本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種棉花gbdrp42734基因、編碼蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)中的主要病害之一，對(duì)棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響和損失，病原體從植物的根部或根莖中入侵，并寄生在維管束中。被感染的棉株葉片發(fā)黃、枯萎、脫落，根和莖的維管束也均變褐色，棉鈴變小，脫鈴率高，甚至導(dǎo)致整個(gè)植株枯死，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。1891年，棉花黃萎病首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)。隨后，此病害迅速傳播到全世界的主要棉花產(chǎn)區(qū)。1935年，我國(guó)通過(guò)引入美國(guó)棉種而引入該病原菌，然后隨著棉花種子的運(yùn)輸而繼續(xù)傳播。目前，該病已經(jīng)擴(kuò)展到中國(guó)18個(gè)省、自治區(qū)的478個(gè)縣(市)。許多棉花產(chǎn)區(qū)均出現(xiàn)該病害，并且中國(guó)北方產(chǎn)區(qū)比南方產(chǎn)區(qū)發(fā)病情況嚴(yán)重。該病導(dǎo)致棉花產(chǎn)量損失占多年平均產(chǎn)量的15-20％，在發(fā)病嚴(yán)重年份損失量可達(dá)50％，甚至造成絕產(chǎn)。上世紀(jì)90年代，該病的蔓延速度加劇。據(jù)調(diào)查估測(cè)，1995和1996年，每年大約2667000hm2的棉田遭受病害，皮棉產(chǎn)量損失約100000噸。2002年發(fā)病棉田已超過(guò)30000000hm2。因此，棉花黃萎病已成為影響我國(guó)棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙。目前該病害的控制管理方法主要以防為主，主要有化學(xué)防治、利用農(nóng)業(yè)措施、生物防治、選用抗病品種等。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐表明，利用化學(xué)、生物等方法防治棉花黃萎病均存在一定的局限性，選育和種植抗病品種才是最直接、最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施。但是經(jīng)過(guò)多年抗性鑒定結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)現(xiàn)存的棉花種質(zhì)資源中對(duì)黃萎病高抗的材料較少，并且大都為海島棉，陸地棉材料中70％以上為感病材料，達(dá)到高抗的材料不足1％。。因此，高抗材料的缺乏是限制抗棉花黃萎病育種的主要因素。利用常規(guī)育種方法對(duì)棉花抗病性進(jìn)行遺傳改良，不僅育種周期長(zhǎng)，而且效率低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問(wèn)題，提供了一種棉花gbdrp42734基因、編碼蛋白及應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了一種棉花gbdrp42734基因的編碼蛋白，其具有seqidno.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種編碼上述蛋白的基因。進(jìn)一步地，其具有seqidno.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了一種含有上述基因的載體。本發(fā)明還公開了一種含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開了一種含有上述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明還公開了一種上述基因在控制植物抗黃萎病中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，所述的植物為棉花。進(jìn)一步地，所述的植物為擬南芥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本發(fā)明所獲得的gbdrp42734基因在黃萎病菌誘導(dǎo)后，不僅在dna水平上表現(xiàn)出dna胞嘧啶甲基化水平的改變，而且在mrna轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出基因表達(dá)的變化，說(shuō)明本發(fā)明的gbdrp42734基因與黃萎病抗性高度相關(guān)。2)gbdrp42734基因表達(dá)量高的棉花植株具有更好的抗病機(jī)制，因?yàn)間bdrp42734基因編碼過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白會(huì)與病原菌產(chǎn)生互作，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。gbdrp42734基因表達(dá)量高的棉花植株會(huì)產(chǎn)生更多的過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白，從而快速激發(fā)抗病反應(yīng)。3)轉(zhuǎn)gbdrp42734基因的轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黃萎病的抗性增強(qiáng)。因?yàn)?，gbdrp42734基因沉默表達(dá)后對(duì)黃萎病菌抗性減弱，并且gbdrp42734基因沉默表達(dá)后感病陸地棉比抗病海島棉的發(fā)病情況較重，說(shuō)明gbdrp42734基因的表達(dá)有助于棉花對(duì)黃萎病的抗性。