專利名稱：：核重編程方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過重編程分化的體細胞來產生誘導性多能干細胞的方法。
背景技術：
：胚胎干細胞(ES細胞)是源自人或小鼠早期胚胎的具有無限增殖能力，同時保持著多能性及分化成活體中存在的所有細胞的能力。通過使用這些特性，期望將人ES細胞用作針對多種疾病(如帕金森癥、青少年糖尿病和白血病)的移植療法的來源。但問題是，ES細胞的移植引發(fā)移植后患者的組織排斥。另外還有許多來自論理學觀點的對使用通過破壞人胚胎建立的人ES細胞的反對意見。如果可將患者自身的分化體細胞用于誘導分化，并建立如ES細胞(在本說明書中，將此細胞稱為"人工多能干細胞"或"iPS細胞"，還稱為"誘導性多能干細胞"、"胚胎干細胞樣細胞"或"ES樣細胞")一樣具有多能性和增值能力的細胞，則期望將它們用作既無排斥反應，又無倫理問題的理想的多能性細胞。近來，有報道稱可從小鼠和人體細胞產生所述iPS細胞，這已引起強烈反響(國際公開WO2007/69666;Cell,126，pp.663-676,2006;Cell,131，pp.861-872，2007)。上述方法包括通過將多個特定因子(如Cell,126，pp.663-676，2006所述使用了四種因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)導入體細胞來進行重編程的步驟，并將逆轉錄病毒載體用于導入所述因子。但因為c-Myc是癌-相關的轉錄因子，當將所述包含c-Myc的四種因子導入體細胞進行重編程時，無法排除分化誘導自所得諸導性多能干細胞的所述細胞或組織具有致瘤性的可能性。已知使用逆轉錄病毒載體導入ES細胞的基因具有沉默功能，并也證實通過使用逆轉錄病毒載體產生的iPS細胞具有沉默功能(參見國際公開W02007/69666的實施例7)。但無法保證所述導入的外源c-Myc不在其后代中表達。Thomson等人建議了使用四種因子0ct3/4、Sox2、Lin28和Nanog(不使用c-Myc)進行核重編程的方法(Science,318，pp.1917-1920，2007;國際公開WO2008/118820)。但當前世界上iPS細胞的研發(fā)過程中仍使用四種因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。此外，國際公開W02007/69666教導可用細胞因子取代Myc家族基因，且上述文獻說明書的實施例5顯示，可用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)代替c-Myc實現(xiàn)核重編程。此外，上述國際公開顯示選為重編程因子候選物的24個基因包括sal14(表4，No.13)。但這不表明Sal14具有核重編程活性。而且顯示，相比使用c-Myc產生iPS細胞，可通過組合L-Myc或N-Myc(Myc家族基因之一)與Oct3/4、Sox2核Klf4有效建立iPS細胞(實施例6)。專利文獻l:國際公開W02007/69666專利文獻2:國際公開WO2008/118820非專利文獻l:Cell,126，pp.663-676，2006非專利文獻2:Cell,131，pp.861-872，2007非專利文獻3:Science,318，pp.1917-1920,200
發(fā)明內容本發(fā)明擬解決的問題本發(fā)明的問題是提供產生安全的誘導性多能干細胞的方法。具體而言，本發(fā)明的問題是提供安全的誘導性多能千細胞，由所述誘導性多能干細胞分化誘導所得的細胞或組織中無致瘤性危險。此外，本發(fā)明的另一目的是提供有效產生誘導性多能干細胞的方法。本發(fā)明的特別優(yōu)選的目的是提供有效產生安全的誘導性多能干細胞的方法。解決所述問題的方法本發(fā)明人為解決上述問題，經(jīng)銳意研究，結果發(fā)現(xiàn)可在不使用c-Myc的情況下產生安全的誘導性多能干細胞。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可通過使用L-Myc、Salll或Sal14(而不使用c-Myc)進行核重編程來提供分化誘導來得到的細胞或組織中無致瘤性危險的安全的誘導性多能干細胞，且可通過實施所述方法極其有效地產生安全的誘導性多能干細胞?；谝陨习l(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將下列三種基因一一Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因導入體細胞的步驟。根據(jù)所述方法的優(yōu)選方面，提供了包括在將下列三種基因一一0ct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因導入體細胞后，培養(yǎng)所述細胞足夠長的時間，從而使所述細胞獲得多能性并增殖的步驟的方法。根據(jù)所述方法的另一優(yōu)選方面，提供了包括將下列三種基因一一Oct3/4、Klf4和Sox2導入體細胞的步驟的方法；和包括在將下列三種基因——Oct3/4、Klf4和Sox2導入體細胞后，培養(yǎng)所述細胞足夠長的時間，從而使所述細胞獲得多能性并增殖的步驟的方法。此外，根據(jù)所述方法的又一優(yōu)選方面，提供了包括分別用含有Oct家族基因的病毒栽體、含有Klf家族基因的病毒載體和含有Sox家族基因的病毒載體各自轉染包裝細胞，并培養(yǎng)所述細胞，以獲得三種培養(yǎng)上清液的步驟，及制備通過上述步驟得到的三種培養(yǎng)上清液的混合物，并使用所述混合物重編程體細胞的步驟的方法。此外，根據(jù)所述方法的另一優(yōu)選方面，提供了包括不使用藥物篩選的情況下重編程所述體細胞的步驟的方法。上述方法中，可任選在缺乏或存在細胞因子的情況下(優(yōu)選在缺乏細胞因子的情況下)進行所述基因導入。此外，可任選在缺乏或由本^明提供的誘導性多能干細胞中，;分化誘導后所得°細胞或組織中的腫瘤發(fā)展基本被降低或消除。因此本發(fā)明還提供了產生誘導性多能干細胞的方法，其中分化誘導后所得細胞或組織中的腫瘤發(fā)展基本被降低或消除，包括將下列三種基因一一Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因，優(yōu)選將Oct3/4家族基因、Klf4基因和Sox2基因導入體細胞的步驟。本發(fā)明另一方面提供了由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合或下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合，及選自下列三種基因——L-Myc、Sa111和Sal14中的至少一種基因導入體細胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供了包括將下列兩種基因一一0ct3/4和Sox2的組合或下列兩種基因——Oct3/4和Klf4的組合，及選自下列三種基因——L-Myc、Salll和Sa114中的至少一種基因導入體細胞的步驟的方法。包括除上述基因外，將下列基因一一Lin28和/或Nanog導入體細胞的步驟的方法也是優(yōu)選方面，且包括將Lin28導入體細胞的步驟的方法是更優(yōu)選的方面。在上述方法中，也可通過合適的組合使用c一Myc。根據(jù)本發(fā)明的再優(yōu)選方面，提供了包括將下列三種基因一一Oct家族基因、Sox家族基因和Klf家族基因的組合(優(yōu)選為Oct3/4、Sox2和Klf4的組合)，及選自下列三種基因——L-Myc、Salll和Sali4中的至少一種基因導入體細胞的步驟的方法。更具體而言，提供了包括將下列四種基因一一Oct3/4、Sox2、Klf4和Salll導入體細胞的步驟的方法；包括將下列四種基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和Sall4導入體細胞的步驟的方法；包括將下列四種基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc導入體細胞的步驟的方法；包括將下列五種基因——0ct3/4、Sox2、Klf4、Salll和L-Myc導入體細胞的步驟的方法；包括將下列五種基因——Oct3/4、Sox2、Klf4、Sal14和L-Myc導入體細胞的步驟的方法；包括將下列五種基因一一Oct3/4、Sox2、Klf4、Salll和Sal14導入體細胞的步驟的方法；和包括將下列六種基因——0ct3/4、Sox2、Klf4、Salll、Sal14和L-Myc導入體細胞的步驟的方法。如果使用了L-Myc，所述體細優(yōu)選是人體細胞。在上述任意方法中，本發(fā)明還提供了包括將Lin28導入體細胞的步驟的方法，且作為優(yōu)選方面，提供了包括將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28導入體細胞的步驟的方法。在根據(jù)本發(fā)明的提供的誘導性多能干細胞中，分化誘導后所得細胞或組織中的腫瘤發(fā)展基本被降低或消除。因此本發(fā)明提供了產生誘導性多能干細胞的方法，其中分化誘導后所得細胞或組織中的腫瘤發(fā)展基本被降低或消除，包括將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因(優(yōu)選為0ct3/4家族基因和Sox2基因)，及選自下列三種基因一—L-Myc、Salll和Sal14中的至少一種基因導入體細胞的步驟。包括還在所述方法中將Klf家族基因(例如Kif4)導入體細胞的步驟的方法也是優(yōu)選方面，且包括將Lin28和Klf家族基因一并或用Lin28代替Klf家族基因導入體細胞的步驟的方法也是優(yōu)選方面。本發(fā)明再一方面提供了由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將下列六種基因——0ct家族基因、Of家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog(優(yōu)選為下列六種基因——Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog)導入體細胞的步驟。在所述方法中，可使用選自下列三種基因——L-Myc、Salll和Sal14中的至少一種基因代替c-Myc，且所述方法也是優(yōu)選方面。在上述各方法中，可使用重組載體將所述基因導入體細胞，且優(yōu)選使用包括選自所述各方法中定義的基因的組合中的至少一種的重組載體，其中所述基因被導入體細胞?？蓪⑷魏尾《驹泽w和非病毒栽體作為所述載體使用。本發(fā)明還提供了包括上述各發(fā)明中定義的基因的組合的核重編程因子。還優(yōu)選進一步組合TERT基因和/或SV40大T抗原基因與上述組合。此夕卜，本發(fā)明還提供了包括上述各發(fā)明中定義的基因的基因產物的組合的核重編程因子，且包括使所述包括上述各發(fā)明中定義的基因的基因產物的組合的核重編程因子與體細胞接觸的步驟的方法。作為優(yōu)選方面，提供了包括將所述核重編程因子加入體細胞培養(yǎng)物中的步驟的方法。在上述各發(fā)明中，提供了其中所述體細胞是哺乳動物體(包括人)細胞(優(yōu)選為靈長類體細胞，更優(yōu)選為人體細胞)的方法；其中所述體細胞是人胎細胞或源自成人的體細胞的方法；其中所述體細胞是收集自患者的體細胞的方法。本發(fā)明另一方面提供了通過上述方法得到的誘導性多能干細胞。此外，根據(jù)本發(fā)明提供了分化誘導自通過上述方法得到的誘導性多能干細胞的體細胞。本發(fā)明還提供了組織、器官、體液和個體，它們是分化誘導的體細胞群。此外，本發(fā)明提供了干細胞療法，包括使用回收和收集自患者的體細胞分化誘導根據(jù)上述方法得到的誘導性多能干細胞，并將得到的體細胞或組織、器官或體液(它們是所述細胞的細胞群)移植給所述患者的步驟。本發(fā)明還提供使用多種通過分化誘導根據(jù)上述方法得到的誘導性多能干細胞得到的細胞測定化合物、藥物或毒素的生理活性或毒性的方法。附圖簡述本發(fā)明的方法第一方面提供由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將下列三種基因一一0ct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因導入體細胞的步驟，且所述方法的優(yōu)選方面包括將下列三種基因一一0ct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因導入體細胞后，培養(yǎng)所述細胞足夠長的時間，從而使所述細胞獲得多能性并增殖的步驟。因而言，所述家族基因的例子見于國際公開WO2007/69666。作為0ct家族基因，優(yōu)選Oct3/4;作為Klf家族基因，優(yōu)選Klf4;且作為Sox家族基因，優(yōu)選Sox2。對于這些基因而言，除野生型基因外，也可使用突變基因(其中一些(例如l-30個，優(yōu)選l-20個，更優(yōu)選1-IO個，再優(yōu)選1-5個，且特別優(yōu)選1或2個)核苷酸被取代、插入和/或刪除)和嵌合基因(通過適當組合所述家族基因而得到，與其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。本發(fā)明的方法第二方面提供由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合或下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合，及選自下列三種基因——L-Myc、Salll和Sa114中的至少一種基因導入體細胞的步驟。不受任何特定理論束縛，選自L-Myc、Salll和Sal14的基因是具有增強核重編程效率的活性的核重編程因子，且通過使用對于核重編程重要的核重編程因子組合(例如Oct家族基因和Sox家族基因的組合或Oct家族基因和Klf家族基因的組合)，可顯著提高重編程效率。如更具體描述，所述方法包括(a)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及L-Myc導入體細胞的步驟。