本發(fā)明是申請(qǐng)日為2010年6月10日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080035446.8，標(biāo)題為“用于棉花中基因功能性分析的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年6月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/185,631的權(quán)益，在此通過(guò)引用將其并入本申請(qǐng)。序列表提交本申請(qǐng)與電子形式的序列表一起提交。序列表名稱為2577_195pct_sequence_listing.txt，于2010年6月3日創(chuàng)建。在此通過(guò)引用將電子形式序列表中的信息并入本申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及在基因組規(guī)模上功能性分析棉花基因的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)在基因組規(guī)模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本發(fā)明還涉及用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體和用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的方法。本文所用的出版物和其它材料是用于說(shuō)明本發(fā)明的背景，或提供與實(shí)踐有關(guān)的額外細(xì)節(jié)，它們?cè)诖嗽尤肭曳謩e列在參考書(shū)目中供參考。棉花(棉屬(gossypiumspp.))是世界上最重要的纖維植物和重要的油料作物，其生長(zhǎng)在超過(guò)80個(gè)國(guó)家中，在2006/2007生長(zhǎng)季節(jié)世界產(chǎn)量的記錄是122,000,000(480磅/包)(美國(guó)農(nóng)業(yè)部海外局)。消費(fèi)量與產(chǎn)量之間的逆差發(fā)生在1994/1995年，預(yù)期在2009/2010生長(zhǎng)季節(jié)將持續(xù)增加至2,500,000(480磅/包)(unitedstatesdepartmentofagriculture–foreignagriculturalservice[usda–fas]2009)。棉花生產(chǎn)為約100,000,000名農(nóng)民帶來(lái)收入，且約150個(gè)國(guó)家參與到棉花進(jìn)口和出口(leeetal.,2007)。估計(jì)世界范圍內(nèi)其經(jīng)濟(jì)影響為約$5,000,000,000,000/年。而且，改進(jìn)食物和飼料用的棉花種子能夠顯著提高食物挑戰(zhàn)型經(jīng)濟(jì)中數(shù)百萬(wàn)人的營(yíng)養(yǎng)和生計(jì)。棉花也是可再生生物燃料的潛在候選植物。棉花纖維由近乎純的纖維素組成。與木質(zhì)素相比，纖維素易于轉(zhuǎn)化為生物燃料。最佳的棉花纖維生產(chǎn)和加工將確保這種天然可再生的產(chǎn)品相比于源自石油的合成不可再生纖維更有競(jìng)爭(zhēng)力，以確保更加可持續(xù)的發(fā)展。為了解決上述問(wèn)題，棉花的許多農(nóng)藝學(xué)性質(zhì)，如纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)度、農(nóng)業(yè)產(chǎn)率、耐旱性和抗害蟲(chóng)性需要通過(guò)可利用的遺傳資源和鑒定基因功能的快速方法來(lái)增強(qiáng)(udalletal.,2006)。棉花是廣泛生長(zhǎng)且用于生產(chǎn)天然織物纖維和棉花籽油的重要作物。棉花纖維是用于研究細(xì)胞伸長(zhǎng)以及細(xì)胞壁和纖維素生物合成的模型系統(tǒng)。此外，棉花纖維是單細(xì)胞，因此細(xì)胞伸長(zhǎng)可獨(dú)立于細(xì)胞分裂來(lái)評(píng)價(jià)。將棉花纖維用作植物發(fā)育的模型系統(tǒng)的最顯著優(yōu)點(diǎn)之一是beasley和ting在1973年對(duì)棉花胚珠的培養(yǎng)方法進(jìn)行了優(yōu)化。棉花屬包括約45個(gè)二倍體(2n＝2x＝26)和5個(gè)四倍體(2n＝4x＝52)的物種，它們?nèi)匡@示出二體遺傳模式。盡管也在一定程度上使用其它三種物種，海島棉(gossypiumbarbadense)(四倍體)、亞洲棉(gossypiumarboretum)(二倍體)和草棉(gossypiumherbaceum)(二倍體)，但最普遍的棉花變種是陸地棉(gossypiumhirsutum)(陸地棉，四倍體)的形式，其占世界范圍內(nèi)每年棉花作物的約95％。其它這三類物種也是重要的遺傳資源，為專門育種目的提供了基因庫(kù)。例如，對(duì)生物和非生物脅迫具有高抗性的草棉可被用作與陸地棉進(jìn)行種間雜交以改善其對(duì)各種脅迫抗性的良好起始遺傳材料。因此，也十分需要在棉屬和親緣植物中進(jìn)行基因功能性分析的獨(dú)立于物種的方法。目前，棉花全基因組測(cè)序剛剛開(kāi)始。同時(shí)，不斷增加的棉屬est序列(目前約400,000個(gè))組和源自在一系列生長(zhǎng)條件下由各種組織和器官構(gòu)建的不同文庫(kù)的非冗余基因(unigene)組可在網(wǎng)絡(luò)上以及通過(guò)基于這些序列的微陣列分析來(lái)獲得(udalletal.,2006)。其它植物基因組序列的可用性起到在棉花est數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定和注解假定的直系同源物的有用平臺(tái)的作用。雖然可從棉花纖維差異以及葉毛狀體和次生木質(zhì)部細(xì)胞形成之間說(shuō)明相似性，但最終需要在棉花中直接檢測(cè)假定的直系同源基因的功能。此外，已知棉花纖維表達(dá)在其它植物中尚無(wú)已知同源物的基因，這些基因賦予了一些獨(dú)特的纖維性質(zhì)。即使一些轉(zhuǎn)錄因子基因的功能已在擬南芥(arabidopsis)中測(cè)試，但它們的確切功能仍需要在同源棉花植物中進(jìn)一步確認(rèn)。鑒定棉屬的農(nóng)藝學(xué)和品質(zhì)性狀的重要方法是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化入棉花。然而，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的棉花植物的低效生產(chǎn)限制了大規(guī)?；蜩b定。而且，此過(guò)程費(fèi)力且耗時(shí)，不適用于基因組規(guī)模上的高通量分析。而且，僅有少量栽培品種可用作轉(zhuǎn)化的宿主。通常，難以通過(guò)在棉花中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化來(lái)從良好的起始遺傳材料中直接鑒定重要的遺傳元件。因此，希望開(kāi)發(fā)出在基因組規(guī)模上獨(dú)立于物種的棉屬基因高通量功能性分析的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在棉花(棉屬)植物中直接操作靶基因表達(dá)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及在全部棉花物種和種質(zhì)，特別是在四倍體棉花，如陸地棉(gossypiumhirsutum)和海島棉(gossypiumbarbadense)，二倍體棉花，如草棉(gossypiumherbaceum)和亞洲棉(gossypiumarboretum)，以及源自種內(nèi)和種間雜交的種質(zhì)中調(diào)節(jié)或抑制一種或多種靶基因表達(dá)的方法。所述方法已對(duì)屬于若干功能性種類的基因，包括參與發(fā)育、小rna途徑和次級(jí)代謝生物合成的轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行了測(cè)試。特別預(yù)期本發(fā)明的方法和組合物可用于棉花基因的功能性分析中。本發(fā)明涉及在基因組規(guī)模上功能性分析棉花基因的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)在基因組規(guī)模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本發(fā)明還涉及用于在棉花植物和植物組織中瞬時(shí)表達(dá)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體和用于在棉花植物和植物組織中瞬時(shí)表達(dá)基因的方法。本發(fā)明涉及vigs在可靠且快速和以高通量方式評(píng)價(jià)棉花(棉屬)植物和植物組織基因功能中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供了用于在棉花(如陸地棉)中進(jìn)行vigs的高效和可再生的系統(tǒng)以及方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了煙草脆裂病毒(trv)全病毒基因組的進(jìn)一步再合成。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于全基因組功能性分析的快速沉默方法。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了trvvigs系統(tǒng)在克隆和功能性鑒定若干功能性種類基因中的應(yīng)用。這些重要的基因可用于改進(jìn)棉花農(nóng)藝學(xué)性狀，如抗害蟲(chóng)性。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含trvrna2的載體和包含trvrna1的載體為合成的植物載體。在另一實(shí)施方式中，trvrna2包含能夠沉默第一目標(biāo)基因的第一沉默序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的有義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的反義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rna干擾(rnai)的短發(fā)夾rna(shrna)。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rnai的前體微小rna(mirna)或mirna的序列。在另一實(shí)施方式中，核酸進(jìn)一步包含能夠沉默第二目標(biāo)基因的第二沉默序列。在另一實(shí)施方式中，核酸包含能夠沉默大于兩個(gè)目標(biāo)基因的大于兩種沉默序列。在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)楹蜻x轉(zhuǎn)錄因子基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槿~綠素或類胡蘿卜素生物合成中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)轭慄S酮生物合成途徑中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)樵ㄉ睾突ㄉ厣锖铣赏緩街械暮蜻x基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維發(fā)育中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維起始、伸長(zhǎng)、次生壁沉積、成熟或種子發(fā)育中的候選基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)樾na(smrna)生物合成中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)榇渭?jí)代謝毒劑生物合成中的候選基因，且對(duì)植物抗生物脅迫也很重要。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)榕c細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞壁生物合成和纖維素生物合成相關(guān)的候選基因。因此，第一方面，本發(fā)明提供了在棉花中進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)的方法。根據(jù)此方面，所述方法包括：(a)將包含能夠沉默第一目標(biāo)基因的第一沉默序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列的載體中，以產(chǎn)生修飾型trvrna2載體；(b)制備農(nóng)桿菌(agrobacterium)的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有修飾型trvrna2載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織以產(chǎn)生受感染的植物組織；和(d)使受感染的植物組織生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以誘導(dǎo)第一目標(biāo)基因的基因沉默。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物或棉花幼苗。在此實(shí)施方式中，受感染的植物在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的植物在步驟(d)中生長(zhǎng)。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花胚珠在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花胚珠在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花纖維在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花纖維在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在另一方面，本發(fā)明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根據(jù)此方面，所述方法包括：(a)將包含能夠沉默候選基因的沉默序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列的載體中，以產(chǎn)生修飾型trvrna2載體；(b)制備農(nóng)桿菌(agrobacterium)的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有修飾型trvrna2載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織以產(chǎn)生受感染的植物組織；(d)使受感染的植物組織生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以誘導(dǎo)候選基因的基因沉默；和(e)分析所沉默的候選基因?qū)κ芨腥镜闹参锝M織的表型影響。在此第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物或棉花幼苗。在此實(shí)施方式中，受感染的植物在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的植物在步驟(d)中生長(zhǎng)。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花胚珠在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花胚珠在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花纖維在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花纖維在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在另一方面，本發(fā)明提供了用于在棉花植物或棉花組織中瞬時(shí)表達(dá)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體和方法。根據(jù)此方面，瞬時(shí)表達(dá)載體包含trvrna2序列和至少一個(gè)拷貝的強(qiáng)亞基因組啟動(dòng)子，以及任選存在地包含第一感興趣的序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子能夠被trv復(fù)制酶識(shí)別。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為強(qiáng)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子源自煙草脆裂病毒組，而非trv。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為合成的豌豆早枯病毒(pebv)亞基因組啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為辣椒環(huán)斑病毒(peprsv)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。用于在棉花中瞬時(shí)表達(dá)的感興趣的核酸插入在亞基因組啟動(dòng)子的下游，且可操縱地連接于此啟動(dòng)子。根據(jù)此方面，用于在棉花組織中瞬時(shí)表達(dá)感興趣的核酸的方法包括：(a)將包含待在棉花植物中表達(dá)的第一感興趣的序列的核酸插入瞬時(shí)表達(dá)載體中，以產(chǎn)生trvrna2表達(dá)載體，所述瞬時(shí)表達(dá)載體包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列和至少一個(gè)拷貝的強(qiáng)亞基因組啟動(dòng)子，其中所述核酸可操縱地連接于所述亞基因組啟動(dòng)子；(b)制備農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有trvrna2表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織；和(d)使受感染的植物生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以瞬時(shí)表達(dá)目標(biāo)基因。在此另一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花幼苗。在此另一方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此另一方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物。在另一實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在另一方面，本發(fā)明提供了修飾型trvrna1載體。根據(jù)此方面，修飾型trvrna1載體包含已插入至少一個(gè)內(nèi)含子的trvrna1序列。在另一方面，修飾trvrna基因組以去除假定的內(nèi)含子樣特征和潛在的問(wèn)題區(qū)域，如長(zhǎng)的富含胸腺嘧啶的序列。此修飾型trvrna1載體可用于在任何上述方法中替換含trvrna1的載體。附圖說(shuō)明圖1：根據(jù)本發(fā)明的用于棉花瞬時(shí)表達(dá)的方法。