當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說(shuō)明此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1是本發(fā)明棉花根部組織總rna電泳圖，圖中m為分子量marker，1自上到下分別為rna的28s、18s、5s帶型；圖2是本發(fā)明利用unigenes42734兩端的5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)的特異性引物對(duì)海島棉cdna進(jìn)行基因擴(kuò)增圖，其中，1為擴(kuò)增出的目的片段，即unigene42734編碼基因片段，m為分子量marker；圖3是本發(fā)明unigene42734目的基因片段與克隆t載體連接后，大腸桿菌在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后長(zhǎng)出的陽(yáng)性白色克隆；圖4是本發(fā)明unigene42734在黃萎病菌誘導(dǎo)12h后在海島棉和陸地棉中的組織表達(dá)特異性熒光定量pcr分析；圖5是本發(fā)明gbhir42734蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；圖6是本發(fā)明gbhir42734蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；圖7是本發(fā)明gbhir42734基因的同源基因在a組和d組染色體上的位置；圖8是本發(fā)明gbhir42734及其同源基因的保守結(jié)構(gòu)域分析；圖9是本發(fā)明不同作物中32個(gè)hir蛋白進(jìn)化樹分析；圖10是本發(fā)明pbi121-unigene42734植物重組表達(dá)載體在含有卡那的lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后長(zhǎng)出白色陽(yáng)性克??；圖11是本發(fā)明pbi121-unigene42734植物重組表達(dá)載體的pcr檢測(cè)；其中，1-3為pcr產(chǎn)物，m為分子量marker；圖12是本發(fā)明含有unigene42734的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得目的基因vigs片段；其中，m為分子量marker，1-2為目的基因vigs片段；圖13是本發(fā)明重組質(zhì)粒和病毒載體trv雙酶切圖；其中，a為重組質(zhì)粒雙酶切圖，b為病毒載體trv雙酶切圖，圖a中，m為分子量marker，1-2為重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；圖b中，m為分子量marker，1為病毒載體trv雙酶切產(chǎn)物；圖14是本發(fā)明unigene4273目的基因vigs片段與病毒載體trv連接后在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中長(zhǎng)出白色克??；圖15是本發(fā)明注入含pyl156-pds載體vigs懸浮液的棉花陽(yáng)性對(duì)照植株在注射一周后變化圖；圖16是本發(fā)明注入含不同載體vigs懸浮液的棉花植株在黃萎病菌處理一周后的發(fā)病情況；(a)為注入含pyl156空載體vigs懸浮液的棉花植株，(b)為注入含pyl156-42734載體vigs懸浮液的棉花植株。具體實(shí)施方式以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中，所述百分含量如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。下述下述實(shí)施例中，所述的海島棉抗黃萎病品種3-79、陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系tm-1都來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花種子中期庫(kù)。實(shí)施例11、海島棉總rna的提取及cdna的合成：本發(fā)明采用改良的異硫氰酸胍法提取棉花子葉、下胚軸及根部的總rna，具體步驟如下：1)rna的提?。?.1)在干凈的50ml離心管中加入15ml已配好的rna提取液及150μl的β-巰基乙醇，混勻后放在冰上。1.2)先在滅菌后的研缽內(nèi)加入液氮，然后加入1.5g左右的樣品，迅速研磨成白色粉末狀，用藥匙刮下研缽上的樣品，將磨碎的樣品加入含有提取液的離心管中，混勻后加入1.5ml2mol·l-1的乙酸鈉緩沖液(ph4.2)，劇烈震蕩混勻后放冰上。1.3)等體積加入氯仿，劇烈震蕩混勻后置于冰上15min。1.4)將離心管放于低溫離心機(jī)內(nèi)，12000r·min-1，4℃離心15min，將上清液小心的轉(zhuǎn)移到另一50ml離心管中，加入等體積的氯仿，劇烈搖勻后放置冰上15min。1.5)12000r·min-1，4℃離心15min，取上清液于心的離心管中，再加入等體積冰冷的異丙醇，-20℃沉淀30min以上。1.6)12000r·min-1，4℃離心15min，離心管底部出現(xiàn)白色沉淀。倒掉上清液，加入1/3體積的提取液，充分溶解后，加入等體積的氯仿，混勻不分層，放置冰上15min。1.7)12000r·min-1，4℃離心15min，取上清液并分裝至7ml離心管中，再加入等體積的冰冷的異丙醇，-20℃沉淀30min以上。1.8)12000r·min-1，4℃離心15min，離心管底部出現(xiàn)白色沉淀，棄上清液，75％depc處理的乙醇進(jìn)行洗滌后，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，風(fēng)干。1.9)加入400μldepc水溶解rna。2)rna的純化：2.1)加入等體積的酚：氯仿(1:1)400μl，渦旋、混勻，13000r·min-1，4℃離心3min。2.2)取上清液，加入等體積的氯仿，渦旋、混勻，冰上靜置10min，13000r·min-1，4℃離心10min。2.3)取上清液，加入1/10體積2mol·l-1的乙酸鈉溶液和2.5體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min以上。13000r·min-1，4℃離心10min，2.4)棄上清，用75％depc處理的乙醇洗滌rna沉淀2次，風(fēng)干。2.5)加入30～40μl的depc水溶解rna沉淀，-70℃保存。以海島棉3-79根部組織為材料進(jìn)行總rna提取，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳顯示如圖1，rna的28s、18s、5s帶型清晰，無(wú)降解。然后使用nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna的質(zhì)量，a260/a280＝1.92，說(shuō)明無(wú)蛋白質(zhì)污染。a260/a230＝2.08，無(wú)其他雜離子殘留。因此，提取的rna的質(zhì)量和純度符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄。2、cdna的合成cdna的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara公司)。操作方法如下：步驟1：去除基因組dna反應(yīng)試劑使用量5×gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μltotalrna*1rnasefreedh2oupto10μl反應(yīng)條件：42℃2min(或者室溫5min*2)，4℃保存。步驟2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑使用量步驟1的反應(yīng)液10.0μlprimescriptrtenzymemixi1.0μlrtprimermix1.0μl5×primescriptbuffer24.0μlrnasefreedh2o4.0μltotal20μl反應(yīng)條件：37℃15min，85℃5sec，4℃保存。