(b)將下列兩種基因^~—Oct家族基因和Sox家族基因的組合及Salll導入體細胞的步驟。(c)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及Sal"導入體細胞的步驟。(d)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及L-Myc和Salll導入體細胞的步驟。(e)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及L-Myc和Sa114導入體細胞的步驟。(f)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及Salll和Sall4導入體細胞的步驟。(g)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Sox家族基因的組合及L-Myc、Salll和Sal14導入體細胞的步驟。(h)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及L-Myc導入體細胞的步驟。(i)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Hf家族基因的組合及Salll導入體細胞的步驟。(j)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及Sall4導入體細胞的步驟。(k)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及L-Myc和Salll導入體細胞的步驟。(1)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及L-Myc和Sal14導入體細胞的步驟。(m)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及Salll和Sall4導入體細胞的步驟。(o)將下列兩種基因一一Oct家族基因和Klf家族基因的組合及L-Myc、Salll和Sall4導入體細胞的步驟。此外，在(a)-(g)中任意方面，還可包括將Klf家族基因導入體細胞的步驟。此外，在(a)-(o)中任意方面，或在將Klf家族基因加入(a)-(g)中任意方面的方面，還包括將Lin家族基因和/或Nanog，優(yōu)選Lin28和/或Nanog,更優(yōu)選Lin28導入體細胞的步驟。如果需要，還可包括將c-Myc導入體細胞的步驟。作為Oct家族基因，優(yōu)選Oct3/4;作為Sox家族基因，優(yōu)選Soxl,且作為Klf家族基因，優(yōu)選Klf4。此外，作為Lin家族基因，已知Lin28和Lin28b，且優(yōu)選Lin28。對于L-Myc的描述見于國際乂>開冊2007/69666的表1,且對于Sal14的描述見于所述國際公開的表4和表5。Salll是ES細胞特異表達的基因，且已知為鋅指蛋白之一，并被認為參與腎的發(fā)育。Salll的NCBI登錄號是NM-021390(小鼠)和NM—002968(人)。此外，Lin28的NCBI登錄號是NM—145833(小鼠)和NM—024674(人)。對于這些基因而言，除野生型基因外，也可使用突變基因(其中一些(例如l-30個，優(yōu)選l-20個，更優(yōu)選1-IO個，再優(yōu)選l-5個，且特別優(yōu)選1或2個)核苷酸被取代、插入和/或刪除)和嵌合基因(通過任意組合家族基因而得到，與其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。例如，作為L-Myc或c-Myc，也可使用突變基因(其中一些(例如1-30個，優(yōu)選1-20個，更優(yōu)選1-10個，再優(yōu)選1-5個，且特別優(yōu)選1或2個)核苷酸被取代、插入和/或刪除)和嵌合Myc基因(與其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。對于Myc基因而言，用于具體分析多種Myc嵌合基因和Myc點突變基因功能的手段和結果。因此，通過使用這些分析手段，可容易選擇并使用具有所期望的功能提升的突變c-Myc基因、突變L-Myc基因或嵌合Myc基因。所述嵌合Myc基因的優(yōu)選例包括Ms-cL-Myc(SEQIDNos:157和158)和Ms-cLc-Mys(SEQIDNos:161和162)，更優(yōu)選為Ms-cL-Myc。所述方法優(yōu)選方面的例子包括以下方法，在上述方法中包括(a-l)將Oct3/4、Sox2和L-Myc導入體細胞的步驟；(a-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc導入體細胞的步驟;(b-l)將Oct3/4、Sox2和Salll導入體細胞的步驟;(b-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4和Sal11導入體細胞的步驟;(c-l)將Oct3/4、Sox2和Sall4導人體細胞的步驟；(c-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4和Sal14導入體細胞的步驟;(d-l)將Oct3/4、Sox2、L-Myc和Salll導入體細胞的步驟;(d-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Sal11導入體細胞的步驟;(e-l)將Oct3/4、Sox2、L-Myc和Sal14導入體細胞的步驟;(e-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Sal14導入體細胞的步驟；(f-l)將Oct3/4、Sox2、SaHl和Sal14導入體細胞的步驟;(f-2)將0ct3/4、Sox2、Klf4、Salll和Sal14導入體細胞的步驟；(g-l)將Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sal11和Sal14導入體細胞的步驟；(g-2)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Salll和Sal14導入體細胞的步驟；(h-l)將Otc3/4、Klf4和L-Myc導入體細胞的步驟;(i-l)將Otc3/4、Klf4和Salll導入體細胞的步驟；(j-l)將0tc3/4、Klf4和Sall4導入體細胞的步驟;(H)將Otc3/4、Klf4、L-Myc和Salll導入體細胞的步驟；(l-l)將Otc3/4、Klf4、L-Myc和Sal14導入體細胞的步驟;(m-l)將Otc3/4、Klf4、Salll和Sal14導入體細胞的步驟;(o-l)將Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sal11和Sal14導入體細胞的步驟。方法還優(yōu)選在上述步驟中包括(a-3)將Oct3/4、Sox2、L-Myc和Lin28導入體細胞的步驟；(a-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28導入體細胞的步驟；(b-3)將Oct3/4、Sox2、Sal11和Lin28導入體細胞的步驟;(b-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、Salll和Lin28導入體細胞的步驟;(c-3)將0ct3/4、Sox2、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟;(c-4)將0ct3/4、Sox2、Klf4、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟;(d-3)將Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sal11和Lin28導入體細胞的步驟；(d-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sal11和Un28導入體細胞的步驟；(e-3)將Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(e-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sal14和Un28導入體細胞的步驟；(f-3)將Oct3/4、Sox2、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(f-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(g-3)將Oct3/4、Sox2、L-Myc、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(g-4)將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(h-2)將Otc3/4、Klf4、L-Myc和Lin28導入體細胞的步驟;(i-2)將Otc3/4、Klf4、Sal11和Lin28導入體細胞的步驟;(j-2)將Otc3/4、Klf4、Sall4和Lin28導入體細胞的步驟;(k-2)將Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sal11和Lin28導入體細胞的步驟；(l-2)將0tc3/4、Klf4、L-Myc、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(m-2)將Otc3/4、Klf4、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟；(o-2)將Otc3/4、Klf4、L-Myc、Salll、Sal14和Lin28導入體細胞的步驟。在上述各方法中，方法包括導入Nanog及Lin28(或無Lin28)的步驟。例如，在(a-4)方面，以使用Nanog及Lin28m的方面(即，包括將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28和Nanog導入體細胞的步驟的方法等)為例。此外，在上述各方法中，還可包括將L-Myc及N-Myc(或無L-Myc)導入體細胞的步驟。此外，在上述各方法中，還任選包括將c-Myc導入體細胞的步驟，但為基本上降低或消除分化誘導后得到的細胞或組織中的腫瘤發(fā)展，還優(yōu)選不在上述方法中包括將c-Myc導入體細胞的步驟。對于包括方面L-Myc的方面而言，優(yōu)選將人體細胞用作待進行核重編程的體細胞。此外，如果包括Oct3/4、Sox2和Klf4的組合，或Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc(或用c-Myc替代L-Myc)的組合，優(yōu)選還組合了Sal14的情況，或還組合了Salll和Sal14二者的情況。如果包括Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28的組合，優(yōu)選還組合了Salll的情況，或還組合了Salll和Sal14二者的情況。仍對所述情況而言，優(yōu)選將人體細胞用作待進行核重編程的體細胞。本發(fā)明的方法第三方面提供由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，且包括將下列六種基因一一Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog導入體細胞的步驟，優(yōu)選包括將下列六種基因——0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog導入體細胞的步驟。上述第一至第三方面提供的本發(fā)明的各方法中，"誘導性多能干細胞"是具有類ES細胞特征的細胞，更具體包括具有多能性和增值能力的未分化細胞，且此術語之含義不得受任何局限，需寬泛地理解。對于通過使用核重編程因子產生誘導性多能干細胞的方法的具體描述見于國際公開WO2007/69666、Cell,126，pp.663-676，2006和Cell,131，pp.861-872，2007,且對分離誘導性多能干細胞的方法的具體描述也見于上述期刊。待通過本發(fā)明的方法進行重編程的"體細胞"指所有細胞，但不局限于所述細胞，無多能性細胞(如ES細胞或其類似細胞)。除胚胎期的體細胞外，也可使用成熟體細胞。優(yōu)選使用源自哺乳動物(包括人)的體細胞，更優(yōu)選使用源自小鼠的體細胞和源自靈長類的體細胞。特別優(yōu)選使用源自人的體細胞。所述體細胞的例子具體包括(l)組織干細胞(成體干細胞)，例如神經(jīng)體細胞、造血干細胞、間質干細胞、牙髓干細胞等，(2)組織前體細胞和(3)分化細胞，例如淋巴細胞、上皮細胞、肌肉細胞、成纖維細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃細胞和粘膜細胞。如果將所述誘導性多能干細胞用于治療疾病，期望使用來自患者自身的體細胞，或分離自具有同型HLA抗原的其他人的細胞，例如，可使用參與疾病的體細胞和參與疾病治療的體細胞。制，但例如，一般使用可表達上述基因的栽體。對于將逆轉錄病毒載體用作栽體的特定方法的乂>開見于國際公開WO2007/69666、Cell,126，pp.663-676，2006和Cell,131，pp.861-872，2007，對于將慢病毒載體用作載體的情況的公開見于Science,318，pp.1917-1920，2007。此外，因為對于使用質粒(其為非病毒載體)的情況的描述見于0kita等人的文章(Science,Publishedonline:October9，2008;10.1126/Science.1164270),本領域技術人員可選擇和釆用其中合適的方法。如果使用栽體，可將選自上述基因中的兩種或多種整合入所述栽體，且可使用多種整合一種基因的載體。當一種或多種上述基因已在待重編程的細胞中表達時，可將表達了的一種或多種基因從上述待導入基因的組合中移除，但勿庸置疑，此方面亦包括在本發(fā)明的范圍內。