發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及殺有害生物蛋白和編碼它們的核酸分子，連同用于控制植物有害生物的組合物和方法。背景蘇云金桿菌(bt)是一種革蘭氏陽性的孢子形成的土壤細(xì)菌，其特征在于它產(chǎn)生晶體包含體的能力，該晶體包含體對(duì)于某些目以及種的植物有害生物(包括昆蟲)是特異地有毒性的，但是對(duì)于植物和其他非目標(biāo)生物是無害的。出于這個(gè)原因，包括蘇云金桿菌菌株或它們的殺昆蟲蛋白質(zhì)的組合物可以用作環(huán)境上可接受的殺昆蟲劑以控制農(nóng)業(yè)昆蟲有害生物或多種人或動(dòng)物疾病的昆蟲載體。來自蘇云金桿菌的晶體(cry)蛋白主要針對(duì)鱗翅目的、雙翅目的、以及鞘翅目的有害生物昆蟲具有有力的殺昆蟲活性。這些蛋白質(zhì)還已經(jīng)顯示針對(duì)以下目的有害生物的活性：膜翅目、同翅目、毛虱目、食毛目、以及壁虱目，連同其他的無脊椎動(dòng)物目，例如線蟲動(dòng)物門、扁形動(dòng)物門、以及肉足鞭毛亞門(斐特爾森,j.(feitelson,j.)1993.在前沿的工程化的殺有害生物劑中的蘇云金桿菌家族樹(thebacillusthuringiensisfamilytree.inadvancedengineeredpesticides).馬塞爾德克爾公司(marceldekker,inc.),紐約,紐約州)。這些蛋白質(zhì)最初主要基于它們的殺蟲活性而被分類為cryi至cryvi。主要的類別是鱗翅目-特異性(i)、鱗翅目-和雙翅目-特異性(ii)、鞘翅目-特異性(iii)、雙翅目特異性(iv)、以及線蟲特異性(v)和(vi)。這些蛋白質(zhì)進(jìn)一步被分類為子族，在各個(gè)家族內(nèi)的更高相關(guān)的蛋白質(zhì)指定了區(qū)分的字母，例如cryia、cryib、cryic、等。在各個(gè)區(qū)分內(nèi)的甚至更緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)被給定名稱，例如cryic(a)、cryic(b)等。術(shù)語“cry毒素”以及“δ-內(nèi)毒素”與術(shù)語“cry蛋白”已可互換地使 用。對(duì)于cry蛋白和基因的當(dāng)前新命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆蟲靶標(biāo)特異性(克里克莫爾(crickmore)等人.(1998)《微生物分子生物學(xué)評(píng)論》(microbiol.mol.biol.rev.)62:807-813)。在這個(gè)更可接受的分類中，每個(gè)毒素被指定一個(gè)唯一的名稱，該名稱合并了一個(gè)初級(jí)等級(jí)(一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)、一個(gè)二級(jí)等級(jí)(一個(gè)大寫字母)、一個(gè)三級(jí)等級(jí)(一個(gè)小寫字母)、以及一個(gè)四級(jí)等級(jí)(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)。在當(dāng)前分類中，在初級(jí)等級(jí)中羅馬數(shù)字已經(jīng)換為阿拉伯?dāng)?shù)字。例如，在舊命名法下的“cryia(a)”現(xiàn)在在當(dāng)前命名法下是“cry1aa”。根據(jù)易卜拉欣(ibrahim)等人(2010,《生物工程學(xué)》(bioeng).蝽象，1:31-50)，cry毒素仍然可以根據(jù)其昆蟲宿主特異性被分為六個(gè)主要類別并且包括：組1-鱗翅目(例如cry1、cry9和cry15)；組2-鱗翅目和雙翅目(例如cry2)；組3-鞘翅目(cry3、cry7和cry8)；組4-雙翅目(cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19和cry20)；組5-鱗翅目和鞘翅目(cry1i)；以及組6-線蟲(cry6)。cry1i、cry2、cry3、cry10和cry11毒素(73–82kda)是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兯坪跏歉骳ry1和cry4蛋白(130–140kda)的天然截短。cry蛋白是在bt的孢子形成階段期間以晶態(tài)形式積聚為原毒素的球狀蛋白質(zhì)分子。在由有害生物攝取后，這些晶體典型地被溶解以釋放原毒素，原毒素大小的范圍可以為，例如，對(duì)于許多該鱗翅目活性的cry蛋白質(zhì)如cry1和cry9為從130-140kda，并且對(duì)于鞘翅目活性的cry3蛋白及鱗翅目/雙翅目活性的cry2蛋白為60-80kda。在這些晶體被易感昆蟲溶解后，這些釋放的原毒素被昆蟲腸道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以產(chǎn)生一種抗蛋白酶的核心cry蛋白毒素。這種蛋白水解加工涉及從各種cry原毒素的不同區(qū)域移除氨基酸。例如，為130-140kda的cry原毒素典型地通過蛋白水解移除25-30個(gè)氨基酸的n-末端肽以及c-末端的大約一半的剩余蛋白，產(chǎn)生一種約60-70kda成熟cry毒素。為60-80kda的原毒素，例如cry2和cry3，也被加工但是其程度不與更大的原毒素相同。與更大的原毒素相比，較小的原毒素典型地從n-末端移除相等或更多個(gè)氨基酸，但較少氨基酸被從c-末端移除。例如，cry2家族成員的蛋白水解激活典型地涉及移除約40-50個(gè)n-末端氨基酸。許多cry蛋白對(duì)特定的目 標(biāo)昆蟲是相當(dāng)有毒的，但許多具有窄的活性譜。cry蛋白質(zhì)通常具有五個(gè)保守序列域、以及三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(參見，例如，德阿加迪爾(demaagd)等人.(2001)《遺傳學(xué)趨勢(shì)》(trendsgenetics)17:193-199)。第一保守結(jié)構(gòu)域(稱作結(jié)構(gòu)域i)典型地由七個(gè)α螺旋組成并且涉及膜插入以及孔形成。結(jié)構(gòu)域ii典型地由三個(gè)安排為希臘鑰匙構(gòu)型的β片層組成，并且結(jié)構(gòu)域iii典型地由兩個(gè)處于‘果凍卷’(‘jelly-roll’)構(gòu)造的反平行的β片層(德阿加迪爾(demaagd)等人，2001，同上)組成。結(jié)構(gòu)域ii和iii涉及受體識(shí)別和結(jié)合，并且因此被考慮為毒素特異性的決定物。眾多商業(yè)上有價(jià)值的植物，包括普通的農(nóng)作物，易受植物有害生物(包括昆蟲和線蟲有害生物)的攻擊的影響，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的實(shí)質(zhì)性降低。例如，植物有害生物是在全世界重要農(nóng)作物損失中的一個(gè)主要因素。由于昆蟲有害生物和疾病，在中國每年收獲的谷類損失約15％-20％。此外，由于無脊椎有害生物(包含昆蟲)的侵染，僅在美國每年就損失大約80億美元。昆蟲有害生物對(duì)于菜農(nóng)和果農(nóng)，對(duì)于觀賞性花卉的生產(chǎn)商，以及對(duì)于家庭花匠也是一種負(fù)擔(dān)。昆蟲有害生物主要是通過密集使用化學(xué)殺有害生物劑來控制，這些化學(xué)殺有害生物劑通過抑制昆蟲成長，預(yù)防昆蟲攝食或繁殖，或者導(dǎo)致死亡而有效。生物性有害生物控制劑，例如表達(dá)殺有害生物毒素(如cry蛋白)的蘇云金桿菌(bacillusthuringiensis)菌株，也已經(jīng)應(yīng)用至作物植物中，產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果，提供化學(xué)殺有害生物劑的替代物或補(bǔ)充物。已經(jīng)分離了編碼這些cry蛋白的一些的基因并且它們?cè)诋愒葱运拗?例如轉(zhuǎn)基因植物)中的表達(dá)已經(jīng)顯示出提供了另一種用于控制經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲有害生物的手段。因此可以達(dá)到良好的昆蟲控制，但是某些化學(xué)品有時(shí)也能影響非靶標(biāo)有益昆蟲，并且某些生物制劑具有非常窄的活性譜。此外，某些化學(xué)和生物控制方法的繼續(xù)使用增加了昆蟲有害生物對(duì)此類控制措施產(chǎn)生抗性的機(jī)會(huì)。通過各種抗性管理實(shí)踐已部分地緩和了這種狀況，但仍需要開發(fā)新型并有效的有害生物控制劑，這些有害生物控制劑為農(nóng)民提供經(jīng)濟(jì)利益并且是環(huán)境可接受的。特別需要是可以靶向更廣譜的經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲有害生物并有效控制昆蟲品系的控制劑，這些昆蟲品系對(duì)現(xiàn)有的昆蟲控制劑是有抗性的或可以變得有抗性。概述鑒于這些需求，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過提供新的蘇云金桿菌(bt)分離株連同可以用來控制多種植物有害生物的新穎基因和殺有害生物蛋白來提供新的有害生物控制劑。本發(fā)明提供了用于賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子的殺有害生物活性的組合物以及方法。具體地，提供了包括從bt分離的編碼cry蛋白的新穎多核苷酸的嵌合基因以及實(shí)質(zhì)上與其一致的序列，這些序列的表達(dá)導(dǎo)致具有對(duì)經(jīng)濟(jì)上重要的昆蟲有害生物(特別是侵染植物的昆蟲有害生物)的毒性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由這些多核苷酸的表達(dá)生成的新穎的cry蛋白，并且涉及含有這些cry蛋白的組合物以及配制品，它們通過抑制昆蟲有害生物的生存、生長以及繁殖或者限制昆蟲相關(guān)的對(duì)作物植物的損害或損失的能力對(duì)昆蟲是有毒的。本發(fā)明的cry蛋白包括天然cry蛋白以及具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或缺失的突變型或變體cry蛋白。突變型cry蛋白的實(shí)例包括但不限于那些被突變?yōu)榫哂斜绕涮烊籧ry蛋白對(duì)應(yīng)物更寬的活性譜或更高的特異活性，那些經(jīng)突變以引入一個(gè)表位來產(chǎn)生從天然蛋白中差異識(shí)別出經(jīng)突變的蛋白的抗體，或那些經(jīng)突變以調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)基因生物中的表達(dá)。本發(fā)明的新穎cry蛋白質(zhì)對(duì)昆蟲有害生物是高毒性的。例如，本發(fā)明的cry蛋白可以用于控制一種或多種經(jīng)濟(jì)學(xué)上重要的昆蟲有害生物，所述昆蟲有害生物例如亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、黃色桃螟蟲(yellowpeachborer)(桃蛀螟(conogethespunctiferalis))、東方黏蟲(orientalarmyworm)(東方粘蟲(mythimnasepatate))、歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))、秋黏蟲(fallarmyworm)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))、玉米穗蛾(cornearworm)(玉米穗蟲(helicoverpazea))、甘蔗螟(sugarcaneborer)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))，絨毛豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis))、大豆夜蛾(soybeanlooper) (大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))，西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))、西部豆切根蟲(westernbeancutworm)(西部豆夜蛾(richiaalbicosta))、煙夜蛾(tobaccobudworm)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))、條紋蛀莖蟲(stripedstemborer)(二化螟(chilosuppressalis))、粉蛀莖蟲(pinkstemborer)(非洲大螟(sesamiacalamistis))、水稻卷葉螟(riceleaffolder)(稻縱卷葉螟(cnaphalocrocismedinalis))等。本發(fā)明還提供了合成的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的cry蛋白，這些cry蛋白已經(jīng)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)密碼子優(yōu)化用于在轉(zhuǎn)基因生物如轉(zhuǎn)基因細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)盒和重組載體，其包括一種編碼本發(fā)明的cry蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包括嵌合基因、或表達(dá)盒或重組載體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織、以及種子，該嵌合基因或表達(dá)盒或重組載體在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織以及種子中表達(dá)本發(fā)明的cry蛋白方面是有用的。