瞬時(shí)表達(dá)可用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)或基因表達(dá)。圖2：用一個(gè)內(nèi)含子插入進(jìn)行trvrna1修飾的示意圖。圖3a-3c：棉酚生物合成基因的沉默。圖3a：用對(duì)照和pstrv2:cad感染的棉花植物的表型。圖3b：使用從處理植物的上部葉提取的總rna進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr。實(shí)時(shí)pcr分析顯示cad轉(zhuǎn)錄物水平在系統(tǒng)葉中顯著降低。圖3c：來(lái)自cad沉默的棉花葉的棉酚和相關(guān)倍半萜化合物的hplc色譜。ck：載體對(duì)照感染的；cad，來(lái)自杜松烯合酶表達(dá)沉默的植物中的葉子。叔丁基蒽醌被用作內(nèi)標(biāo)。圖4a-c：vigs對(duì)一種葉綠素生物合成基因鎂螯合酶ch42基因的影響和對(duì)胡蘿卜素生物合成基因八氫番茄紅素去飽和酶(pds)基因的影響。將攜帶pstrv1或pstrv2(載體對(duì)照1+2(圖4a)或核對(duì)物(check)(圖4b)、pstrv2:ch42(圖2a和2b)、pstrv2:pds(圖2a))的根瘤農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)株的培養(yǎng)物以1:1的比例混合。使混合培養(yǎng)物真空進(jìn)入2-3葉齡植物期的陸地棉植物。圖4a：在接種后(dpi)14天采集的棉花葉；圖4b：棉花芽和45dpi采集的棉花葉。ch42酶負(fù)責(zé)在葉綠素生物合成期間將mg加入卟啉環(huán)中。ch42基因的沉默阻礙了新生葉中葉綠素合成，這些新生葉喪失了它們的綠色，但因存在類胡蘿卜素而顯出黃色。圖4c：定量rt-pcr分析，以確定在ch42處理的棉花新生葉中沉默的陸地棉ch42rna水平，和在pds處理的棉花新生葉中陸地棉pdsrna水平。數(shù)值代表來(lái)自具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)時(shí)pcr分析顯示ch42和pds轉(zhuǎn)錄物水平在系統(tǒng)葉中顯著降低。圖5a-c：vigs系統(tǒng)不但在四倍體棉花陸地棉中起作用，而且也在二倍體棉花亞洲棉(圖a、圖b)和草棉(圖c)中起作用。圖6：預(yù)測(cè)的假定的棉花as1(ghas1)蛋白(seqidno:18)與擬南芥as1(atas1(genbank登錄號(hào)：nm_129319；seqidno:19))、普通煙(nicotianatabacum)as1(ntas1(genbank登錄號(hào)：ay559043；seqidno:20))和小翠云(selaginellakraussiana)arp(skarp(genbank登錄號(hào)：ay667452；seqidno:21))的氨基酸序列比較。格式為clustalw產(chǎn)生的比對(duì)圖，共有序列(seqidno:22)列在下方。在保守的r2r3myb結(jié)構(gòu)域下方劃線。圖7a-7h：轉(zhuǎn)錄因子as1的沉默。圖7a-7d：pstrv2:as1感染的棉花植物的表型。圖7f和7g：pstrv2:as1感染的棉花植物的掃描電鏡圖。圖9h：使用從處理植物的上部葉提取的總rna進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr。實(shí)時(shí)pcr分析顯示as1轉(zhuǎn)錄物水平在系統(tǒng)葉中顯著降低。pb：主要葉片；eb：異位葉片；ebad：近軸的異位葉片；ebab：遠(yuǎn)軸的異位葉片。ck：受感染的載體對(duì)照；as1，來(lái)自as1表達(dá)沉默的植物的葉。圖8a-8c：pstrv2:ago1感染的棉花植物的表型。pb：主要葉片；eb：異位葉片。圖9a和9b：棉花葉中花色素和原花色素生物合成基因ans和anr的沉默。圖9a：pstrv2:ans或strv2:anr感染的棉花植物的表型顯示出對(duì)葉、葉柄和芽的影響。圖9b：使用從處理植物的上部葉提取的總rna進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr。實(shí)時(shí)pcr分析顯示anr和ans轉(zhuǎn)錄物水平在系統(tǒng)葉中顯著降低。ck：受感染的載體對(duì)照；anr，來(lái)自anr表達(dá)沉默的植物的葉；ans，來(lái)自ans表達(dá)沉默的植物的葉。圖10：棉花皮中花色素和原花色素生物合成基因ans和anr的沉默。圖11：不同棉花器官中花色素和原花色素生物合成基因ans和anr的沉默。圖12：棉花芽中花色素和原花色素生物合成基因ans和anr的沉默。圖13a-13n：在pstrv2:an處理的植物中，在棉花葉(圖13a和13b)、花芽和花球(圖13d、13f、13h、13j、13l和13n)中，以及在對(duì)照植物的棉花花芽和花球中(圖13c、13e、13g、13i、13k和13m)，ctbp直系同源基因an的沉默。圖14：ctbp直系同源基因an在棉花胚珠和纖維中的沉默。ck：受感染的載體對(duì)照；anr，來(lái)自an表達(dá)沉默的植物的葉。圖15：棉花ctbp直系同源基因an在棉花纖維起始中起重要作用。1+2：受感染的載體對(duì)照；an，來(lái)自an表達(dá)沉默的植物的葉。圖16a和16b：ctbp直系同源基因an在棉花系統(tǒng)葉(圖16a)和胚珠(圖16b)中的沉默。實(shí)時(shí)pcr分析顯示an轉(zhuǎn)錄物水平在系統(tǒng)葉和胚珠中均顯著降低。ck：受感染的載體對(duì)照；an，來(lái)自an表達(dá)沉默的植物的葉。圖17a-j：細(xì)胞骨架基因katanin(ktn)在棉花中的沉默。圖17a：載體對(duì)照處理的植物中的表型影響；圖17b：pstrv2:ktn處理的植物中的表型影響；圖17d、17f、17h和17j：pstrv2:ktn處理的植物的花芽和花球中的表型影響；圖17c、17d、17g和17i：對(duì)照植物的花芽和花球中的表型影響。圖18：ktn是棉花纖維伸長(zhǎng)的必需基因。圖19：ktn在葉毛狀體長(zhǎng)度和模式中起作用。圖20a-20e：pstrv2:gfp感染的植物。圖20a：空載體感染的植物的表型。圖20b-20d：pstrv2:gfp感染的植物的表型。圖20e：pstrv2:gfp感染的植物的蛋白印跡。上欄：用抗gfp抗體檢測(cè)的gfp蛋白。下欄：用作為上樣對(duì)照的考馬斯亮藍(lán)染色的rbcl帶。欄1：空載體；欄2-4：pstrv2:gfp進(jìn)入的3種獨(dú)立植物。圖21a和21b：棉花胚珠培養(yǎng)物。圖21a：bt培養(yǎng)基中的2周齡培養(yǎng)物。圖21b：體外胚珠培養(yǎng)物上的纖維長(zhǎng)度。圖22a和22b：棉花中肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)。圖22a：pstrv1+pstrv2處理的胚珠。全部胚珠能夠很好地生長(zhǎng)為纖維。圖22b：pstrv1+pstrv2:actin1處理的胚珠。雖然胚珠能夠生長(zhǎng)為纖維，但此纖維比對(duì)照纖維短。圖23a-23l：vigs-ghactin1、vigs-ghadf1和pstrv1+pstrv2的胚珠表面的掃描電鏡圖。圖23a-23d：在0(圖23a)、1(圖23b)和2(圖23c、圖23d)dpa時(shí)，pstrv1+pstrv2感染的胚珠，以及在感染后1(圖23a、圖23b、圖23c)和2(圖23d)天掃描的胚珠。注意到，纖維長(zhǎng)度隨時(shí)間增加。圖23e-23h：在0(圖23e)、1(圖23f)和2(圖23g、圖23h)dpa時(shí)，pstrv1+pstrv2:actin1感染的胚珠，以及在感染后1(圖23e、圖23f、圖23g)和2(圖23h)天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度短，毛狀體的表面粗糙且褶皺。圖23i-23l：在0(圖23i)、1(圖23j)和2(圖23k、圖23l)dpa時(shí)，pstrv1+pstrv2:ghadf1感染的胚珠，以及在感染后1(圖23i、圖23j、圖23k)和2(圖23l)天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2的纖維長(zhǎng)度相同。圖24a-24c：vigs-ghctr1、vigs-ghdella1和pstrv1+pstrv2的胚珠表面的掃描電鏡圖。圖24a：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。圖24b：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:ghctr1感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度比相同時(shí)期strv1+strv2的纖維長(zhǎng)度短。圖24c：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:ghdella1感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2的纖維長(zhǎng)度相同。圖25a-25c：vigs-ghalpha-tubulin1、vigs-ghbeta-tubulin1和pstrv1+pstrv2的胚珠表面的掃描電鏡圖。圖25a：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。圖25b：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:ghalpha-tubulin1dpa感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。注意到毛狀體的表面粗糙且褶皺。圖25c：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:adfghbeta-tubulin1感染的胚珠和在感染后1天掃描的胚珠。注意到毛狀體的表面粗糙且褶皺。圖26a-26d：vigs-ghmads9、vigs-ghmby5、vigs-ghmby6和pstrv1+pstrv2的胚珠表面的掃描電鏡圖。圖26a：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2感染的胚珠和在感染后3天掃描的胚珠。圖26b：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:ghmads9感染的胚珠和在感染后3天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度比相同時(shí)期strv1+strv2的纖維長(zhǎng)度長(zhǎng)。圖26c：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:adfghmyb5感染的胚珠和在感染后3天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2的纖維長(zhǎng)度相同。圖26d：在1dpa時(shí)pstrv1+pstrv2:adfghmyb6感染的胚珠和在感染后3天掃描的胚珠。注意到纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期strv1+strv2的纖維長(zhǎng)度相同。圖27a和27b：棉花纖維中g(shù)hactin1基因表達(dá)的rt-pcr分析。圖27a：將作為rna標(biāo)準(zhǔn)的微管蛋白基因用作對(duì)照。圖27b：棉花纖維中g(shù)hactin1基因表達(dá)。rt-pcr結(jié)果顯示actin1的vigs導(dǎo)致其mrna表達(dá)顯著降低。圖28：棉花纖維中vigs-actin1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hactin1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghtubulin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示actin1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖29：棉花纖維中vigs-adf1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hadf1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghtubulin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示adf1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖30：棉花纖維中vigs-ctr1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hctr1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghtubulin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ctr1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖31：棉花纖維中vigs-della1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hdella1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghtubulin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示della1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖32：棉花纖維中vigs-ghalpha-tubulin1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)halpha-tubulin1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghubiquitin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ghalphy-tubulin1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖33：棉花纖維中vigs-ghbeta-tubulin1的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hbeta-tubulin1基因表達(dá)的相對(duì)值以ghubiquitin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ghbeta-tubulin1的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖34：棉花纖維中vigs-ghmads9的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hmads9基因表達(dá)的相對(duì)值以ghubiquitin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ghmads9的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖35：棉花纖維中vigs-ghmyb5的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hmyb5基因表達(dá)的相對(duì)值以ghubiquitin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ghmyb5的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖36：棉花纖維中vigs-ghmyb6的實(shí)時(shí)rt-pcr分析。感染后14天纖維中g(shù)hmyb6基因表達(dá)的相對(duì)值以ghubiquitin表達(dá)活性的百分?jǐn)?shù)顯示(參見(jiàn)材料和方法實(shí)施例12)。實(shí)時(shí)pcr結(jié)果顯示ghmyb6的vigs導(dǎo)致其mrna顯著降低。圖37顯示pstrv2001的圖譜。strv2的序列從6785位核苷酸延伸至9696位核苷酸，如seqidno:82所示。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及在基因組規(guī)模上功能性分析棉花基因的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)在基因組規(guī)模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本發(fā)明還涉及用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體和用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的方法。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)(ruizetal.,1998；burch-smithetal.,2004)系統(tǒng)為在無(wú)需對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化下確定基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能提供了可能性。rna和dna病毒均誘導(dǎo)導(dǎo)致病毒相關(guān)sirna產(chǎn)生的rna沉默(baulcombe,2004)?？蓸?gòu)建攜帶插入的候選植物基因部分序列的重組病毒。此重組病毒可在整個(gè)植物中系統(tǒng)地移動(dòng)，產(chǎn)生可介導(dǎo)內(nèi)源候選基因轉(zhuǎn)錄物降解的sirna(brignetietal.,2004；burch-smithetal.,2004)，導(dǎo)致接種植物中候選基因表達(dá)的沉默。vigs方法提供了若干機(jī)會(huì)：(1)基因/基因家族敲減的有效反向遺傳學(xué)工具；(2)快速且高通量(nasiretal.,2005)--全基因組orf敲除少于1個(gè)月；(3)瞬時(shí)、可逆的和所謂“可誘導(dǎo)的”敲除表型(burch-smithetal.,2004)；和(4)適用于沉默的不同器官為通過(guò)不同感染方法在根(valentineetal.,2004)、花(liuetal.,2004)、葉(liuetal.,2002)或果實(shí)(fuetal.,2005)中敲除基因提供了機(jī)會(huì)。煙草脆裂病毒(trv)為雙向的正鏈有義rna病毒。trvrna1編碼來(lái)自基因組rna的134kda和194kda復(fù)制酶蛋白，來(lái)自亞基因組rna的29-kda移動(dòng)蛋白和16-kda富含半胱氨酸的蛋白。trvrna2編碼來(lái)自基因組rna的衣殼蛋白和來(lái)自亞基因組rna的兩種非結(jié)構(gòu)蛋白。trvrna1可在沒(méi)有rna2下復(fù)制并系統(tǒng)地移動(dòng)。在trvrna2cdna構(gòu)建體中，將非結(jié)構(gòu)基因用多克隆位點(diǎn)(mcs)替換，此多克隆位點(diǎn)用于克隆vigs中靶基因序列(macfarlaneandpopovich,2000)。trvvigs系統(tǒng)已成功地用在一些植物中，如擬南芥(burch-smithetal.,2006)、辣椒(capsicumannuum)(chungetal.,2004)、番茄(lycopersiconesculentum)(liuetal.,2002)、矮牽牛(petuniahybrida)(chenetal.,2005)和馬鈴薯(solanumtuberosum)(brignetietal.,2004)。