當將病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體)用作將所述基因導入體細胞的手段時，優(yōu)選通過制備含各待導入基因的病毒載體，然后用各病毒載體各自轉染包裝細胞，并培養(yǎng)，從而產生含各病毒的培養(yǎng)上清液的混合物來獨立制備含各病毒的培養(yǎng)上清液，并通過用含所述基因的病毒感染而用于基因導入。通過采用此方法，在一些情況下可顯著增強基因導入效率，且特別優(yōu)選在不用c-Myc進行核重編程的情況下使用此方法。事實上，還可能使用多個病毒載體轉染單包裝細胞，制備含多個病毒載體的培養(yǎng)上清液，并將其用于基因導入。如果將所述基因導入體細胞，可將表達載體導入培養(yǎng)于飼養(yǎng)細胞上的體細胞中，或可將表達栽體導入無飼養(yǎng)細胞的體細胞中。未增強表達載體的導入效率，后一種方法適于一些情況。作為所述祠養(yǎng)細胞，可適用用于培養(yǎng)胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞，且例如，可使用經(jīng)藥物(絲裂霉素C)處理或經(jīng)照射的細胞(如受精后14-15天時的小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)細胞或ST0細胞(成纖維細胞衍生細胞系))。基因導入后的體細胞培養(yǎng)優(yōu)選在銅養(yǎng)細胞上進行。另外，可在基因導入后約幾天到M天時用嘌呤霉素進行藥物篩選。事實上已知可在非藥物篩選下誘導iPS細胞的方法(國際公開WO2007/69666的實施例9)，也優(yōu)選在非藥物篩選下誘導iPS細胞。通過在合適條件下培養(yǎng)導入核重編程因子的體細胞，核重編程自動進行，并可由體細胞產生誘導性多能干細胞。將所述基因導入體細胞后，優(yōu)選將所述細胞培養(yǎng)足夠長的時間，從而使所述細胞獲得多能性并增殖。當產生人誘導性多能干細胞時，期望將導入表達載體后所述細胞的培養(yǎng)密度設置為低于培養(yǎng)動物細胞時的情況。例如，培養(yǎng)時優(yōu)選以1-10萬，優(yōu)選約5萬/皿的細胞密度繼續(xù)培養(yǎng)。通常可例如通過使用用于動物體細胞的合適的培養(yǎng)基(例如，用于胚胎干細胞(ES細胞)的培養(yǎng)基(例如，當將所述基因導入人體細胞時為用于靈長類ES細胞(優(yōu)選人ES細胞)的培養(yǎng)基))培養(yǎng)25天或更久而得到所述誘導性多能干細胞。在所述第一方面的方法中，核重編程效率相比在一些情況下使用含c-Myc、L-Myc、N-Myc、Sal11和Sal14中的一種或兩種或多種的組合進行核重編程的情況降低，且在許多情況下通常都需長期培養(yǎng)。例如，在此方法中需繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)選28天或更久，更優(yōu)選3Q天或更久，再優(yōu)選33天或更久，且特別優(yōu)選35天或更久。如果將所迷基因導入人體細胞，在一些情況下，培養(yǎng)40天或更久，再為培養(yǎng)45天或更久將成為特別合適的培養(yǎng)天數(shù)。事實上，根據(jù)所述第一方面提供的方法消除了殘骸細胞(成為背景)污染，從而可得到純細胞群的誘導性多能干細胞集落，使得到具有極高質量的基因表達和分化能力的誘導性多能干細胞成為可能。另一方面，在第二方面和第三方面提供的本發(fā)明的方法中，由于誘導性多能干細胞的產生效率通常足夠高，可在更短培養(yǎng)天數(shù)(例如，在一些情況下15-30天，優(yōu)選約20天)下得到期望數(shù)量的誘導性多能干細胞。可通過檢測(例如)多種未分化細胞的特異性標記物(如堿性磷酸酶(ALP)、SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-鉤粘蛋白)而容易測定所述導入了基因的細胞是否獲得了多能性。對于所述標記物的種類和測定方法的具體描述見于文獻(例如Cell，126，pp.663-676，2006和Cel1，131，pp.861-872，2007等)。如果用具有在ES細胞特異表達基因的啟動子下游整合有標記基因(如GFP)的基因的體細胞進行核重編程時，可能通過將標記物(GFP)陽性用作指標來鑒定所述誘導性多能干細胞。此外，通常可通過集落形成測定增殖情況，且已知集落形狀(通常為由約500-1，000誘導性多能干細胞組成的細胞群)根據(jù)動物種類表現(xiàn)出特征形態(tài)，可容易鑒定通過誘導性多能干細胞增殖形成的集落。例如，已知小鼠誘導性多能干細胞形成隆起集落，而人誘導性多能干細胞形成扁平集落，且由于這些集落形狀與小鼠ES細胞和人ES細胞的形狀極其相似，本領域技術人員可通過檢測所產生的誘導性多能千細胞集落而確定所述誘導性多能干細胞的增殖程度。已知多種可維持ES細胞的未分化性質和多能性的培養(yǎng)基或不可維持所述性質的培養(yǎng)基，且通過使用合適的培養(yǎng)基組合，可有效分離所述誘導性多能千細胞。本領域技術人員可利用在ES細胞中通常使用的確定方法容易確定所述分離的誘導性多能干細胞的分化和增殖能力。在上述方法中，可在任選缺乏或存在細胞因子(優(yōu)選缺乏細胞因子)的情況下進行基因導入。此外，在上述方法中，可將基因導入后的體細胞在任選缺乏或存在細胞因子的情況下進行培養(yǎng)。細胞因子的例子一般包括(但不限于)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、干細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)等，可在存在或缺乏在本領域中被分類為細胞因子的生理活性物質的情況下進行基因導入和/或培養(yǎng)?？蓪⒒谏鲜龇椒ㄖ?，可使用無所述基因的基因編碼的基因產物進行核重編程。如果使用核重編程因子(是基因產物)進行上述方法，可使所述核重編程因子與體細胞在可使所述體細胞和所述誘導性多能干細胞增殖的大氣壓下接觸?？筛唧w使用例如將所述基因產物加入培養(yǎng)基的方法?？赏ㄟ^諸如微注射融合蛋白或核的方法將這些基因中的一種或兩種基因產物導入核，且可通過合適的基因導入方法(例如，使用重組栽體的方法)導入其余的一種或兩種基因。所述基因產物可為所述基因產生的蛋白質本身，或可為所述蛋白質與其他蛋白質或肽的融合基因產物形式。例如，可使用與綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白或與肽(如組氨酸標簽)的融合基因產物。通過制備和使用與源自HIV病毒的TAT肽的融合蛋白，可促進核重編程因子從質膜到細胞內的吸收，且使得僅通過將融合蛋白加入培養(yǎng)基而誘導重編程成為可能，避免了復雜操作(如基因導入)。因為本領域技術人員已知制備所述融合基因產物的方法，本領域技術人員可根據(jù)目的容易設計和制備合適的融合基因產物。在上述各方法中，在一些情況下，可通過使低分子化合物與體細胞接觸，以代替向體細胞中導入一種或兩種或多種所述基因。作為所述低分子化合物，例如，可使用具有促進選自Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Salll、Sal14和Nanog基因中的一種或多種基因表達的作用的低分子化合物，且本領域技術人員可以各基因的表達量作為指標容易篩選所述低分子化合物。在上述方法中，除定義的各基因外，還可組合編碼誘導永生細胞的因子的基因。如國際公開WO2007/69666中所公開的一樣，可單獨使用或適當聯(lián)合使用例如TERT基因及選自下列基因一一SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7和Bmil中的一種或多種基因。除上述基因外，還可組合選自Fbxl5、ERas、ECAT15-2、Tcll和P-連環(huán)蛋白中的一種或多種基因，和/或也可組合選自ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、Fthl17、Rexl、UTF1、Stella、Stat3和Grb2中的一種或多種基因。對這些組合的具體描述見于國際公開WO2007/69666。事實上，可用于本發(fā)明的方法中的基因不限于以上具體描述的基因。在本發(fā)明的方法中，除其他可發(fā)揮核重編程因子功能的基因外，還可包括編碼參與分化、發(fā)育或增殖的因子的基因中的一種或多種基因，或其他具有生理學活性的因子，且勿庸置疑，所述方面也被包括在本發(fā)明的范圍內。例如，作為確定核重編程因子的手段，可利用篩選核重編程因子的方法(描述見于國際公開W02005/80598)和指定特異性核重編程因子的方法(描述見于國際公開WO2007/69666)。將國際公開WO2005/80598和國際公開WO2007/69666的全部7>開內容通過引用并入本說明書的公開內容中。本領域技術人員可參考這些文獻篩選核重編程因子，并應用于本發(fā)明的方法中。此外，也可使用所述篩選方法的適當改進或變化方法確定核重編程因子。本領域技術人員可根據(jù)所述文獻描述的方法容易確定上述方法中使用的基因組合發(fā)揮核重編程因子的作用。本發(fā)明的方法中，為提高產生誘導性多能干細胞的效率，可導入和/或加入多種產生效率提高劑。提高iPS細胞產生效率的物質的例子包括(但不限于)組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑(例如低分子抑制劑(如丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.,26(7)，pp.795-797，2008)、制滴菌素A、乳酸鈉、MC1293和M344)和核酸表達抑制劑(HDAC的siRNAd和shRNA(例如HMC1siRNASmarpool(注冊商標，Millipore))、抗HDAC1(0riGene)的HuSH29聚shRNA構建體等))和G9a組蛋白甲基轉移酶抑制劑(例如低分子抑制劑(如BIX-01294(CellStemCell,2，pp.525-528，2008)等)和核酸系統(tǒng)表達抑制劑(如G9a的siRNA和shRNA(例如G9asiRNA(人)(SantaCruzBiotechnology))等))。所述核酸系統(tǒng)表達抑制劑可為含編碼siRNA或shRNA的DNA的表達載體的形式。只要是可用于例如使用ES細胞進行的所有檢測/研究及使用ES細胞治療疾病的細胞，對通過本發(fā)明的方法產生的誘導性多能千細胞的用途并無具體限制。例如，用視黃酸、生長因子(如EGF)或糖皮質激素處理通過本發(fā)明的方法得到的誘導性多能干細胞，可誘導出所期望的分化細胞(例如，神經(jīng)細胞、心肌細胞、血細胞等)，即，可形成合適的組織。對分化誘導方法的具體描述見于國際公開WO2007/69666。通過將這些所得分化細胞或組織返回給患者，可實現(xiàn)通過自體細胞移植進行的干細胞療法。例如，可由患者自身體細胞有效產生具有高度安全性的誘導性多能干細胞，可將通過使這些細胞(例如心肌細胞、胰島素產生細胞或神經(jīng)細胞)分化而得到的細胞安全地用于針對多種疾病(心力衰竭、胰島素依賴性糖尿病、帕金森病和脊髓損傷)的干細胞移植療法。此外，通過本發(fā)明的方法由人體細胞產生誘導性多能干細胞后，也可分化誘導這些誘導性多能干細胞，以制備體細胞、組織或器官，還可評估針對所述體細胞、組織或器官的化合物、藥物、毒素等的生理學活性或毒性。此外，由患特定疾病的患者體細胞產生誘導性多能干細29胞后，也可分化誘導這些誘導性多能干細胞，以制備體細胞、組織或器官，及對所述體細胞、組織或器官起作用的藥物候選化合物，以測定治療性和/或預防性效用，并從而可篩選藥物候選化合物。事實上，本發(fā)明的誘導性多能干細胞的用途并不局限于上述特定方面。實施例以下實施例將更具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不受以下實施例的限制。實施例1:在小鼠ES細胞培養(yǎng)基中由成年HDF建立iPS細胞用慢病毒載體將Slc7al(小鼠逆轉錄病毒受體)基因導入人成年皮膚衍生成纖維細胞(成年HDF)或人新生兒陽莖外鞘衍生成纖維細胞(BJ)(分別稱為",a-Slc7al"和"BJ-Slc7al")，將HDFa-Slc7al或BJ-Slc7al調至800,000，隨后接種于伺養(yǎng)細胞(經(jīng)絲裂霉素處理的STO細胞)上，并將基因通過下列組合導入逆轉錄病毒載體。1.Oct3/4、Sox2、Klf4、c--Myc、hTERT、Bmil2.Oct3/4、Sox2、Klf4、c--Myc、hTERT、HPV16E6、HPV163.Oct3/4、Sox2、Klf4、c--Myc、hTERT、HPV16E74.Oct3/4、Sox2、Klf4、c--Myc、hTERT、SV40大T抗原5.Oct3/4、Sox2、Klf4、c--Myc、hTERT、HPV16E66.Oct3/4、Sox2、Klf4、c扁-Myc圖中"-"表示組合"6.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc，，(0ct3/4、Sox2、Klf4、g-Mw和TERT源自人，而BmiJ源自小鼠).在培養(yǎng)小鼠ES細胞的條件下，繼續(xù)無藥物選擇地進行培養(yǎng)，在原位細胞中導Al且合4的基因，在病毒感染8^出iEJ^皮認為是ips細胞的克隆。在其他組合(1-3和5)中，盡管不如組合1的情況清晰，也可出現(xiàn)iPS細月^f羊集落。甚至當僅導入四種基因(6)時，雖無集落出現(xiàn)，^上述^下僅導入了四種基因的細胞清晰表現(xiàn)出堿性磷酸酶染色陽性(圖1)。相似地，將表達小鼠Slc7al基因的人新生兒陽莖外鞘成纖維細胞(BJ)調至80，000，隨后接種于飼養(yǎng)細胞(經(jīng)絲裂霉素C處理的STO細胞)上，并將所述基因通過下列組合導入逆轉錄病毒載體。Klf4、c-Myc)、hTERT、SV40大T抗原2.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc)、hTERT、Bmil3.hTERT、SV40大T抗原4.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c一Myc)、hTERT、HPV16E65.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、,16E76.