本發(fā)明還涉及分離的蘇云金桿菌(bt)菌株，這些菌株產(chǎn)生本發(fā)明的cry蛋白。此類bt菌株可以是天然存在的分離株或一種轉(zhuǎn)基因bt菌株，其產(chǎn)生本發(fā)明的cry蛋白中的一種或多種。本發(fā)明還涉及使用這些多核苷酸的方法，例如在dna構(gòu)建體或嵌合基因或表達(dá)盒或重組載體中用于在生物(包括植物和微生物，如細(xì)菌)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)。核苷酸或氨基酸序列可以是已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于在一種生物(如一種植物或細(xì)菌)中表達(dá)的天然的或合成的序列，或者制成雜交的、具有增強(qiáng)的殺有害生物活性的cry毒素。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造這些cry蛋白的多種方法以及使用這些多核苷酸序列和cry蛋白的多種方法，例如，在微生物中控制昆蟲或者在轉(zhuǎn)基因植物中賦予保護(hù)免受昆蟲損害。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括殺昆蟲組合物和配制品，這些組合物和配制品包括本發(fā)明的cry蛋白或蘇云金桿菌菌株；以及使用這些組合物或配制品來控制昆蟲群體的多種方法，例如通過將這些組合物或配制品施用至昆蟲侵襲的區(qū)域，或者施用至預(yù)防性處理易感染昆蟲的區(qū)域或植物以賦予針對(duì)昆蟲有害生物的保護(hù)。任選地，除本發(fā)明的cry蛋白或bt菌株之外，本發(fā)明的這些組合物或配制品還可以包括其他殺 有害生物劑(例如化學(xué)殺有害生物劑)以加強(qiáng)或增強(qiáng)組合物或配制品的昆蟲控制能力。本發(fā)明的這些組合物和方法有用于控制攻擊植物、特別是作物植物的昆蟲有害生物。本發(fā)明的這些組合物對(duì)于產(chǎn)生改變的或改善的具有殺有害生物活性的cry蛋白、或?qū)τ跈z測(cè)商用產(chǎn)品或轉(zhuǎn)基因生物中的cry蛋白或核酸的存在也是有用的。參考以下詳細(xì)的說明和權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他特征、方面、以及優(yōu)點(diǎn)將變得更好理解。附圖簡要說明圖1是bt-0049和bt-0211cry蛋白的氨基酸序列的比對(duì)。在序列表中的序列的簡要說明seqidno:1代表對(duì)bt-0049蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:2代表對(duì)bt-0063蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:3代表對(duì)bt-0064蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:4代表對(duì)bt-0086蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:5代表對(duì)bt-0498蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:6代表對(duì)bt-0049蛋白進(jìn)行編碼的密碼子優(yōu)化序列。seqidno:7代表對(duì)bt-0063蛋白進(jìn)行編碼的密碼子優(yōu)化序列。seqidno:8代表對(duì)bt-0064蛋白進(jìn)行編碼的密碼子優(yōu)化序列。seqidno:9代表對(duì)bt-0086蛋白進(jìn)行編碼的密碼子優(yōu)化序列。seqidno:10代表對(duì)bt-0498蛋白進(jìn)行編碼的密碼子優(yōu)化序列。seqidno:11代表對(duì)突變型bt-0049蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:12代表對(duì)突變型bt-0063蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:13代表對(duì)突變型bt-0064蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:14代表對(duì)突變型bt-0086蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:15代表對(duì)突變型bt-0498蛋白進(jìn)行編碼的核苷酸序列。seqidno:16代表bt-0049蛋白的氨基酸序列。seqidno:17代表bt-0063蛋白的氨基酸序列。seqidno:18代表bt-0064蛋白的氨基酸序列。seqidno:19代表bt-0086蛋白的氨基酸序列。seqidno:20代表bt-0498蛋白的氨基酸序列。seqidno:21代表突變型bt-0049蛋白的氨基酸序列。seqidno:22代表突變型bt-0063蛋白的氨基酸序列。seqidno:23代表突變型bt-0064蛋白的氨基酸序列。seqidno:24代表突變型bt-0086蛋白的氨基酸序列。seqidno:25代表突變型bt-0498蛋白的氨基酸序列。seqidno:26代表bt-0211蛋白的氨基酸序列。seqidno:27代表對(duì)bt-0049樣蛋白而言獨(dú)特的氨基酸序列。seqidno:28代表對(duì)bt-0049樣蛋白而言獨(dú)特的氨基酸序列。詳細(xì)說明本說明不旨在是一個(gè)本發(fā)明以其而實(shí)施的所有不同方式，或可以加入本發(fā)明中的所有特征的詳細(xì)目錄。例如，關(guān)于一個(gè)實(shí)施例所說明的特征可以結(jié)合入其他實(shí)施例中，并且關(guān)于一個(gè)具體實(shí)施例所說明的特征可以從那個(gè)實(shí)施例刪除。因此，本發(fā)明考慮了，在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可以排除或省略在此陳述的任何特征或特征的組合。另外，鑒于本披露內(nèi)容，對(duì)在此建議的不同實(shí)施例的眾多變體以及附加對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，這不脫離本發(fā)明。因此，以下說明旨在闡述本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，并且并沒有窮盡地?cái)⑹銎渌信帕?、組合和變化。除非另外定義，否則所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。在此的本發(fā)明的說明中使用的術(shù)語是僅出于描述具體實(shí)施例的目的，且并不旨在限 制本發(fā)明。定義當(dāng)在本文和附帶的權(quán)利要求中使用時(shí)，單數(shù)形式“一個(gè)/種(a)”、“和(and)”和“所述/該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文明確地指示其他的情況。因此，例如，提及“一種植物”是提及一種或多種植物并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。如在此使用的，詞語“或/或者(or)”意指具體清單的任何一個(gè)成員并且還包括這個(gè)清單的成員的任何組合(即，還包括“和”)。術(shù)語“約”在此用于表示近似、大致、約或在.....左右。當(dāng)術(shù)語“約”結(jié)合數(shù)值范圍來使用時(shí)，它通過將邊界延伸至高于以及低于所闡明的數(shù)值來限定這個(gè)范圍。通常，術(shù)語“約”在此用于將數(shù)值限定至以20％的變化、優(yōu)選10％上下(更高或更低)地高于以及低于規(guī)定值。關(guān)于溫度，術(shù)語“約”意指±1℃，優(yōu)選±0.5℃。當(dāng)術(shù)語“約”被用于本發(fā)明的上下文中(例如與溫度或分子量值組合)時(shí)，精確值(即，無“約”)是優(yōu)選的。如在此所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增的”是指使用至少一種核酸分子作為一個(gè)模板，構(gòu)建一個(gè)核苷酸分子的多個(gè)拷貝或與該核酸分子互補(bǔ)的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba，cangene公司，密西索加(mississauga)，安大略省(ontario))、q-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)以及鏈置換擴(kuò)增(sda)。參見例如診斷分子微生物學(xué)：原理與應(yīng)用(diagnosticmolecularmicrobiology:principlesandapplications)，佩爾辛(persing)等人編著，美國微生物學(xué)會(huì)(americansocietyformicrobiology)，華盛頓哥倫比亞特區(qū)(washington,d.c.)(1993)。擴(kuò)增產(chǎn)物被稱為“擴(kuò)增子”。如在此所使用的術(shù)語“嵌合構(gòu)建體”或“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(或類似術(shù)語)是指一種構(gòu)建體或分子，該構(gòu)建體或分子包括被組裝進(jìn)單個(gè)核酸分子中的不同來源的兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸。術(shù)語“嵌合構(gòu)建體”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指任何建體或分子，其包含但不限于(1)多核苷酸 (例如，dna)，包括在自然界中沒有被發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)節(jié)多核苷酸和編碼多核苷酸(即，構(gòu)建體中的至少一個(gè)多核苷酸相對(duì)于它的其他多核苷酸中的至少一個(gè)是異源的)，或(2)編碼不是天然毗鄰的蛋白部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗鄰的啟動(dòng)子部分。另外，嵌合構(gòu)建體、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核苷酸可以包括衍生自不同來源的調(diào)節(jié)多核苷酸和編碼多核苷酸，或包括衍生自相同來源、但以與在自然界中所發(fā)現(xiàn)的不同的方式進(jìn)行安排的調(diào)節(jié)多核苷酸和編碼多核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該嵌合構(gòu)建體、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括一種在調(diào)節(jié)多核苷酸的控制下、特別地在植物或細(xì)菌中具有功能性的調(diào)節(jié)多核苷酸的控制下的本發(fā)明的多核苷酸?！熬幋a序列”是轉(zhuǎn)錄成rna(如mrna、rrna、trna、snrna、正義rna或反義rna)的一個(gè)核酸序列。優(yōu)選地，該rna進(jìn)而在一個(gè)生物體中被翻譯以產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。如在此使用的，“密碼子優(yōu)化的”序列意指一種重組的、轉(zhuǎn)基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中這些密碼子被選擇以反映宿主細(xì)胞或生物可以具有的特定的密碼子偏好性。這典型地是以這樣一種方式來完成，該方式是為了保持由密碼子優(yōu)化的核苷酸序列所編碼的多肽的氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，該重組dna構(gòu)建體的dna序列包括已經(jīng)針對(duì)該構(gòu)建體有待在其中進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞(例如，動(dòng)物、植物、或真菌細(xì)胞)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的序列。例如，一種有待在植物細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建體可以使它的全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表達(dá)元件)進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在植物中的表達(dá)。參見例如美國專利號(hào)6,121,014，通過引用結(jié)合在此?！翱刂啤崩ハx意指通過一種毒性作用抑制昆蟲有害生物存活、生長、攝食、或繁殖的能力，或者限制與昆蟲有關(guān)的損害或作物植物中的損失，或者保護(hù)在昆蟲有害生物存在的條件下生長時(shí)的作物的產(chǎn)量潛力?！翱刂啤崩ハx可以是或可以不是意指殺死昆蟲，盡管它優(yōu)選意指殺死昆蟲。術(shù)語“包括(comprises)”或“包括(comprising)”當(dāng)用于本說明書中時(shí)指示所說明的特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、或組分的存在，但并不排除一個(gè)或多個(gè)其他特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、 組分、或其組的存在或添加。如在此使用的，連接詞“基本上由...