3、基因片段的分離與獲得為了克隆unigenes42734完整的編碼序列(codingsequence，cds)，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中unigenes序列與雷蒙德氏棉的cds數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地比對(duì)，獲得與之序列相似性最大的序列，然后以其兩端的5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，利用primer5.0設(shè)計(jì)引物，由立菲公司合成。引物如下：表1unigenes42734引物序列以海島棉3-79的cdna為模板，使用新合成的特異引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成目的片段，即unigenes42734完整的編碼序列cds。pcr反應(yīng)體系為50μl：模板cdna5μl，primer(10μmol·l-1)各1μl，2xtranstaqpcrsupermix25μl，ddh2o18μl。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，50℃30s，72℃90s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；如圖2所示，擴(kuò)增出的目的基因片段大小為1100bp,與估測(cè)的大小相符。4、目的片段膠回收若上述步驟獲得的pcr產(chǎn)物無(wú)非特異性擴(kuò)增，進(jìn)行dna純化后可直接與克隆t載體連接。若pcr擴(kuò)增獲得的目的片段有非特異性片段，則需先進(jìn)行膠回收，去除雜帶后再與t載體連接。膠回收具體步驟如下：1)使用tae緩沖液制作1.0％的瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2)在紫外燈下切出含有目的dna的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的dna部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高dna回收率。膠塊超過(guò)300mg時(shí)，請(qǐng)使用多個(gè)column進(jìn)行回收，否則嚴(yán)重影響收率。注：切膠時(shí)請(qǐng)注意不要將dna長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止dna損傷。3)切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6)的膠塊溶解時(shí)間，提高dna回收率。4)稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1mg＝1μl進(jìn)行計(jì)算。5)向膠塊中加入膠塊3倍體積的溶解液buffergm。6)均勻混合后室溫15-25℃溶解膠塊，此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分溶解(約5～10分鐘)。注：膠塊一定要充分溶解，否則將會(huì)嚴(yán)重影響dna的回收率。高濃度凝膠可以適當(dāng)延長(zhǎng)溶膠時(shí)間。7)當(dāng)凝膠完全溶解后，觀察溶膠液的顏色，如果溶膠液顏色由黃色變?yōu)槌壬蚍凵?，向上述膠塊溶解液中加入3m醋酸鈉溶液(ph5.2)10μl，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。當(dāng)分離小于400bp的dna片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20％的異丙醇。8)將試劑盒中的spincolumn安置于collectiontube上。9)將上述操作步驟7)的溶液轉(zhuǎn)移至spincolumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。注：如將濾液再加入spincolumn中離心一次，可以提高dna的回收率。10)將700μl的bufferwb加入spincolumn中，室溫12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。注：請(qǐng)確認(rèn)bufferwb中已經(jīng)加入了指定體積的100％乙醇。11)重復(fù)操作步驟10)。12)將spincolumn安置于collectiontube上，室溫12,000rpm離心1分鐘。13)將spincolumn安置于新的1.5ml的離心管上，在spincolumn膜的中央處加入30μl滅菌蒸餾水或elutionbuffer，室溫靜置1分鐘。注：將滅菌蒸餾水或elutionbuffer加熱至60℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。14)室溫12,000rpm離心1分鐘洗脫dna。15)膠回收后的目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)膠回收效率。5、目的片段與克隆t載體連接克隆t載體選用的是zerocloningvector，該載體通過(guò)自殺基因表達(dá)與否篩選陽(yáng)性重組子，當(dāng)目的片段與t載體連接成功時(shí)，阻止自殺基因正常表達(dá)，那么包含重組載體的大腸桿菌就可以正常生長(zhǎng)，當(dāng)目的片段與載體未連接成功時(shí)，自殺基因就會(huì)正常表達(dá)，包含該載體的大腸桿菌就無(wú)法正常生長(zhǎng)。該載體包含卡那霉素和氨芐青霉素兩種篩選標(biāo)記。連接體系：試劑使用量目的片段(膠回收后)4μlpeasy-t5zerocloningvector1μl輕輕混合，室溫(20℃-37℃)反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。注：a、最佳插入片段dna量載體與片段摩爾比＝1：7，可以粗略的按照“1kb20ng”的比例計(jì)算。(如1kb加20ng、1.5kb加30ng等)；b、最佳載體使用量：1μl；c、最佳反應(yīng)體系3-5μl，體積不足時(shí)可以補(bǔ)充無(wú)菌水。連接反應(yīng)時(shí)間：片段大小時(shí)間0.1-1kb5-10min1-2kb10-15min2-3kb15-20min>3kb20-30min注：片段為膠回收產(chǎn)物時(shí)，反應(yīng)時(shí)間取最大值。連接反應(yīng)的溫度：最佳連接溫度為25℃，最好采用pcr儀控溫(上蓋溫度設(shè)為40℃)。目的片段與克隆t載體連接成功后，阻止t載體上自殺基因的表達(dá)，大腸桿菌則可以正常生長(zhǎng)繁殖，如圖3為大腸桿菌在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后長(zhǎng)出的白色克隆。