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、HPV16E6、HPV16E77.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT8.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)9.DsRed(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和TERT源自人，而Bmil源自小鼠)。當在小鼠ES細胞的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周時，僅導入四種基因的細胞(8)表現(xiàn)出堿性磷酸酶染色陽性(圖2)。實施例2:iPS細胞中的ECAT表達(1)研究了由成年皮膚衍生成纖維細胞(成年HDF)建立的人iPS細胞是否表達ECATUS細胞相關轉錄本，是在ES細胞中特異表達的一組基因)。將源自成年HDF的iPS細胞(克隆iPS-HDFaSlc-87E6)以5x104/孔的比例接種于飼養(yǎng)細胞(經(jīng)絲裂霉素C處理的STO細胞，預先將其培養(yǎng)于6孔平板上)上，并培養(yǎng)4天。用含10。/。甲醛的PBS固定所述細胞，移除固定液，用PBS洗滌，再加入含3%BSA的PBS，然后在室溫下靜置45分鐘。用含3%BSA的PBS以1:100稀釋第一抗體(抗人ABCG-2抗體(小鼠IgG)、抗SSEA-3抗體(ratIgM)和抗SSEA-4抗體(小鼠IgG))，然后使其在4'C下反應過夜，用含1%BSA的PBS洗滌細胞三次，及使用第二抗體(已用含1%BSA的PBS以1:300稀釋)在室溫避光條件下與其反應1小時。作為第二抗體，使用經(jīng)Cy-3標記的抗小鼠IgG抗體(抗ABCG-2和SSEA-4抗體；Chemicon)和抗大鼠IgM抗體(抗SSEA-3抗體；JacksonImmunoResearch)。用PBS洗滌所述細胞，隨后在顯微鏡下拍照(圖3)。結果，觀察到源自成年HDF的iPS細胞表達ABCG-2、SSEA-3和SSEA-4。實施例3:iPS細胞中的ECAT表達(2)將源自人成年皮膚衍生成纖維細胞(成年HDF)的iPS細胞(克隆iPS-HDFaSlc-87E3、87E4和87E12)以5x104/孔的比例接種于祠養(yǎng)細胞(經(jīng)絲裂霉素C處理的STO細胞，預先將其接種于6孔平板上)上，并培養(yǎng)5天。作為對照，將HDF(源自所述iPS細胞的細胞)接種于6孔平板上，并維持2天。用含10%甲醛的PBS固定所述細胞。移除固定液后，用PBS洗滌所述細胞，向所述細胞加入封閉緩沖液(含3%BSA的PBS)，并使其在室溫下靜置45分鐘。于4。C下與第一抗體(抗人ABCG-2抗體(小鼠IgG;用封閉緩沖液以l:80稀釋)、抗E-鈣粘蛋白(小鼠IgG;用封閉緩沖液以1:80稀釋)、抗SSEA-3抗體(ratIgM;用封閉緩沖液以U50稀釋)和抗SSEA-4抗體(小鼠IgG;用封閉緩沖液以l:250稀釋))反應過夜后，用所述封閉緩沖液洗滌所述細胞。洗滌后，使所述細胞再于室溫下與第二抗體反應1小時。作為第二抗體，使用經(jīng)Cy-3標記的抗小鼠IgG抗體(抗ABCG-2、E-4丐粘蛋白和SSEA-4抗體，已用封閉緩沖液以l:300稀釋)和抗大鼠IgM抗體(抗SSEA-3抗體)。與第二抗體反應后，移除抗體溶液，將其用PBS洗滌、向所述細胞加入含50%甘油的PBS，并對其進行觀察(圖4)。源自表達SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-釣粘蛋白(ES細胞的表面標記物)的人成年皮膚衍生成纖維細胞(成年HDF)的iPS細胞。相反，HDFa(源自iPS細胞的細胞)不表達SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-鈣粘蛋白中的任一個。實施例4:iPS細胞中的ECAT表達(3)從表達小鼠Slc7al基因的人iPS細胞克隆(iPS-HDFaSlc87E-l-8、11和l2)、NTERA卩克隆D1人胚胎癌細胞(第35代)和成年HDF(第6代)分離總RNA。根據(jù)產品說明書用寡dT20引物和ReverTraAce-oc-試劑盒(Toyobo)合成cDM笫一鏈。用下列引物進行PCR。對于內原性0CT3/4,使用了hOct3/4-S1165和h0ct3/4-AS1283;對于內原性Sox2，4吏用了hSox2-S1430和hSox2-AS1555;對于Nanog，使用了ECAT4-macaca-968S和ECAT4-macaca-l334AS;對于REX1，4吏用了<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>胎癌細胞(第35代)和新生兒陽莖外鞘衍生成纖維細胞(BJ)(第6代)中分離總RNA。根據(jù)產品說明書用寡dT20引物和ReverTraAce-a-試劑盒(Toyobo)合成cDNA第一鏈。用下列引物進行PCR。對于內原性OCT3/4，使用了M)ct3/4-S1165和h0ct3/4-AS1283;對于內原性Sox2，使用了hSox2-S1430和hSox2-AS1555;對于Nanog，使用了ECAT4-macaca-968S和ECAT4-macaca-1334AS;對于REX1，使用了hRexl-RT-U和hRexl-RT-L;對于FGF4，使用了hFGF4-RT-U和hFGF4-RT-L;對于GDF3，使用了hGDF3-S243和hGDF3-AS850;對于ECAT15-1，使用了hECAT15-S532和hECAT15-AS916;對于ECAT15-2，使用了hECAT15-2-S85和hECAT15-2-AS667;對于ESG1，使用了hpH34-S40和hpH34-AS259;對于hTERT，使用了hTERT-S3556和hTERT-AS3713;及對于G3PDH，使用了G3PDH-F和G3PDH-R(表2;序列表的SEQIDNo:23-44)。結果，許多人iPS細胞克隆(iPS-BJSlc-97E-l、2、4、5、6、7、8、10、11、12、-97G-3、5、-97H-3和5)表達ECAT(圖6)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例6:由iPS細胞形成畸胎瘤將5.0x106人iPS細胞皮下注射給SCID小鼠(雌性，5周齡)背部。注射后五周時，觀察到大肺瘤。切下腫瘤，稱重，并拍照。用含10%曱醛的PBS固定所述細胞。將經(jīng)石蠟包埋的所述腫瘤切成4.5pm切片，并將所得薄切片置于載波片上，風干，隨后用蘇木精-伊紅染色。圖7中的A表示皮下注射了iPS-HDFaSlc-87E12克隆的小鼠及其畸胎瘤。圖7中的B表示從皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E3的小鼠中切下的畸胎瘤的組織學圖，圖7C表示從皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E6的小鼠中切下的畸胎瘤的組織學圖，圖7D表示從皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E12的小鼠中切下的畸胎瘤的組織學圖。實施例7:人iPS細胞的體外分化通過懸浮培養(yǎng)形成胚狀體(EB)，并評估人iPS細胞的體外分化能力。懸浮培養(yǎng)人iPS細胞(iPS-HDFaSlc-127F2、E3)7天，以形成胚狀體。然后，將所述胚狀體轉移到包被明膠的平板上，繼續(xù)培養(yǎng)8天，然后進行免疫細胞化學分析。所用第一抗體如下。用含3%BSA的PBS以1:100分別稀釋抗a-平滑肌肌動蛋白抗體(Dako)、抗PIII-微管蛋白抗體(Chemicon)和抗cc-胎蛋白抗體(Dako)，正常小鼠IgG(2mg/ml，Chemicon)和正常兔IgG(2mg/ml，Chemicon)，并將這些用作第一抗體。于室溫下與第一抗體反應1小時后，用PBS洗滌所述細胞，并與第二抗體反應(用含3。/。BSA的PBS以l:300稀釋)。此外用DAPI對核進^f亍染色。結果，cc-平滑肌肌動蛋白(a-SMA，中胚層標記物)、piII-微管蛋白(外胚層標記物)和oc-胎蛋白(內胚層標記物)表現(xiàn)出陽性，因此證實，人iPS細胞通過形成胚狀體進行體外分化(圖8)。實施例8:優(yōu)化用逆轉錄病毒進行的基因導入過程(用于產生人iPS細胞)認為具有高效基因導入能力的逆轉錄病毒可有效從小鼠成纖維細胞誘導出iPS細胞(Takahashietal.，Cell,126，pp.663-676，2006)。所以優(yōu)化了人成年皮膚衍生成纖維細胞(成年HDF)的基因導入方法。首先，使用在PLAT-A包裝細胞中制備的兼嗜性逆轉錄病毒將綠色焚光蛋白(GFP)導入成年HDF。作為對照，使用在PLAT-E包裝細胞中制備的親嗜性逆轉錄病毒(Moritaetal.，GeneTher.，7，pp.1063-1066，2000)將GFP導入小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中。在MEF中，80%或更多的細胞表達GFP(圖9)。另一方面，少于20%的成年HDF的GFP表達強度明顯低于MEF的情況，且GFP表達率少于20%。為提高基因導入效率，用慢病毒將小鼠逆轉錄病毒的受體Slc7al(Verreyetal.，PflugersArch.，447，pp.532-542，2004)(也被稱為mCATl)導入成年HDF中。隨后用親嗜性逆轉錄病毒將GFP導入HDFa-Slc7al中。通過此法，可達60%的基因導入效率(圖9)。實施例9:使用靈長類ES細胞培養(yǎng)基由成年HDF制備iPS圖10A中顯示了誘導人iPS細胞的概要流程。用逆轉錄病毒載體將人Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc導入HDF-Slc7al中(圖IOB，8xl05細胞/100mm皿)。基因導入后6天時，通過胰蛋白酶處理收集所述細胞，調至5x104或5x105細胞/100麗皿，然后接種于經(jīng)絲裂霉素C處理的SNL飼養(yǎng)細胞(McMahonetal.，Cell，62，pp.1073-85，1990)上。次日，使用補充有4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的用于靈長類ES細胞的靈長類ES細胞培養(yǎng)基(ReprocellInc.)替換培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM)。約兩周后，形成幾個粒狀集落(granuledcolonies),其細胞形態(tài)不類似于人ES細胞(圖1QC)。約25天時，觀察到另一種類型的類似于人ES細胞集落的扁平集落(圖10D)。從5xl(T成纖維細胞，可觀察到約10個人ES細胞樣集落和約100個粒狀集落(在六個獨立實驗中觀察到7/122、8/84、8/171、5/73、6/122和11/213。結果匯于表3)。36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>30天時，挑選人ES細胞樣集落，并機械解聚成小團塊(不用酶消化)。當始于5x105成纖維細胞時，皿幾乎被多于300個粒狀集落覆蓋。在一些情況中，可在粒狀集落之間觀察到幾個人ES細胞樣集落，但因為所述粒狀集落密度高，難以分離人ES細胞樣集落。當人iPS細胞在含bFGF的靈長類ES細胞樣培養(yǎng)基中于SNL飼養(yǎng)細胞上增殖時，所述形成扁平集落的細胞密集(圖IOE)。每個細胞都顯示出與人ES細胞相同的細胞形態(tài)，特征在于較大的核和較小的胞質(圖IOF)。如在人ES細胞的情況一樣，在一些情況下，觀察到集落中心發(fā)生同時分化(圖IOG)。此外，如在人ES細胞中觀察到的一樣，這些細胞表現(xiàn)出飼養(yǎng)細胞依賴性，且不粘附于包被明膠的組織培養(yǎng)板上。另一方面，這些細胞在MEF條件靈長類ES細胞培養(yǎng)基(MEF-CM)中于包被基質膠的平板上保持未分化狀態(tài)，但在非條件靈長類ES細胞培養(yǎng)基中不保持未分化狀態(tài)(圖11)。建立的人iPS細胞克隆匯于表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>達被有效沉默，提示所述水平依賴于這些基因的內原性表達(圖13B)。實施例ll:人iPS細胞中ES細胞特異基因啟動子的活性。通過亞硫酸氬鹽基因組測序法，測定了多能性相關基因一一Oct3/4、REX1和Nanog的啟動子區(qū)域的胞嗜啶鳥噪呤二核苷酸(CpG)的曱基化狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，在原來的親本HDF(HDF)的所述區(qū)域的CpG二核苷酸高度甲基化，而其在人iPS細胞中高度去曱基化(201B2，201B6,201B7)(圖14A)。此發(fā)現(xiàn)提示，這些啟動子在人iPS細胞中活化。熒光素酶報告測定實驗也顯示，人Oct3/4和REX1啟動子在人iPS細胞中具有高水平的轉錄活性，但在HDF中則不這樣。廣泛表達的基因(如人RM聚合酶II(PolII))的啟動子活性在人iPS細胞和HDF二者中表現(xiàn)出的活性相當(圖14B)。實施例12:人iPS細胞的高端粒酶活性和指數(shù)增殖hTERT的高表達水平提示，人iPS細胞表現(xiàn)出高端粒酶活性(圖15A)。人iPS細胞指數(shù)增殖至少4個月(圖15B)。計算出人iPS細胞的倍增時間是46.9±12.4(克隆201B2)、47.8±6.6(201B6)和43.2±11.5(201B7)小時(圖15B)。這些時間與已報導的人ES細胞的倍增時間相當(Cowanetal.，N.Engl.J.Med.,350，pp.1353—56，2004)。實施例13:對源自HDF的人iPS細胞中的交叉污染的測定對人iPS細胞的基因組DM的PCR顯示，所有克隆均整合有所有四種逆轉錄病毒(圖16A)。用c-MyccDNA探針進行DNA印記分析發(fā)現(xiàn)，每個克隆都有特異性的逆轉錄病毒整合位點模式(圖16B)。此外，人iPS克隆和親本HDF之間的16個短串聯(lián)重復模式完全相同。