組成”(以及語法變體)意指，權(quán)利要求書的范圍有待被解讀為涵蓋權(quán)利要求書中所列舉的指定材料或步驟以及不實(shí)質(zhì)上改變所要求的發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)基本和新穎特征的那些。因此，當(dāng)用于本發(fā)明的權(quán)利要求中時(shí)，術(shù)語“基本上由......組成”并不意在被解釋為等同于“包括(comprising)”。在本發(fā)明的背景中，“相應(yīng)于(correspondingto)”或“相應(yīng)于(correspondsto)”意指當(dāng)變體或同系物cry蛋白的氨基酸序列與彼此比對(duì)時(shí)，“相應(yīng)于”在該變體或同系物蛋白中某些枚舉的位置的這些氨基酸是與參比蛋白中的這些位置比對(duì)的那些，但在相對(duì)于本發(fā)明的特定參比氨基酸序列而言的這些精確的數(shù)字位置中是不必要的。例如，如果seqidno:16是參比序列并且與seqidno:26比對(duì)的話，seqidno:26的arg415“對(duì)應(yīng)于”seqidno:16的gly421。如在此所使用的，術(shù)語“cry蛋白”意指蘇云金桿菌晶體δ-內(nèi)毒素類型的殺昆蟲蛋白。術(shù)語“cry蛋白”可以指原毒素形式或其任何殺昆蟲活性的片段或毒素?！斑f送”一種組合物或毒性蛋白意指該組合物或毒性蛋白與一種昆蟲接觸，這促進(jìn)該組合物或毒性蛋白的經(jīng)口攝取，產(chǎn)生對(duì)昆蟲的毒性作用和控制?？梢园凑赵S多公認(rèn)的方式，包括但不限于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、一種或多種配制的蛋白質(zhì)組合物、一種或多種可噴灑的蛋白質(zhì)組合物、一種餌基(baitmatrix)、或任何其他的領(lǐng)域公認(rèn)的蛋白遞送系統(tǒng)來遞送該組合物或毒性蛋白。術(shù)語“域”是指沿著進(jìn)化相關(guān)蛋白的序列的比對(duì)在特定位置處保守的一組氨基酸。雖然其他位置上的氨基酸可在同系物之間有所不同，但是在特定位置處高度保守的氨基酸指示在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能中很可能是必需的氨基酸。通過其在蛋白質(zhì)同系物家族的經(jīng)比對(duì)序列中的高度保守性進(jìn)行鑒別，其可用作鑒別物(identifier)，用來確定所討論的任何多肽是否屬于先前鑒別的多肽組。“有效的昆蟲控制量”意指毒性蛋白的濃度，它通過一種毒性作用抑制昆蟲存活、生長、攝食或繁殖的能力，或者限制昆蟲相關(guān)的損害或作物植物損失，或者保護(hù)在昆蟲有害生物存在的條件下生長時(shí)的作物的產(chǎn)量潛力。“有效的控制昆蟲的量”可以或可以不是意為殺死 昆蟲，盡管它優(yōu)選意為殺死昆蟲。如在此使用的“表達(dá)盒”意指能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)至少一種感興趣的多核苷酸(例如編碼本發(fā)明的cry蛋白的多核苷酸)的表達(dá)的核酸序列，包括啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地連接至感興趣的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至終止信號(hào)?！氨磉_(dá)盒”還典型地包括正確翻譯感興趣的多核苷酸所需的另外的多核苷酸。該表達(dá)盒還可以包括在感興趣的多核苷酸的直接表達(dá)中不是必需的但是由于用于從一個(gè)表達(dá)載體去除該表達(dá)盒的方便限制位點(diǎn)而存在的其他多核苷酸。包括一個(gè)或多個(gè)感興趣的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意味著它的組分中的至少一種相對(duì)于它的其他組分中的至少一種是異源的。該表達(dá)盒還可以是一種天然發(fā)生的表達(dá)盒，但已經(jīng)是以對(duì)于異源表達(dá)有用的重組形式而獲得的。然而，典型地，該表達(dá)盒相對(duì)于該宿主是異源的，即在該表達(dá)盒中的感興趣的多核苷酸不是天然存在于該宿主細(xì)胞中的，并且必須已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化過程或育種過程引入到該宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先中。該表達(dá)盒中的一個(gè)或多個(gè)感興趣的多核苷酸的表達(dá)通常是在啟動(dòng)子的控制下。在多細(xì)胞生物(如一種植物)的情況下，該啟動(dòng)子還可能對(duì)于特定組織、或器官、或者發(fā)育階段是特異性的或優(yōu)先的。當(dāng)被轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中時(shí)，表達(dá)盒或其片段也可被稱為“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”?！盎颉痹诖硕x為包括一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的一種遺傳單位，該遺傳單位占據(jù)染色體或質(zhì)粒上特定位置并且包含用于生物中的具體特征或性狀的遺傳指令?！澳c蛋白酶”是在蟲的消化道中天然發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶。該蛋白酶通常涉及被攝取的蛋白質(zhì)的消化中。腸蛋白質(zhì)酶的實(shí)例包括胰蛋白酶，其典型地切割賴氨酸(k)或精氨酸(r)殘基的c-端側(cè)上的肽；以及胰凝乳蛋白酶，其典型地切割苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)或酪氨酸(y)的c-端側(cè)上的肽。當(dāng)提及基因或多核苷酸或多肽使用時(shí)，術(shù)語“異源”是指基因或多核苷酸或多肽不是在其天然環(huán)境中或包含其非天然環(huán)境中存在的一部分(即，已經(jīng)通過人工改變)。例如，異源基因可以包括自一個(gè)物種引入到另一個(gè)物種的多核苷酸。異源基因還可以包括對(duì)生物來說是天然的多核苷酸，該多核苷酸已經(jīng)以一些方式(例如，突變；以多個(gè) 拷貝添加；連接至一種非天然啟動(dòng)子或增強(qiáng)子多核苷酸等)被改變。異源基因可以進(jìn)一步包括植物基因多核苷酸，其包括植物基因的cdna形式；這些cdna可以以正義方向(以產(chǎn)生mrna)或反義方向(以產(chǎn)生一種反義rna轉(zhuǎn)錄本，其與mrna轉(zhuǎn)錄本是互補(bǔ)的)被表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，異源基因區(qū)別于內(nèi)源性植物基因在于該異源基因多核苷酸被典型地連接至包括調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子的多核苷酸上，未發(fā)現(xiàn)這些多核苷酸與由該異源基因編碼的蛋白質(zhì)的基因或與該染色體中的植物基因多核苷酸天然相關(guān)聯(lián)，或者與在自然界中未發(fā)現(xiàn)的染色體的部分(例如，在基因座中表達(dá)的基因，其中該基因未正常表達(dá))相關(guān)聯(lián)。另外，“異源”多核苷酸是指不與將多核苷酸引入其中的宿主細(xì)胞天然地相關(guān)聯(lián)的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多拷貝?！巴粗亟M”是在相同的多核苷酸的一個(gè)區(qū)域中成對(duì)染色體的兩個(gè)dna分子或染色單體之間的dna片段的交換(“交叉”)?！爸亟M事件”在此被理解為意指一種減數(shù)分裂交叉。當(dāng)核酸序列編碼了一種多肽(該多肽與由一種參考核酸序列所編碼的多肽具有相同的氨基酸序列)時(shí)，這種核苷酸序列與這種參考核酸序列“同類編碼”。例如，seqidno:6與seqidno:1為同類編碼，因?yàn)樗鼈兌季幋a由seqidno:16代表的氨基酸序列。術(shù)語“分離的”核酸分子、多核苷酸或蛋白是一種不再存在于其天然環(huán)境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白。本發(fā)明的分離的核酸分子、多核苷酸或蛋白可以按照一種純化的形式存在，或者可以存在于重組宿主中，例如轉(zhuǎn)基因細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物中?！昂怂岱肿印笔强梢詮娜魏蝸碓粗蟹蛛x的單鏈或雙鏈dna或rna。在本發(fā)明的背景中，該核酸分子優(yōu)選地是一個(gè)dna區(qū)段?！翱刹僮鞯剡B接”是指在一個(gè)單一核酸片段上多核苷酸的關(guān)聯(lián)，這樣使得一者的功能影響另一者的功能。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼多核苷酸或功能rna的表達(dá)時(shí)(即，該編碼多核苷酸或功能rna處于該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，則該啟動(dòng)子與該編碼多核苷酸或功能rna是可操作地連接的。正義方向或者反義方向的編碼多核苷酸能夠與調(diào)節(jié)多核苷酸可操作地連接。如在此使用的“殺有害生物”、“殺昆蟲”等是指本發(fā)明的cry 蛋白控制有害生物的能力或者可以控制如在此所定義的有害生物的cry蛋白的量。因此，殺有害生物cry蛋白可以殺死或抑制有害生物(例如，昆蟲有害生物)存活、生長、攝食、或繁殖的能力。“植物”是在發(fā)育的任何階段的任何植物，特別是種子植物?！爸参锛?xì)胞”是植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以處于一種分離的單細(xì)胞或一種培養(yǎng)細(xì)胞的形式，或者是作為較高級(jí)的組織單位(例如，植物組織、植物器官、或整株植物)的一部分?！爸参锛?xì)胞培養(yǎng)物”意指植物單元(例如像，原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及處于不同發(fā)育階段的胚)的培養(yǎng)物?！爸参锊牧稀笔侵溉~、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、接合子、種子、切條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或一種植物的任何其他部分或產(chǎn)物?！爸参锲鞴佟笔侵参锏囊粋€(gè)獨(dú)特而明顯的已結(jié)構(gòu)化并且分化的部分，如根、莖、葉、花蕾或胚。如在此使用的“植物組織”意指組織化成結(jié)構(gòu)和功能單元的一組植物細(xì)胞。包括植物中或培養(yǎng)物中的任何植物組織。這個(gè)術(shù)語包括但不限于：全株植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物以及被組織化成結(jié)構(gòu)或功能單元的任何植物細(xì)胞群組。這個(gè)術(shù)語與以上列出的或由該定義以其他方式涵蓋的任何具體類型的植物組織的聯(lián)合應(yīng)用或單獨(dú)應(yīng)用并不旨在排除任何其他類型的植物組織?！岸嗪塑账帷笔侵赣晒矁r(jià)鍵合于一條鏈中的許多核苷酸單體構(gòu)成的一種聚合物。此類“多核苷酸”包括dna、rna、經(jīng)修飾的寡核苷酸(例如，包括對(duì)于生物rna或dna不典型的堿基的寡核苷酸，如2'-o-甲基化寡核苷酸)等。在一些實(shí)施例中，核酸或多核苷酸可以是單股、雙股、多股或其組合。除非另外指示，否則本發(fā)明的具體核酸或多核苷酸任選地包括或編碼除明確指示的任何多核苷酸之外的互補(bǔ)多核苷酸?！案信d趣的多核苷酸”是指任何多核苷酸，當(dāng)其轉(zhuǎn)移至一個(gè)生物(例如，一種植物)中時(shí)賦予該生物一種所希望的特征，如昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑耐受性、抗生素抗性、改善的營養(yǎng)價(jià)值、工業(yè)過程 中改善的性能、商業(yè)上有價(jià)值的酶或代謝物的生產(chǎn)、或者改變的繁殖能力。術(shù)語“啟動(dòng)子”是指多核苷酸，通常在它的編碼多核苷酸的上游(5')，它通過提供對(duì)正確轉(zhuǎn)錄所需的rna聚合酶以及其他因子的識(shí)別來控制該編碼多核苷酸的表達(dá)?！霸|(zhì)體”是一種分離的植物細(xì)胞，沒有細(xì)胞壁或僅具有部分的細(xì)胞壁。如在此所使用的，術(shù)語“重組”是指核酸分子(例如，dna或rna)或蛋白質(zhì)或生物的一種形式，該形式通常不會(huì)在自然界中發(fā)現(xiàn)并且正因?yàn)槿绱送ㄟ^人類干預(yù)來產(chǎn)生。如在此所使用的，“重組核酸分子”是包括多核苷酸組合的核酸分子，這些多核苷酸不會(huì)天然地一起存在并且是人類干預(yù)的結(jié)果，例如，一種核酸分子，該核酸分子由至少兩種彼此異源的多核苷酸的組合組成；或一種核酸分子，該核酸分子是人工合成的并且包括偏離通常存在于自然界中的多核苷酸的一種多核苷酸；或一種核酸分子，該核酸分子包括人工摻入至宿主細(xì)胞的基因組dna中的轉(zhuǎn)基因和該宿主細(xì)胞基因組的相關(guān)側(cè)翼dna。重組核酸分子的一個(gè)實(shí)例是由將轉(zhuǎn)基因插入至植物的基因組dna中產(chǎn)生的一種dna分子，其可以最終導(dǎo)致該生物中的重組rna或蛋白質(zhì)分子的表達(dá)。如在此使用的，“重組植物”是一種通常不會(huì)在自然界中存在的植物，是人類干預(yù)的結(jié)果，并且包含摻入至其基因組中的轉(zhuǎn)基因或異源核酸分子。