這些植物中大多數(shù)已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明是對(duì)一些trv株敏感的宿主(plantvirusonline,httpcolonbackslashbackslashimagedotfsdotuidahodotedubackslashvidebackslashdescr808dothtm)。更重要地是，無(wú)法合理地預(yù)期此trvvigs系統(tǒng)在全部植物中必然起作用。例如，dineshkumaretal.(2007)中說(shuō)明了trvvigs系統(tǒng)可能起作用的植物列表。然而，此trvvigs系統(tǒng)無(wú)法在花生(arachishypogaea)和大豆(glycinemax)中起作用，因?yàn)楸M管它們包含在dineshkumaretal.(2007)的列表中，但仍不是trv的宿主。事實(shí)上，如本文所述，trvvigs系統(tǒng)不在dineshkumaretal.(2007)或在線病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中所列對(duì)煙草脆裂病毒(trv)敏感的全部植物中起作用。而且，系統(tǒng)感染是待用于功能性基因分析的trvvigs系統(tǒng)所需的。一些植物局部地而非系統(tǒng)地對(duì)trv敏感，因此trvvigs系統(tǒng)可在這些植物中起作用。在本發(fā)明前，尚不知道在包括棉花植物(棉屬)的錦葵目中的植物是trv的宿主或在一定程度上對(duì)trv局部或系統(tǒng)地敏感。在篩選許多病毒載體后，發(fā)現(xiàn)棉花對(duì)trv敏感且trvvigs系統(tǒng)可用在棉花中，因此，此發(fā)現(xiàn)是無(wú)法預(yù)期的。本發(fā)明的不可預(yù)期性進(jìn)一步通過(guò)以下證實(shí)，即trvvigs系統(tǒng)無(wú)法在對(duì)trv敏感或作為trv宿主植物列出的全部植物中起作用。一方面，本發(fā)明提供了用于在棉花中進(jìn)行vigs的高效和可再生的系統(tǒng)以及方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了trv全病毒基因組的進(jìn)一步再合成。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明表明這些載體具有與原始載體類似的效率。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了trvvigs系統(tǒng)在克隆和功能性鑒定棉花基因中的應(yīng)用。根據(jù)此方面，瞬時(shí)表達(dá)載體包含trvrna2序列和至少一個(gè)拷貝的強(qiáng)亞基因組啟動(dòng)子，以及任選存在地包含第一感興趣的序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子能夠被trv復(fù)制酶識(shí)別。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為強(qiáng)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子源自煙草脆裂病毒組，而非trv。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為合成的豌豆早枯病毒(pebv)亞基因組啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為辣椒環(huán)斑病毒(peprsv)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。用于在棉花中瞬時(shí)表達(dá)的感興趣的核酸插入在亞基因組啟動(dòng)子的下游，且可操縱地連接于此啟動(dòng)子。此載體可用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)感興趣的核酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了其中內(nèi)含子已插入trvrna1序列的修飾型trvrna1載體。因此，一方面，本發(fā)明提供了在棉花中進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括：(a)將包含能夠沉默第一目標(biāo)基因的第一沉默序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列的載體中，以產(chǎn)生修飾型trvrna2載體；(b)制備農(nóng)桿菌(agrobacterium)的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有修飾型trvrna2載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織以產(chǎn)生受感染的植物組織；和(d)使受感染的植物組織生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以誘導(dǎo)第一目標(biāo)基因的基因沉默。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物或棉花幼苗。在此實(shí)施方式中，受感染的植物在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的植物在步驟(d)中生長(zhǎng)。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花胚珠在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花胚珠在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花纖維在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花纖維在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含trvrna2的載體和包含trvrna1的載體為合成的植物載體。本文所示的結(jié)果和表型數(shù)據(jù)表明合成的trv-vigs系統(tǒng)可有效地用作trv-vigs系統(tǒng)，以誘導(dǎo)所需內(nèi)源棉花基因的沉默。在另一實(shí)施方式中，trvrna2包含能夠沉默第一目標(biāo)基因的第一沉默序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的有義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的反義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rna干擾(rnai)的短發(fā)夾rna(shrna)。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rnai的前體微小rna(mirna)或mirna的序列。在另一實(shí)施方式中，核酸進(jìn)一步包含能夠沉默第二目標(biāo)基因的第二沉默序列。在另一實(shí)施方式中，核酸包含能夠沉默大于兩個(gè)目標(biāo)基因的大于兩種沉默序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)楹蜻x轉(zhuǎn)錄因子基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槿~綠素或類胡蘿卜素生物合成中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)轭慄S酮生物合成途徑中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)樵ㄉ鼗蚧ㄉ厣锖铣赏緩街械暮蜻x基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維發(fā)育中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維起始、伸長(zhǎng)、次生壁沉積、成熟或種子發(fā)育中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)閟mrna生物合成中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)橹参锛に匦盘?hào)途徑中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)榕c非生物和生物脅迫抗性有關(guān)的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)橹舅嵘锖铣芍械暮蜻x基因，如硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶(sad)基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維發(fā)育中的候選基因，如與細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞壁生物合成和纖維素生物合成相關(guān)的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)橄嚓P(guān)棉花毛狀體中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)榇渭?jí)代謝生物合成中的候選基因。本文所示的結(jié)果表明本發(fā)明的vigs系統(tǒng)可有效地抑制靶宿主基因，且可作為快速的手段來(lái)測(cè)定候選基因的功能，以及研究諸如轉(zhuǎn)錄因子基因等調(diào)節(jié)基因的功能，或參與小rna生物合成途徑的基因的功能。本文所述的vigs測(cè)定提供了在同源系統(tǒng)中檢測(cè)棉花基因序列功能的手段。使用標(biāo)準(zhǔn)化的cdna文庫(kù)，可以通過(guò)本發(fā)明的vigs系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的大規(guī)模篩選。宿主植物可為陸地棉(四倍體)，但如本文所述，本發(fā)明不限于此物種。因此，宿主植物也可為海島棉(四倍體)、亞洲棉(二倍體)和草棉(二倍體)，以及其它天然棉屬物種，和全部商購(gòu)棉花變種和種質(zhì)，包括源自種內(nèi)和種間雜交的種質(zhì)。第二方面，本發(fā)明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括：(a)將包含待沉默候選基因的沉默序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列的載體中，以產(chǎn)生修飾型trvrna2載體；(b)制備農(nóng)桿菌(agrobacterium)的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有修飾型trvrna2載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織以產(chǎn)生受感染的植物組織；(d)使受感染的植物組織生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以誘導(dǎo)候選基因的基因沉默；和分析所沉默的候選基因?qū)κ芨腥镜闹参锝M織的表型影響。在此第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物或棉花幼苗。在此實(shí)施方式中，受感染的植物在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的植物在步驟(d)中生長(zhǎng)。在此第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花胚珠在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花胚珠在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在此實(shí)施方式中，受感染的棉花纖維在步驟(c)中產(chǎn)生，且受感染的棉花纖維在步驟(d)的培養(yǎng)中生長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含trvrna2的載體和包含trvrna1的載體為合成的植物載體。本文所示的結(jié)果和表型數(shù)據(jù)表明合成的trv-vigs系統(tǒng)可有效地用作trv-vigs系統(tǒng)，以誘導(dǎo)所需內(nèi)源棉花基因的沉默。在另一實(shí)施方式中，trvrna2包含能夠沉默第一目標(biāo)基因的第一沉默序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的有義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為目標(biāo)基因的反義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rna干擾(rnai)的短發(fā)夾rna(shrna)。在另一實(shí)施方式中，第一沉默序列為編碼能夠?qū)Φ谝荒繕?biāo)基因進(jìn)行rnai的前體微小rna(mirna)或mirna的序列。在另一實(shí)施方式中，核酸進(jìn)一步包含能夠沉默第二目標(biāo)基因的第二沉默序列。在另一實(shí)施方式中，核酸包含能夠沉默大于兩個(gè)目標(biāo)基因的大于兩種沉默序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)楹蜻x轉(zhuǎn)錄因子基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)閟mrna生物合成中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)樵ㄉ睾突ㄉ厣锖铣赏緩街械暮蜻x基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維發(fā)育中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因?yàn)槊藁ɡw維起始、伸長(zhǎng)、次生壁沉積、成熟或種子發(fā)育中的候選基因。在另一實(shí)施方式中，目標(biāo)基因如上所述。本文所示的結(jié)果表明本發(fā)明的vigs系統(tǒng)可有效地抑制靶宿主基因，且可作為快速的手段來(lái)測(cè)定候選基因的功能，以及研究諸如轉(zhuǎn)錄因子基因等調(diào)節(jié)基因的功能，或參與小rna生物合成途徑的基因的功能。本文所述的vigs測(cè)定提供了在同源系統(tǒng)中檢測(cè)棉花基因序列功能的手段。使用標(biāo)準(zhǔn)化的cdna文庫(kù)，可以通過(guò)本發(fā)明的vigs系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的大規(guī)模篩選。宿主植物可為陸地棉(四倍體)，但如本文所述，本發(fā)明不限于此物種。因此，宿主植物也可為海島棉(四倍體)、亞洲棉(二倍體)和草棉(二倍體)，以及其它天然棉屬物種，和全部商購(gòu)棉花變種和種質(zhì)，包括源自種內(nèi)和種間雜交的種質(zhì)。一旦一種或多種棉花基因的功能被表征，可使用常規(guī)技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因植物以改變一種或多種基因的表達(dá)模式?；蛘?，如本文所述可制備瞬時(shí)表達(dá)一種或多種基因的植物。插入棉屬植物的dna(感興趣的dna)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程不是至關(guān)重要的。通常，被引入植物的dna是構(gòu)建體的一部分。dna可為感興趣的基因，如蛋白的編碼序列，或其可為能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列，如反義序列、有義抑制序列、shrna、前體mirna或mirna序列。構(gòu)建體通常包括與感興趣dna的5’端和/或感興趣dna的3’端可操縱連接的調(diào)節(jié)區(qū)域。本文中也將包含全部這些元件的盒稱為表達(dá)盒。在表達(dá)盒構(gòu)建體中，表達(dá)盒可額外地包含5’引導(dǎo)序列。調(diào)節(jié)區(qū)域(即啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和翻譯終止區(qū)域)和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是天然/同源的?；蛘?，調(diào)節(jié)區(qū)域和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是異源的。參見(jiàn)美國(guó)專利7,205,453以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616。表達(dá)盒可額外地包含可選擇的標(biāo)記基因。參見(jiàn)美國(guó)專利7,205,453以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616。通常，表達(dá)盒將包括用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可選擇的標(biāo)記基因。使用可選擇的標(biāo)記基因來(lái)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。通常，植物可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素抗性，適合的基因包括以下至少一組：編碼抗生素大觀霉素的基因、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(spt)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptii)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因?；蛘撸参锟蛇x擇的標(biāo)記基因?qū)⒕幋a除草劑抗性，如對(duì)磺酰脲類除草劑、草銨膦、草甘膦、銨、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸鹽(2,4-d)的抗性，包括編碼有此除草劑抗性的基因，所述除草劑對(duì)谷氨酰胺合酶起抑制作用，如草胺膦或basta(如bar基因)。參見(jiàn)wo02/36782、美國(guó)專利7,205,453以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616，和本文援引加入的那些文獻(xiàn)?？蛇x擇的標(biāo)記基因的此列表不意在限制?？墒褂萌魏慰蛇x擇的標(biāo)記基因。大量啟動(dòng)子可用在本發(fā)明的實(shí)施中?？苫谒杞Y(jié)果選擇啟動(dòng)子。也就是說(shuō)，核酸可與組成型的啟動(dòng)子、組織優(yōu)選的啟動(dòng)子或用于在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)的其它啟動(dòng)子組合。