對源自HDF的iPS細胞的STR分析結果匯于表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>(外胚層)和PAX6(外胚層)(圖17L)。另一方面，Oct3/4、Sox2和Nanog的表達明顯降低。這些結果顯示，iPS細胞可體外分化成三種胚層的細胞。實施例15:人iPS細胞分化成神經(jīng)細胞測定了是否可用已報導用于人ES細胞的方法由人iPS細胞進行誘導。將人iPS細胞接種于PA6飼養(yǎng)細胞層上，并維持/培養(yǎng)2周(Kawasakietal.，Neuron,28，pp.31-40，2000)。大量擴增所述細胞，并觀察到一些神經(jīng)結構(圖18A)。通過免疫細胞化學分析，檢測了培養(yǎng)中的酪氨酸羥化酶和PIII-微管蛋白陽性細胞(圖18B)。PCR分析結果證實，有多巴胺能神經(jīng)標記物(AADC、ChAT、DAT和LMX1B，及MAP2(其他神經(jīng)標記物))表達(圖18C)。此外，Oct3/4、Sox2和Nanog的表達降低(圖18C)。這些結果顯示，通過與PA6細胞共培養(yǎng)，iPS細胞可分化成含多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)細胞。實施例16:人iPS細胞直接分化成心臟細胞根據(jù)使用激活素A和骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)4分化成心臟細胞的參考文獻(Laflammeetal.，Nat.Biotechnol.，25，pp.1015-24，2007)，測定了人iPS細胞至心臟的分化。分化誘導后12天時，細胞聚集開始相沖突(beating)(圖18D)。RT-PCR結果顯示，這些細胞表達心肌細胞標記物，如TnTc、MEF2C、NKX2.5、MYL2A和MYHCB(圖18E)。另一方面，Oct3/4、Sox2和Nanog的表達顯著降低。這些結果顯示，人iPS細胞可體外分化成心肌細胞。實施例17:由分iPS細胞形成畸胎瘤為測定體外多能性，將人iPS細胞(克隆201B7)皮下移植到免疫缺陷(SCID)小鼠背側。9周后，觀察到腫瘤發(fā)生。組織學觀察顯示，腫瘤中含多種組織，包括神經(jīng)腸管樣上皮組織(外胚層)、橫紋肌(中胚層)、軟骨(肌肉)、神經(jīng)組織(內胚層)和含角蛋白的扁平組織(內胚層)(圖19)。實施例18:有其他人體細胞制備iPS細胞除HDF外，使用了從成年人滑膜組織的原代人衍生成纖維細胞樣滑膜細胞建立的細胞系(HFLS)和從源于新生兒陽莖外鞘的成纖維細胞建立的細胞系(BJ細胞)和從源于新生兒陽莖外鞘的成纖維細胞建立的細胞系(表3)。檢查了有HFLS(5xl()4細胞/100nmi皿)的iPS細胞制備，結果得到600或更多粒狀集落和17個人ES細胞樣集落。當測定所述17個集落中的6個集落時，其中只有兩個集落可增殖(圖20)。接種5xl05HFLS的皿倍粒狀集落覆蓋，且無法確認為人ES細胞樣集落。另一方面，檢查了由BJ細胞制備iPS細胞，結果在5x1(^細胞/100mm亞的情況下，識別出7-13個人ES細胞樣集落和輕度粒狀集落，但在5><105細胞/100mm皿的情況下得到IOO個人ES細胞樣集落(表3)。收集其中六個人ES細胞樣集落，且5個集落被證實為iPS細胞(圖20)。源自HFLS和BJ的人iPS細胞以等于或高于人ES細胞的情況的水平的水平表達人ES細胞標記基因(圖21)。這些人iPS細胞通過EB分化成3種胚層細胞(圖22)。通過STR分析證實，iPS-HFLS細胞和iPS-BJ細胞分別源自HFLS細胞和BJ細胞。表6顯示源自HFLS的iPS細胞的STR分析結果，而表7顯示源自BJ的iPS細胞的STR分析結果。2.質粒構建通過RT-PCR擴增人Oct3/4的開放閱讀框，并克隆于pCR2.1-T0P0中。將pCR2.l-hOct3/4中的EcoRI片段亞克隆于pMX逆轉錄病毒載體的EcoRI位點。為區(qū)別個實驗，將20bp的隨機序列(稱為N2。條碼)插入Oct3/4表達栽體的Notl/Sall位點。為避免實驗間污染，每個實驗中使用唯一的條碼序列。還通過RT-PCR擴增人Sox2、Klf4和c-Myc的開放閱讀框，并亞克隆于pENTR-D-T0P0(Invitrogen)中。根據(jù)產品說明書用Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)將亞克隆于pENTR-D-T0P0中的全基44因插入到pMX逆轉錄病毒載體中。還擴增小鼠Slchl開放閱讀框，亞克隆于pENTR-D-T0P0中，并使用Gateway系統(tǒng)插入pLenti6/UbC/V5-DEST(Invitrogen)中。用PCR擴增人0ct3/4基因和REX1基因的調控區(qū)域，并亞克隆于pCRXL-T0P0中(Invitrogen)。對于PhOCT4-Luc和phREXl-Luc，通過Kpnl/BglH消化從pCRXL載體移除Kpnl/BglII片段，并亞克隆于pGV-BM2中的Kpnl/Bglll位點。對于pPolII-Luc,將pQBI-polII的AatII(頓端)/Nhel片段插入pGV-BM2的Kpnl(頓端)/Nhel位點。所有片段經(jīng)測序確認。引物序列顯示于表8(序列表的SEQIDNO:45—126)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>因導入后30天時挑選集落，并轉移到0.2ml靈長類ES細胞培養(yǎng)基中。通過溫和抽吸將集落機械解聚成小團塊。將所述細胞懸液轉移到24孔平板中的SNL祠養(yǎng)細胞上。將此時期認為是第1代。5.RNA分離和反轉錄用Trizol試劑(Invitrogen)純化總RNA,并用TurboMA游離試劑盒(Ambion)處理以除去基因組DNA污染。使用ReverTraAce-a(Toyobo)和dL引物根據(jù)產品說明書用ljag總RNA進行反轉錄。用ExTaq(Takara)進行PCR。用PlatinumSYBRGreenqPCRSupermixUDG(Invitrogen)進行定量PCR，并用7300實時PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進行分析。引物序列顯示于表8。6.堿性磷酸酶染色和免疫細胞化學分析用白細胞堿性磷酸酶試劑盒(Sigma)進行堿性磷酸酶染色。對于免疫細胞化學分析，于室溫下用含4%多聚甲醛的PBS固定細胞10分鐘。用PBS洗涂后，于室溫下用含5%正常山羊或驢血清(Chemicon)、1%牛血清白蛋白(BSA,NacalaiTesque)和0.1%TritonX-IOO的PBS處理所述細胞45分鐘。作為第一抗體，使用了SSEA1(1:100稀釋，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)、SSEA3(1:10稀釋，PeterW.Andrews博士捐贈)、SSEA4(1:100稀釋，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)、TRA-2-49/6E(1:20稀釋，DevelopmentalStudiesHybridomaBank)、TRA-l-60(1:50稀釋，PeterW.Andrews博士捐贈)、TRA-1-81(1:50稀釋，PeterW.Andrews博士捐贈)、Nanog(1:20稀釋，AF1997,R&DSystems)、pIII-微管蛋白(1:100稀釋，CB412,Chemicon)、膠質纖維脂蛋白(1:500稀釋，Z0334,Dako)、oc-平滑肌肌動蛋白(稀釋，N1584,Dako)、結蛋白(1:100稀釋，LabVision)、波形蛋白(1:100稀釋，SC-6260,SantaCruz)、oc-胎蛋白(1:100稀釋，MAB1368,R&DSystems)和酪氨酸羥化酶(1:100稀釋，AB152,Chemicon)。作為第二抗體，使用了綴合了花菁3(Cy3)的山羊抗大鼠IgM(l:500稀釋，JacksonImmunoResearch)、綴合了Alexa546的山羊抗小鼠IgM(1:500稀釋，Invitrogen)、綴合了Alexa488的山羊抗兔IgG(1:500稀釋，Invitrogen)、綴合了Alexa488的驢抗山羊IgG(1:500稀釋，Invitrogen)、綴合了Cy3的山羊抗小鼠IgG(1:500稀釋，Chemicon)和綴合了Alexa488的山羊抗小鼠IgM(1:500稀釋，Invitrogen)。用lMg/mlHoechst33342(Invitrogen)對核進行染色。7.體外分化用膠原酶IV處理人iPS細胞，轉移到包被羥乙基甲基丙烯酸酯的皿中，并用含20%KSR(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺、lxl0"M非必需氨基酸、lxl(TM2-巰基乙醇(Invitrogen)和0.5%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12進行懸浮培養(yǎng)，以形成胚狀體(EB)。隔日更換所述培養(yǎng)基。懸浮培養(yǎng)8天后，將EB轉移到包被明膠的平板上，并在相同培養(yǎng)基中再培養(yǎng)8天。為分化成多巴胺能神經(jīng)元，首先將PA6飼養(yǎng)細胞平板接種于包被明膠的6孔平板上，并溫育4天至達到匯合。將iPS細胞的小團塊平板接種于含10%KSR(Invitrogen)、1x10-4M非必需氨基酸、1x10-4M2-巰基乙醇(Invitrogen)及0.5°/。青霉素和鏈霉素的Glasgow最低基礎培養(yǎng)基(Invitrogen)中的PA6飼養(yǎng)層上。為分化成心肌細胞，使iPS細胞在包被基質膠的平板中的補充有4ng/mlbFGF的MEF-CM中維持6天。然后，用補充有100ng/ml人重組激活素A(R&DSystems)的補充B27的RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI/B27)(Invitrogen)替換所述培養(yǎng)基24小時，隨后用10ng/ml人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4，R&DSystems)4天。經(jīng)細胞因子刺激后，將細胞維持于不含任何細胞因子的RPMI/B27中。隔日更換所述培養(yǎng)基。8.亞硫酸氫鹽測序法用Cp基因組DM改良試劑盒(Chemicon)根據(jù)產品說明書處理基因組DNA(1)ig)。用QIAQuickColumn(QIAGEN)純化經(jīng)處理的DNA。通過PCR擴增人Oct3/4、Nanog和Rexl基因的啟動子區(qū)域。將PCR產物亞克隆于pCR2.1-TOPO中。通過用Ml3通用引物進行測序來確認每個樣品的10個克隆。用于PCR擴增的引物序列顯示于表8。9.熒光素酶測定用50ngpRL-TK(Promega)將含螢火蟲熒光素酶基因的各報告質粒(lpg)導入人iPS細胞或HDF中?；驅牒?8小時，用1x被動性溶解緩沖液(Promega)溶解所述細胞，并于室溫下溫育15分鐘。用雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)(Promega)和CentroLB960檢測系統(tǒng)(Barthold)根據(jù)產品說明書測量熒光素酶活性。10.畸胎瘤形成通過膠原酶IV處理收獲所述細胞，收集于管中，并離心，并將沉淀重懸于DMEM/F12中。將匯合的100mm皿中細胞的1/4皮下接種于SCID小鼠背側(CleaJapan)。9周后，切下腫瘤，稱重，并用含4%多聚甲醛的PBS固定。對石蠟包埋的組織進行切片，并用蘇木精-伊紅染色。12.DNA印記用BglII、EcoRI和NcoI過夜消化基因組DNA(5iag)。在0.8%瓊脂糖凝膠上分離消化的DNA片段，并轉移到尼龍膜(Amersham)上。于42'C勻速攪拌下在DIGEasyHyb緩沖液(Roche)中使所述膜與經(jīng)洋地黃毒普(DIG)標記的DNA探針過夜反應。洗滌后，向所述膜加入綴合了堿性磷酸酶的抗DIG抗體(1:10000稀釋，Roche)。用CDP-star(Roche)激發(fā)信號，并用LAS3000成像系統(tǒng)檢測。13.短串聯(lián)重復分析和核型分析對基因組DNA用使用Powerplex16系統(tǒng)(Promega)進行PCR，并用ABIPRISM3100(基因分析儀和基因定位儀v3.5)(AppliedBioSystems)分析。在NihonGeneResearchLaboratories公司(曰本)進行染色體G帶分析。14.檢測端粒酶活性用TRAPEZE端粒酶檢測試劑盒(Chemicon)根據(jù)產品說明書檢測端粒酶活性。通過基于TBE的10%丙稀酰胺非變性凝膠電泳分離所述樣品。膠。15,染色質免疫沉淀測定于室溫下將約1x107細胞交聯(lián)于1%多聚甲醛5分鐘，并通過加入甘氨酸停止所述反應。對所述細胞溶解物進行超聲波處理，以共享染色質-DNA復合物。用連接有免疫磁珠蛋白G(Invitrogen)的抗三甲基Lys4組蛋白H3(07-473，Upstate)、抗三甲基Lys27組蛋白H3(07-449，Upstate)或正常兔IgG抗體進行免疫沉淀。將洗脫液用作定量PCR的模板。16.DNA微陣列分析用Cy3標記來自HDF和MPS細胞(克隆201B)的總RNA。使樣品與人全基因組微陣列4x44K(G4112F，Agilent)雜交。使每個樣品一次與一種顏色方案雜交。用G2565BA微陣列掃描系統(tǒng)(Agilent)掃描陣列，并用GeneSpringGX7.3.l軟件分析數(shù)據(jù)。進行兩次校正。首先，將小于0.01的信號強度設置為0.01。然后用取自芯片測量值的第50個百分位數(shù)校正每個芯片。用hESH9細胞的微陣列數(shù)據(jù)(Tesaretal.，Nature,448，pp.196-199，2007)檢索GEO數(shù)據(jù)集(GSM194390,http://www,ncbi.nlm.nih.gov/sUes/entrezdb=gds&cmd=search&term=GSE7902)。在所有三個樣品中，使用具有"當前"標記值的基因進行分析(32,266基因)。