由于此類基因組改變，該重組植物明顯不同于相關(guān)的野生型植物?！罢{(diào)節(jié)元件”是指涉及控制核苷酸序列的表達(dá)的序列。調(diào)節(jié)元件包括一個(gè)可操作地連接至感興趣的核苷酸序列和終止信號(hào)上的啟動(dòng)子。它們還典型地涵蓋了適當(dāng)翻譯該核苷酸序列所要求的序列。在兩個(gè)核酸或氨基酸序列的背景下，術(shù)語“一致性”或“一致的”或“實(shí)質(zhì)上一致的”是指當(dāng)針對(duì)最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)具有至少60％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選90％、甚至更優(yōu)選95％、并且最優(yōu)選至少99％核苷酸或氨基酸殘基一致性的兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列，如使用以下序列比較算法之一或通過目測(cè)檢查所測(cè)量的。優(yōu)選地，該實(shí)質(zhì)上的一致性存在于整個(gè)具有長度為至少約50個(gè)殘基或堿基的序列的區(qū)域中，更優(yōu)選地在整個(gè)至少約100個(gè)殘基或堿基的區(qū)域中， 并且最優(yōu)選地這些序列在至少約150個(gè)殘基或堿基上是實(shí)質(zhì)上一致的。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施例中，這些序列在這些編碼區(qū)的全部長度上基本上是一致的。此外，實(shí)質(zhì)上一致的核酸或氨基酸序列實(shí)質(zhì)上執(zhí)行相同的功能。對(duì)于序列比較，典型地，一個(gè)序列充當(dāng)與測(cè)試序列進(jìn)行比較的參比序列。當(dāng)使用一種序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比的序列輸入到電腦中(若有必要，指定子序列坐標(biāo))，并且指定序列算法程序的參數(shù)。然后，這種序列比較算法基于所指定的程序參數(shù)來計(jì)算這個(gè)或這些測(cè)試序列相對(duì)于該參考序列的序列一致性百分比。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以按照以下方式進(jìn)行，例如通過史密斯(smith)和沃特曼(waterman)，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》(adv.appl.math.)2:482(1981)的局部同源性算法、通過尼德爾曼(needleman)和伍茲(wunsch)，《分子生物學(xué)雜志》(j.mol.biol.)48:443(1970)的同源比對(duì)算法、通過皮爾森(pearson)和李普曼(lipman)，《美國科學(xué)院院報(bào)》(proc.nat'l.acad.sci.usa)85:2444(1988)的相似性法的搜索，通過這些算法(威斯康星州遺傳學(xué)分析軟件包、遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組、575科學(xué)驅(qū)動(dòng)(sciencedr.)，麥迪遜(madison),wis.中的gap、bestfit、fasta、以及tfasta)的計(jì)算機(jī)化實(shí)施、或通過目測(cè)檢查(總體上見奧蘇貝爾(ausubel)等人，下文)。一種適合于確定序列一致性百分?jǐn)?shù)以及序列相似性的算法的一個(gè)實(shí)例是blast算法，它說明于altschul等人，《分子生物學(xué)雜志》(j.mol.biol).215:403-410(1990)。執(zhí)行blast分析的軟件是通過國家生物技術(shù)信息中心(thenationalcenterforbiotechnologyinformation，美國國家醫(yī)學(xué)圖書館(u.s.nationallibraryofmedicine)，8600rockvillepike,bethesda,md20894usa)可供公眾使用的。這種算法涉及首先通過識(shí)別查詢序列中具有長度w的短字碼而識(shí)別得分高的序列對(duì)(hsp)，這些得分高的序列對(duì)當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的字碼(word)進(jìn)行比對(duì)時(shí)匹配或滿足一些正值閾值的得分t。t被稱為鄰近字碼得分閾(altschul等人，1990)。這些初始的鄰近字碼命中充當(dāng)種子用于起始搜索以發(fā)現(xiàn)包含它們的較長的hsp。然后，將這些字碼命中在兩個(gè)方向上沿著每個(gè)序列延伸直到累積的比對(duì)得分可以得到增加。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)m(對(duì) 于一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞得分；總是>0)和n(對(duì)于錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)來計(jì)算累積的得分。對(duì)于氨基酸序列，使用得分矩陣來計(jì)算該累積得分。當(dāng)累積的比對(duì)得分從它的最大達(dá)到值降低了數(shù)量x；由于累積一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分的殘基比對(duì)使累積得分趨于0或0以下；或者到達(dá)任一序列的末端時(shí)，停止這些字碼命中在每個(gè)方向上的延伸。blast算法的參數(shù)w、t、以及x決定了該比對(duì)的靈敏度與速度。blastn程序(對(duì)核苷酸序列來說)使用字長(w)為11、期望值(e)為10、截止值(cutoff)為100、m＝5、n＝-4、以及兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對(duì)于氨基酸序列，blastp程序使用字長(w)為3、期望值(e)為10、以及blosum62評(píng)分矩陣作為默認(rèn)設(shè)置(參見赫尼科夫(henikoff)和赫尼科夫(henikoff)，《美國國家科學(xué)院院刊》(proc.natl.acad.sci.usa)89:10915(1989))。除了計(jì)算序列一致性百分?jǐn)?shù)之外，blast算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的一種統(tǒng)計(jì)分析(見，例如karlin&altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。由blast算法提供的相似性的一種量度是最小概率總和(p(n))，它提供了在兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間會(huì)偶然發(fā)生一個(gè)匹配的概率的一個(gè)指示。例如，若在一個(gè)測(cè)試核酸序列與一個(gè)參比核酸序列的比較中該最小概率和是小于約0.1、更優(yōu)選地是小于約0.01、并且最優(yōu)選地是小于約0.001，則該測(cè)試核酸序列被認(rèn)為是與該參比序列相類似的。兩個(gè)核酸序列實(shí)質(zhì)上一致的另一指示是這兩種分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。短語“特異性雜交”是指一種分子在嚴(yán)格條件下僅可與一種特定的核苷酸序列結(jié)合、雙鏈化或雜交，這是在該序列存在于一種復(fù)合混合物(例如，總細(xì)胞的)dna或rna中時(shí)進(jìn)行的?！皩?shí)質(zhì)上結(jié)合”是指在一個(gè)探針核酸與一個(gè)靶核酸之間的互補(bǔ)雜交，并且涵蓋少量錯(cuò)配，這些錯(cuò)配可以通過降低該雜交介質(zhì)的嚴(yán)格來容納，以實(shí)現(xiàn)該靶核酸序列的所希望的檢測(cè)。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)(如dna和rna雜交)的背景下“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列特定地在較高的溫度下雜交。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于蒂森(tijssen)(1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-使用核酸探針的雜交第2章第i部分“雜交原理和核酸探針檢 驗(yàn)策略綜述”(laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobespartichapter2"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays")，愛思唯爾，紐約?？傮w上，高嚴(yán)格雜交和洗滌條件在限定的離子強(qiáng)度和ph下被選定為比特定序列的熱熔點(diǎn)(tm)低約5℃。典型地，在“嚴(yán)格條件”下，一種探針將會(huì)與它的目標(biāo)子序列進(jìn)行雜交，但不會(huì)與其他序列雜交。tm是50％的目標(biāo)序列與完全匹配的探針進(jìn)行雜交時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和ph下)。極嚴(yán)格條件被選定為等于具體探針的tm。對(duì)于互補(bǔ)核酸(它們?cè)赿na或rna印跡中在濾器上具有超過100個(gè)互補(bǔ)的殘基)的雜交的嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、將雜交進(jìn)行過夜。高嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是0.15mnacl在72℃下大約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是在65℃下，0.2xssc洗滌持續(xù)15分鐘(參見，sambrook，以下，對(duì)于ssc緩沖劑的說明)。經(jīng)常，高嚴(yán)格洗滌之前會(huì)先進(jìn)行低嚴(yán)格洗滌，以去除背景探針信號(hào)。對(duì)于一個(gè)例如多于100個(gè)核苷酸的雙鏈體的實(shí)例性中等嚴(yán)格性洗滌是1xssc，在45℃持續(xù)15分鐘。對(duì)于一種例如超過100個(gè)核苷酸的雙鏈體(duplex)的低嚴(yán)格洗滌的一個(gè)實(shí)例是在40℃下的4-6xssc持續(xù)15分鐘。對(duì)于短探針(例如，大約10-50個(gè)核苷酸)，嚴(yán)格條件典型地涉及小于約1.0m的na離子的鹽濃度，典型地在ph7.0至8.3下，大約0.01至1.0m的na離子濃度(或其他鹽類)，并且該溫度典型地是至少約30℃。通過加入去穩(wěn)定試劑例如甲酰胺也可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。一般而言，相比于不相關(guān)的探針，在特定的雜交測(cè)定中觀察到高出2倍(或更高)的一個(gè)信噪比就表明檢測(cè)到一個(gè)特異的雜交。如果在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸所編碼的蛋白是實(shí)質(zhì)上一致的，則它們?nèi)匀皇菍?shí)質(zhì)上一致的。例如，當(dāng)使用該遺傳密碼允許的最大程度的密碼簡并而生成一個(gè)核酸的拷貝時(shí)，則發(fā)生這種情況。以下是雜交/洗滌條件的組的實(shí)例，這些條件可被用來克隆與本發(fā)明的參比核苷酸序列實(shí)質(zhì)上一致的同源核苷酸序列：一種參比核苷酸序列在以下條件下優(yōu)選地與該參比核苷酸序列雜交：在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃下，并且在 2xssc、0.1％sds中在50℃下洗滌；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4、1mmedta種在50℃下，并且在1xssc、0.1％sds中在50℃下洗滌；仍又更加令人希望的是在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃下，并且在0.5xssc、0.1％sds中在50℃下洗滌；優(yōu)選地在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃下，并且在0.1xssc、0.1％sds中在50℃下洗滌；更優(yōu)選地在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中在50℃下，并且在0.1xssc、0.1％sds中在65℃下洗滌。兩個(gè)核酸序列或蛋白基本上是一致的另一個(gè)指示是指由該第一核酸編碼的蛋白與由該第二核酸編碼的蛋白進(jìn)行免疫性交聯(lián)反應(yīng)或與其特異性結(jié)合。因此，一種蛋白典型地是與一種第二蛋白基本上一致的，例如其中這兩種蛋白僅區(qū)別于保存性取代?！昂铣傻摹笔侵敢环N核苷酸序列，該核苷酸序列包括在天然序列中不存在的堿基或結(jié)構(gòu)特征。例如，編碼本發(fā)明的cry蛋白的一種人工序列，其更類似于g+c含量并且雙子葉或單子葉植物基因的正常密碼子分布表述為合成的。如在此使用的，一種對(duì)昆蟲有害生物是“毒性的”cry蛋白意指該cry蛋白充當(dāng)一種口服活性的昆蟲控制劑以殺死昆蟲有害生物，或者該cry蛋白質(zhì)能夠破壞或阻止昆蟲攝食、或引起對(duì)昆蟲有害生物的生長抑制，其兩者可以引起或可以不引起昆蟲死亡。