此類組成型的啟動(dòng)子包括，例如rsyn7的核啟動(dòng)子(wo99/48338和美國(guó)專利6,072,050)；核camv35s啟動(dòng)子(odelletal.,1985)；大米肌動(dòng)蛋白(mcelroyetal.,1990)；泛素(christensenandquail,1989，和christensenetal.,1992)；pemu(lastetal.,1991)；mas(veltenetal.,1984)；als啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,659,026)等。其它組成型的啟動(dòng)子包括例如美國(guó)專利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463和5,608,142中描述的那些。其它啟動(dòng)子包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，特別是病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子包括來(lái)自通過(guò)病原體感染誘導(dǎo)的病理相關(guān)蛋白(pr蛋白)，如pr蛋白、sar蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。其它啟動(dòng)子包括在病原體感染位點(diǎn)處或附近表達(dá)的那些。在另一實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可為損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方式中，通過(guò)應(yīng)用外源性化學(xué)調(diào)節(jié)劑，可用化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控植物中的基因表達(dá)。啟動(dòng)子可為應(yīng)用化學(xué)品誘導(dǎo)基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，或應(yīng)用化學(xué)品抑制基因表達(dá)的化學(xué)抑制型啟動(dòng)子。此外，可使用組織優(yōu)選的啟動(dòng)子來(lái)靶向提高特定植物組織內(nèi)部感興趣的多核苷酸的表達(dá)。這些啟動(dòng)子分別描述于美國(guó)專利6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2007/0061917和2007/0143880。適合時(shí)，可最佳化感興趣的dna以提高在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)。也就是說(shuō)，可使用植物優(yōu)選的密碼子來(lái)合成編碼序列以改進(jìn)表達(dá)。本領(lǐng)域中可獲得合成植物優(yōu)選的基因的方法。參見(jiàn)如美國(guó)專利5,380,831、5,436,391和7,205,453，以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616。在植物中使用dsrna進(jìn)行基因沉默以及設(shè)計(jì)用于基因沉默的sirna或shrna分子是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2004/0192626、2004/0203145、2005/0026278、2005/0186586、2005/0244858、2006/0212950、2007/0259827、2007/0265220、2007/0269815、20080269474和2008/0318896。在植物中使用mirna進(jìn)行基因沉默以及設(shè)計(jì)用于基因沉默的前體mirna或mirna分子是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0130176、2006/0218673、2007/0083947、2007/0130653、2007/0154896和2008/0313773。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“植物產(chǎn)物”意在包括可從特定植物獲得的任何物，例如，果實(shí)、種子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蠟、蛋白、脂類、脂肪酸、維生素、全部或部分的植物組織(例如，根、葉、莖、花、棉桃、果實(shí)、皮)、細(xì)胞、細(xì)胞懸液、塊莖和匍匐莖。在另一方面，本發(fā)明提供了用于在棉花植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體和方法。根據(jù)此方面，瞬時(shí)表達(dá)載體包含trvrna2序列和至少一個(gè)拷貝的強(qiáng)亞基因組啟動(dòng)子，以及任選存在地包含第一感興趣的序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子能夠被trv復(fù)制酶識(shí)別。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為強(qiáng)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子源自煙草脆裂病毒組，而非trv。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為合成的豌豆早枯病毒(pebv)亞基因組啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，亞基因組啟動(dòng)子為辣椒環(huán)斑病毒(peprsv)衣殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子。用于在棉花中瞬時(shí)表達(dá)的感興趣的核酸插入在亞基因組啟動(dòng)子的下游，且可操縱地連接于此啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，核酸包含在棉花植物中分別待表達(dá)的兩種或更多種感興趣的序列。在另一實(shí)施方式中，載體包含兩種或更多種核酸，每一核酸包含待在棉花植物中表達(dá)的感興趣的序列，且每一核酸可操縱地連接于亞基因組啟動(dòng)子的單獨(dú)拷貝。在棉屬植物中待瞬時(shí)表達(dá)的感興趣的序列對(duì)本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)方法不是至關(guān)重要的。感興趣的序列可為感興趣的基因，例如蛋白的編碼序列，或其可為能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列，如反義序列、有義抑制序列或微小rna(mirna)序列。感興趣的序列除了包括亞基因組啟動(dòng)子外，還通常包括調(diào)節(jié)區(qū)域，所述調(diào)節(jié)區(qū)域可操縱地連接于感興趣序列的5’端和/或感興趣序列的3’端。在瞬時(shí)表達(dá)盒中，感興趣的序列可額外地包含5’引導(dǎo)序列。調(diào)節(jié)區(qū)域(即轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和翻譯終止區(qū)域)和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是天然/同源的?；蛘?，調(diào)節(jié)區(qū)域和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是異源的。參見(jiàn)美國(guó)專利7,205,453以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616。適合時(shí)，可最佳化感興趣的序列以提高在植物中的瞬時(shí)表達(dá)。也就是說(shuō)，可使用植物優(yōu)選的密碼子來(lái)合成編碼序列以改進(jìn)表達(dá)。本領(lǐng)域中可獲得合成植物優(yōu)選的基因的方法。參見(jiàn)如美國(guó)專利5,380,831、5,436,391和7,205,453，以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本2006/0218670和2006/0248616。在一個(gè)實(shí)施方式中，感興趣的序列為(a)在棉花中待表達(dá)的基因的編碼序列，如蘇云金桿菌(bacillusthuringiensis)殺蟲(chóng)毒素蛋白(bt)和flowerlocust(ft)基因，以縮短開(kāi)花時(shí)間；或(b)待下調(diào)的基因的序列，如候選轉(zhuǎn)錄因子基因、smrna生物合成中的候選基因、植物激素信號(hào)途徑中的候選基因、與非生物和生物脅迫抗性有關(guān)的候選基因、脂肪酸生物合成中的候選基因、棉花纖維發(fā)育中的候選基因、相關(guān)棉花毛狀體中的候選基因和次級(jí)代謝生物合成中的候選基因。根據(jù)此方面，用于在棉花組織中瞬時(shí)表達(dá)感興趣的核酸的方法包括：(a)將包含待在棉花植物中表達(dá)的第一感興趣的序列的核酸插入瞬時(shí)表達(dá)載體中，以產(chǎn)生trvrna2表達(dá)載體，所述瞬時(shí)表達(dá)載體包含煙草脆裂病毒(trv)rna2序列和至少一個(gè)拷貝的亞基因組啟動(dòng)子，其中所述核酸可操縱地連接于所述亞基因組啟動(dòng)子；(b)制備農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物，所述混合培養(yǎng)物包含：含有包含trvrna1序列的載體的農(nóng)桿菌和含有trvrna2表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；(c)將農(nóng)桿菌的混合培養(yǎng)物引入棉花的植物組織；和(d)使受感染的植物組織生長(zhǎng)足夠的時(shí)間，以瞬時(shí)表達(dá)目標(biāo)基因。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花幼苗。在此方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花胚珠。在此方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花植物。在此方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，植物組織為棉花纖維。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花組織中傳播，使得vigs在受感染的棉花植物或幼苗的全部組織中發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含trvrna2的載體和包含trvrna1的載體為合成的植物載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一感興趣的序列為基因的有義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一感興趣的序列為基因的反義鏈的序列。在另一實(shí)施方式中，第一序列編碼前體mirna或mirna。如本文所示，本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)載體可用于在棉花植物中快速地瞬時(shí)表達(dá)感興趣的核酸。在另一實(shí)施方式中，核酸進(jìn)一步包含待在棉花植物中表達(dá)的感興趣的第二序列。在另一實(shí)施方式中，核酸包含待在棉花植物中表達(dá)的多于兩種的感興趣的序列。在另一實(shí)施方式中，兩種或更多種核酸被插入瞬時(shí)表達(dá)載體中。在此實(shí)施方式中，每一核酸包含感興趣的序列，且每一核酸可操縱地連接于亞基因組啟動(dòng)子的單獨(dú)拷貝。兩種或更多種核酸中的感興趣的序列可以相同或不同。感興趣的序列包括上述那些。宿主植物可為陸地棉(四倍體)，但如本文所述，本發(fā)明不限于此物種。因此，宿主植物也可為海島棉(四倍體)、亞洲棉(二倍體)和草棉(二倍體)，以及其它天然棉屬物種，和全部商購(gòu)棉花變種和種質(zhì)，包括源自種內(nèi)和種間雜交的種質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)植物獲得的植物產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)植物產(chǎn)物摂意在包括可從特定植物獲得的任何物，例如，果實(shí)、種子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蠟、蛋白、脂類、脂肪酸、維生素、全部或部分的植物組織(例如，根、葉、莖、花、棉桃、果實(shí)、皮)、細(xì)胞、細(xì)胞懸液、塊莖和匍匐莖。在另一方面，本發(fā)明提供了修飾型trvrna1載體，其具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)錄起始。有很多原因會(huì)引起rna病毒載體的轉(zhuǎn)錄起始困難。首先是可能被rna加工工具錯(cuò)誤識(shí)別的非最佳化的基因組序列，如嵌在rna基因組中的隱蔽剪接位點(diǎn)和富含胸腺嘧啶的假定的內(nèi)含子序列。其次，trvrna1病毒載體編碼約7.0kb核苷酸的極大的轉(zhuǎn)錄物，其大小是平均植物基因大小(1-2kb)的約3-4倍。實(shí)際上，植物基因通常包含促進(jìn)來(lái)自細(xì)胞核的前mrna加工和輸出的大量?jī)?nèi)含子。在基于農(nóng)桿菌滲入法(agroinfiltration)的vigs和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，沒(méi)有內(nèi)含子序列，在來(lái)自病毒構(gòu)建體的植物細(xì)胞核中產(chǎn)生的前mrna轉(zhuǎn)錄物無(wú)法被有效地識(shí)別或適當(dāng)?shù)丶庸?。根?jù)此方面，修飾型trvrna1載體包含已插入至少一個(gè)內(nèi)含子的trvrna1序列?？刹迦肓硗獾膬?nèi)含子以使病毒轉(zhuǎn)錄物更容易地被宿主細(xì)胞核前mrna加工和輸出工具識(shí)別，以此增加能發(fā)生病毒復(fù)制的植物細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以及增加能起始感染的效率。理論上，可使用任何植物內(nèi)含子。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)含子的大小為約100核苷酸至約400核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)含子源自擬南芥。內(nèi)含子插入位點(diǎn)可為trv1基因組的共有ag/gt序列，或?yàn)槠ヅ浯斯灿行蛄卸淹ㄟ^(guò)沉默核苷酸取代來(lái)突變的序列。此修飾型trvrna1載體可用于在任何上述方法中替換含trvrna1的載體。宿主植物可為陸地棉(四倍體)，但如本文所述，本發(fā)明不限于此物種。因此，宿主植物也可為海島棉(四倍體)、亞洲棉(二倍體)和草棉(二倍體)，以及其它天然棉屬物種，和全部商購(gòu)棉花變種和種質(zhì)，包括源自種內(nèi)和種間雜交的種質(zhì)。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。參見(jiàn)，例如maniatisetal.,1982,molecularcloning(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)；sambrooketal.,1989,molecularcloning,2nded.(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)；sambrookandrussell,2001,molecularcloning,3rded.(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)；ausubeletal.,1992),currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley&sons,includingperiodicupdates)；glover,1985,dnacloning(irlpress,oxford)；russell,1984,molecularbiologyofplants:alaboratorycoursemanual(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)；anand,techniquesfortheanalysisofcomplexgenomes,(academicpress,newyork,1992)；guthrieandfink,guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology(academicpress,newyork,1991)；harlowandlane,1988,antibodies,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；thetreatise,methodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)；methodsinenzymology,vols.154and155(wuetal.eds.),immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker,eds.,academicpress,london,1987)；handbookofexperimentalimmunology,volumesi-iv(d.m.weirandc.c.blackwell,eds.,1986)；riott,essentialimmunology,6thedition,blackwellscientificpublications,oxford,1988；fireetal.,rnainterferencetechnology:frombasicsciencetodrugdevelopment,cambridgeuniversitypress,cambridge,2005；schepers,rnainterferenceinpractice,wiley–vch,2005；engelke,rnainterference(rnai):thenuts&boltsofsirnatechnology,dnapress,2003；gott,rnainterference,editing,andmodification:methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology),humanpress,totowa,nj,2004；sohail,genesilencingbyrnainterference:technologyandapplication,crc,2004。實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)參考以下實(shí)施例來(lái)描述，這些實(shí)施例以說(shuō)明的方式提供且不意在以任何方式限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或以下具體描述的技術(shù)。實(shí)施例1：實(shí)施例2-6的實(shí)驗(yàn)方法棉花幼苗：棉花種子在溫室中繁殖并發(fā)芽。將帶有2-3片真正葉子的4至14日齡幼苗用于vigs測(cè)定。僅具有子葉的更年幼幼苗也可用于vigs測(cè)定。合成的trvrna1表達(dá)載體：合成的trv1載體全長(zhǎng)(7756bp)序列包括：sphi位點(diǎn)、t-dna右邊界序列(152bp)、復(fù)制的花椰菜花葉病毒(camv)35s增強(qiáng)子區(qū)域(752bp)(shietal.,1997)、trvppk20株rna1(6791bp)、地下三葉草斑駁病毒衛(wèi)星rna核酶序列(46bp)和smai位點(diǎn)序列。