維的特異性的分沖斤從棉花葉、根和莖分離RNA，針對glucl基因和蛋白磷酸酶2A基因(普遍存在并保守的絲氨^/蘇氨酸磷酸酶，其具有廣泛的底物特異性和不同細(xì)胞功能)的表達(dá)對RNA加以分析。使用用于RT-PCR(Invitrogen)的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)來進(jìn)行第一鏈cDNA合成，之后加入glucl或pp2A特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果示于表7中。道17中的陽性結(jié)果表明成功實現(xiàn)了第一鏈合成。使用pp2A特異性引物，在葉、根和莖RNA樣品中，道10、12、14中的陽性結(jié)果特異性地表明了葉、根和莖樣品中的第一鏈合成是有成效的。道ll、13、15是陰性對照，其省略了來自反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶。道8是基因組DNA構(gòu)成的陽性對照，用于驗汪glucl特異性PCR反應(yīng)的正確性。在道2、4、6中，沒有檢測到信號，這表明，在棉花葉、根和莖中不存在Glucl表達(dá)。道3、5和7是省略了逆轉(zhuǎn)錄酶的43陰性對照?？傊?，在棉花葉、根和莖組織中沒有檢測到Glucl表達(dá)。實施例8:用含有的農(nóng)桿菌菌林進(jìn)行棉花胚珠轉(zhuǎn)化用攜帶不同嵌合glucl啟動子::GUS融合基因(在實施例4中示為Glucl-SGA(A1.9)和Glucl-SGD(D2.0))的才艮瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，在0DPA、1DPA和2DPA分離棉花花的胚珠，將其用于胚珠培養(yǎng)實驗(如例如Feng和Brown,2000，InvitroCellular&DevelopmentalBiology,巻36，Number4第293-299頁所述)。在1周、2周、3周、4周或5周后，針對GUS表達(dá)通過組織化學(xué)方法來分析初始的纖維細(xì)胞/纖維。培養(yǎng)的胚珠作為陽性對照被包括進(jìn)來，其已經(jīng)過了具有嵌合CaMV35啟動子::Gus融合基因的農(nóng)桿菌菌林的感染。注意使用的GUS編碼區(qū)域含有內(nèi)含子序列，以避免感染性農(nóng)桿菌中偶然的GUS表達(dá)。結(jié)果概括于表l中。表l:對經(jīng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的棉花胚珠的Gus組織化學(xué)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>這些數(shù)據(jù)確證了針對來自GhGlucl的不同亞基因組等位基因的啟動子而言從實施例2的數(shù)據(jù)推斷的表達(dá)模式。權(quán)利要求1.纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含選自以下核苷酸序列的核苷酸序列a)核苷酸序列，其包含SEQIDNo9的第2149位核苷酸至第2307位核苷酸的核苷酸序列；b)核苷酸序列，其包含SEQIDNo10的第3109位核苷酸至第3269位核苷酸的核苷酸序列；c)核苷酸序列，其包含與a)或b)提到的任何所述核苷酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，特別是至少95％序列同一性或者更特別是與a)或b)提到的任何所述核苷酸序列相同的核苷酸序列；或d)核苷酸序列，其包含大約150bp至大約1000bp的DNA片段的核苷酸序列，所述DNA片段在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有a)、b)或c)提到的所述核苷酸序列的DNA片段雜交。2.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo9的第465位至第2307位的核苷酸序列。3.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo9的第1374位至笫2307位的核苷酸序列。4.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo9的第1531位至第2307位的核普酸序列。5.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo10的第1397位至第3269位的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo10的第2371位至第3269位的核苷酸序列。7.權(quán)利要求1的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子，其包含SEQIDNo10的第2718位至第3269位的核苷酸序列。8.纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域，其包含權(quán)利要求1至7中任意一項的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子。9.權(quán)利要求8的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域，其還包含SEQID9的第2308位核普酸至第2409位核普酸的核苷酸序列。10.權(quán)利要求8的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域，其還包含SEQID10的第3270位核苷酸至第3372位核苷酸的核苷酸序列。11.嵌合基因，其包含下述有效相連的DNA區(qū)域a)權(quán)利要求1至7中任意一項的纖維細(xì)胞特異性啟動子；b)異源DNA區(qū)域，其編碼感興趣的生物活性RNA;以及c)轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號。