挑取上述白色克隆進(jìn)行pcr檢測(cè)其是否為陽(yáng)性克隆，選取陽(yáng)性克隆送去立菲公司測(cè)序，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示。6、重組t載體向大腸桿菌dh5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化1)加連接產(chǎn)物于50μldh5α感受態(tài)細(xì)胞中(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴20-30分鐘。2)42℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。3)加250μl平衡至室溫的lb液體培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)、37℃孵育1小時(shí)。4)取200μl菌液鋪板(lb固體培養(yǎng)基中加抗生素氨芐)，培養(yǎng)過(guò)夜(為得到較多克隆，4000rpm離心1min，棄掉部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜)。注：1llb培養(yǎng)基需加10g蛋白胨，5g酵母粉，10gnacl；若配制固體培養(yǎng)基需再加入15g瓊脂粉。7、陽(yáng)性重組子的鑒定和測(cè)序1)用滅菌牙簽挑取白色菌落于10μl無(wú)菌水中，渦旋混合。2)25μlpcr反應(yīng)體系中取1μl混合菌液作模板，用通用引物m13f和m13r鑒定重組子。3)pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸(根據(jù)片段的大小確定延伸時(shí)間)30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10分鐘。4)pcr產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆，加入1mllb液體培養(yǎng)基(加氨芐)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，200轉(zhuǎn)、37℃，培養(yǎng)6h后，取500μl至1.5ml離心管(用封口膜封好)送至公司測(cè)序，測(cè)序引物用通用引物m13f，m13r。8、組織特異性分析1)研究黃萎病菌誘導(dǎo)12h后棉花根、莖、子葉中基因表達(dá)特異性，總rna的提取及cdna的合成方法同上。2)熒光定量引物如表2：表2unigenes42734熒光定量引物序列3)熒光定量分析以actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，分別利用特異性引物進(jìn)行熒光定量pcr分析兩個(gè)品種根、下胚軸和子葉片組織的抗性相關(guān)基因在枯萎病病原菌誘導(dǎo)下的表達(dá)量。通過(guò)熒光定量pcr分析unigenes42734的組織表達(dá)特異性，結(jié)果如圖4所示：從unigenes42734在黃萎病菌誘導(dǎo)12h后的海島棉3-9根部組織表達(dá)量高，在陸地棉tm-1子葉中表達(dá)量最高。unigenes42734為一種植物過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)的蛋白。熒光定量分析其表達(dá)模式表明，該基因在清水對(duì)照中表達(dá)水平在4-48h一直較低，在接菌處理誘導(dǎo)4h后表達(dá)量顯著上升，在此推測(cè)，該基因在清水對(duì)照樣品中轉(zhuǎn)錄受到抑制，而在接菌的樣品中基因的表達(dá)量上升。綜上所述，該基因很有可能在棉花抗黃萎病中發(fā)揮重要的作用，因此，本實(shí)驗(yàn)克隆其完整的基因編碼區(qū)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因功能打下基礎(chǔ)。通過(guò)熒光定量pcr分析這該基因的組織特異性表達(dá)情況，結(jié)果表明，該基因在不同品種中的根、胚軸、子葉中的表達(dá)量不同。實(shí)施例2gbdrp42734基因的生物信息學(xué)分析根據(jù)unigene42734基因的注釋信息，本發(fā)明命名為gbdrp42734。1、gbdrp42734蛋白序列的理化特性分析利用computepi/mw軟件和protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)ghdrp42734蛋白序列的等電點(diǎn)和分子量及相關(guān)理化性質(zhì)，利用netphos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/netphos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，采用tmhmm軟件預(yù)測(cè)蛋白的跨膜螺旋區(qū)，采用targetp對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。用protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，在gbdrp42734蛋白中的ala、val、leu、glu、asp、gln、lys這三種氨基酸的含量最高，分別達(dá)到11.3％、9.9％、8.5％、7.4％、6.3％、6.0％、6.0％。預(yù)測(cè)結(jié)果表明帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為39個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)為33個(gè)，因此該蛋白質(zhì)帶正電。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為29.57，該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白的親疏水性平均系數(shù)(gravy)為-0.131，負(fù)值說(shuō)明蛋白親水性較強(qiáng)。利用netphos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/netphos/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果如圖5所示，ser磷酸化位點(diǎn)有3個(gè)、thr磷酸化位點(diǎn)有3個(gè)、tyr磷酸化位點(diǎn)3個(gè)。通過(guò)tmhmm軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域，如圖6所示，該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白。