此全長(zhǎng)序列被內(nèi)源性sali位點(diǎn)分為兩部分。這兩部分單獨(dú)合成，并被克隆入pgh載體以得到兩個(gè)載體pgh-yej-v1-1和pgh-yej-v1-2。合成的trvrna1片段v1-1(通過(guò)sphi和sali酶處理從pgh-yej-v1-1釋放)和v1-2(通過(guò)sali和smai酶處理從pgh-yej-v1-2釋放)與用sphi和ecoicri酶處理的pbi121(genbank登錄號(hào)：af485783)載體連接。新合成的trvrna1載體被稱為pstrv1001(本文也稱作pstrv1)。合成的pstrv1001的序列在seqidno:1中示出。合成的trvrna1序列與公開(kāi)的trvrna1序列相同。合成的trvrna2表達(dá)載體：合成的trv2載體全長(zhǎng)(2915bp)序列包括：hindiii位點(diǎn)、復(fù)制的花椰菜花葉病毒(camv)35s增強(qiáng)子區(qū)域(752bp)(shietal.,1997)、trv株ppk20rna25'-序列(1639bp)、多克隆位點(diǎn)(61bp)、trv株ppk20rna23'-序列(396bp)和hpai位點(diǎn)。合成此全長(zhǎng)序列，并克隆入pgh載體以得到pgh-yej-v2。將合成的trvrna2片段v2通過(guò)hindiii和hpai位點(diǎn)連接入pcambia0390(genbank登錄號(hào)：af234291)。新合成的trvrna2載體被稱為pstrv2001(本文也稱作pstrv2)。合成的strv2的序列在seqidno:2中示出。合成的trvrna2序列與公開(kāi)的trvrna2序列相同。合成的pstrv2001的序列在seqidno:82中示出。合成的trv瞬時(shí)表達(dá)載體：為了構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pstrv2100，將合成的豌豆早枯病毒(pebv)亞基因組啟動(dòng)子(237bp,seqidno:3)多核苷酸插入pstrv2001載體的多克隆位點(diǎn)中，此多核苷酸包括在其5'末端的ecori位點(diǎn)和其3'末端的ncoi位點(diǎn)。將綠色熒光蛋白(gfp)表達(dá)載體pk20gfpc用引物gfp-f(5’-ttataggtaccatggctagcaaaggagaagaac-3’(seqidno:25))和gfp-r(5’-cctaagagctcttaatccatgccatgtgtaatccc-3’(seqidno:26)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將gfp基因插入pstrv2100的ncoi和bamhi位點(diǎn)中。此載體稱為pstrv2:gfp。修飾型strv1載體：使用基于pcr的策略將來(lái)自擬南芥actin1(內(nèi)含子2，genbank登錄號(hào)u27981，位置1957-2111bp)的植物內(nèi)含子引入trvrna1基因組中。三個(gè)片段基于三對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增：用于f1的f1p5和f1p3、用于f2的f2p5和f2p3、和用于f3的f3p5和f3p3。這些引物對(duì)的序列在表1中示出。引物相對(duì)于此內(nèi)含子的位置顯示在圖2中。在第二輪pcr擴(kuò)增中，通過(guò)使用f1p5和f3p3的重疊pcr得到更長(zhǎng)的dna片段。將pcr產(chǎn)物進(jìn)一步用ecori和xbai消化，并插入pstrv1001載體中。含內(nèi)含子的pstrv1被稱為pstrv1001-內(nèi)含子(本文也稱作pstrv1-內(nèi)含子)。插入的內(nèi)含子的序列為gtaagtacatttccataacgttccatcgtcattgattcttcattagtatgcgtttatgaagctttttcaatttaattctctttggtagatcttaagattcctctgtttcttgcaaaataaagggttcaattatgctaatattttttatatcaattttgacag(seqidno:27)。表1：用于內(nèi)含子合成的基因引物引物序列(5’→3’)seqidno:pstrv1001中的位置f1p5cctgaattcaatatcgtgtttaaagacg410764-10791f1p3ataattctagagggggactgtttctggtggcatg5f2p5cgttttgggtaactagaggtaagtacatttccataacgttcc6f2p3aatgaatccttttctcacctgtcaaaattgatataaaaaata7f3p5ttatatcaattttgacaggtgagaaaaggattcattcctgttg8f3p3cctacatgtacaaccctgatatgtatt911115-11141基因克隆和vigs載體克?。簩?duì)來(lái)自陸地棉葉樣品的cdna產(chǎn)物進(jìn)行pcr以擴(kuò)增候選基因，并將其克隆到合成載體pstrv2001的xbai和bamhi位點(diǎn)中。基因克隆中所用的引物在表2中示出，表2中也包括所克隆基因序列的參照。表2：基因引物和基因序列農(nóng)桿菌滲入法：將合成的pstrv載體和它們的衍生物通過(guò)電穿孔引入農(nóng)桿菌株agl1。3ml培養(yǎng)物在50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平以及28℃下生長(zhǎng)24小時(shí)。1天后，將培養(yǎng)物接種入含50mg/l卡那霉素、10mm2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)和20μm乙酰丁香酮(acetosyringone)的lb培養(yǎng)基中，并在28℃搖床中過(guò)夜生長(zhǎng)。農(nóng)桿菌細(xì)胞通過(guò)離心收集，并重懸浮于mma溶液(10mmmes、10mmmgcl2、200μm乙酰丁香酮)至最終od600為1.5。將農(nóng)桿菌懸液在室溫下靜置3-4小時(shí)。在滲入前，將包含ptrv1/pstrv1或ptrv2/pstrv2載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物以1:1的比例混合。通過(guò)注射器滲入或真空滲入將培養(yǎng)物滲入棉花植物中。對(duì)于注射器滲入，使用1ml無(wú)針頭注射器將農(nóng)桿菌接種物送入2或3片最新展開(kāi)葉的下側(cè)。對(duì)于真空滲入，將全部植物浸入農(nóng)桿菌接種物并持續(xù)經(jīng)歷80-90kpa真空5分鐘，隨后快速解除真空，以使接種物迅速進(jìn)入植物組織。下述全部數(shù)據(jù)通過(guò)真空滲入獲得。然而，也可使用注射器滲入，但注射器滲入比真空滲入更耗時(shí)。通過(guò)真空滲入獲得的沉默效果優(yōu)于通過(guò)注射器滲入獲得的沉默效果。在滲入后，多余的農(nóng)桿菌細(xì)胞懸液被用于浸潤(rùn)所滲入植物的根系統(tǒng)。所滲入植物在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期循環(huán)下，在25℃生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。相同方法也用于測(cè)試在假定宿主植物中進(jìn)行vigs的實(shí)驗(yàn)。棉酚和相關(guān)萜類化合物的高效液相色譜測(cè)定：棉籽和其它組織中的棉酚和相關(guān)萜類化合物的水平通過(guò)使用下述基于hplc的方法測(cè)定。將100mg新鮮棉花葉樣品用研缽和杵在液氮中勻漿，并將1ml溶劑1(乙腈:水:磷酸乙酸＝80:20:0.1(v/v/v)，ph＝2.8-2.9)加入樣品中。將植物組織進(jìn)一步通過(guò)mixermillmm300(qiagen，germany)破碎。將懸液以3000g離心10分鐘。將50μl提取物部分在安裝有微注射器的agilent1200hplc系統(tǒng)上進(jìn)行分析。將樣品以恒溶劑強(qiáng)度由保持在40℃的synergi4μmfusion-rp80a(phenomenx)柱洗脫。流動(dòng)相為乙醇:甲醇:異丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:二甲基甲酰胺:磷酸＝16.7:4.6:12.1:20.2:37.4:3.8:5.1:0.1(stipanovicetal.,1988)。溶劑流速為1.0mlmin-1，總運(yùn)行時(shí)間為45分鐘。信號(hào)在272nm下監(jiān)測(cè)。數(shù)據(jù)收集和分析在agilentchemstation軟件上進(jìn)行。使用叔丁基蒽醌作為內(nèi)標(biāo)。gfp顯像和熒光定量分析。為了在葉片和整株植物上可視地監(jiān)測(cè)gfp熒光，使用手持式100w長(zhǎng)波uv燈(uvproducts,upland,ca)，且使用安裝有uv和kenko黃色透鏡(tokyo,japan)的nikoncoolpix995數(shù)碼相機(jī)(tokyo,japan)拍攝熒光圖像?？贵w和蛋白質(zhì)凝膠印跡分析：總植物蛋白通過(guò)12％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將抗gfp蛋白的鼠單克隆igg用作一抗。將ecl過(guò)氧化物酶綴合的驢抗兔igg用作二抗。使用ecl蛋白印跡檢測(cè)試劑(gehealthcare)來(lái)觀察免疫反應(yīng)性條帶。將考馬斯亮藍(lán)染色的rbcl條帶用作上樣對(duì)照。掃描電鏡(sem)。將新鮮葉用帶子固定在樣品室的內(nèi)側(cè)，隨后用液氮冷凍。使用sem(jsm-6360lv,jeol,usa)收集圖像。rna提取和分析。將100mg葉組織在液氮中研磨，并用植物rna純化試劑(invitrogen)提取。rna濃度使用nanodrop(thermo,usa)測(cè)定。將m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶(promega,usa)用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)pcr使用powergreenpcrmaster(appliedbiosystems,usa)，并使用表3所示的基因特異性引物在abi7900ht中進(jìn)行。全部樣品一式三份進(jìn)行，且數(shù)據(jù)在預(yù)設(shè)的ct值(appliedbiosystems,usa)下用rq管理工具分析。jatropharbclmrna用作內(nèi)標(biāo)。分析中包括的ct值是基于3個(gè)生物平行測(cè)定，對(duì)每個(gè)生物樣品進(jìn)行三個(gè)技術(shù)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)偏差基于3個(gè)生物平行測(cè)定來(lái)計(jì)算。表3：基因特異性實(shí)時(shí)pcr分析中所用的引物。實(shí)施例2：在棉花中開(kāi)發(fā)vigs系統(tǒng)，使用參與萜類化合物生物合成的基因作為標(biāo)記基因此實(shí)施例描述了棉花中基于煙草脆裂病毒(trv)的載體的構(gòu)建和其在基因沉默中的應(yīng)用。當(dāng)攜帶來(lái)自宿主基因序列的重組病毒感染植物時(shí)，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(vigs)開(kāi)始。與vigs載體中插入物具有序列同源性的內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄物通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(ptgs)來(lái)降解(baulcombe,2004)。棉酚和相關(guān)萜類化合物存在于葉腺體(theglandsoffoliage)、花器官和棉桃以及根等整個(gè)棉花植物中。棉酚和其它相關(guān)倍半萜化合物源自(+)-δ-杜松烯。在棉花中評(píng)價(jià)trvvigs克隆對(duì)抑制cad基因表達(dá)的基因抑制效率。δ-杜松烯合酶基因編碼的酶負(fù)責(zé)參與法尼基二磷酸酯向(+)-δ-杜松烯環(huán)化的第一關(guān)鍵步驟。當(dāng)此基因被沉默時(shí)，棉酚和其它倍半萜化合物的生物合成將被全部干擾。sunilkumaretal.(2006)已經(jīng)成功使用cad基因rnai通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化來(lái)干擾棉花種子中的棉酚生物合成。此外，誘導(dǎo)這些萜類化合物以應(yīng)答微生物感染。這些化合物保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)和病原菌侵?jǐn)_。為了研究cad在棉花害蟲(chóng)抗性和發(fā)育功能中的作用，首先基于全長(zhǎng)cdna序列(genbank登錄號(hào)：ay800106)，使用引物(seqidno:10和11)通過(guò)pcr克隆了棉花cad(seqidno:16)，并將其插入pstrv2載體以得到pstrv2:cad。使用真空滲入，將包含pstrv1和pstrv2:cad載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物滲入棉花植物中。在感染后(dpi)14天，受感染棉花植物的莖變?yōu)楹稚易兇?，葉子開(kāi)始枯萎。在pstrv2:cad處理植物的上部葉中沒(méi)有明顯的表型(圖3a)。在25dpi時(shí)，褐色壞死和枯萎在大多數(shù)pstrv2:cad植物皮中可見(jiàn)，然而在僅載體對(duì)照植物中未見(jiàn)明顯的表型(圖3a)。在35dpi(25/30植物死亡)后，大多數(shù)pstrv2:cad植物死亡，這說(shuō)明棉花中的vigs以強(qiáng)力且可靠的方式發(fā)揮高效的作用。使用從受處理植物的葉中提取的總rna來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，以在分子水平上確認(rèn)cad基因的vigs，結(jié)果顯示在圖3b中。在pstrv2:cad感染植物的上部葉中cadrna的積累遠(yuǎn)低于空strv2載體感染的植物，在cad處理的植物中僅剩余0.2％的cadrna。使用高效液相色譜(hplc)來(lái)檢驗(yàn)來(lái)自對(duì)照和沉默的植物葉的棉酚和相關(guān)倍半萜化合物。棉酚對(duì)空氣氧化很敏感，且易于在醇溶液中形成縮醛，因此我們改進(jìn)了提取和分析方法(具體參見(jiàn)實(shí)施例1)以得到正確和可重復(fù)的結(jié)果。正如所預(yù)期的，hplc數(shù)據(jù)顯示棉酚和相關(guān)倍半萜化合物水平幾乎降低至0，而對(duì)照植物的這些化合物保持了高水平(圖3c)。cad沉默植物中的這些結(jié)果和表型數(shù)據(jù)說(shuō)明合成的strvvigs系統(tǒng)可用于以強(qiáng)力且可靠的方式高效誘導(dǎo)目標(biāo)內(nèi)源性棉花基因的沉默。目前，棉花全基因組測(cè)序剛剛開(kāi)始。同時(shí)，不斷增加的棉屬est序列(目前約400,000個(gè))組和源自在一系列生長(zhǎng)條件下由各種組織和器官構(gòu)建的不同文庫(kù)的非冗余基因的組可在網(wǎng)絡(luò)上獲得。這些表達(dá)序列標(biāo)簽(est)為棉花的功能基因組學(xué)研究提供了大量信息。因此，本文所述的vigs測(cè)定提供了在同源系統(tǒng)中檢測(cè)棉花基因序列功能的手段。使用標(biāo)準(zhǔn)化的cdna文庫(kù)，可以通過(guò)基于vigs系統(tǒng)的strv進(jìn)行基因功能的大規(guī)模篩選。實(shí)施例3：在棉花中開(kāi)發(fā)vigs系統(tǒng)，使用ch42和pds作為標(biāo)記基因此實(shí)施例描述了棉花中基于其它煙草脆裂病毒(trv)的載體的構(gòu)建和其在病毒誘導(dǎo)的基因沉默中的應(yīng)用。我們測(cè)定了合成的trv(strv)克隆在陸地棉中抑制ch42基因表達(dá)的基因沉默效率。ch42基因編碼的酶負(fù)責(zé)在葉綠素生物合成期間將鎂加入卟啉環(huán)中。當(dāng)此基因被沉默時(shí)，葉綠素合成被阻斷，因此葉喪失了它們的綠色，但因存在類胡蘿卜素而顯出黃色。為了從陸地棉中擴(kuò)增ch42同源物，假定的est序列通過(guò)使用擬南芥ch42基因(nm117962)作為genbank全est序列blast的種子序列來(lái)鑒定。在棉花中鑒定出一個(gè)編碼假定的ch42蛋白的est。設(shè)計(jì)pcr引物(seqidno:54和55)以通過(guò)pcr擴(kuò)增陸地棉的653-bpch42cdna，且將ch42片段(seqidno:76)插入pstrv2mcs位點(diǎn)以得到pstrv2:ch42。ch42的序列通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。將攜帶pstrv1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物與攜帶pstrv2:ch42或pstrv2載體對(duì)照的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合。將混合培養(yǎng)物真空滲入具有2-3片真正葉子的陸地棉植物中(具體參見(jiàn)實(shí)施例1)。檢驗(yàn)所處理植物的上部葉或生殖器官花芽的沉默效果(圖4a和4b)。在幾乎全部處理植物中，觀察到靶基因在整株植物中的均勻沉默，這有助于使用vigs進(jìn)行高通量研究和快速分析，因?yàn)檫@允許簡(jiǎn)易取樣和收集重復(fù)數(shù)據(jù)。使用從不同strv載體處理的植物中提取的總rna來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，以在分子水平上確認(rèn)ch42基因的vigs，結(jié)果顯示在圖4c中。在pstrv2:ch42感染植物的上部葉中ch42rna的積累遠(yuǎn)低于空pstrv2載體感染的植物，在ch42處理的植物中僅剩余0.2％的ch42rna。我們進(jìn)一步選擇，以沉默另一種標(biāo)記基因八氫番茄紅素去飽和酶(pds)，此基因編碼參與類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶。pds基因的沉默將抑制類胡蘿卜素生物合成，這導(dǎo)致葉綠素在高光強(qiáng)度下的光氧化和破壞，引起光褪色的葉子。為了從陸地棉中擴(kuò)增pds同源物，假定的est序列通過(guò)使用擬南芥pds基因(ay057669)序列在genbank全est序列中進(jìn)行blast來(lái)鑒定。在棉花中鑒定出一個(gè)編碼假定的pds蛋白的est。設(shè)計(jì)pcr引物(seqidno:56和57)以通過(guò)pcr擴(kuò)增陸地棉的479-bppdscdna，且將pds片段(seqidno:77)插入strv2mcs位點(diǎn)以得到pstrv2:pds。pds的序列通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。將攜帶pstrv1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物與攜帶pstrv2:pds或載體對(duì)照的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合。將混合培養(yǎng)物真空滲入具有2-3片真正葉子的陸地棉植物中。檢驗(yàn)所處理植物的上部葉的沉默效果(圖4a)。