將HDF和hiPS細胞的微陣列數(shù)椐以登錄號GSE9561儲存于GEO數(shù)據(jù)集中。實施例19:不用c-Myc建立iPS細胞通過用逆轉錄病毒將0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc導入小鼠成纖維細胞而得到的小鼠iPS細胞的iPS克隆(Takahashietal.，Cell,126，pp.663-76，2006)在每個基因中含有一些逆轉錄病毒。每個克隆具有共多于20個逆轉錄病毒整合位點，且發(fā)生腫瘤的風險的可能性升高。在小鼠iPS細胞的情況下，已知源于iPS細胞的嵌合體小鼠及其后代的肺瘤發(fā)生率達~20%(Okitaetal.，Nature,448，pp.313-17，2007)，且有c-Myc逆轉錄病毒再活化升高使用iPS細胞產生的嵌合體小鼠及其后代小鼠的腫瘤發(fā)生率的可能性。從而研究了不用c-Myc建立iPS細胞的方法。此外，測定了是否可通過使用四種基因一一Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的家族基因建立iPS細胞。為此，使用了含有受Nanog基因調控元件驅動的綠色焚光蛋白(GFP)-IRES-Puror轉基因的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)(Okitaetal.，Nature,448，pp.313-17，2007)。Nanog在小鼠ES細胞和移植前胚胎中特異性表達(Chambersetal.，Cell,113，pp.643-655，2003;Mitsuietal.，Cell,113，pp.631-642，2003)，且可作為iPS細胞導入過程的篩選標記。當誘導了重編程時，GFP表達，且這成為所述細胞是iPS細胞的標志。結果顯示，經(jīng)Nanog篩選的iPS細胞無法與ES細胞區(qū)分開，并產生性系有功能的嵌合體小鼠(Wernigetal.，Nature,448，pp.318-324，2007;Okitaetal.，Nature,448，pp.313-17，2007;Maheralietal.，Cel1StemCel1，1，pp.55-70，2007)。Oct3/4屬于轉錄因子的Oct家族，其含有POU結構域(Ryanetal.，GenesDev11:1207-25，1997)。最接近于Oct3/4的同源物是Octl和Oct6。用逆轉錄病毒將Oct3/4、Octl或Oct6集其余3種基因導入Nanog報告MEF中。如果使用Oct3/4,則觀察到許多GFP陽性集落(圖23a)。Sox2屬于Sox(SRY相關HMG盒)轉錄因子，其特征在于，存在高運動性基團(HMG)結構域(Schepersetal.,Dev.Cell,3，pp.167-170，2002)。檢測了Soxl、Sox3、Sox7、Soxl5、Soxl7和Sox18，且當使用Soxl時得到GFP陽性集落。此外，如果使用Sox3、Soxl5和Soxl8，可得到少量GFP陽性集落(圖23a)。Klf4屬于克魯佩爾樣因子(Klf)，是含有類似于果蠅胚胎模式調控子克魯佩爾的氨基酸序列的鋅指蛋白(Dangetal.，Int.J.Biochem.CellBiol,，32，pp.1103-1121，2000)。檢測了Klfl、Klf2和Klf5，且當使用Klf2時得到表達GFP的集落(圖23a)。使用Klfl和Kif5也可誘導iPS細胞。c-Myc有兩個相關基因(N-Myc和L-Myc)(Adhikaryetal.,Nat.Rev.Mol.CellBiol.，6，pp.635—645，2005)。通過使用N-Myc或L-Myc,形成GFP陽性集落(圖23a)。因此顯示，可通過四種基因的家族基因誘導iPS細胞。針對家族基因研究了是否可從MEF(其中將Pgeo敲入Fbxl5基因座位)(Tokuzawaetal.,Mol.CellBiol.，23,pp.2699-2708，2003)誘導出iPS細胞，并得到了與通過基于Nanog的篩選得到的結果類似的結果?？捎肧oxl或Sox3代替Sox2，可用Klf2代替Klf4，且可用N-Myc和L-Myc代替c-Myc?？稍鲋乘鐾ㄟ^所述家族基因產生的細胞，并顯示可從形態(tài)上與ES細胞區(qū)分開，并在棵鼠中造成畸胎瘤(圖24)。因此顯示，這些家族基因可從Nanog報告MEF和Fbxl5報告MEF二者誘導iPS細胞。不使用c-Myc由Nanog報告MEF得到少數(shù)ES細胞樣GFP陽性集落(圖23a)。盡管0kita等人之前報導不用c-Myc得不到GFP陽性集落(Okitaetal.，Nature,448，pp.313-17，2007)，但該文報導的方法與上述方法的一個區(qū)別是藥物篩選時間。該文描述的方法中，于基因導入后7天時開始嘌呤霉素篩選，而本方法中在第14天開始了藥物篩選。將四種基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc或三種基因(無c-Myc)中的每一個都導入Nanog報告MEF中，并于基因導入后7天、14天或21天時開始嘌呤霉素篩選(圖23b)。當使用四種基因時，在所有條件下觀察到GFP陽性集落，而當嘌呤霉素篩選延遲時，集落數(shù)顯著增加。在不用c-Myc的用途的情況下，當在基因導入后7天時開始篩選時觀察不到GFP陽性集落，但當在基因導入后14天或21天時開始篩選，可形成GFP陽性集落。在各條件下，使用三種基因的情況的集落數(shù)小于使用四種基因的情況。使用三種基因(Oct3/4、Sox2、Klf4)(不用Myc逆轉錄病毒)產生的經(jīng)Nanog篩選的iPS細胞以接近ES細胞的水平表達ES細胞標記基因(圖25)，并在移植到胚泡中時產生成年嵌合體小鼠(表9)。54<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>用三種基因(不使用MYC)由MEF或TTF誘導所有iPS克隆。*FB:Fbxl5-(3geo報告子;Ng:Nanog-GFP-IRES-Puro^艮告子；GFP:CAG-EGFP另一個不同是，當使用三種基因(不使用c-Myc)誘導iPS細胞時，觀察到更少的GFP陰性集落和更低的背景細胞(圖23c)。因此，不使用c-Myc的誘導方法具有優(yōu)點，即誘導緩慢，且相比并用c-Myc的iPS細胞誘導效率降低，但iPS細胞誘導的特異性升高?？稍诓皇褂胏-Myc的情況下從MEF(其中將Pgeo敲入Fbx15座位)(Tokuzawaetal.，Mol.CellBiol.，23，pp.2699-2708，2003)產生很少的iPS細胞(圖26A)。Takahashi等人之前報導不使用c-Myc不能得到iPS細胞(Takahashietal.,Cell,126，pp.663-676，2006)，且該文報導的方法與上述方法的G418篩選開始于相同時間(基因導入后3天)。但該文報導的方法中于基因導入后14-21天對所述集落進行了篩選，而在本實驗中則在約30天后進行了集落篩選。此外，本實驗中，使用各自獨立的PLAT-E細胞各自制備了含四種基因(或三種基因)的逆轉錄病毒(Moritaetal.，GeneTher.，7，pp.1063-1066，2000)。通過此操作，逆轉錄病毒的轉染效率提高，并觀察到iPS細胞集落數(shù)相比已報導的在單個PLAT-E細胞中制備所有四種基因的方法顯著提高。通過導入四種基因產生的經(jīng)Fbxl5篩選的iPS細胞中的ES細胞標記基因的表達水平低于ES細胞(Takahashietal,，CelL，126，pp.663-676，2006)。當將此iPS細胞微注射到胚泡中時不可產生成年嵌合體小鼠，但當也進行Fbx15篩選時，不使用c-Myc制備的iPS細胞的ES細胞標記基因的表達水平與ES細胞的表達水平相當(圖26B)。此外，以高iPS細胞貢獻率由不使用c-Myc制備的iPS細胞得到了成年嵌合體小鼠(圖27，表9)。未觀察到這些嵌合體小鼠中腫瘤發(fā)生率增加。即，在源自用四種基因建立的iPS細胞的嵌合體小鼠中，37只嵌合體小鼠中的6只在出生后IOO天內死于胂瘤，但源于用三種基因(不用c-Myc)建立的iPS的的嵌合體小鼠，因為所有26只嵌合體在觀察期(短于4個月)內存活，從而表明不使用c-Myc降低了腫瘤發(fā)生風險。研究了是否可不使用c-Myc，且不使用藥物篩選有效分離iPS細胞。將四種基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三種基因(不使用c-Myc)導入含Nanog報告子的成年尾尖成纖維細胞(TTF)中，并在非噪呤霉素篩選下繼續(xù)培養(yǎng)。尾觀察所述導入了基因的細胞，導入DsRed逆轉錄病毒集四種基因或三種基因。逆轉錄病毒導入后30天時，有導入四種基因的細胞的皿被許多GFP陰性集落和背景細胞覆蓋(圖28A,表10:Nanog-GFP報告TTF+非藥物篩選)。表中括號的數(shù)值表示GFP陽性克隆或克隆數(shù)。逆轉錄病毒(0ct3/4、Sox2、Klf4、(C-Myc)和DsRed)的比例在No.256中是l:1:1:(1):4，而在No.272和309中是1:1:1:(1):4。No.220中，DsRed未導入。表10實驗號220256基因i接種的細胞數(shù)；總集落數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>使用熒光顯微鏡觀察集落中的GFP陽性集落(在三個獨立實驗中4、132、424個集落)。GFP陽性集落呈DsRed陰性，這與在經(jīng)Nanog篩選的iPS中觀察到的逆轉錄病毒沉默類似(Okitaetal.，Nature,448pp.313-17，2007)。當使用三種基因(不使用c-Myc)時，觀察到集落中的有很少背景細胞的集落(在三個獨立實驗中7、21和43個)。這些集落中約半數(shù)以斑駁形式表達GFP。僅在一些集落的一小部分中檢測到DsRed，表示其被大量沉默。未觀察到GFP和DsRed之間的重疊。這些集落中的大部分可擴增，且由iPS細胞組成，其在第2代呈GFP陽性和DsRed陰性。因此顯示，可在非藥物篩選和不使用c-Myc的情況下增強iPS細胞的特異性產生。所述iPS細胞中Nanog-GFP活化，且逆轉錄病毒沉默。試著從成年TTF(不具有篩選標記物，但具有由具有組成型活性的啟動子驅動的DsRed轉基因)制備iPS細胞(Vinterstenetal.，Genesis,40，pp.241-246，2004)。將四種基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三種基因(不使用c-Myc)導入所述細胞。再導入GFP逆轉錄病毒以監(jiān)控沉默。非藥物篩選30天后，從導入所述四種基因的0.5x105中形成約1000個集落。其中大部分是GFP陽性集落，表明這些細胞中未發(fā)生逆轉錄病毒沉默。另一方面，用導入三種基因(不使用c-Myc)的3.5乂105細胞產生16個集落(圖28B)。這些集落中的大部分不表達GFP，而其余集落微量表達GFP。所有這些集落均可增殖，甚至在第2代，它們也顯示出iPS細胞形態(tài)(ES細胞樣形態(tài))。此外，結果顯示，這些細胞均為GFP陰性的，并產生逆轉錄病毒沉默。RT-PCR顯示，這些細胞中ES細胞標記基因的表達水平與ES細胞相當(圖28C)。通過使用這些基因制備的iPS細胞，通過RT-PCR證實了Klf4的逆轉錄病毒沉默和c-Myc轉基因的缺失，當將這些iPS細胞移植到胚泡中時產生嵌合體小鼠(圖28D和表9)。以上結果顯示，可在不使用c-Myc的情況下得到具有優(yōu)良特性的iPS細胞，且可在非藥物篩選下由成年TTF有效制備iPS細胞。接下來，將Oct3/4、Sox2和Klf4的逆轉錄病毒導入人新生兒陽莖外鞘衍生成纖維細胞(BJ)(克隆246H)或人成年皮膚衍生成纖維細胞HDF(253G)中。30天后形成很少的人iPS細胞集落。這些細胞表現(xiàn)出人ES細胞樣集落形態(tài)，并可被增殖(圖29A)。當把三種基因(不使用c-Myc)導入(253G)中，或當向所述三種基因添加c-Myc，并同時導入(253F)時，證實源于HDF的人iPS細胞表達ES細胞標記基因(圖29B)。此外，證實了未使用c-Myc逆轉錄病毒誘導的人iPS細胞的通過胚狀體的分化(圖30)。實施例19中的實驗材料與方法如下1，質粒構建使用列于表ll的引物通過RT-PCR擴增家族基因的編碼區(qū)域(序列表的SEQIDNO:127-152)，亞克隆于pD0NR201或pENTR-D-T0P0(Invitrogen)中，并通過LR反應(Invitrogen)重組于pMXs-gw中。表ll翻一SoxlSox3Siox7Soxl5—序—列—CAGCCT玩fC化C—ATG—GCTCCA6C匿GACGGTTACGATGAT6G—C—C玩(S5CTCC力T，CTATGTGGCATSoxl80ctli)ct6Klf1CACCA—TGTAC——TAG—A—Tr「ClC——C—IfG—TlTCA—fG—T—G—CAC——CTCGGCICTCCAf—TCC!CACGG(5…!TTAAAGGT—GfclCCA(]逛CGTC—AAATCCACIaT—g—5—ActT玩c，6aCAC—ClT—G—A—A—GjTTT—G—CC—西，[匿____________GGAGAC—琶——,:響復T—，—GfTG—G—G—ACACACCTClCAGGGCGACCT可—Ha—I，CATGAGTCGGG(5TaI—kc—Hac—CAGCCCTAG—竹GGCCGCCAGC蘿—AT—CI&A—:麗HGGATGCAATACGGCTAGTAATAAA—C—CA—A.玩C—————CGGACt—二:『—CACCATGAGGCAGAAGAGAGAGAGGAGKlf2Klf5L-MycWTTCAGAGGTG一A&GCATGT化c—ac——c——g—g—c一Wf—CIg——c——gTMTN—MycWTCTACATATG—CXCCAT—:麗—，—A，—歐W—WTCGCTTCATGTG玩—C———G—CAG—;，:gXccat麗—GC—■G—CTTCGACTCGTATCAGCACTATTTCACTGAG麗—C—TC麗Igc德德—g阮—，kGAT』CTACctt2.逆轉錄病毒轉導58使用Fugene6試劑(Roche)根據(jù)產品說明書將基于pMX的逆轉錄病毒栽體轉染至PLAT-E細胞(Moritaetal.，GeneTher.，7，pp.1063-1066，2000)中。