通過(guò)targetp軟件，分析其所在的亞細(xì)胞位置，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，也不存在葉綠體和線綠體內(nèi)，因此，推測(cè)該蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。2、染色體物理分布定位利用gbdrp42734比對(duì)棉花a組和d組基因數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得與之同源亞洲棉和雷蒙德氏棉中的hir基因，然后利用perl程序?qū)Ρ葘?duì)獲得的基因組數(shù)據(jù)的信息文件(gff3)進(jìn)行解析，然后根據(jù)hir基因在染色體上的位置信息及染色體的長(zhǎng)度信息，利用mapchart2.1繪制基因在染色體上的物理分布圖。gbdrp42734基因通過(guò)與棉花a組和d組比對(duì)，分別找到3個(gè)同源基因，如表3所示，通過(guò)computepi/mwtool軟件預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。利用mapchart2.1軟件繪制其同源基因在a組和d組染色體上的位置，如圖7所示。表3gbdrp42734基因比對(duì)二倍體棉花雷蒙德氏棉(gossypiumraimondii)和亞洲棉(gossypiumarboreum)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)3、保守結(jié)構(gòu)域分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建利用smart軟件對(duì)gbdrp42734蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，然后利用dnaman對(duì)gbdrp42734蛋白及與之同源的a組和d組中的hir蛋白進(jìn)行聯(lián)配。在uniprotkb蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋其他植物中的hir蛋白，并利用mega5.1構(gòu)建進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。利用smart軟件分析gbdrp42734及其a組和d組上同源基因的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該類蛋白均含有植物過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)的家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域spfh(stomatins、prohibitin、flo-tillins、hflk/c)結(jié)構(gòu)域和phb(prohibitinhomologues)，通過(guò)dnaman對(duì)這組同源基因進(jìn)行聯(lián)配，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明這組同源基因序列高度相似。對(duì)擬南芥(arabidopsisthaliana，arath)，玉米(maize)，水稻(oryzasativa，os)，小麥(triticumaestivum，ta)，大麥(hordeumvulgare，hv)，大豆(glycinemax，gm)，辣椒(capsicumannuum，ca)及棉花中等32個(gè)hir蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，從進(jìn)化樹中可以看出，32個(gè)hir蛋白大致劃分為3個(gè)組(group1，group2，group3)。每個(gè)組中均包含雙子葉植物和單子葉植物。推測(cè)該基因可能在單子葉和雙子葉植物分化以前的原始祖先中已經(jīng)存在。group1又可分為3個(gè)亞組，其中有5個(gè)棉花中的hir蛋白聚在一起，另兩個(gè)棉花hir蛋白cotton_a_16164和cotton_d_gene_10012947也聚在一起，第三個(gè)亞組中包含水稻的hir蛋白和玉米、大麥、小麥中hir3蛋白，此亞組中均為單子葉植物；group2也主要包含3個(gè)亞組，其中一個(gè)亞組是雙子葉植物擬南芥和大豆，另一個(gè)亞組是玉米、水稻、大麥、小麥的hir1蛋白，第三亞組是玉米、水稻、大麥、小麥的hir2基因；group3主要包含兩個(gè)亞組，其中一個(gè)包含雙子葉植物，另一個(gè)是水稻、大麥、小麥的hir4蛋白。同時(shí)從進(jìn)化樹中(圖9)還可以看出與gbdrp42734同源的棉花a組中的3個(gè)基因與d組3基因呈現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，如cotton_a_02693與cotton_d_gene_10022660高度同源，cotton_a_24778與cotton_d_gene_10021683高度同源，cotton_a_16164與cotton_d_gene_10012947高度同源。我們還可以看出hir1、hir2、hir3及hir4分別在各物種間聚集在一起，相似性較大，體現(xiàn)了該及基因家族在物種間的普遍性和保守性。通過(guò)對(duì)gbdrp42734蛋白的理化特性分析發(fā)現(xiàn)，gbdrp42734蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)ser有3個(gè)，thr有3個(gè)，tyr有3個(gè)。蛋白磷酸化是細(xì)胞內(nèi)最常見的一種蛋白修飾方式，蛋白通過(guò)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)是細(xì)胞信號(hào)傳遞中的重要環(huán)節(jié)，可以調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等。通過(guò)對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析，這兩個(gè)蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，它們均為親水性蛋白，并且通過(guò)亞細(xì)胞定位，它們均未有信號(hào)肽，因此，它們并非分泌蛋白，并且也不存在線粒體和葉綠體中，推測(cè)它們應(yīng)該是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用的一類蛋白。