使用從不同strv載體處理的植物中提取的總rna來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，以在分子水平上確認(rèn)pds基因的vigs，結(jié)果顯示在圖4c中。在pstrv:pds感染植物的上部葉中pdsrna的積累遠(yuǎn)低于空strv載體感染的植物，在pds處理的植物中僅剩余10％的pdsrna。實(shí)施例4：在其它棉花種質(zhì)中證實(shí)vigs系統(tǒng)棉花屬包括約45個(gè)二倍體(2n＝2x＝26)和5個(gè)四倍體(2n＝4x＝52)的物種，它們?nèi)匡@示出二體遺傳模式。盡管也在一定程度上使用其它三種物種，海島棉(四倍體)、亞洲棉(二倍體)和草棉(二倍體)，但最普遍的棉花變種是陸地棉(陸地棉，四倍體)的形式，其占世界范圍內(nèi)每年棉花作物的約95％。其它這三類物種也是重要的遺傳資源，為專門育種目的提供了基因庫(kù)。例如，對(duì)生物和非生物脅迫具有高抗性的草棉可被用作與陸地棉進(jìn)行種間雜交以改善其對(duì)各種脅迫抗性的良好起始遺傳材料。因此，也十分需要在棉屬和親緣植物中進(jìn)行基因功能性分析的獨(dú)立于物種的方法。圖5a-5c顯示，通過(guò)對(duì)一種葉綠素生物合成基因鎂螯合酶ch42基因的沉默作用，表明vigs系統(tǒng)不但在四倍體棉花陸地棉中起作用，而且也在二倍體棉花亞洲棉和草棉中起作用。攜帶pstrv1和pstrv2(圖5a，載體對(duì)照1+2)或pstrv2:ch42(圖5b和5c)的根瘤農(nóng)桿菌株的培養(yǎng)物以1:1的比例混合。將混合培養(yǎng)物真空滲透入2-3葉齡植物期的亞洲棉和草棉植物。圖5a和5b的棉花葉采自7dpi，而圖5c的棉花葉采自14dpi。我們的數(shù)據(jù)表明我們的strvvigs系統(tǒng)可在全部測(cè)試的二倍體和四倍體棉花物種中，至少在它們的葉中起作用。這些數(shù)據(jù)表明此strvvigs系統(tǒng)也可在源自種內(nèi)或種間雜交的全部商購(gòu)棉花變種和種質(zhì)中起作用。實(shí)施例5：使用vigs分析棉花中轉(zhuǎn)錄因子基因的功能轉(zhuǎn)錄因子(tfs)介導(dǎo)調(diào)節(jié)的mrna產(chǎn)生是調(diào)節(jié)植物應(yīng)答發(fā)育信號(hào)和環(huán)境暗示的主要方法，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)已在諸如擬南芥和大米等模式植物中廣泛地研究。我們測(cè)試了trv-vigs系統(tǒng)在tf基因功能高通量分析中的應(yīng)用。擬南芥asymmetricleaves1(as1)和其直系同源物屬于r2r3myb家族。它們?cè)谥l頂端分生組織、葉和果實(shí)發(fā)育中起到進(jìn)化保守的作用(sunetal,2002；alonso-cantabranaetal.,2007)。as1通過(guò)結(jié)合i類knotted1-樣同源盒(knox)基因的啟動(dòng)子來(lái)抑制其表達(dá)(guoetal.,2008)，且其通過(guò)調(diào)節(jié)植物激素活性來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞功能(alonso-cantabranaetal.,2007)。as1也通過(guò)選擇性結(jié)合某些jp響應(yīng)性基因啟動(dòng)子來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)對(duì)病原菌的誘導(dǎo)抗性(nurmbergetal.,2007；yangetal.,2008)。相反，as1是抗細(xì)菌性病原體的非水楊酸(sa)依賴型細(xì)胞外防御的正向調(diào)節(jié)子(nurmbergetal.,2007)。為了研究as1在棉花發(fā)育和生物脅迫中的作用，我們首先克隆了假定的棉花as1基因同源物。我們使用擬南芥as1(genbank登錄號(hào)：nm129319)的氨基酸序列和tblastn來(lái)檢索genbank棉花est數(shù)據(jù)庫(kù)。棉花est克隆dt568841、dw499296、es792898與擬南芥as1顯示出顯著的同源性?；谶@些信息，我們得到了全長(zhǎng)cdna編碼的假定的棉花as1蛋白。假定的棉花as1基因的核苷酸序列在seqidno:17中示出。棉花as1的氨基酸序列分析與擬南芥as1顯示出65.9％的相同性和75.8％的相似性(圖4a)。與不同植物物種的其它as1類似，此棉花as1包含保守的r2r3myb結(jié)構(gòu)域(由圖6中黑色下劃線所示)。r2r3myb結(jié)構(gòu)域外側(cè)的氨基酸序列在此假定的棉花as1和其它as1直系同源物之間顯著不同(圖6)。假定的棉花as1基因的氨基酸在seqidno:18中示出。為了擴(kuò)增用于在棉花中通過(guò)vigs進(jìn)行功能性分析的as1基因，設(shè)計(jì)pcr引物以獲得418bp片段，將此片段插入pstrv2以得到pstrv2:as1。將包含pstrv1和pstrv2:as1載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物真空滲入棉花植物中。在18dpi后，在新生葉中可見(jiàn)到明顯的表型。若干向下的卷曲是葉子近軸側(cè)最明顯的表型(圖7b和圖7c)。as1表達(dá)沉默的葉子中具有正常的近軸/遠(yuǎn)軸極性，但在近軸區(qū)域顯示出特異性分布，導(dǎo)致異位葉片在葉脈水平側(cè)面上的形成(圖7d)。異位近軸葉片(eb)直接發(fā)育自主要葉片(pb)的主葉脈且顯示出固定極性(圖7d)。也通過(guò)使用掃描電鏡來(lái)詳細(xì)地確認(rèn)as1處理的植物的這些表型(圖7f和圖7g)。這些表型也發(fā)現(xiàn)在as1下調(diào)的煙草中(mchaleandkoning,2004)。在擬南芥和煙草中，knox基因的異位表達(dá)導(dǎo)致異位近軸葉片的產(chǎn)生(orretal.,2000；mchaleandkoning,2004)。在麻瘋樹(shù)(jatropha)(大戟科(euphorbiaceae)家族的小型木本植物)中，as1樣基因的沉默也導(dǎo)致類似的異位近軸葉片和向下的葉卷曲(參見(jiàn)2009年12月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/sg20009/000481和2009年1月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/143,484)。在此假定的棉花as1基因沉默植物和其它as1同源物下調(diào)植物間的表型相似性說(shuō)明此基因?yàn)槊藁ㄖ衋s1基因同源物。使用從受處理植物的葉中提取的總rna來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，以在分子水平上確認(rèn)as1基因的vigs，結(jié)果顯示在圖7h中。在pstrv2:as1感染植物的上部葉中as1rna的積累遠(yuǎn)低于空strv載體感染的植物，在as1處理的植物中僅剩余17％的as1rna。這些近軸葉片表型提供了這樣的證據(jù)，即這是棉花as1基因，且trvvigs可用在棉花中以用于對(duì)tf基因功能的快速篩選。這類基因?qū)Σ煌l(fā)育時(shí)期棉鈴發(fā)育以及棉纖維起始和伸長(zhǎng)都很重要。更重要地，最近的證據(jù)顯示共同的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)擬南芥中葉和果實(shí)的模式(nurmbergetal.,2007)。因此，可使用葉作為模式系統(tǒng)來(lái)快速測(cè)定tf的基因功能，并利用此信息進(jìn)一步利用這些基因來(lái)修飾或增強(qiáng)棉花纖維的質(zhì)量和數(shù)量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)植物產(chǎn)物摂意在包括可從特定植物獲得的任何物，例如，果實(shí)、種子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蠟、蛋白、脂類、脂肪酸、維生素、全部或部分的植物組織(例如，根、葉、莖、花、棉桃、果實(shí)、皮)、細(xì)胞、細(xì)胞懸液、塊莖和匍匐莖。實(shí)施例6：通過(guò)vigs對(duì)棉花中的小rna途徑基因進(jìn)行功能性分析小rna(smrna)調(diào)節(jié)植物抗病毒以及植物發(fā)育和分化等多種過(guò)程。我們測(cè)試了trvvigs系統(tǒng)對(duì)參與smrna生物發(fā)生途徑的基因的功能進(jìn)行高通量分析的能力。全部rna沉默途徑需要18-至26-ntsmrna的生物發(fā)生，所述smrna來(lái)自雙聯(lián)rna(dsrna)的裂解或單鏈病毒rna內(nèi)的高度結(jié)構(gòu)化區(qū)域。微小rna是一種重要的smrna。通過(guò)結(jié)合argonaute1(ago1)蛋白，mirna引導(dǎo)rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(riscs)，以裂解具有部分或全部序列互補(bǔ)性的mrna。因此，擬南芥ago1結(jié)合mirna并顯示出對(duì)mirna靶的剪接子活性，且強(qiáng)ago1功能缺失突變體積累過(guò)多mirna靶轉(zhuǎn)錄物(baulcombe,2004)。也已證明ago1結(jié)合病毒源的sirna，且ago1突變體顯示出對(duì)病毒的超敏感性(beclinetal.,2002；moreletal.,2002)。為了研究ago1在棉花發(fā)育和生物脅迫中的作用，我們首先克隆了ago1的棉花同源物。我們使用擬南芥ago1(genbank登錄號(hào)：nm_179453)的氨基酸序列和tblastn來(lái)檢索genbank棉花est數(shù)據(jù)庫(kù)。一些棉花est克隆顯示出與擬南芥ago1不同區(qū)域的顯著同源性?；诖诵畔?，我們獲得了編碼一部分假定的棉花ago1蛋白的2329bp部分cdna序列。棉花ago1基因的核苷酸序列在seqidno:23中示出。棉花ago1的氨基酸序列在seqidno:24中示出。在此776個(gè)氨基酸區(qū)域中，此假定的棉花ago1的分析顯示出與擬南芥ago1具有87.5％的相同性和92.7％的相似性。為了擴(kuò)增用于在棉花中通過(guò)vigs進(jìn)行功能性分析的ago1樣基因，設(shè)計(jì)pcr引物以獲得583bp片段，將此片段插入pstrv2以得到pstrv2:ago1。將包含pstrv1和pstrv2:ago1載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物真空滲入棉花植物中。將包含pstrv1和pstrv2:ago1載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物滲入棉花植物中。在27dpi后，在新生葉中可見(jiàn)到多種和變化的表型。若干向下的卷曲是葉子近軸側(cè)(圖8b)和遠(yuǎn)軸側(cè)(圖8c)最明顯的表型。ago1沉默的葉顯示出在遠(yuǎn)軸區(qū)域的特異性破壞，導(dǎo)致遠(yuǎn)軸異位葉片的形成(圖8c)。我們進(jìn)一步觀察到沿葉脈和面對(duì)主要遠(yuǎn)軸葉片的異位遠(yuǎn)軸側(cè)出現(xiàn)的遠(yuǎn)軸葉片結(jié)構(gòu)(圖8c)。在擬南芥中，異位的phav表達(dá)導(dǎo)致在突變體中異位遠(yuǎn)軸葉片的形成(kidnerandmartienssen,2004)。在麻瘋樹(shù)(大戟科家族的小型木本植物)中，ago1樣基因的沉默也導(dǎo)致類似的異位遠(yuǎn)軸葉片和向上的葉卷曲(參見(jiàn)2009年12月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/sg20009/000481和2009年1月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/143,484)。這些表型相似性提示此基因?yàn)槊藁ㄖ械腶go1同源物。這些遠(yuǎn)軸葉片表型提供了這樣的證據(jù)，即這是棉花ago1基因，且trvvigs可用在棉花中以用于對(duì)小rna調(diào)節(jié)途徑和病毒抗性途徑的功能的快速篩選。這類基因?qū)Σ煌l(fā)育時(shí)期棉鈴發(fā)育以及棉纖維起始和伸長(zhǎng)都很重要。更重要地，最近的證據(jù)顯示共同的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)擬南芥中葉和果實(shí)的模式(nurmbergetal.,2007)。因此，可使用葉作為模式系統(tǒng)來(lái)快速測(cè)定小rna途徑的基因功能，并利用此信息進(jìn)一步利用這些基因來(lái)修改或增強(qiáng)棉花纖維的質(zhì)量和數(shù)量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)植物產(chǎn)物摂意在包括可從特定植物獲得的任何物，例如，果實(shí)、種子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蠟、蛋白、脂類、脂肪酸、維生素、全部或部分的植物組織(例如，根、葉、莖、花、棉桃、果實(shí)、皮)、細(xì)胞、細(xì)胞懸液、塊莖和匍匐莖。實(shí)施例7：通過(guò)vigs對(duì)棉花中的原花色素進(jìn)行功能性分析原花色素(pa)是一種主要類型的類黃酮中，即植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的最大類中的一種。pa是類黃酮生物合成途徑的寡聚和聚合終產(chǎn)物。pa起到抗生素、antisporulants、取食抑制劑和酶變性劑的作用。許多證據(jù)已經(jīng)顯示出棉花凋謝病/昆蟲(chóng)抗性與棉花中pa水平的良好相關(guān)性。對(duì)pa生物合成途徑進(jìn)行的大多數(shù)遺傳學(xué)研究已經(jīng)在模式植物擬南芥和最近的蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)上進(jìn)行。據(jù)我們所知，對(duì)棉花中pa生物合成途徑?jīng)]有進(jìn)行基因功能性分析。我們利用我們的strvvigs系統(tǒng)在棉花中破譯用于pa生物合成過(guò)程的結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。pa是來(lái)自導(dǎo)致花青素的途徑的一類產(chǎn)物。兩種酶，即花色素合酶(ans)和花色素(anr)在花青素和pa生物合成之間的支路上起作用。在擬南芥和苜蓿屬(medicago)中，ans將底物黃烷-3,4-二醇(無(wú)色花色素)轉(zhuǎn)化為花色素，此花色素可用作anr的底物以產(chǎn)生另一種主要的pa單元，即2,3-順式-黃烷-3-醇(表兒茶素)。編碼ans和anr的兩種假定的基因被用于插入功能性分析用的strvvigs載體。為了從陸地棉中擴(kuò)增這兩種基因，根據(jù)用擬南芥ans和anr蛋白在genbankest數(shù)據(jù)庫(kù)中的詢問(wèn)結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了pcr引物(ans:seqidno:58和59；anr:seqidno:60和61)來(lái)擴(kuò)增假定的ghansandghanr的部分片段。將pcr產(chǎn)物(ans:seqidno:78；anr:seqidno:79)進(jìn)一步克隆入pstrv2以得到pstrv2:ans和pstrv2:anr。將包含pstrv1以及pstrv2、pstrv2:ans或pstrv2:anr的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物真空滲入具有2-3片真正葉子的棉花植物中。在接種后7-10天后，在pstrv2:anr棉花植物新生葉周圍的葉緣出現(xiàn)了褐色表型。2-7天后，基因沉默表型在整個(gè)葉片，特別是3-5片新生葉的葉脈(圖9a)中很明顯，且褐色表型在滲入葉下的水平葉中也可見(jiàn)。褐色表型也發(fā)現(xiàn)在葉柄(圖9a)、皮(圖10)、根(圖11)和生殖器官花芽(圖12)上。我們推斷，此褐色表型是由于阻斷了anr在花色素向原花色素單元轉(zhuǎn)化上的功能。這種阻斷導(dǎo)致積累了較高水平的有色底物花色素。相反，ans植物與載體對(duì)照植物之間未顯示出可見(jiàn)的表型差異。實(shí)時(shí)pcr的轉(zhuǎn)錄物分析顯示，與載體(1+2)對(duì)照相比，在對(duì)應(yīng)植物中ans和anr轉(zhuǎn)錄物水平降低99.9％(圖9b)。隨后，我們使用了廣泛使用的pa染色劑dmaca來(lái)檢測(cè)基因沉默棉花中pa的聚集水平。dmaca(芳族醛)在與兒茶酚(與棉花pa相關(guān)的主要黃烷-3-醇)反應(yīng)后顯示出深藍(lán)色。dmaca染色顯示，載體(1+2)對(duì)照植物中的大多數(shù)組織包含高水平的pa(圖11中的皮，圖12中的葉、花芽、花、根，和圖13中的全裂花芽)。例如，在棉花葉中，pa在韌皮部周圍的薄壁組織細(xì)胞中高度聚集。在anr植物中，葉脈區(qū)域和葉柄顯示出更深的花色素紅色。與anr植物相反，由于既沒(méi)有花色素紅色，也沒(méi)有pa藍(lán)色，所以ans植物顯示無(wú)色(圖11、圖12和圖13)。anr和ans沉默結(jié)果證明沉默效果可進(jìn)入全部棉花植物，且顯示很均勻的沉默效果，這對(duì)良好vigs系統(tǒng)是很重要的優(yōu)點(diǎn)(圖4a-圖7)。更重要地，沉默可在生殖器官如花芽、花和胚珠中實(shí)現(xiàn)。這些結(jié)果說(shuō)明strvvigs可用于篩選對(duì)棉花纖維發(fā)育重要的基因。ans和anr沉默也發(fā)現(xiàn)在大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)感染并引起枯萎病的棉花根中。這強(qiáng)烈地提示strvvigs系統(tǒng)也可用于抗棉花真菌病。實(shí)施例8：通過(guò)vigs在棉花中對(duì)ctbp進(jìn)行功能性分析棉花纖維為種子毛狀體且是棉花植物最重要的產(chǎn)物。棉花纖維發(fā)育經(jīng)歷了許多不同但重疊的步驟，包括纖維起始、伸長(zhǎng)、次生細(xì)胞壁生物合成和成熟，以產(chǎn)生成熟的纖維。單細(xì)胞棉花纖維也為研究細(xì)胞伸長(zhǎng)提供了獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。以前實(shí)驗(yàn)中的許多證據(jù)已經(jīng)顯示strvvigs系統(tǒng)在植物性以及生殖器官如花和花芽中均可有效地工作。在此實(shí)施例中，我們顯示strvvigs在棉花纖維中也可工作。ctbp(c末端結(jié)合蛋白)是進(jìn)化上保守的nad(h)依賴性轉(zhuǎn)錄輔阻遏物，其活性已顯示為受nad/nadh比例的調(diào)節(jié)。雖然最近的研究已經(jīng)對(duì)ctbp調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和與其它蛋白組分之間相互作用的機(jī)理提出了新觀點(diǎn)，但仍未完全理解ctbp的生物學(xué)功能。angustifolia(an)是來(lái)自植物以及擬南芥中毛狀體分支的對(duì)照葉寬度和模式的第一個(gè)c末端結(jié)合蛋白(ctbp)基因。然而，尚不知道ctbp或其直系同源物在棉花纖維發(fā)育中的作用。為了從陸地棉中擴(kuò)增an直系同源物，假定的est序列通過(guò)使用擬南芥an基因(nm100033)序列在genbank全棉花est序列中進(jìn)行blast來(lái)鑒定。在棉花中鑒定出一個(gè)編碼假定的an蛋白的est。