12.權(quán)利要求11的嵌合基因，其中所述生物活性RNA編碼感興趣的蛋白質(zhì)。13.權(quán)利要求12的嵌合基因，其中所述異源DNA區(qū)域編碼選自N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選地，NodC型的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，纖維素合酶，蔗糖合酶，優(yōu)選地，C型的蔗糖合酶；蔗糖磷酸合酶；p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶，木聚糖合酶(cslF)、木葡聚糖合酶(cslD)和1,3-1,4葡聚糖合酶(cslC)的分子。14.權(quán)利要求ll的嵌合基因，其中所述生物活性RNA是核酶、微小RNA、雙鏈發(fā)夾RNA。15.權(quán)利要求12的嵌合基因，其中所述生物活性RNA下調(diào)內(nèi)源棉花基因，例如P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)。16.植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11至15中任意一項的嵌合基因。17.植物，其在其細(xì)胞中包含權(quán)利要求11至15中任意一項的嵌合基因。18.權(quán)利要求17的植物，其是棉花植物。19.在其細(xì)胞中包含權(quán)利要求11至15中任意一項的嵌合基因的植物的種子。20.在產(chǎn)纖維植物，例如棉花植物的纖維細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)生物活性RNA的方法，所述方法包括a)向所述植物的細(xì)胞提供權(quán)利要求11至15中任意一項的的嵌合基因，以及b)種植所述植物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述植物是棉花植物。22.權(quán)利要求1至7中任意一項的纖維特異性和/或纖維優(yōu)先性啟動子用于在產(chǎn)纖維植物的纖維細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)生物活性RNA的用途。23.權(quán)利要求22的用途，其中所述植物是棉花植物。24.經(jīng)分離的DNA分子，其包含編碼下述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含編碼(3-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶并且與SEQIDNo11或SEQIDNo12的氨基酸序列具有至少95%序列同一性、優(yōu)選相同的^J^酸序列。25.經(jīng)分離的DNA分子，其包含選自SEQIDNo1、SEQIDNo2、SEQIDNo3和SEQIDNo4的核苦齡列。26.經(jīng)分離的DNA分子，其包含選自下述的核苷^列SEQIDNo9的第2410-2443位的核苷酸序列和SEQIDNo9的第2556-3499位核苷酸序列或SEQIDNo10的第3373-3406位核普,列和SEQIDNo10的笫3501-4444位核苷酸序列。27.權(quán)利要求24至27中任意一項的經(jīng)分離的DNA分子用于分離纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子或啟動子區(qū)域的用途。28.分離纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子區(qū)域的方法，所述方法包括下述步驟a)鑒定編碼下述RNA轉(zhuǎn)錄本的基因組片段，可從所述RNA轉(zhuǎn)錄本合成下述cDNA,所述cDNA包含SEQIDNo1、SEQIDNo2、SEQIDNo3或SEQIDNo4或其功能等價物的核苷酸序列；b)分離編碼下述蛋白質(zhì)的核苷^列上游的DNA區(qū)域，所述蛋白質(zhì)具有SEQIDNo11或SEQIDNo12或其功能等價物的氨基酸。29.通過權(quán)利要求28的方法獲得的纖維細(xì)胞優(yōu)先性啟動子或啟動子區(qū)域。30.增加棉花植物纖維長度的方法，所述方法包括下述步驟向所述棉花植物的細(xì)胞中引入下述嵌合基因，所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA元件(a)可植物表達(dá)的啟動子，優(yōu)選地，控制在所述纖維細(xì)胞中優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的可植物表達(dá)的啟動子；(b)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，當(dāng)其被轉(zhuǎn)錄時，其產(chǎn)生下述生物活性RNA分子，所述分子能降低對于所述產(chǎn)纖維植物內(nèi)源的(5-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的表達(dá)，所述P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶涉及從所述胞間連絲去除胼胝質(zhì)，以及(c)3，末端區(qū)域，其包含在所述植物的細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺香化信號，所述方法特征在于，所述內(nèi)源p-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因是所述棉花植物的D亞基因組中包含的(3-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述啟動子是來自棉花的纖維特異性p微管蛋白啟動子、來自棉花的纖維特異性肌動蛋白啟動子、來自棉花的脂轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)基因的纖維特異性啟動子、來自棉花的擴(kuò)展蛋白基因的啟動子或來自棉花幾丁質(zhì)酶基因的啟動子或權(quán)利要求1至7中任意一項所述的啟動子。