當(dāng)本發(fā)明的cry蛋白被遞送至昆蟲或昆蟲與cry蛋白進(jìn)行經(jīng)口接觸時(shí)，該結(jié)果典型地是該昆蟲的死亡、或者該昆蟲的生長減慢、或者該昆蟲停止以使該有毒的cry蛋白可供該昆蟲利用的來源為食。“轉(zhuǎn)化”是一種用于將異源核酸引入到宿主細(xì)胞或生物的方法。具體地，“轉(zhuǎn)化”意為dna分子穩(wěn)定整合到一種感興趣生物的基因組中?！稗D(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指一種宿主生物，例如其中引入了一種異源核酸分子的一種細(xì)菌或一種植物。該核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到宿主的基因組中，或者該核酸分子還可以作為一種染色體外分子存在。這樣的一種染色體外分子能夠自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物應(yīng)當(dāng)理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物，而且包含其轉(zhuǎn)基因 子代。一種“非轉(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”、或“非重組的”宿主是指一種野生型生物，例如一種細(xì)菌或植物，它不包含該異源的核酸分子。核苷酸通過其堿基由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫進(jìn)行表示：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、以及鳥嘌呤(g)。氨基酸同樣是由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫來表示：丙氨酸(ala；a)、精氨酸(arg；r)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、半胱氨酸(cys；c)、谷氨酰胺(gln；q)、谷氨酸(glu；e)、甘氨酸(gly；g)、組氨酸(his；h)、異亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、賴氨酸(lys；k)、蛋氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、絲氨酸(ser；s)、蘇氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)、以及纈氨酸(val；v)。本發(fā)明提供了用于控制有害的植物有害生物的多種組合物以及方法。特別地，本發(fā)明涉及cry蛋白，其可以分離自細(xì)菌如蘇云金桿菌，其對(duì)昆蟲有害生物是有毒的；并且涉及包括編碼這些cry蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸；以及涉及制造和使用這些多核苷酸和cry蛋白以控制昆蟲有害生物的方法。根據(jù)一些實(shí)施例，本發(fā)明提供一種核酸分子或任選地一種分離的核酸分子，所述核酸分子包括編碼處于其原毒素形式的一種cry蛋白或其一種生物學(xué)活性或毒素片段的一個(gè)核苷酸序列，其中該核苷酸序列(a)與seqidno:1-5中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(b)編碼包括一種氨基酸序列的一種蛋白，該氨基酸序列與seqidno:16-20中任一項(xiàng)或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(c)是(a)或(b)的一種合成序列，該合成序列已經(jīng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在一種轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。在其他實(shí)施例中，該核苷酸序列包括seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、或seqidno:1-5中任一項(xiàng)的任何毒素編碼片段。在其他實(shí)施例中，該合成核苷酸序列包括seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、或seqidno:6-15中任一項(xiàng)的任何毒素編碼片段。本發(fā)明還涵蓋多核苷酸，其是cry蛋白原毒素編碼多核苷酸的片段?！捌巍笔侵妇幋a一種cry蛋白的核苷酸序列的一個(gè)部分。核苷酸序列的片段可以編碼cry蛋白的生物活性部分，即所謂的“毒性片段”，或它可以是一個(gè)片段，使用以下披露的方法該片段可以用作一種雜交探針或pcr引物。核酸分子是cry蛋白質(zhì)核苷酸序列的片段，根據(jù)所期望的用途包括至少約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450個(gè)連續(xù)核苷酸，或高達(dá)存在于在此披露的全長cry蛋白編碼核苷酸序列中的核苷酸的數(shù)目(例如，用于seqidno:1的2343個(gè)核苷酸)?！斑B續(xù)的”核苷酸是指彼此直接相鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的一些片段將編碼保留cry蛋白的生物活性、并且因此保留殺昆蟲活性的毒性片段?！氨Ａ魵⒗ハx活性”是指該片段將具有至少約30％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約80％的cry蛋白的殺昆蟲活性。用于測(cè)量殺昆蟲活性的方法在本領(lǐng)域是已熟知的。參見例如恰普拉(czapla)和朗(lang)(1990)《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(j.econ.entomol.)83:2480-2485；安德魯斯(andrews)等人(1988)《生物化學(xué)雜志》(biochem.j.)252:199-206；馬羅內(nèi)(marrone)等人(1985)《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(j.ofeconomicentomology)78:290-293；以及美國專利號(hào)5,743,477，其全部通過引用以其全文結(jié)合于此。本發(fā)明的cry蛋白的毒素片段將編碼至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、和450個(gè)連續(xù)的氨基酸，或高達(dá)存在于本發(fā)明的全長cry蛋白中的總數(shù)目的氨基酸(例如，用于seqidno:16的781個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子包括以下項(xiàng)、或基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：編碼cry蛋白的核苷酸序列，該cry蛋白包括一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-20中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在一些其他實(shí)施例中，該氨基酸序列包括以下項(xiàng)、或基本由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:16-20中任一項(xiàng)或其一種毒素片段。因此，在一些實(shí)施例中，借助于蛋白酶水解加工(例如通過從昆蟲的腸中制備 的蛋白酶)而已經(jīng)被激活的cry蛋白可以被表征并且經(jīng)激活的毒素片段的n-末端或c-末端氨基酸被鑒定。在本發(fā)明的這個(gè)方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定：例如，seqidno:17的毒素片段可能包括來自seqidno:17的約27-603或約27-624或約27-629個(gè)的氨基酸，或者seqidno:18的毒素片段可能包括來自seqidno:18的約43-623或約44-623個(gè)的氨基酸，或者seqidno:19的毒素片段可能包括來自約42-640或約43-640個(gè)的氨基酸，或者seqidno:20的毒素片段最可能包括來自seqidno:20的約27-603或約27-622個(gè)的氨基酸，或者通過在該編碼序列的適當(dāng)?shù)奈恢锰幰牖蛳鞍酌讣庸の稽c(diǎn)以允許、或消除昆蟲、植物或微生物蛋白酶對(duì)較大變體蛋白質(zhì)的蛋白水解切割而產(chǎn)生的毒素片段cry蛋白變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類操作的最終結(jié)果被理解為產(chǎn)生具有與完整cry原毒素蛋白相同或更好活性的毒素片段分子。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，提供了一種嵌合基因，該嵌合基因包括異源啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地連接至多核苷酸，該多核苷包括以下項(xiàng)、或基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：核苷酸序列，該核苷酸序列編碼對(duì)于鱗翅目有害生物是有毒的cry蛋白，其中該核苷酸序列(a)與seqidno:1-5中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段具有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)到至少99％(99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)序列一致性；或者(b)編碼包括一種氨基酸序列的蛋白，該氨基酸序列與seqidno:16-20中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％(例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)到至少99％(99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)序列一致性；或者(c)是(a)或(b)的一種合成序列，該合成序列已經(jīng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在一種轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。在其他實(shí)施例中，該異源啟動(dòng)子是一種植物可表達(dá)型啟動(dòng)子。例 如但不限于，該植物可表達(dá)型啟動(dòng)子可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：泛素、夜香樹屬黃病毒、玉米trpa、osmads6、玉蜀黍h3組蛋白、噬菌體t3基因95'utr、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脫氫酶1、玉米捕光復(fù)合物、玉米熱休克蛋白、玉米mtl、豌豆小亞基rubp羧化酶、水稻肌動(dòng)蛋白、水稻親環(huán)蛋白、ti質(zhì)粒甘露堿合酶、ti質(zhì)粒胭脂堿合酶、矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶、豆類富甘氨酸蛋白1、馬鈴薯糖蛋白(potatopatatin)、凝集素、camv35s以及s-e9小亞基rubp羧化酶啟動(dòng)子。在另外的實(shí)施例中，由嵌合基因編碼的蛋白對(duì)一種或多種鱗翅目有害生物是有毒的，這些鱗翅目有害昆蟲選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、黃色桃螟蟲(yellowpeachborer)(桃蛀螟(conogethespunctiferalis))、東方黏蟲(orientalarmyworm)(東方粘蟲(mythimnasepatate))、歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))、秋黏蟲(fallarmyworm)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))、玉米穗蛾(cornearworm)(玉米穗蟲(helicoverpazea))、甘蔗螟(sugarcaneborer)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))，絨毛豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis))、大豆夜蛾(soybeanlooper)(大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))，西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))、西部豆切根蟲(westernbeancutworm)(西部豆夜蛾(richiaalbicosta))、煙夜蛾(tobaccobudworm)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))、條紋蛀莖蟲(stripedstemborer)(二化螟(chilosuppressalis))，粉蛀莖蟲(pinkstemborer)(非洲大螟(sesamiacalamistis))和水稻卷葉螟(riceleaffolder)(稻縱卷葉螟(cnaphalocrocismedinalis))。