設(shè)計(jì)pcr引物(seqidno:62和63)以通過(guò)pcr擴(kuò)增陸地棉的621-bpancdna，且將an片段(seqidno:80)插入strv2mcs位點(diǎn)以得到pstrv2:an。an序列也通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。將攜帶ptrv1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物與攜帶pstrv2:an或載體對(duì)照的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合。將混合培養(yǎng)物真空滲入具有2-3片真正葉子的陸地棉植物中(具體參見(jiàn)實(shí)施例1)。在an沉默的棉花植物的植物性器官中沒(méi)有明顯的表型，如毛狀體分支的葉寬度(圖13a和13b)和模式。使用從受處理植物的上部葉中提取的總rna來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，以在分子水平上確認(rèn)an基因的vigs，結(jié)果顯示在圖16a中。在pstrv2:an感染植物的上部葉中anrna的積累遠(yuǎn)低于空strv載體感染的植物，在an處理的植物中僅剩余10％的anrna。這些數(shù)據(jù)提示，an在葉寬度方向的葉展開(kāi)上的作用在棉花中不保守。與在植物性生長(zhǎng)和發(fā)育上無(wú)明顯作用相反，an在器官大小確定，特別是寬度方向和纖維發(fā)育中起到很關(guān)鍵的作用。在an沉默的棉花中，與各自的對(duì)照相比(圖13c、13e、13g、13i、13k、13m)，花芽和花球更薄且更小(圖13d、13f、13h、13j、13l、13n)。在an沉默的花球中，最明顯的表型顯示為在一個(gè)胚珠很少的起始纖維和在一個(gè)花球中很少的總胚珠數(shù)(圖14和圖15)。實(shí)時(shí)pcr分析顯示an轉(zhuǎn)錄物水平在胚珠中顯著降低(圖16b)。這可由皮層mt的異常排列引起?，F(xiàn)已證明，皮層微管的異常排列歸因于擬南芥中細(xì)胞的異常形狀。an基因可通過(guò)控制皮層mt的排列來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的極性(kimetal.,2002)。除了an在細(xì)胞骨架中的作用，其通過(guò)與其它蛋白組分的相互作用也可有諸如發(fā)育中逆轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等其它作用。an編碼與c末端結(jié)合蛋白/brefeldina核糖基化底物具有序列相似性的新型蛋白，已知此底物參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或囊泡發(fā)育。在動(dòng)物王國(guó)中，ctbps自身結(jié)合且起到轉(zhuǎn)錄協(xié)阻抑物的作用。在鼠中，ctbp參與胚胎發(fā)生，突變體導(dǎo)致在某些時(shí)期胚胎發(fā)育停止。這可有助于解釋為何在棉花胚珠發(fā)育中一些an沉默的胚珠是致死的(圖14)。擬南芥中微陣列分析提示an基因可能調(diào)節(jié)某些基因，如參與細(xì)胞壁形成的基因的表達(dá)(kimetal.,2002)。此實(shí)施例清楚地表明strvvigs在棉花纖維和胚珠發(fā)育步驟中很好地工作，此步驟是確定棉花纖維長(zhǎng)度、纖維和胚珠數(shù)量的關(guān)鍵時(shí)期。實(shí)施例9：通過(guò)vigs在棉花中對(duì)ktn進(jìn)行功能性分析藥理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，微管細(xì)胞骨架在植物細(xì)胞形態(tài)發(fā)生中起重要作用。微管細(xì)胞骨架可參與將攜帶膜和細(xì)胞壁組分的囊泡和細(xì)胞器運(yùn)輸至根毛、毛狀體細(xì)胞和花粉管中的細(xì)胞生長(zhǎng)位點(diǎn)。因此，微管細(xì)胞骨架對(duì)細(xì)胞伸長(zhǎng)和根尖生長(zhǎng)是必需的。劍蛋白(ktn)是異源二聚體微管(mt)切斷蛋白，其使用來(lái)自atp水解的能量產(chǎn)生沿mt的內(nèi)部斷裂。兩個(gè)亞基之一的劍蛋白p60具有atpase和mt結(jié)合/切斷活性，p60亞基負(fù)責(zé)將劍蛋白靶向至某些亞細(xì)胞位置。在動(dòng)物中，劍蛋白對(duì)將mt從它們?cè)谥行捏w的成核位點(diǎn)中釋放起到重要作用。其也參與將mt切割為更小的片段，此片段用作進(jìn)一步聚合的模板以在減數(shù)分裂和有絲分裂紡錘體組裝期間增加mt數(shù)量。劍蛋白同源物存在于各種植物物種中。已顯示擬南芥劍蛋白同源物具有體外atp依賴的mt切割活性，且在細(xì)胞皮層和核周區(qū)域顯示出點(diǎn)狀定位模式(punctatelocalizationpattern)。通過(guò)遺傳突變破壞劍蛋白功能會(huì)導(dǎo)致核周mt排列消失的延遲，并引起伸長(zhǎng)細(xì)胞中皮層mt的異常組織化。因此，劍蛋白突變導(dǎo)致細(xì)胞伸長(zhǎng)、纖維素微纖維沉積和激素應(yīng)答的缺陷。劍蛋白的研究為我們理解其在細(xì)胞功能中的作用提供了新體會(huì)。sirna在胚珠和纖維中的富集提示纖維發(fā)育期間活性小rna代謝和染色質(zhì)修飾，然而mirna在纖維中的普遍抑制與12個(gè)確定的mirna靶的上調(diào)有關(guān)，這些mirna靶編碼轉(zhuǎn)錄和植物激素響應(yīng)因子，包括發(fā)現(xiàn)待在棉花纖維中高表達(dá)的基因。微管動(dòng)力學(xué)在mirna引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制中起作用，但在mirna引導(dǎo)的分裂中不起作用。然而，尚不知道ktn在生殖器官發(fā)育或其直系同源物在棉花纖維發(fā)育中的作用。為了從陸地棉中擴(kuò)增ktn直系同源物，假定的est序列通過(guò)使用擬南芥ktn基因(nm_106684.4)序列在genbank全棉花est序列中進(jìn)行blast來(lái)鑒定。在棉花中鑒定出一個(gè)編碼假定的ktn蛋白的est。設(shè)計(jì)pcr引物(seqidno:64和65)以通過(guò)pcr擴(kuò)增陸地棉的675-bpktncdna，且將ktn片段(seqidno:81)插入strv2mcs位點(diǎn)以得到pstrv2:ktn。ktn的序列通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。將攜帶ptrv1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物與攜帶pstrv2:ktn或載體對(duì)照的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合。將混合培養(yǎng)物真空滲入具有2-3片真正葉子的陸地棉植物中(具體參見(jiàn)實(shí)施例1)。在ktn沉默的棉花植物的植物性器官中有明顯的表型，如深綠和較小的葉片、較短的葉柄(相比于圖17a中的載體對(duì)照和圖17b中的ktn沉默)以及毛狀體分支的模式和葉毛狀體的長(zhǎng)度(圖19)。這些數(shù)據(jù)提示ktn在植物發(fā)育中發(fā)揮多種重要作用。ktn不但在植物性生長(zhǎng)和發(fā)育中起作用，而且也在器官大小確定，特別是寬度方向和纖維發(fā)育中起到很關(guān)鍵的作用。在ktn沉默的棉花中，與各自的對(duì)照相比(圖17c、17e、17g、17i)，花芽和花球更薄且更小(圖17d、17f、17h、17j)。ktn沉默的花球中最明顯的表型變現(xiàn)為在一個(gè)胚珠中纖維更短(圖18)。這可由皮層mt的異常排列引起?，F(xiàn)已證明，皮層微管的異常排列歸因于擬南芥中細(xì)胞的異常形狀。實(shí)施例10：使用瞬時(shí)表達(dá)載體在棉花中表達(dá)使用經(jīng)遺傳工程化以產(chǎn)生諸如蘇云金桿菌(bt)毒素等表達(dá)蛋白或多肽的作物已快速增加至大于32,000,000公頃。在難以轉(zhuǎn)化的棉花中很需要快速表達(dá)外源或內(nèi)源性多肽的瞬時(shí)系統(tǒng)。使用本發(fā)明方法的瞬時(shí)表達(dá)的實(shí)例如下所述。簡(jiǎn)單地，此方法需要包含植物啟動(dòng)子、編碼蛋白的dna序列的異源dna構(gòu)建體。優(yōu)選地，dna構(gòu)建體編碼另一種感興趣的基因。例如，dna構(gòu)建體可包含這樣的基因，此基因的表達(dá)導(dǎo)致在滲入植物中棉花對(duì)昆蟲(chóng)抗性的增加或增加棉花纖維長(zhǎng)度或其它農(nóng)藝學(xué)性質(zhì)。在以下實(shí)施例中，瞬時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)的棉花植物從被包括gfp基因的農(nóng)桿菌真空滲入的組織中獲得。此gfp基因和其它基因如gus、熒光素酶基因可作為簡(jiǎn)單地可篩選標(biāo)記用在下述一些實(shí)例中，簡(jiǎn)單的原因是因?yàn)樗鼈兊谋硇鸵子谠谡婵諠B入的植物中檢測(cè)到。有理由預(yù)期，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的dna構(gòu)建體，可應(yīng)用本發(fā)明來(lái)獲得實(shí)際上表達(dá)其它任何基因的棉花植物。在其它實(shí)施方式中，用于獲得瞬時(shí)表達(dá)的棉花植物的方法包括將gfp與包括感興趣基因的其它基因融合。為了擴(kuò)增在棉花中作為標(biāo)記以用于瞬時(shí)表達(dá)分析的gfp基因，針對(duì)被插入pstrv2001以pstrv2:gfp的片段設(shè)計(jì)pcr引物，此pstrv2001具有合成的豌豆早枯病毒(pebv)亞基因組啟動(dòng)子。將包含pstrv1和pstrv2:gfp載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的混合物真空滲入棉花植物中。在3dpi時(shí)，當(dāng)在全部植物中用紫外光刺激滲入的棉花植物時(shí)，強(qiáng)gfp表達(dá)被快速地篩選(圖20b、20c、20d)。收集棉花葉，并使用gfp抗體來(lái)檢測(cè)麻瘋樹(shù)毒蛋白。蛋白印跡分析顯示強(qiáng)gfp積累在棉花葉中。核酮糖1,5-二磷酸鹽羧化酶/加氧酶的大亞基的考馬斯亮藍(lán)染色表明了可比較的樣品上樣。實(shí)施例11：包含內(nèi)含子的修飾型vigs載體有很多原因會(huì)引起rna病毒載體的轉(zhuǎn)錄起始困難。首先是可能被rna加工工具錯(cuò)誤識(shí)別的非最佳化的基因組序列，如嵌在rna基因組中的隱蔽剪接位點(diǎn)和富含胸腺嘧啶的假定的內(nèi)含子序列。其次，trvrna1病毒載體編碼約7.0kb核苷酸的極大的轉(zhuǎn)錄物，其大小是平均植物基因大小(1-2kb)的約3-4倍。實(shí)際上，植物基因通常包含有助于來(lái)自細(xì)胞核的前mrna加工和輸出的大量?jī)?nèi)含子。在本發(fā)明的基于農(nóng)桿菌滲入法的vigs和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，沒(méi)有內(nèi)含子序列，在來(lái)自病毒構(gòu)建體的植物細(xì)胞核中產(chǎn)生的前mrna轉(zhuǎn)錄物無(wú)法被有效地識(shí)別或適當(dāng)?shù)丶庸ぁＡ硗獾膬?nèi)含子可使病毒轉(zhuǎn)錄物更容易地被宿主細(xì)胞核前mrna加工和輸出工具識(shí)別，以此增加能發(fā)生病毒復(fù)制的植物細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以及增加能起始感染的效率。共有序列ag/gt被用作內(nèi)含子插入的靶序列。在第二輪篩選循環(huán)中，我們使用netgeneii程序(httpcolonbackslashbackslashwwwdotcbsdotdtudotdkbackslashservicesbackslashnetgene2/)來(lái)分析trv1的序列，此程序使用為擬南芥序列設(shè)定的參數(shù)。我們注意到一個(gè)具有高可信度的包含ag/gt的位點(diǎn)(pstrv1001序列中10919-10922的位置)，以用作供體剪接位點(diǎn)。因此，我們選擇此位點(diǎn)來(lái)插入植物內(nèi)含子。使用重疊pcr來(lái)產(chǎn)生trv1，此trv1與源自擬南芥的內(nèi)含子序列融合，并插入pstrv1001載體中以得到pstrv1001-內(nèi)含子載體。分析修飾的載體，以顯示包含內(nèi)含子的載體可導(dǎo)致更好的vigs效率和更高的過(guò)表達(dá)水平。實(shí)施例12：實(shí)施例13的材料和方法實(shí)施例12和13中所述的方法涉及克隆與細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞壁和纖維素生物合成進(jìn)入病毒遞送載體相關(guān)的靶棉花基因的短序列。載體用于體外感染棉花胚珠，且在若干天或周中，涉及抑制病毒復(fù)制的天然防御機(jī)制導(dǎo)致來(lái)自被靶向沉默的內(nèi)源性植物基因的mrna的特異性降解。此方法快速(從感染至沉默為1-4天)，不需要開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，允許表征在穩(wěn)定系中可能致死的表型，且提供沉默基因家族中單個(gè)或多個(gè)成員的潛力。植物生長(zhǎng)條件：全部棉花植物(陸地棉)在具有自然溫度和光照的溫室的盆栽土中生長(zhǎng)。在開(kāi)花期標(biāo)記待用于收集子房的花芽，并在這天的后1天收集對(duì)應(yīng)的棉桃。棉花胚珠培養(yǎng)：在開(kāi)花期后一天(dpa)，收集花芽或棉桃，并去除苞葉、萼片和花瓣。將子房使用75％乙醇消毒，隨后用無(wú)菌水清洗3-5次。將胚珠在無(wú)菌條件下從子房中小心地切割下。將這些胚珠用包含肌動(dòng)蛋白1基因的trv感染。在用無(wú)菌水清洗3-5次后，將這些胚珠立即浮在添加有1.1mg/liaa、1.7mg/lga3和0.3mg/liba的bt培養(yǎng)基的表面上(beasleyandting1973)。使用前，對(duì)bt培養(yǎng)基充氧(純氧)30分鐘。將胚珠在32ec下的黑暗中孵育，除偶爾簡(jiǎn)單檢查外不攪動(dòng)。棉花胚珠培養(yǎng)物顯示在圖21a和21b中。掃描電鏡：為了檢驗(yàn)纖維起始和伸長(zhǎng)，將trv-肌動(dòng)蛋白1感染的胚珠置于鋁樣品支持器上的雙側(cè)粘性帶上并立即用液氮冷凍。冷凍樣品用jsm-6360lv掃描電鏡(jeol,tokyo,japan)觀察?？俽na提取：棉花纖維在液氮中冷凍，并用杵在冷研缽研磨成細(xì)粉末。根據(jù)wanandwilkins(1994)，從至多100mg研磨的纖維中提取總rna。全部rna制備物用dnase處理并用qiagenrneasy植物小試劑盒純化。逆轉(zhuǎn)錄pcr分析：在全部實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行兩步rt-pcr步驟。首先，使用rt-pcr用的superscript第一鏈合成系統(tǒng)(invitrogen)從2μg總rna中合成第一鏈cdna，并用1μg寡聚脫氧胸腺嘧啶(dt)(dt15)來(lái)引發(fā)延伸。隨后，將cdna用作使用基因特異性引物的rt-pcr反應(yīng)的模板。用于擴(kuò)增ghactin1的rt-pcr引物為act-up(5′-atattctagaagaagaactatgagttgcct-3′；seqidno:28)和act-dn(5′-atgggatcccgtagagatccttcctgatat-3′；seqidno:29)。微管蛋白基因用作rna標(biāo)準(zhǔn)。用于擴(kuò)增ghtubulin基因的rt-pcr引物為tub-up(5′-gatgttgtgcccaaggatgttaatgc-3′；seqidno:30)和tub-dn(5′-atgagatcaaacttgtggtcaatgcg-3′；seqidno:31)。實(shí)時(shí)pcr分析：棉花纖維中g(shù)hactin1基因的表達(dá)使用表4所示的基因特異性引物和熒光嵌入染料sybr-green，通過(guò)實(shí)時(shí)定量rt-pcr在檢測(cè)系統(tǒng)(appliedbiosystems)中分析。棉花微管蛋白基因(ghtubulin)或泛素基因(ghubiquitin)用作qrt-pcr反應(yīng)中的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。使用powersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)和abi7900序列檢測(cè)系統(tǒng)，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(appliedbiosystems)來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)。通過(guò)sybr-綠色熒光來(lái)檢測(cè)每個(gè)循環(huán)的靶基因的擴(kuò)增。表達(dá)水平的相對(duì)值通過(guò)等式y(tǒng)＝靶基因(肌動(dòng)蛋白1)/標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(微管蛋白或泛素)來(lái)計(jì)算。表4：基因特異性實(shí)時(shí)pcr分析中用的引物實(shí)施例8：棉花基因在纖維發(fā)育中的功能為了測(cè)試棉花基因在纖維發(fā)育中的功能，我們選擇了ghactin1、ghadf1、ghctr1、ghdella1、ghalpha-tubulin1、ghbeta-tubulin1、ghmads9、ghmby5和ghmby6。應(yīng)用使用rnai技術(shù)的vigs(病毒誘導(dǎo)的基因沉默)方法。將候選基因的500-650bp片段構(gòu)建入包括化學(xué)合成的煙草脆裂病毒(strv)rna2序列的載體中，以產(chǎn)生修飾型strv2載體。為了了解是否全部候選基因的mrna均降低，我們使用基因特異性引物(表4)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量sybr-greenrt-pcr在纖維中分析了全部候選基因的表達(dá)水平。為了了解是否纖維長(zhǎng)度的變化也涉及全部候選基因，我們通過(guò)掃描電鏡觀察了胚珠表面。ghactin1：棉花胚珠培養(yǎng)物中肌動(dòng)蛋白表達(dá)顯示在圖22a和22b中。在野生型對(duì)照纖維和pstrv1+pstrv2對(duì)照載體中檢測(cè)出明顯的帶，然而在vigs-actin1行中未檢測(cè)到信號(hào)或檢測(cè)到弱信號(hào)(圖27a，27b)。實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghactin1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghactin1沉默(圖28)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度短，且毛狀體的表面粗糙且褶皺(圖23a-11d和圖23e-23h)。全部vigs-ghactin1顯示出短纖維表型和肌動(dòng)蛋白1轉(zhuǎn)錄物水平的降低，這說(shuō)明此表型是ghactin1沉默引起的肌動(dòng)蛋白1降低的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)提示ghactin1是纖維伸長(zhǎng)中的主要和功能性基因。