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述D亞基因組中包含的所述l3-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因表征為具有SEQIDNo10笫3407-3500位的核苷酸序列的內(nèi)含子序列的存在。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述D亞基因組中包含的所迷P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因表征為翻譯起始密碼子下游大約326個核苷酸處(不包括該翻譯起始密碼子)核苷酸序列AAGATC的存在。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述D亞基因組中包含的所述P-l，3-內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因表征為用具有SEQIDNo5和SEQIDNo6的核苷酸序列的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用Ahvl限制性酶消化后，對大約538bp的片段和大約118bp的片段的鑒定。35.權(quán)利要求31的方法，其中所述內(nèi)源基因編碼包含SEQIDNo12的氨基^列的蛋白質(zhì)或者其中所述基因包含SEQIDNo2的核苷^列。36.權(quán)利要求30至35中任意一項的方法，其中所述棉花植物是陸地棉((？os卿Zw附Ai7^由附)。37.權(quán)利要求30至35中任意一項的方法，其中所述生物活性RNA是反義RNA，所述反義RNA包含與SEQIDNo3的核普酸序列互補(bǔ)序列具有至少94%序列同一性的至少19個核香酸。38.權(quán)利要求30至35中任意一項的方法，其中所述生物活性RNA是正義RNA，所述正義RNA包含與SEQIDNo3的核苷酸序列具有至少94%序列同一性的至少19個核普酸。39.權(quán)利要求30至35中任意一項的方法，其中所述生物活性RNA是雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子包含與SEQIDNo3的核苷酸序列互補(bǔ)序列具有至少94%序列同一性的至少19個核苷酸以及與所述至少19個核苷酸的互補(bǔ)序列基本上相似的互補(bǔ)RNA鏈。40.權(quán)利要求37至39中任意一項的方法，其中所述19個核苷酸包含特異于如圖2所示的D亞基因組Ghglucl基因的至少一個核苷酸。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述雙鏈RNA是從包含SEQIDNo15、SEQIDNo16、SEQIDNo20或SEQIDNo21的核苷斷列的前樣史小RNA力口工的孩史小RNA。42.權(quán)利要求30至41中任意一項的方法，其中所述纖維是棉絨纖維。43.權(quán)利要求30至41中任意一項的方法，其中所述纖維是絨毛纖維。44.權(quán)利要求30至43中任意一項的方法，其還包括(a)種植根據(jù)所述方法獲得的植物；以及(b)從所述產(chǎn)纖維植物分離纖維。45.減少產(chǎn)纖維植物的纖維長度的方法，所述方法包括下述步驟將嵌合基因引入所述產(chǎn)纖維植物的細(xì)胞，其中，所述嵌合基因包含下述有效相連的DNA片段(a)根據(jù)權(quán)利要求lb、5、6或7的可植物表達(dá)的啟動子；(b)DNA區(qū)域，其編碼p-l，3-葡聚糖酶蛋白質(zhì)；以及(c)3，末端區(qū)域，其包含在所述植物的細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化信號。46.權(quán)利要求17的方法，其中編碼所述|3-1，3葡聚糖酶蛋白質(zhì)的所述DNA區(qū)域編碼與SEQIDNo11或SEQIDNo12的#^酸序列具有至少95%序列同一性的M^列。47.權(quán)利要求30至46中任意一項所述的嵌合基因。48.產(chǎn)纖維植物的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求47的嵌合基因。49.產(chǎn)纖維植物，其包含權(quán)利要求47的嵌合基因。50.權(quán)利要求49的產(chǎn)纖維植物，其中所述植物的纖維長度較之未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照植物有所增加。51.權(quán)利要求49或50中任意一項的產(chǎn)纖維植物，其中所述植物是棉花。52.權(quán)利要求51的棉花植物，其是陸地棉。53，權(quán)利要求49至52中任意一項的產(chǎn)纖維植物的種子，所述種子包含權(quán)利要求47的嵌合基因。54.根據(jù)權(quán)利要求30至46中任意一項的方法生產(chǎn)的纖維。全文摘要本發(fā)明公開了改變產(chǎn)纖維植物(例如棉花)的纖維性質(zhì)(例如纖維長度)的方法和手段。本發(fā)明還提供了具有纖維優(yōu)先性或纖維選擇性表達(dá)模式的植物啟動子。文檔編號C12N15/82GK101578371SQ200880001514公開日2009年11月11日申請日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日發(fā)明者A·阿廖利,S·恩格勒恩申請人:拜爾生物科學(xué)公司