實(shí)施例3gbdrp42734轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)分析1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物的設(shè)計(jì)本發(fā)明采用in-fusion技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，該技術(shù)是在克隆引物的兩端分別引入與表達(dá)載體插入位點(diǎn)兩端各15個(gè)堿基，然后通過(guò)同源融合，使目的基因正確插入植物表達(dá)載體中。根據(jù)gbdrp42734基因的非編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，在特異性上下游引物5’端各加上15個(gè)堿基，15個(gè)堿基分別為bamhi和saci酶切位點(diǎn)兩側(cè)的15個(gè)堿基。在線設(shè)計(jì)引物網(wǎng)址為http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertpcrprimersinit.do引物序列見下表4。表4用于擴(kuò)增gbdrp42734基因編碼區(qū)的引物序列2)gbdrp42734基因編碼區(qū)的獲得以海島棉3-79的cdna為模板，以上步驟設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行pcr，擴(kuò)增出uingene42734基因的cds編碼區(qū)。pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同第三章基因克隆。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，若沒(méi)有雜帶，則可以經(jīng)過(guò)純化后直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；若有雜帶，則需要先進(jìn)行膠回收。步驟與同源序列克隆時(shí)膠回收過(guò)程。3)pbi121-gbdrp42734植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建首先用限制性內(nèi)切酶bamhi和xhoi雙酶切植物表達(dá)載體pbi121，將載體中g(shù)us基因酶切下來(lái)，酶切體系共50μl如下：sacⅰ1μl，bamhⅰ1μl，pbi12120μl，10xnebuffer5μl，滅菌水23μl。反應(yīng)時(shí)間3h或過(guò)夜，反應(yīng)溫度37℃。然后將上步擴(kuò)增出的目的片段同酶切后的表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接體系如下：5xin-fusionhdenzymepremix1μl，酶切后的121表達(dá)載體1μl，目的片段3μl。反應(yīng)條件：50℃15min(推薦pcr儀控溫，上蓋55℃)，然后置于冰上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，經(jīng)卡那霉素(kan)篩選后，挑取生長(zhǎng)良好的克隆進(jìn)行pcr檢測(cè)。pcr檢測(cè)時(shí)用的引物為35s和nosr，構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為pbi121-42734。4)農(nóng)桿菌lba4404感受態(tài)的制備4.1)挑取lba4404單菌落在1mllb培養(yǎng)基，28℃，200rpm，過(guò)夜培養(yǎng)。4.2)取2ml農(nóng)桿菌加入50mllb培養(yǎng)基，28℃，200rpm，培養(yǎng)至od值為0.5-0.8。5000rpm4℃離心5min。4.3)用10ml冰冷的0.15mnacl懸浮細(xì)胞，5000rpm4℃離心5min。4.4)用1ml冰冷的20mmcacl2在冰上懸浮，加75ul7％的dmso(每1ml加75ul)4.5)每管100ul分裝，-70℃保存。5)重組表達(dá)載體pbi121-uingene42734轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟如下：5.1)取感受態(tài)細(xì)胞50ul,冰上解凍，然后加入2-3ug重組質(zhì)粒(6-10ul)，冰上30min。5.2)液氮冷卻1min，37℃水浴4min，冰上2min。5.3)重復(fù)步驟2一次，加1mllb，28℃200rpm搖菌4-6h。5.4)離心后去掉上清，保留200ul，懸浮菌體，涂lb板(加卡那和利福平)，鋁箔紙包裹，28℃暗培養(yǎng)兩天。5.5)挑取單克隆，用通用引物35s和nosr進(jìn)行pcr檢測(cè)。6)pbi121-gbdrp42734植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建目的片段與酶切好的pbi12載體進(jìn)行融合連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α后，在含有卡那的lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后長(zhǎng)出白色克隆，如圖10所示。挑取單克隆進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，結(jié)果如圖11所示，片段大小均為預(yù)期大小?？梢赃M(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌實(shí)驗(yàn)。2、vigs載體pyl156-42734的構(gòu)建本發(fā)明選擇的病毒載體為煙草脆裂病毒trv，載體選用pyl156載體。1)引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)要求目的片段大小300-500bp，且選擇的酶切位點(diǎn)必須是病毒載體上含有，但目的片段上不含有，本實(shí)驗(yàn)選擇的酶切位點(diǎn)為酶切位點(diǎn)選擇bamh1和xho1，上下游引物5，端加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物為表5用于擴(kuò)增目的基因vigs片段的引物序列2)擴(kuò)增目的基因vigs片段以含gbdrp42734cds的重組質(zhì)粒模板，及合成的特異性引物pcr擴(kuò)增出目的片段。pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同上述獲得目的基因時(shí)的程序。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，若沒(méi)有雜帶，則可以經(jīng)過(guò)純化后直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；若有雜帶，則需要先進(jìn)行膠回收。步驟同上。3)pyl156-42734載體的構(gòu)建將上步目的片段首先連接到克隆載體t5上，構(gòu)建中間重組質(zhì)粒t5-42734，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α，送至公司測(cè)序。