ghadf1：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghadf1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghadf1沉默(圖29)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度相同(圖23a-23d和圖23i-23l)。雖然全部vigs-ghadf1顯示出adf1轉(zhuǎn)錄物水平降低，但纖維長(zhǎng)度無(wú)任何變化。這些數(shù)據(jù)提示ghadf1與纖維伸長(zhǎng)無(wú)關(guān)。ghctr1：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghctr1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghctr1沉默(圖30)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度短(圖24a和24b)。全部vigs-ghctr1顯示出短纖維表型和ctr1轉(zhuǎn)錄物水平的降低，這說(shuō)明此表型是ghctr1沉默引起的ctr1降低的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)提示ghctr1是纖維伸長(zhǎng)中的主要和功能性基因。ghdella1：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghdella1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghdella1沉默(圖31)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度相同(圖24a和24c)。雖然全部vigs-ghdella1顯示出della1轉(zhuǎn)錄物水平降低，但纖維長(zhǎng)度無(wú)任何變化。這些數(shù)據(jù)提示ghdella1與纖維伸長(zhǎng)無(wú)關(guān)。ghalpha-tubulin1：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghalpha-tubulin1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghalpha-tubulin1沉默(圖32)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度短，且毛狀體的表面粗糙且褶皺(圖25a和25b)。全部vigs-ghalpha-tubulin1顯示出短纖維表型和alpha-tubulin1轉(zhuǎn)錄物水平的降低，這說(shuō)明此表型是ghalpha-tubulin1沉默引起的alpha-tubulin1降低的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)提示ghalpha-tubulin1是纖維伸長(zhǎng)中的主要和功能性基因。ghbeta-tubulin1：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghbeta-tubulin1rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghbeta-tubulin1沉默(圖33)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度短，且毛狀體的表面粗糙且褶皺(圖25a和25c)。全部vigs-ghbeta-tubulin1顯示出短纖維表型和beta-tubulin1轉(zhuǎn)錄物水平的降低，這說(shuō)明此表型是ghbeta-tubulin1沉默引起的beta-tubulin1降低的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)提示ghbeta-tubulin1是纖維伸長(zhǎng)中的主要和功能性基因。ghmads9：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghmads9rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghmads9沉默(圖34)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度比在相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度長(zhǎng)(圖26a和26b)。全部vigs-ghmads9顯示出短纖維表型和mads9轉(zhuǎn)錄物水平的降低，這說(shuō)明此表型是ghmads9沉默引起的mads9降低的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)提示ghmads9是纖維伸長(zhǎng)中負(fù)調(diào)節(jié)子之一。ghmyb5：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghmyb5rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghmyb5沉默(圖35)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度相同(圖26a和26c)。雖然全部vigs-ghmyb5顯示出myb5轉(zhuǎn)錄物水平降低，但纖維長(zhǎng)度無(wú)任何變化。這些數(shù)據(jù)提示ghmyb5與纖維伸長(zhǎng)無(wú)關(guān)。ghmyb6：實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果揭示，在vigs-1、vigs-2、vigs-3、vigs-4和vigs-5行中，ghmyb6rnai的表達(dá)水平導(dǎo)致完全的ghmyb6沉默(圖36)。sem的結(jié)果提示，纖維長(zhǎng)度與相同時(shí)期pstrv1+pstrv2中的纖維長(zhǎng)度相同(圖26a和26d)。雖然全部vigs-ghmyb6顯示出myb6轉(zhuǎn)錄物水平降低，但纖維長(zhǎng)度無(wú)任何變化。這些數(shù)據(jù)提示ghmyb6與纖維伸長(zhǎng)無(wú)關(guān)。除非特別指出或者上下文明確相反，否則本發(fā)明描述內(nèi)容(特別是權(quán)利要求的上下文中)中，術(shù)語(yǔ)“一”、“所述”和類似詞語(yǔ)應(yīng)理解包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非另外提到，否則術(shù)語(yǔ)“包括”、“具有”、“含有”、“包含”被認(rèn)為是開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)(即，意味著“包括，但不限于”)。文中數(shù)值范圍的列舉僅僅是充當(dāng)范圍內(nèi)每個(gè)單獨(dú)數(shù)值一個(gè)一個(gè)提到的簡(jiǎn)寫(xiě)方法，除非特別指出，否則每個(gè)單獨(dú)值并入說(shuō)明書(shū)，如同每個(gè)單獨(dú)在此提到。例如，如果公開(kāi)了范圍10-15，那么11、12、13和14也被公開(kāi)了。除非特別指出或者上下文明確相反，否則文中描述的所有方法能以任何適宜順序進(jìn)行。任何實(shí)施例的使用，或者文中提供的舉例語(yǔ)言(例如“諸如”)，除非文中要求保護(hù)，否則僅僅為了更好說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明范圍。說(shuō)明書(shū)語(yǔ)言不應(yīng)解釋為指定對(duì)于本發(fā)明實(shí)踐關(guān)鍵的任何未要求元素。應(yīng)意識(shí)到本發(fā)明的方法和組合物包括各種形式的實(shí)施方案，本文僅僅公開(kāi)了一小部分。本發(fā)明文中描述的實(shí)施方案包括本發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明的最好方式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀以上描述的基礎(chǔ)上可顯而易見(jiàn)實(shí)施方案的變化。本發(fā)明人期望技術(shù)人員可以適當(dāng)應(yīng)用這些改變，且可以本文所述不同的方式實(shí)施本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明包括適用法律允許的在所附權(quán)利要求中所述主題的所有修改和等價(jià)物。此外，除非特別指出或者上下文明確相反，則上述元素的所有可能范圍內(nèi)的任意變化組合均包含在本發(fā)明內(nèi)。參考文獻(xiàn)alonso-cantabrana,h.etal.(2007).commonregulatorynetworksinleafandfruitpatterningrevealedbymutationsinthearabidopsisasymmetricleaves1gene.development134:2663-2671.baulcombe,d.(2004).rnasilencinginplants.nature431:356-363.beclin,c.etal.(2002).abranchedpathwayfortransgene-inducedrnasilencinginplants.currbiol12:684-688.beasley,c.a.andting,i.p.(1973).theeffectsofplantgrowthsubstancesoninvitrofiberdevelopmentfromfertilizedcottonovules.amerjbot60:130–139.brigneti,g.etal.(2004).virus-inducedgenesilencinginsolanumspecies.plantj39:264-272.burch-smith,t.m.etal.(2004).applicationsandadvantagesofvirus-inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.plantj39:734-746.burch-smith,t.m.(2006).efficientvirus-inducedgenesilencinginarabidopsis.plantphysiol142:21-27.chen,j.c.etal.(2005).silencingaprohibitinaltersplantdevelopmentandsenescence.plantj44:16-24.chung,e.etal.(2004).amethodofhighfrequencyvirus-inducedgenesilencinginchilipepper(capsicumannuuml.cv.bukang).molcells17:377-380.fu,d.q.etal.(2005).virus-inducedgenesilencingintomatofruit.plantj43:299-308.guo,m.etal.(2008).directrepressionofknoxlocibytheasymmetricleaves1complexofarabidopsis.plantcell20:48-58.kidner,c.a.andmartienssen,r.a.(2004).spatiallyrestrictedmicrornadirectsleafpolaritythroughargonaute1.nature428:81-84.kim,g.etal.(2002).theangustifoliageneofarabidopsis,aplantctbpgene,regulatesleaf-cellexpansion,thearrangementofcorticalmicrotubulesinleafcellsandexpressionofageneinvolvedincell-wallformation.emboj21:1267-1279.lee,j.j.etal.(2007).amethodofhighfrequencyvirus-inducedgenesilencinginchilipepper(capsicumannuuml.cv.bukang).molcells17:377-380.liu,y.etal.(2002).virus-inducedgenesilencingintomato.plantj31:777-786.liu,y.etal.(2004).virusinducedgenesilencingofadeficiensorthologinnicotianabenthamiana.plantmolbiol54:701-711.macfarlane,s.a.andpopovich,a.h.(2000).efficientexpressionofforeignproteinsinrootsfromtobravirusvectors.virology267:29-35.mchale,n.a.etal.(2004).phantasticaregulatesdevelopmentoftheadaxialmesophyllinnicotianaleaves.plantcell16:1251-1262.morel,j.b.etal.(2002).fertilehypomorphicargonaute(ago1)mutantsimpairedinpost-transcriptionalgenesilencingandvirusresistance.plantcell14:629-639.nurmberg,p.l.etal.(2007).thedevelopmentalselectoras1isanevolutionarilyconservedregulatoroftheplantimmuneresponse.procnatlacadsciusa104:18795-18800.ori,n.etal.(2000).mechanismsthatcontrolknoxgeneexpressioninthearabidopsisshoot.development127:5523-5532.ruiz,m.t.etal.(1998).initiationandmaintenanceofvirus-inducedgenesilencing.plantcell10:937-946.shi,b.j.etal.(1997).plasmidvectorforcloninginfectiouscdnasfromplantrnaviruses:highinfectivityofcdnaclonesoftomatoaspermycucumovirus.jgenvirol78(pt5):1181-1185.stipanovic,r.d.etal.(1988).terpenoidaldehydesinuplandcottons:analysisbyanilineandhplcmethods.jagricfoodchem36:509-515.sun,y.etal.(2002).asymmetricleaves1,anarabidopsisgenethatisinvolvedinthecontrolofcelldifferentiationinleaves.planta214:694-702.udall,j.a.etal.(2006).aglobalassemblyofcottonests.genomeres16:441-450.valentine,t.etal.(2004).efficientvirus-inducedgenesilencinginrootsusingamodifiedtobaccorattlevirusvector.plantphysiol136:3999-4009.wan,c.y.andwilkins,t.a.(1994).amodifiedhotboratemethodsignificantlyenhancestheyieldofhighqualityrnafromcotton(gossypiumhirsutuml.).analbiochem223:7–12.序列表<110>淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司<120>rapidfunctionalanalysisofcottongenes<130>2577-195<150>61/185,631<151>2009-10-09<160>82<170>patentinversion3.5<210>1<211>17164<212>dna<213>artificial<220><223>sequenceofsyntheticpstrv1001vector<400>1ctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgt60tgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataat120taacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaatt180atacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcg240cgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtg300actgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgcca360gctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctga420atggcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccc480cgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctc540gaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacg600gtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaact660ggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatt720tcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgc780tgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtga840aaagaaaaaccaccccagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagc900gtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccgg960cagctcggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtccgggacggcgtcagc1020gggagagccgttgtaaggcggcagactttgctcatgttaccgatgctattcggaagaacg1080gcaactaagctgccgggtttgaaacacggatgatctcgcggagggtagcatgttgattgt1140aacgatgacagagcgttgctgcctgtgatcaaatatcatctccctcgcagagatccgaat1200tatcagccttcttattcatttctcgcttaaccgtgacaggctgtcgatcttgagaactat1260gccgacataataggaaatcgctggataaagccgctgaggaagctgagtggcgctatttct1320ttagaagtgaacgttgacgatatcaactcccctatccattgctcaccgaatggtacaggt1380cggggacccgaagtt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