在另外的實(shí)施例中，該多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：核苷酸序列，該核苷酸序列與seqidno:1或其一種毒素編碼片段具有至少85％到至少99％序列一致性，或者與seqidno:2或其一種毒素編碼片段具有至少95％到至少99％序列 一致性，或者與seqidno:3或其一種毒素編碼片段具有至少90％到至少99％序列一致性，或者與seqidno:4或其一種毒素編碼片段具有至少90％到至少99％序列一致性，或者與seqidno:5或其一種毒素編碼片段具有至少95％到至少99％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:1-5中任一項(xiàng)或其一種毒素片段在其他實(shí)施例中，該多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：編碼一種蛋白的一種核苷酸序列，該蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-20中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:16或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:17或其一種毒素片段具有至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又另外的實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:18或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:19或其一種毒素片段具有至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:20或其一種毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的嵌合基因包括一種多核苷酸，該多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：核苷酸序列的合成序列，與seqidno:6-15中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或在至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％一致性，其中該合成序列已經(jīng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在一種轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的嵌合基因包括一種多核苷酸，該多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：編碼蛋白的核苷酸序列的合成序列，該蛋白包括一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或在至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或 至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性，其中該合成序列已經(jīng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于在一種轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。在另外的實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因生物是一種轉(zhuǎn)基因細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種合成多核苷酸，該合成多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：一種核苷酸序列，該核苷酸序列編碼對(duì)于鱗翅目有害生物是有毒的一種蛋白，其中該核苷酸序列與seqidno:6-15中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種合成多核苷酸，該合成多核苷酸包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：一種核苷酸序列，該核苷酸序列編碼對(duì)于鱗翅目有害生物是有毒的一種蛋白，其中該核苷酸序列編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。本發(fā)明的cry蛋白可以分離自某些蘇云金桿菌(bt)菌株，例如yn171-1、gx078-2和gx435-1。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的cry蛋白還可以分離自其他bt菌株并且此類bt菌株可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離并且測(cè)試對(duì)本發(fā)明的鱗翅目有害生物的毒性。通常，bt菌株可以通過本領(lǐng)域中已知的方法分離自任何環(huán)境樣品，包括土壤、植物、昆蟲、谷物升降機(jī)粉塵、以及其他樣品材料等。參見，例如，特拉弗斯(travers) 等人(1987)《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》(appl.environ.microbiol.)53:1263-1266；薩利赫(saleh)等人(1969)《加拿大微生物學(xué)雜志》(canj.microbiol.)15:1101-1104；德盧卡(delucca)等人(1981)《加拿大微生物學(xué)雜志》27:865-870；以及諾里斯(norris)等人(1981)“芽孢桿菌屬和芽孢乳桿菌屬”(“thegenerabacillusandsporolactobacillus,”)于斯塔爾(starr)等人.(編著)，原核生物：關(guān)于細(xì)菌的棲息地、分離和鑒定手冊(cè)，第ii卷，施普林格德國海德堡柏林(springer-verlogberlinheidelberg)中。分離之后，可以測(cè)試bt菌株對(duì)于鱗翅目有害生物的毒性并且可以鑒定由本發(fā)明涵蓋的cry蛋白。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種經(jīng)分離的蘇云金桿菌(bt)菌株，該菌株產(chǎn)生一種cry蛋白或一種重組cry蛋白，所述cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：一種氨基酸序列，其與seqidno:16-25中任一項(xiàng)具有至少80％到至少99％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該bt菌株選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：yn171-1、gx078-2和gx435-1。在又另外的實(shí)施例中，該cry蛋白或重組cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:16-25中的任一項(xiàng)。根據(jù)一些實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種任選地被分離的cry蛋白，其對(duì)于鱗翅目有害生物是有毒的，其中該蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：(a)一種氨基酸序列，與seqidno:16-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％序列一致性到至少99％序列一致性；或者(b)一種氨基酸序列，其由一種核苷酸序列編碼，該核苷酸序列與由seqidno:6-15中任一項(xiàng)代表的核苷酸序列或其一種毒素編碼片段具有至少80％序列一致性到至少99％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該任選地被分離的cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:16或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、 或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。該氨基酸序列與seqidno:17或其一種毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:18或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又另外的實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:19或其一種毒素片段具有至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:20或其一種毒素片段具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在一些實(shí)施例中，該氨基酸序列包括以下項(xiàng)、基本由以下項(xiàng)組成、 或由以下項(xiàng)組成：seqidno:16-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段。在其他實(shí)施例中，該氨基酸序列是由一種核苷酸序列編碼的，該核苷酸序列包括以下項(xiàng)、基本由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:6-15中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的cry蛋白對(duì)鱗翅目有害生物是有毒的，該鱗翅目有害昆蟲選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、黃色桃螟蟲(yellowpeachborer)(桃蛀螟(conogethespunctiferalis))、東方黏蟲(orientalarmyworm)(東方粘蟲(mythimnasepatate))、歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))、秋黏蟲(fallarmyworm)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))、玉米穗蛾(cornearworm)(玉米穗蟲(helicoverpazea))、甘蔗螟(sugarcaneborer)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))，絨毛豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis))、大豆夜蛾(soybeanlooper)(大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))，西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))、西部豆切根蟲(westernbeancutworm)(西部豆夜蛾(richiaalbicosta))、煙夜蛾(tobaccobudworm)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))、條紋蛀莖蟲(stripedstemborer)(二化螟(chilosuppressalis))，粉蛀莖蟲(pinkstemborer)(非洲大螟(sesamiacalamistis))和水稻卷葉螟(riceleaffolder)(稻縱卷葉螟(cnaphalocrocismedinalis))。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋了重組cry蛋白，其對(duì)于鱗翅目有害生物是有毒的，其中該重組cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：(a)一種氨基酸序列，與由seqidno:21-25中任一項(xiàng)代表的氨基酸序列或其一種毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或者(b)一種氨基酸序列，其由一種核苷酸序列編碼，該核苷酸序列與由seqidno:11-15中任一項(xiàng)代表的核苷酸序列或其一種毒素編碼片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在其他實(shí)施例中，該重組cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng) 組成、或由以下項(xiàng)組成：一種氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:21-25中任一項(xiàng)或其一種毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:21或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:22或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:23或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:24或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少 99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又其他實(shí)施例中，該氨基酸序列與seqidno:25或其一種毒素片段具有至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少94％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99.1％、或至少99.2％、或至少99.3％、或至少99.4％、或至少99.5％或至少99.6％、或至少99.7％、或至少99.8％、或至少99.9％序列一致性。