然后提取大腸桿菌中的重組質(zhì)粒，再用xhoⅰ和bamhⅰ對(duì)其雙酶切，得到兩端具有粘性末端的目的基因，并和同樣酶切的trv載體用t4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，經(jīng)卡那霉素篩選后，挑取生長(zhǎng)良好的克隆進(jìn)行pcr檢測(cè)和酶切鑒定。最后構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為pyl156-42734。雙酶切體系共50ul：10*kbuffer5ul，bamhⅰ1ul，xhoⅰ1ul，載體(質(zhì)粒)20ul，滅菌ddh2o23ul。連接過(guò)程：將質(zhì)粒載體dna與插入dna片段混合制備成體積為5-10μl的dna溶液。載體dna和插入dna的摩爾數(shù)比一般為：0.03pmol：0.03-0.3pmol。向上述dna溶液中加入等體積(5-10μl)的solutioni，充分混勻。16℃反應(yīng)30分鐘。3、pyl156-42734載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv31011)重組質(zhì)粒的提取提取方法同質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明。2)農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)的制備制備感受態(tài)操作方法同同制農(nóng)桿菌lba4404。3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的步驟。3.1)準(zhǔn)備超凈工作臺(tái)、常溫離心機(jī)、28度恒溫?fù)u床及培養(yǎng)基、37°水浴鍋、滅菌槍頭、無(wú)菌玻璃珠、黑色塑料布、液氮、冰塊。3.2)自-80℃冰箱取出感受態(tài)，冰浴緩慢融化約10min待待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒同樣于冰浴中冷卻。3.3)用預(yù)冷的槍頭將2-5ug質(zhì)粒加入剛?cè)诨母惺軕B(tài)中，輕輕彈碰混勻后水浴30min；3.4)液氮冷凍處理1-3min，37度快速熱激3-5min，迅速與冰浴中放置約2min，重復(fù)該步驟；3.5)加1000微升空白lb培養(yǎng)液，封口膜封口，28℃，180rpm，活化4-6h；3.6)5000rpm離心2min富集菌液，棄去上層多余培養(yǎng)基，管內(nèi)余約200微升，無(wú)菌槍頭緩慢吹打至沉沉菌重現(xiàn)懸浮；3.7)在超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干三抗板，用無(wú)菌的玻璃珠或涂抹棒將菌液均勻涂布與平板上，風(fēng)干，封口；3.8)用黑色塑料布遮光，倒置，28℃培養(yǎng)24h左右；3.9)挑取單菌落用于擴(kuò)搖、檢測(cè)、保存等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以含有g(shù)bdrp42734cds的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得目的片段，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，如圖12和13所示，可知其片段大小符合要求，膠回收后可以進(jìn)行下一步的連接轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。先將vigs片段與t5載體構(gòu)建中間重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α后，將陽(yáng)性克隆送去公司測(cè)序檢測(cè)，將含有目的片段的重組質(zhì)粒提取出來(lái)，用xhoⅰ和bamhⅰ分別雙酶切重組質(zhì)粒和病毒載體trv，然后將二者用t4連接酶連接起來(lái)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α，在含有卡那霉素的lb中過(guò)夜培養(yǎng)，長(zhǎng)出白色克隆如圖14所示。4、vigs棉花植株的獲得本發(fā)明采用pyl156-pds載體使植物中的葉綠體基因沉默表達(dá)，出現(xiàn)白化葉片，作為陽(yáng)性對(duì)照。pyl156空載體作為陰性對(duì)照。1)包含pyl156-42734、pyl156-pds、pyl156-192及pyl156空載體的農(nóng)桿菌分別在含有卡那霉素(50ug/ml)、慶大霉素(50ug/ml)、利福平(25ug/ml)的lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)，活化菌體后，培養(yǎng)至od＝1.5。2)4000rp離心5min。3)用vigs懸浮液將菌液調(diào)至od＝1.5。25℃靜置4h后，將pyl156-42734、pyl156-pds、pyl156空載體vigs懸浮液分別于pyl156-192的vigs懸浮液1:1混合。4)用無(wú)菌注射器對(duì)生長(zhǎng)10天左右的棉花子葉注射，將vigs液體打滿棉花子葉的下面。5)將注射后的棉花幼苗在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5、gbdrp42734基因功能的鑒定1)棉花注射vigs液體約一周后，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)白化葉片時(shí)，對(duì)棉花幼苗進(jìn)行接菌處理。2)黃萎病菌選用大麗輪枝菌vd080(朱荷琴老師惠贈(zèng))，在查氏液體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)10d，溫度25℃、轉(zhuǎn)速150r·min-1。稀釋至孢子數(shù)2×107個(gè)·ml-1。3)待棉花發(fā)病，根據(jù)棉花的發(fā)病情況，初步鑒定目的基因在棉花黃萎病抗性中發(fā)揮的作用。含注入含pyl156-pds載體vigs懸浮液的棉花植株在注射一周后真葉逐漸白化，如圖15所示，黃萎病菌處理一周后，初顯病癥，棉花真葉的葉緣開始變黃、變脆，并向下卷曲。發(fā)病情況如圖所示。圖16分別為含pyl156空載體、pyl156-42734的vigs海島棉3-79植株，可以看出，pyl156-42734的vigs植株中個(gè)別真葉開始顯病癥，而pyl156空載體植株未發(fā)現(xiàn)病癥。pyl156-4273的vigs陸地棉tm-1中，幾乎所有真葉均出現(xiàn)葉緣變黃卷曲且發(fā)脆的病癥，而pyl156空載體植株發(fā)病真葉相對(duì)較少?？傮w來(lái)看，陸地棉tm-1比海島棉3-79的的發(fā)病情況較重。