24小時后更換培養(yǎng)基，再24小時后取含病毒上清液，并通過逆轉錄病毒感染進行基因導入。在"混合的"方案中，將四種基因的質粒的混合物轉染至單皿的PLAT-E細胞中。在"各自的"方法中，將每個質粒轉染至各自皿的PLAT-E細胞中。在基因導入前混合含病毒上清液。在所述各自的方法中，觀察到顯著高的基因導入效率。4.在不使用藥物進行篩選下誘導iPS細胞TTF分離自成年Nanog報告小鼠或成年DsRed轉基因小鼠(Vinterstenetal.,Genesis,40，pp.241—246，2004)。用所述各自的方法制備含逆轉錄病毒的上清液。對于導入四種基因，以1:1:1:1:4的比例混合Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2和DsRed的含逆轉錄病毒上清液。當導入所述三種基因時，以1:1:1:1:4的比例混合Klf4、Oct3/4、Sox2、Mock(空栽體)和DsRed的含逆轉錄病毒上清液。對于DsRed轉基因小鼠，使用GFP逆轉錄病毒替代DsRed。為轉染，以8.(^105細胞/100mm皿(無飼養(yǎng)細胞)的比例接種TTF。將TTF于含病毒/聚凝胺的上清液中溫育24小時?；驅牒?天時，以3.5x105細胞/100鵬皿(有SNL飼養(yǎng)細胞)的比例重接種導入了三種基因的TTF，并用ES細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。以0.5x105細胞/100隱皿(有SNL伺養(yǎng)細胞)的比例重接種導入了四種基因的TTF?；驅牒?0-40天時對集落數(shù)進行計數(shù)。選出一些集落用于擴增。5.iPS細胞評估根據(jù)已報導方法進行RT-PCR和畸胎瘤形成。對于嵌合體實驗，將15-20個iPS細胞注射入BDF1衍生胚泡中，隨后將其移植入假孕小鼠的子宮中。實施例20:使用六種基因由上皮細胞產生人iPS細胞使用下列六種基因——Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28(NCBI登錄號NM—145833(小鼠)或NM一024674(人))的組合，或缺少所述組合中一種或兩種或多種基因的組合誘導iPS細胞。將6xl06293FT細胞接種于10cm陪替皿中，并過夜培養(yǎng)，并用3|ugpLenti6/UbC-Slc7al慢病毒載體，使用9MgVirapower包裝混合物及脂質體2000(Invitrogen)轉染這些陪替皿。24小時后用新培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。再20小時后，取所述培養(yǎng)上清液，并用孔徑尺寸0.45Mm的醋酸纖維素過濾器(Whatman)進行過濾。于前日制備5xl05上皮細胞。向已移除培養(yǎng)上清液的上皮細胞陪替皿中加入經(jīng)過濾的加入了4ug/ml聚凝胺(NacalaiTesque)的培養(yǎng)上清液，并培養(yǎng)所述細胞24小時。將1.0xl06PLAT-E細胞接種于6cm陪替皿中，并培養(yǎng)。次日，使用27nlFugene6轉染試劑(Roche)，用9.0mg基于pMX的逆轉錄病毒栽體(含Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)轉染所述細胞。24小時后，用新培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。再次日，收集PLAT-E細胞的培養(yǎng)上清液，并用孔徑尺寸0.45jam的醋酸纖維素過濾器(Whatman)進行過濾。慢病毒感染后7天時以3.0x105細胞/6cm皿重接種上皮細胞，并加入上述含逆轉錄病毒和聚凝胺的培養(yǎng)上清液。結果顯示于表12中。表中，"6F"表示6種基因(Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)，分別是"L"表示Lin28，"N，，表示Nanog,"M"表示c-Myc,"0"表示Oct3/4，"S，，表示Sox2，及"K，，表示Klf4。字母前的"-，，指將由緊隨"-"的字母指代的基因從六種基因中除去的情況，例如"-L，，指通過從六種基因中除去ln-28而剩下的五種基因，而"-KS，，指六種基因中缺失Klf4和Sox2的四種基因。表中數(shù)值表示集落數(shù)，"非ES樣"表示具有非ES樣形態(tài)的集落，而"ES樣"表示具有ES樣細胞形態(tài)的集落。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表12顯示兩次實驗的結果。第一次實驗的結果顯示基因導入后第23天或第29天的通過導入各基因的組合而誘導的細胞的集落數(shù)，而笫二次實驗(右欄的第23天)的結果顯示在"6F"、w-KM"和W-NL"的情況下的集落數(shù)。因為未導入Lin-28(如"-L")的細胞的集落數(shù)小于導入了Lin-28時的集落數(shù)，顯示Lin28在提高iPS細胞產生效率中負責重要作用。還使用六種基因(Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)和四種基因的兩種不同組合(圖31中Y4F代表的Klf4、c-Myc、Oct3/4和Sox2，和圖31中T4F代表的Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)進行iPS細胞誘導。T4F與Yueta1.，Science,318，pp.1917-1920，2007中公開的組合相同。圖31中，"ES樣"表示形態(tài)類似于ES細胞集落的集落數(shù)，而"總"表示ES樣集落數(shù)和非ES樣集落數(shù)的總合。Exp"、Exp并2、Exp#3和Exp#4表示各自實驗的結果。在這些實驗中，通過使用六種基因和Y4F的四種基因的組合得到形態(tài)類似于ES樣細胞集落的iPS細胞集落。但在T4F的組合中，未觀察到有形態(tài)類似于ES樣細胞集落的集落形成。實施例21:使用Sall4有效產生iPS細胞使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和人成年皮膚成纖維細胞(成年HDF)進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)，當使用向三種基因(Klf4、Oct3/4和Sox2)的組合添加Sal14的組合(即使用Klf4、Oct3/4、Sox2和Sal14)誘導iPS細胞時增加'iPS細胞的產生效率(圖32和33)。當向四種基因(Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc)添加Sal14時觀察到更多的iPS細胞集落。這些實驗顯示，可通過向核重編程因子添加Sal14而提高iPS細胞的誘導效率。實施例22:小鼠Sal14和/或小鼠Sal11促進iPS細胞誘導的效應根據(jù)已報導的方法(Cell,131，pp.861-872，2007)，并使用逆轉錄病毒將源于人的四種基因(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三種基因(Y3F:0ct3/4、Sox2和Klf4)和小鼠Sal14(mSal14)基因或小鼠Salll(mSalll)基因導入成年皮膚成纖維細胞(成年HDF，通過慢病毒使其表達小鼠親嗜性受體Slc7a基因)?；驅牒蟮?天收集一次HDF，然后將調至5x105的HDF接種于經(jīng)絲裂霉素C處理的1.5x106STO細胞上。次日后將細胞培養(yǎng)于用于培養(yǎng)靈長類ES細胞的培養(yǎng)基(ReproCELL)(含4ng/ml重組人bFGF(WAKO))中。感染后笫32天和第40天的ES細胞樣集落數(shù)的計數(shù)結果顯示于圖34。在感染后第32天，當導入Y3F+模擬物(空載體)時的集落數(shù)是l，而當導入Y4F+模擬物時的集落數(shù)是37;而當同時導入Y3F或Y4F和Sall4時，在導入HF+mSal14的組觀察到22個集落，而在導入Y4F+mSa114的組觀察到73個集落。當把mSal11導入Y3F或Y4F時，在導入Y3F+mSa111的組觀察到2個集落，而在導入Y4F+mSa111的組觀察到43個集落，并與僅導入Y3F或Y4F的情況相比無顯著的集落數(shù)差異。當把mSa114和mSa111同時導入Y3F或Y4F時，導入Y3F+mSa114+mSa111的組的集落數(shù)是34,而導入Y4F+mSall4+mSa111的組是79。感染后第40天，當導入Y3F+模擬物時的集落數(shù)是8，而當導入Y4F+模擬物時的集落數(shù)是57;而當同時導入Y3F或Y4F和mSal14時，在導入Y3F+mSa114的組觀察到62個集落，而在導入Y4F+mSal14的組觀察到167個集落。當把mSalll導入Y3F或Y4F時，在導入nF+mSa111的組觀察到14個集落，而在導入Y4F+mSaUl的組觀察到103個集落。而且，當把mSal14和mSalll同時導入Y3F或Y4F時，導入Y3F+mSall4+mSa111的組的集落數(shù)是98,而導入Y4F+mSal14+mSal11的組是193。以上結果顯示，可通過將mSall4導入Y3F，或同時導入mSa114和mSalll，使以20-IOO倍效率導入人iPS細胞。此外顯示，可通過將mSall4導入Y4F，或同時導入mSa114和mSalll，4吏以2-4倍效率導入人iPS細胞。實施例23:小鼠Sal14和/或小鼠Sal11促進iPS細胞誘導的效應(2)根據(jù)已報導的方法(Cell,131，pp.861-872，2007),將小鼠SaU4(mSal14)或小鼠Salll(mSalll)或此二者及源于人的四種基因(T4F:Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)或三種基因(T3F:Oct3/4、Sox2和Nanog)導入人成年皮膚成纖維細胞(用慢病毒使其表達小鼠親嗜性受體Slc7a)(HDFa-Slc7al)?；驅牒蟮?天收集一次HDF-Slc7al，然后將調至5xl05的HDF-Slc7al接種于經(jīng)絲裂霉素C處理的1.5x106STO細胞上。培養(yǎng)7天后將細胞培養(yǎng)于用于培養(yǎng)靈長類ES細胞的培養(yǎng)基(ReproCeLL)(含4ng/ml重組人bFGF(WAKO))中。感染后第32天和第40天的ES細胞樣集落數(shù)的計數(shù)結果顯示于圖35。在感染后第32天，當導入T3F+模擬物和T4F+模擬物時的集落數(shù)是0，而當同時導入T3F或T4F和mSa114時，在導入T3F+mSa114的組檢測到兩個集落。未在導入T4F+mSa114的組觀察到人ES細胞樣集落。當同時導入T3F或T4F和mSa111時，在導入T3F+mSal11的組觀察到3個集落，而在導入T4F+mSa111的組觀察到6個集落。而且，當同時導入mSall4和mSalll及T3F或T4F時，在導入T3F+mSall4+mSaUl的組觀察到3個集落。未在導入T4F+mSall4+mSa111的組觀察到人ES樣集落。感染后第40天，當導入T3F+模擬物和T4F+模擬物時的集落數(shù)是0,而當同時導入T3F或T4F和mSa114時，在導入T3F+mSal14的組觀察到6個集落，而在導入T4F+mSa114的組觀察到2個集落。實施例24:人Sall4促進iPS細胞誘導的效應根據(jù)Cell，131，pp.861-872，2007描述的方法制備人成年皮膚成纖維細胞(用慢病毒使其表達小鼠親嗜性受體Slc7al)(HDF-Slc7al)，次日用逆轉錄病毒導入源于人的四種基因(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三種基因(Y3F:Oct3/4、Sox2和Klf4)和人Sal14(hSal14)?；驅牒蟮?天收集一次HDF，然后將調至5xl()5的HDF接種于經(jīng)絲裂霉素C處理的1.5xlQST0細胞上。次日后將細胞培養(yǎng)于用于培養(yǎng)靈長類ES細胞的培養(yǎng)基(ReproCELL)(含4ng/ml重組人bFGF(WAKO))中。感染后第32天和第40天的ES細胞樣集落數(shù)的計數(shù)結果顯示于圖36。在感染后第32天，當導入Y3F+模擬物(空栽體)時的集落數(shù)是l,而當導入Y4F+模擬物時的集落數(shù)是34;而當同時導入Y3F或Y4F和hSal14時，在導入Y3F+hSa114的組觀察到8個集落，而在導入Y4F+hSa114的組觀察到52個集落。感染后第40天，當導入Y3F+模擬物時的集落數(shù)是5，而當導入Y4F+模擬物時的集落數(shù)是52;而當同時導入Y3F或Y4F和hSal14時，在導入Y3F+Sal14的組觀察到32個集落，而在導入Y4F+mSa114的組觀察到137個集落。結果顯示，可通過同時將hSal14導入Y3F而以6-8倍效率得到人iPS細胞集落，且可通過同時導入Y4F和hSal14而以1.5-2.5倍效率得到人iPS細胞集落。實施例25:L-Myc的效應(A)測定通過導入四種基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc)進行的重編程(1)對人iPS細胞誘導的影響根據(jù)已報導的方法(Cell,131，pp.861-872，2007)制備成年皮膚衍生成纖維細胞(使其表達小鼠親嗜性病毒受體Slc7al基因)(aHDF-Slc7al)。以3x105/60鵬皿的比例接種aHDF-Slc7al,次日，根據(jù)本文上述方法用逆轉錄病毒導入源于人的四種基因(共4種基因，除三種基因Oct3/4、Klf4和Sox2外，L-Mycl(以下簡稱為"L-Myc")、c-Myc或N-Myc基因)。病毒感染后6天時收集細胞，并重接種于MSTO細胞上(5x10Vl00mra皿)。從次日開始，將細胞培養(yǎng)于補充有4ng/ml重組人bFGF(窗0)的靈長類ES細胞培養(yǎng)基(ReproCELL)中。對逆轉錄病毒感染后第37天形成的人iPS細胞集落數(shù)進行計數(shù)。對四次實驗結果的總結顯示于表13和圖37(圖37是表13的圖像，且圖像上的數(shù)值表示iPS細胞集落相對總集落數(shù)的比率)。