在又另外的實(shí)施例中，該重組cry蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:21-25中任一項(xiàng)的氨基酸序列或其一種毒素片段。在其他實(shí)施例中，該重組cry蛋白是由一種核苷酸序列編碼的，該核苷酸序列包括以下項(xiàng)、基本由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：seqidno:11-15中任一項(xiàng)或其一種毒素編碼片段。本發(fā)明還涵蓋響應(yīng)于通過一種天然的或突變型bt-0049、bt-0063、bt-0064、bt-0086和bt-0498、或相關(guān)cry蛋白的免疫激發(fā)而產(chǎn)生的抗體。此類抗體可以使用生產(chǎn)多克隆抗血清的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)生產(chǎn)，并且如果需要的話，無限增殖免疫宿主的抗體產(chǎn)生細(xì)胞用于單克隆抗體生產(chǎn)源。用于生產(chǎn)任一感興趣物質(zhì)的抗體的技術(shù)是熟知的，例如如在哈洛(harlow)和萊恩(lane)(1988.《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(antibodiesalaboratorymanual.)第726頁.冷泉港實(shí)驗(yàn)室(coldspringharborlaboratory)中以及如在在戈丁(goding)(單克隆抗體：原理與實(shí)踐(monoclonalantibodies:principles&practice)1986.學(xué)術(shù)出版社公司(academicpress,inc.)，奧蘭多(orlando)，佛羅里達(dá)州(fl))中。本發(fā)明涵蓋殺昆蟲蛋白，其與抗體、特別是單克隆抗體交叉反應(yīng)，產(chǎn)生了針對(duì)本發(fā)明的殺昆蟲cry蛋白中的一種或多種。本發(fā)明中生產(chǎn)的這些抗體在用于確定生物樣品中天然或突變型bt-0049、bt-0063、bt-0064、bt-0086和bt-0498或相關(guān)cry蛋白的量或存在的免疫測(cè)定中也是有用的。此類測(cè)定在質(zhì)量控制生產(chǎn)包含本發(fā)明的cry蛋白中的一種或多種或相關(guān)毒性蛋白的組合物中也是有 用的。此外，這些抗體可以用來評(píng)估本發(fā)明的cry蛋白中的一種或多種或相關(guān)蛋白的重組生產(chǎn)的功效，連同針對(duì)編碼本發(fā)明的cry蛋白中的一種或多種的核苷酸序列或相關(guān)蛋白編碼序列的存在而篩選表達(dá)文庫的功效?？贵w還作為親和性配體用于純化或分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的任何一種或多種以及相關(guān)蛋白質(zhì)是有用的。本發(fā)明的cry蛋白和包含相關(guān)抗原表位的蛋白可以通過在一種優(yōu)選的宿主細(xì)胞中過度表達(dá)一種編碼全部或部分本發(fā)明的cry蛋白或相關(guān)蛋白的序列的全長或部分長度來獲得。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以通過不同的方法來改變編碼本發(fā)明的cry蛋白的dna序列，并且這些改變可以導(dǎo)致編碼以下蛋白質(zhì)的dna序列，這些蛋白質(zhì)具有不同于由本發(fā)明的天然cry蛋白所編碼的氨基酸序列。這種突變型cry蛋白可以按照不同的方式進(jìn)行改變，包括seqidno:16-20中任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸置換、缺失、截短、以及插入，包括多達(dá)約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155個(gè)、或更多個(gè)氨基酸置換、缺失或插入。用于這樣的操作的方法在本領(lǐng)域中是通常是已知的。例如，通過在編碼該蛋白的多核苷酸中的突變可以制備天然cry蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通過幾種誘變形式之一或在定向進(jìn)化中來完成。在某些方面，在該氨基酸序列中所編碼的改變將實(shí)質(zhì)上不影響該蛋白質(zhì)的功能。此類變體將具有所希望的殺昆蟲活性。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，由seqidno:1-5代表的核苷酸序列被改變，以在編碼的蛋白中引入氨基酸置換。在其他實(shí)施例中，所得到的突變型蛋白是由合成的突變型多核苷酸編碼的，該多核苷酸包括由seqidno:11-15中任一項(xiàng)代表的核苷酸序列。在其他實(shí)施例中，這些突變型蛋白包括以下項(xiàng)、基本上由以下項(xiàng)組成、或由以下項(xiàng)組成：由seqidno:21-25中任一項(xiàng)代表的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解的是可以通過使用此類技術(shù)改進(jìn)殺昆蟲蛋白對(duì)本發(fā)明的這些組合物賦予殺昆蟲活性的能力。例如，可以在以下宿主細(xì)胞中表達(dá)cry蛋白，這些宿主細(xì)胞在dna復(fù)制過程中展現(xiàn)高比率的堿基錯(cuò) 誤結(jié)合，如xl-1red(斯特塔杰公司(stratagene)，拉荷亞(lajolla)，加利福尼亞州)。在此類菌株中繁殖之后，可以分離出該dna(例如通過制備質(zhì)粒dna，或通過由pcr進(jìn)行擴(kuò)增并且將得到的pcr片段克隆到一個(gè)載體中)，在一種非誘變菌株中培養(yǎng)這些cry蛋白突變體，并且鑒定具有殺昆蟲活性的經(jīng)突變的基因，例如通過進(jìn)行一項(xiàng)對(duì)殺昆蟲活性進(jìn)行測(cè)試的測(cè)定?？傮w上，在攝食測(cè)定中混合并使用了該蛋白質(zhì)。參見例如馬羅內(nèi)(marrone)等人.(1985)《經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志》(j.ofeconomicentomology)78:290-293。此類測(cè)定可以包括使植物與一種或多種有害生物接觸，并且確定該植物存活或引起這些有害生物死亡的能力。導(dǎo)致毒性提高的突變的實(shí)例見于史涅夫(schnepf)等人.(1998)《微生物分子生物學(xué)綜述》(microbiol.mol.biol.rev).62:775-806中?？商娲?，可以在氨基或羧基的末端上對(duì)本發(fā)明的氨基酸序列進(jìn)行改變，而實(shí)質(zhì)上不影響活性。這可以包括通過現(xiàn)代分子方法所引入的插入、缺失、或改變，這些方法如pcr，包括pcr擴(kuò)增，這些pcr擴(kuò)增借助于將編碼氨基酸的序列包含到在pcr擴(kuò)增中所使用的寡核苷酸之中而改變或延長該蛋白編碼序列?？商娲?，所加入的蛋白質(zhì)序列可以包括完整的蛋白質(zhì)編碼序列，例如在本領(lǐng)域內(nèi)通常用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些序列。此類融合蛋白常常用于(1)增加一種感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)；(2)引入結(jié)合域、酶活性、或表位以促進(jìn)蛋白質(zhì)純化、蛋白檢測(cè)、亦或本領(lǐng)域已知的其他實(shí)驗(yàn)用途；(3)將蛋白質(zhì)的分泌或翻譯靶向亞細(xì)胞器，例如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的糖基化。本發(fā)明的cry蛋白還可以被突變以引入表位來產(chǎn)生識(shí)別該突變蛋白的抗體。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了經(jīng)突變的cry蛋白，其中在天然cry蛋白中的氨基酸置換產(chǎn)生一種具有抗原性區(qū)域的突變型cry蛋白，該抗原性區(qū)域允許該突變型cry蛋白在蛋白質(zhì)檢測(cè)分析中區(qū)別于該天然cry蛋白。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種制備以下抗體的方法，所述抗體從衍生出經(jīng)突變的cry蛋白質(zhì)的天然cry蛋白中差異識(shí)別出經(jīng)突變的cry蛋白，該方法包括以下步驟：在天然cry蛋白的抗原環(huán)中取代氨基酸；并且產(chǎn)生特異性識(shí)別突變cry蛋白的突變抗原環(huán)但不識(shí)別 該天然cry蛋白的抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，該抗原環(huán)在天然cry蛋白的結(jié)構(gòu)域i的外部的非保守區(qū)中被鑒定。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗原環(huán)不是一種參與cry蛋白的昆蟲腸受體識(shí)別或參與cry蛋白的蛋白酶活化的環(huán)。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還涵蓋了由誘變和引起重組的程序(例如dna改組)所衍生的序列。使用此類程序，可以將一個(gè)或多個(gè)不同的毒性蛋白編碼區(qū)用來創(chuàng)造出一種具有所希望特性的新的毒性蛋白。用這種方式，從相關(guān)序列多核苷酸的群體產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，這些相關(guān)序列多核苷酸包含以下的序列區(qū)域，這些序列區(qū)域具有實(shí)質(zhì)性的序列一致性并且可以在體外或活體內(nèi)進(jìn)行同源重組。例如，使用這種方法，可以將編碼感興趣的域的序列基序在本發(fā)明的殺有害生物基因與其他已知的殺有害生物基因之間進(jìn)行改組，以獲得編碼一種蛋白質(zhì)的新基因，該蛋白質(zhì)具有一種改善的感興趣的特性，例如一種增加的殺昆蟲活性。用于此種dna改組的策略在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如施特默爾(stemmer)(1994)《美國國家科學(xué)院院刊》(proc.natl.acad.sci.usa)91:10747-10751；施特默爾(stemmer)(1994)《自然》(nature)370:389-391；克萊默(crameri)等人.(1997)《自然生物技術(shù)》(naturebiotech).15:436-438；穆爾(moore)等人(1997)《分子生物學(xué)雜志》(j.mol.biol).272:336-347；張(zhang)等人.(1997)《美國國家科學(xué)院院刊》94:4504-4509；克萊默(crameri)等人.(1998)《自然》391:288-291；以及美國專利號(hào)5,605,793和5,837,458。域交換或改組是針對(duì)產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)改變的cry蛋白的另一種機(jī)制?？梢栽赾ry蛋白之間交換域，從而導(dǎo)致具有改善的殺有害生物活性或目標(biāo)譜的雜合或嵌合毒性蛋白。用于產(chǎn)生重組蛋白和測(cè)試它們的殺有害生物活性的方法在本領(lǐng)域是已熟知的(參見，例如，納莫夫(naimov)等人.(2001)《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》(appl.environ.microbiol).67:5328-5330；德阿加迪爾(demaagd)等人，(1996)《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》62:1537-1543；格(ge)等人.(1996)《生物化學(xué)雜志》(j.biol.chem.)266:17954-17958；史涅夫(schnepf)等人.(1990)《生物化學(xué)雜志》265:20923-20930；蘭格(rang)等人.(1999)《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》65:2918-2925)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種重組載體，該重組載體包括本發(fā)明的多核苷酸、核酸分子、表達(dá)盒或嵌合基因。在其他實(shí)施例中，該載體被進(jìn)一步限定為質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、人工染色體、噬菌體或病毒載體。用于在植物和其他有機(jī)體的轉(zhuǎn)化中使用的某些載體在本領(lǐng)域是已知的。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施例針對(duì)被設(shè)計(jì)來表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸和核酸分子的表達(dá)盒。如在此所使用，“表達(dá)盒”是指一種核酸分子，該核酸分子具有操作性地連接到感興趣的核苷酸序列上的至少一個(gè)控制序列。以這種方式，例如，可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的植物啟動(dòng)子可以在表達(dá)盒中提供，用于在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)。