通過(guò)構(gòu)建vigs載體注射棉花子葉后，待陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)白化性狀時(shí)開始進(jìn)行黃萎病菌誘導(dǎo)處理，接菌一周后逐漸開始顯病癥。從棉花的發(fā)病情況可以看出，不論是在海島棉3-79還是在陸地棉tm-1中，pyl156-42734的vigs植株發(fā)病情況均比pyl156空載體vigs植株嚴(yán)重。說(shuō)明gbdrp42734基因沉默表達(dá)后對(duì)黃萎病菌抗性減弱，初步驗(yàn)證gbdrp42734基因?qū)γ藁S萎病的抗性有一定的作用。并且還可以明顯看出，陸地棉tm-1比海島棉3-79的發(fā)病情況較重，由此可以看出海島棉3-79對(duì)黃萎病的抗性明顯高于陸地棉tm-1，并且可以推測(cè)，這兩類基因在陸地棉中對(duì)黃萎病菌的抗性也起著非常重要的作用。上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種棉花gbdrp42734基因、編碼蛋白及應(yīng)用<130>2017<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>855<212>dna<213>海島棉<400>1atgggtaatcttttctgttgtgtacaagttgaccagtctacagtagccattaaggagaga60tttggcaggtttgaggatgttcttgaacctggatgccattgcctaccttggtttcttgga120agtcaacttgctggccacctgtcgctaagattgcagcagttggatgttcgttgtgaaacc180aagactaaggacaatgtatttgttaatgttgttgcatctattcaataccgggcactggca240gacaaggcaagtgatgccttttacaagctgacaaacacaaggacacaaattcaagcctat300gtgtttgatgttattagagcaagtgttccgaagctaaatctggatgatgtttttgaacaa360aagactgaaattgctaaagctgttgaagaagaacttgagaaggctatgtctgcctatggg420tatgagattgttcaaacacttattgtggacatagaacctgacgagcatgtgaagcgtgcg480atgaatgaaattaatgccgctgcaaggctgagagtggcagctaatgagaaggcagaggct540gagaaaattttgcaaatcaaacgagctgaaggtgaggctgagtccaaatatttgtcaggg600ctgggtatcgctcgccaacgacaagcaattgttgatggtttgcgagatagcgtgcttgga660ttctccgttaatgtcccggggactactgcaaaggatgttatggatatggtcctggttacc720cagtactttgacaccatgaaagaaattggtgctgcttctaagtcctcagctgtgtttatc780cctcatggtcctggagctgttcgtgatgtcgctactcagattcgtgatggactcctccag840gccacacaccagtaa855<210>2<211>284<212>prt<213>海島棉<400>2metglyasnleuphecyscysvalglnvalaspglnserthrvalala151015ilelysgluargpheglyargphegluaspvalleugluproglycys202530hiscysleuprotrppheleuglyserglnleualaglyhisleuser354045leuargleuglnglnleuaspvalargcysgluthrlysthrlysasp505560asnvalphevalasnvalvalalaserileglntyrargalaleuala65707580asplysalaseraspalaphetyrlysleuthrasnthrargthrgln859095ileglnalatyrvalpheaspvalileargalaservalprolysleu100105110asnleuaspaspvalphegluglnlysthrgluilealalysalaval115120125gluglugluleuglulysalametseralatyrglytyrgluileval130135140glnthrleuilevalaspilegluproaspgluhisvallysargala145150155160metasngluileasnalaalaalaargleuargvalalaalaasnglu165170175lysalaglualaglulysileleuglnilelysargalagluglyglu180185190alagluserlystyrleuserglyleuglyilealaargglnarggln195200205alailevalaspglyleuargaspservalleuglypheservalasn210215220valproglythrthralalysaspvalmetaspmetvalleuvalthr225230235240glntyrpheaspthrmetlysgluileglyalaalaserlysserser245250255alavalpheileprohisglyproglyalavalargaspvalalathr260265270glnileargaspglyleuleuglnalathrhisgln275280<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3ctgcttcttctccttcttcctct23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cacgaaccgtttatgcccac20<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5agagatttggcaggtttgaggat23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6gtttgtcagcttgtaaaaggcat23<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列<400>7ggactctagaggatccctgcttcttctccttcttcctct39<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列<400>8gatcggggaaattcgagctccacgaaccgtttatgcccac40<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9cgggatcccgcttcacatgctcgtc25<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<400>10ccctcgaggatgccattgcctacctt26當(dāng)前第1頁(yè)12