通過使用L-Myc，誘導iPS細胞集落的效率成為使用c-Myc的6倍以上，且在使用L-Myc的情況下比使用c-Myc的情況，其iPS細胞集落數(shù)相對總集落數(shù)的比率升高約2倍。當使用N-Myc時，可觀察到iPS細胞集落數(shù)比c-Myc的情況增加。對于誘導小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)衍生iPS細胞，有報導稱使用c-Myc的情況和使用L-Myc的情況之間無差異(NatureBiotech.,26，pp.101-106，2008)，但已清楚，當使用人細胞時，在使用L-Myc時比使用c-Myc時誘導iPS細胞的效率更顯著提高。表13hiPS集落數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>(2)體外分化誘導將通過導入四種基因——Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc而建立的人iPS細胞(32R2,32R6)接種于低結合性皿中，并根據(jù)已報導的方法(Cel1，131，pp.861-872，2007)形成胚狀體(EB)(100mm皿)。培養(yǎng)2周后，使用抗oc-胎蛋白(R&DSystems)(內胚層細胞的分化標記)、oc-平滑肌肌動蛋白(Wako)(中胚層細胞的分化標記)和PIII-微管蛋白(Chemicon)(外胚層細胞的分化標記)的各抗體進行染色。結果顯示于圖38。通過染色，確認了各標記物的表達，并證實得到的人iPS細胞具有分化成三種胚層細胞的能力。(3)畸胎瘤形成能力將通過導入四種基因——0ct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc而建立的人iPS細胞(32R6)培養(yǎng)于用于培養(yǎng)靈長類ES細胞的培養(yǎng)基(ReproCeLL)(含重組人bFGF(4ng/ml)和Rho激酶抑制劑Y-27632(IO"M))中。1小時后，通過用膠原IV處理收集所述細胞，通過離心回收所述細胞，以將其懸浮于含Y-27632(IOjuM)的DMEM/F12中。將匯合細胞(100mm皿)量的1/4注射到SCID小鼠的睪丸中。2-3月后，切下腫瘤，用含4%多聚甲醛的PBS(-)固定。對石蠟包埋的組織進行切片，并用蘇木精-伊紅染色。結果顯示于圖39。因為腫瘤由多種細胞以組織學方式構成，因此觀察到神經(jīng)組織、腸道樣組織、軟骨組織、毛組織、脂肪組織和色素組織，確證了iPS細胞的多能性。(4)嵌合體小鼠對腫瘤發(fā)生的影響MEF(MEF-Ng)分離自具有Nanog報告子的小鼠，所述Nanog報告子通過將EGFP和嘌呤霉素抗性基因并入Nanog座位而制成(Nature,448，pp.313-317，2007)。MEF(MEF-Fbx)也類似分離自具有Fbxl5報告子的小鼠所述報告子通過將p-geo基因并入Fbxl5座位而制成(Cell,126，pp.663-676，2006)。用逆轉錄病毒將四種基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc)導入這些MEF中，并通過用有關MEF-Ng的嘌呤霉素篩選建立iPS細胞，且通過用有關MEF-Fbx的G418篩選建立iPS細胞(分別稱為Nanog-iPS和Fbx-iPS)。通過將這些iPS細胞移植到C57BL/6小鼠的胚泡中而產生嵌合體小鼠。研究了嵌合體小鼠和F1小鼠的腫瘤發(fā)生，結果此時小鼠分別存活如下天數(shù)，且未在任何活的小鼠中觀察到腫瘤發(fā)生。對三個GFP陽性集落衍生的克隆進行RT-PCR和基因組PCR，以分析基因表達。結果顯示于圖41。所有克隆都表達Nanog、Rexl和ECATl(ES細胞的標記基因)。此外，在所有iPS細胞集落中，導入的三種基因(0ct3/4、Klf4和L-Myc)均整合到基因組中。另一方面，未在一些克隆中檢測到mRNA的表達，被認為其發(fā)生沉默。(3)畸胎瘤形成能力將在上述(1)中建立的四種克隆(iPS-MEF-Ng-443-3-3、iPS-MEF-Ng-443-3-6、iPS-MEF-Ng-443-3-12和iPS-MEF-Ng-443-3-13)分別皮下注射給棵鼠。四周后在所有實施例中證實了畸胎瘤形成。因為肺瘤由多種細胞以組織學方式構成，因此觀察到神經(jīng)組織、腸道樣組織、肌肉組織、上皮組織和軟骨組織(圖43)，確證了iPS細胞的多能性。實施例26:L-Myc和Lin28在誘導人iPS細胞中的效應根據(jù)已報導方法(Cell,131，pp.861-872，2007)制備成年皮膚成纖維細胞(使其表達小鼠親嗜性病毒受體Slc7al基因)(aHDF-Slc7al)。以3x10760mm皿的比例接種aHDF-Slc7al，次日根據(jù)上文已報導方法使用逆轉錄病毒導入源于人的下列三種、四種或五種基因。Sox2、Oct3/4和Klf4Sox2、Oct3/4、Uf4和c-Myc'Sox2、Oct3/4、Klf4和L-Myc'Sox2、Oct3/4、Klf4和Lin28參Sox2、0ct3/4、Klf4、c-Myc和Lin28'Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28病毒感染后6天時收集所述細胞，并重接種于MST0細胞(5x10V100咖皿)上。從次日后，將所述細胞培養(yǎng)于補充有4ng/ml重組人bFGF(Wako)的靈長類ES細胞培養(yǎng)基(ReproCELL)中。逆轉錄病毒感染后，對第37天形成的總集落數(shù)和hiPS集落數(shù)進行計數(shù)。結果顯示于表14和圖44(圖44是表14的圖像)。hiPS集落總集落hiPS(%)1模擬物DsRed模擬物模擬物模擬物A0002S0X20CT4KLF4模擬物模擬物D3560.03S0X20CT4KLF4c-MYC模擬物B3810336.94S0X20CT4KLF4L-MYC模擬物C15621173.95S0X20CT4KLF4模擬物LIN28G909792.86S0X20CT4KLF4c-MYCLI謂E9815463.67S0X20CT4KLF4L-MYCLI脂F(xiàn)36643284.7通過向四種基因——Sox2、Oct3/4、Klf4和L-Myc添加Lin28,使iPS細胞集落數(shù)顯著增加。iPS細胞集落數(shù)顯著多于向四種基因——Sox2、Oct3/4、Klf4和c-Myc添加Un28的情況。此外Lin28對c-Myc的作用表現(xiàn)出協(xié)同效應，且還對L-Myc的作用表現(xiàn)出強協(xié)同效應(表14)。有關iPS細胞集落數(shù)相對總集落數(shù)的比率，當使用五種基因——Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28時，達到極高的比率(84.7%)。以上結果清晰顯示，為提高誘導人iPS細胞的效率，五種基因一一Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28的組合將極其有效。實施例27:Myc嵌合基因和突變基因在人iPS細胞誘導中的效應如下構建圖45中所示多種嵌合基因(Ms-cL-Myc、Ms-Lc-Myc、Ms-cLc-Myc、Ms-LcL-Myc、Ms-ccL-Myc、Ms-cLL-Myc、Ms-LLc-Myc、Ms-Lcc-Myc)和Myc點突變基因(c-MycWl35E、c-MycV394D、c-MycL420P、L-MycW96E、L-MycV325D、L-MycL351P):首先，將小鼠c-Myc(Ms-c-Myc)和L-Myc(Ms-L-Myc)分別插入pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中，以制備pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc和pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc。其次，基于小鼠c-Myc(NCBIAcc.No.NM—010849)和L-Myc(NCBIAcc.No.NM-008506)的序列信息，制備圖45中所示用于引入點突變的引物，并通過用pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc和pENTR-D-T0P0-Ms-L-Myc作為模板進行PCR。通過測序確認各突變后，通過LR反應將其亞克隆于pMX逆轉錄病毒栽體中。有關圖45中所示嵌合Myc，通過PCR擴增各片段，根據(jù)各組合使用混合物作為模板進行PCR，并如上所述將其亞克隆于pMX逆轉錄病毒栽體中。將得到的以上各逆轉錄病毒載體和在實施例25中使用的Sox2、Oct3/4和Klf4的各逆轉錄病毒栽體如同實施例25導入成年皮膚衍生成纖維細胞UHDF-Slc7al)中，并在逆轉錄病毒感染后，對第31天形成的總集落數(shù)和hiPS集落數(shù)進行計數(shù)。結果顯示于圖46和表15(圖46是表15的圖像)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>人和小鼠的c-Myc和L-Myc在氨基酸水平上的同一性接近100%。因為如圖46和表15中所示，用人基因(c-Myc和L-Myc)產生的人iPS細胞集落，也在使用小鼠基因(Ms-c-Myc和Ms-L-Myc)時如此，證實小鼠c-Myc和L-Myc與人c-Myc和L-Myc具有基本上相同的功能。比較多種Myc嵌合基因和點突變基因與野生型基因的結果的結果，當使用Ms-cL-Myc和Ms-cLc-Myc時，所述iPS細胞集落數(shù)相比野生型L-Myc(L-Myc)增加，且尤其當使用Ms-cL-Myc時得到最佳結果。此外，點突變基因的結果清晰顯示，位于C-末端的一個氨基酸(c-MyM20P和L-MycL351P)對c-Myc和L-Myc均非常重要。以上結果提示，在人iPS細胞建立中Myc的重要的功能區(qū)域是c-Myc的N-末端的1/3部分、L-Myc的中段和c/L-Myc的C-末端部分。工業(yè)實用性本發(fā)明提供了產生安全的誘導性多能干細胞的方法及更有效產生誘導性多能千細胞的方法。權利要求1.由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因這三種基因這三種基因導入體細胞的步驟。2.權利要求l的方法，包括下述步驟在將0ct家族基因、Klf家族基因這三種基因和Sox家族基因導入體細胞后，培養(yǎng)所述細胞足夠長的時間，從而使所述細胞獲得多能性并增殖。3.權利要求l的方法，包括將Oct3/4、Klf4和Sox2這三種基因導入體細胞的步驟。4.權利要求1-3中任一項的方法，包括分別用含有Oct家族基因的病毒載體、含有Klf家族基因的病毒載體和含有Sox家族基因的病毒載體轉染各自的包裝細胞，并培養(yǎng)所述細胞，以獲得三種培養(yǎng)上清液的步驟；及制備通過上述步驟得到的三種培養(yǎng)上清液的混合物，并使用所述混合物重編程體細胞的步驟。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述誘導性多能干細胞通過無藥物篩選而產生。6.由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將Oct家族基因和Sox家族基因這兩種基因的組合或Oct家族基因和Klf家族基因這兩種基因的組合，及選自L-Myc、Salll和Sal14這三種基因中的至少一種基因導入體細胞的步驟。7.權利要求6的方法，包括將0ct3/4和Sox2這兩種基因的組合或Oct3/4和Kif4這兩種基因的組合，及選自L-Myc、Salll和Sal14這三種基因中的至少一種基因導入體細胞的步驟。8.由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將Oct家族基因、Sox家族基因和Klf家族基因這三種基因的組合，及選自L-Myc、Salll和Sa114這三種基因中的至少一種基因導入體細胞的步驟。9.權利要求8的方法，包括將Oct3/4、Sox2和Klf4這三種基因的組合，及選自L-Myc、Salll和Sal14這三種基因中的至少一種基因導入體細胞的步驟。10.權利要求6-9中任一項的方法，包括除上述基因外，將下列基因Lin28和/或Nanog導入體細胞的步驟。11.權利要求10的方法，包括將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28導入體細胞的步驟。12.產生誘導性多能干細胞的方法，其中分化誘導后所得細胞或組織中的腫瘤發(fā)展基本被降低或消除，包括在權利要求1-11中任一項之中定義的步驟。13.由體細胞產生誘導性多能干細胞的方法，包括將0ct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog這六種基因導入體細胞的步驟。14.權利要求13的方法，包括將Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog這六種基因導入體細胞的步驟。15.權利要求1-14中任一項的方法，其中所述體細胞是哺乳動物體細胞，所述哺乳動物包括人。16.權利要求1-14中任一項的方法，其中所述體細胞是人體細胞。17.由權利要求1-16中任一項定義的方法可得到的誘導性多能干細胞。18.從權利要求17的誘導性多能干細胞經(jīng)分化誘導而得的體細胞。19.組織、器官、體液或個體，它們是權利要求18的體細胞的群體。全文摘要由體細胞有效產生安全的誘導性多能干細胞的方法，包括將下列三種基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因導入體細胞的步驟；或將下列兩種基因——Oct家族基因和Sox家族基因的組合或下列兩種基因——Oct家族基因和Klf家族基因的組合，及選自下列三種基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一種基因導入體細胞的步驟。文檔編號C12N15/09GK101617043SQ20088000083公開日2009年12月30日申請日期2008年10月31日優(yōu)先權日2007年10月31日發(fā)明者中川誠人,山中伸彌,高橋和利申請人:國立大學法人京都大學