包含感興趣的多核苷酸的表達(dá)盒可以是嵌合的，意味著它的組分中的至少一種相對(duì)于它的其他組分中的至少另外一種是異源的。表達(dá)盒還可以是一種天然存在但已經(jīng)是以適用于異源表達(dá)的重組形式獲得的表達(dá)盒。然而，典型地，該表達(dá)盒相對(duì)于該宿主而言是異源的，即該表達(dá)盒的特定核酸序列不是天然存在于該宿主細(xì)胞中的，并且必須已經(jīng)通過一個(gè)轉(zhuǎn)化事件引入到該宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先(ancestor)中。除可操作地連接至本發(fā)明的核苷酸序列的啟動(dòng)子之外，本發(fā)明的表達(dá)盒還可以包括其他調(diào)節(jié)序列。如在此使用的，“調(diào)節(jié)序列”意指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非編碼序列)并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列包括但不限于增強(qiáng)子、內(nèi)含子、翻譯前導(dǎo)序列、終止信號(hào)、以及多腺苷酸化信號(hào)序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的表達(dá)盒還可以包括編碼除本發(fā)明的cry蛋白之外的其他所希望的性狀的多核苷酸。此類包括疊加性狀的表達(dá)盒可以用來產(chǎn)生具有所希望的含有疊加性狀(即，分子疊加)的表型的植物、植物部分或植物細(xì)胞。植物中的此類疊加的組合還可以通過其他方法來產(chǎn)生，包括但不限于通過任何常規(guī)的方法學(xué)的雜交育種植物。如果是通過遺傳轉(zhuǎn)化這些植物來進(jìn)行疊加的，所感興趣的核苷酸序列可以在任何時(shí)間并且以任何次序進(jìn)行組合。例如，包括一種或多種所希望的性狀的轉(zhuǎn)基因植物可以用作通過后續(xù)轉(zhuǎn)化而引入另外 的性狀的靶標(biāo)。另外的核苷酸序列可以在一個(gè)共轉(zhuǎn)化方案中與由表達(dá)盒的任何組合提供的本發(fā)明的核苷酸序列、核酸分子、核酸構(gòu)建體、或組合物同時(shí)引入。例如，如果將引入兩個(gè)核苷酸序列，則它們可以合并在分開的盒(反式)中或可以合并在相同的盒(順式)上。多核苷酸的表達(dá)可以通過相同的啟動(dòng)子或通過不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到多核苷酸可以使用一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在一個(gè)所希望的基因組位置處疊加。參見，例如，國際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo99/25821；wo99/25854；wo99/25840；wo99/25855；以及wo99/25853。表達(dá)盒還可以包括用于農(nóng)藝性狀的感興趣的一個(gè)或多個(gè)多肽或雙鏈rna分子(dsrna)的另外的編碼序列，這些農(nóng)藝性狀的主要受益者是種子公司、栽培者或谷物加工者。感興趣的多肽可以是由感興趣的核苷酸序列編碼的任何多肽。適合用于在植物中生產(chǎn)的感興趣的多肽的非限制性實(shí)例包括產(chǎn)生農(nóng)藝學(xué)重要性狀的那些多肽，這些性狀如除草劑抗性(有時(shí)也稱為“除草劑耐受性”)、病毒抗性、細(xì)菌病原體抗性、昆蟲抗性、線蟲抗性、或真菌抗性。參見，例如，美國專利號(hào)5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；以及6,337,431。該多肽還可以是提高植物活力或產(chǎn)量(包括允許植物在不同的溫度、土壤條件以及日光和沉淀水平下生長的性狀)的多肽、或是允許對(duì)展現(xiàn)感興趣性狀的植物進(jìn)行鑒定的多肽(例如，可選擇性標(biāo)志、種皮顏色、等等)。不同的感興趣的多肽，以及用于將這些多肽引入植物的方法描述于例如，美國專利號(hào)4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903；5,928,937；6,084,155；6,329,504和6,337,431；以及美國專利公開號(hào)2001/0016956中。還參見，萬維網(wǎng)上的lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/。賦予對(duì)抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑(例如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的多核苷酸也可以適用于本發(fā)明的一些實(shí)施例中。對(duì)于突變型als和ahas酶在這一分類號(hào)中的示例性多核苷酸如描述于例如，美國專利號(hào)5,767,366和5,928,937中。美國專利號(hào)4,761,373和5,013,659針對(duì)抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草劑的植物。美國專利號(hào)4,975,374涉及包含以下核酸的植物細(xì)胞和植物，所述核酸編碼突變的谷氨酰胺合酶(gs)，所述突變的谷氨酰胺合酶抵抗已知抑制 gs的除草劑(例如，草胺膦和甲硫氨酸磺基肟(methioninesulfoximine))的抑制作用。美國專利號(hào)5,162,602披露了抵抗環(huán)己二酮和芳氧苯氧丙酸除草劑的抑制作用的植物。該抗性由改變的乙酰輔酶a羧化酶(accase)賦予。賦予對(duì)草甘膦抗性的、由核苷酸序列編碼的多肽也適用于本發(fā)明。參見，例如美國專利號(hào)4,940,835和美國專利號(hào)4,769,061。美國專利號(hào)5,554,798披露了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米植物，所述抗性由改變的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(epsp)合成酶基因賦予。編碼對(duì)磷?；衔?例如草銨膦或草胺膦、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及環(huán)己酮)的抗性的多核苷酸也是適合的。參見歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?242246。參見，例如美國專利號(hào)5,879,903、5,276,268和5,561,236。其他合適的多核苷酸包括編碼對(duì)抑制光合作用的除草劑(例如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性的那些，參見美國專利號(hào)4,810,648。編碼用于除草劑抗性的另外的合適多核苷酸包括編碼對(duì)2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾靈、咪唑啉酮除草劑、硫酰脲除草劑、三唑并嘧啶除草劑、均三嗪除草劑以及溴草腈的抗性的那些。同樣適合的是賦予對(duì)原卟啉原氧化酶的抗性或者提供增強(qiáng)的對(duì)植物疾病的抗性、增強(qiáng)的對(duì)不利環(huán)境條件(非生物脅迫)的耐受性(這些條件包括但不限于干旱、極冷、極熱、或極端的土壤鹽度或極端的酸度或堿度)、以及在植物構(gòu)造或發(fā)育中的改變(包括發(fā)育時(shí)間方面的變化)的多核苷酸。參見，例如，美國專利公開號(hào)2001/0016956和美國專利號(hào)6,084,155。另外的合適的多核苷酸包括對(duì)殺有害生物(例如殺昆蟲)多肽進(jìn)行編碼的那些。這些多肽可以按足以控制例如昆蟲有害生物的量(即，昆蟲控制量)進(jìn)行生產(chǎn)。認(rèn)識(shí)到在植物中對(duì)控制昆蟲或其他有害生物必要的殺有害生物多肽的生產(chǎn)量可以變化，這取決于栽培品種、有害生物的類型、環(huán)境因素等。有用于另外的昆蟲或有害生物抗性的多核苷酸例如包括這些核苷酸序列，它們編碼芽孢桿菌屬(bacillus)生物中鑒定到的毒素。已經(jīng)克隆了包括編碼來自幾個(gè)亞種的蘇云金桿菌(bt)cry蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些重組克隆對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲幼蟲是有毒的。此類bt殺昆蟲蛋白 的實(shí)例包括這些cry蛋白，例如cry1aa、cry1ab、cry1ac、cry1b、cry1c、cry1d、cry1ea、cry1fa、cry3a、cry9a、cry9b、cry9c等，連同營養(yǎng)期殺昆蟲蛋白例如vip1、vip2、vip3等。bt來源的蛋白的完整清單可以在萬維網(wǎng)在蘇塞克斯大學(xué)(universityofsussex)維護(hù)的蘇云金桿菌毒素命名法數(shù)據(jù)庫中找到(還參見，克里克摩爾(crickmore)等人.(1998)《微生物分子生物學(xué)綜述》(microbiol.mol.biol.rev.)62:807-813)。適合在植物中生產(chǎn)的多肽進(jìn)一步包括改進(jìn)或通過其他方式有助于收獲的植物或植物部分轉(zhuǎn)化成為一種商業(yè)上有用的產(chǎn)品(包括(例如)增加的或改變的碳水化合物含量或分布、改善的發(fā)酵特性、增加的油含量、增加的蛋白含量、改善的消化率、以及增加的營養(yǎng)成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量或增加的維生素含量))的那些。感興趣的多肽還包括，例如在一種收獲的作物中導(dǎo)致或促成不需要的成分(例如植酸、或降解糖的酶類)的含量降低的那些。“導(dǎo)致”或“促成”是指這種感興趣的多肽可以直接或間接地促成一種感興趣的性狀的存在(例如，通過一種異源纖維素酶的使用來增加纖維素降解)。在一些實(shí)施例中，多肽促成了食品或飼料的改善的可消化度。木聚糖酶是半纖維素分解酶，這些酶改善了植物細(xì)胞壁的分解，這導(dǎo)致動(dòng)物更好地利用這些植物營養(yǎng)素。這導(dǎo)致了改善的生長率和飼料轉(zhuǎn)化。同樣，可以減小包含木聚糖的飼料的粘度。在植物細(xì)胞內(nèi)異源產(chǎn)生木聚糖酶也可以促進(jìn)木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成工業(yè)加工中的可發(fā)酵糖。來自真菌和細(xì)菌微生物的多種木聚糖酶已經(jīng)得到鑒別和特征化(參見，例如美國專利號(hào)5,437,992；庫格林(coughlin)等人(1993)“里氏木霉纖維素酶和其他水解酶的第二三醋酸纖維研討會(huì)論文集(proceedingsofthesecondtricelsymposiumontrichodermareeseicellulasesandotherhydrolases)”，埃斯波(espoo)；索米寧(souminen)和雷尼凱恩(reinikainen)編(1993)生物技術(shù)和工業(yè)發(fā)酵研究基金會(huì)(foundationforbiotechnicalandindustrialfermentationresearch)8:125-135；美國專利公開號(hào)2005/0208178；以及pct公開號(hào)wo03/16654)。具體地說，在里氏木霉(t.reesei)中已經(jīng)鑒別出三種特異性木聚糖酶(xyl-i、xyl-ii、和xyl-iii) (滕卡寧(tenkanen)等人，(1992)微生物酶技術(shù)(enzymemicrob.technol.)14:566；特洛寧(torronen)等人，(1992)生物/技術(shù)(bio/technology)10:1461；以及徐(xu)等人，(1998)應(yīng)用微生物生物技術(shù)(appl.microbiol.biotechnol.)49:718)。在其他實(shí)施例中，對(duì)于本發(fā)明有用的多肽可以是多糖降解酶。產(chǎn)生這樣一種酶的本發(fā)明的植物對(duì)于產(chǎn)生例如用于生物加工的發(fā)酵原料會(huì)是有用的。在一些實(shí)施例中、可用于發(fā)酵過程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質(zhì)酶、顆粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。多糖降解酶包括：淀粉降解酶，例如α-淀粉酶(ec3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶(e.c.3.2.1.131)；外-1,4-α-d葡聚糖酶，例如淀粉糖化酶和葡糖淀粉酶(ec3.2.1.3)、β-淀粉酶(ec3.2.1.2)、α-糖苷酶(ec3.2.1.20)以及其他外-淀粉酶；淀粉脫支酶，例如a)異淀粉酶(ec3.2.1.68)、支鏈淀粉酶(ec3.2.1.41)以及類似物；b)纖維素酶，例如外-1,4-3-纖維二糖水解酶(ec3.2.1.91)、外-1,3-β-d-葡聚糖酶(ec3.2.1.39)、β-糖苷酶(ec3.2.1.21)；c)l-阿拉伯糖酶(arabinases)，例如內(nèi)-1,5-α-l-阿拉伯糖酶(ec3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶(ec3.2.1.55)以及類似物；d)半乳聚糖酶(galactanase)，例如內(nèi)-1,4-β-d-半乳聚糖酶(ec3.2.1.89)、內(nèi)-1,3-β-d-半乳聚糖酶(ec3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(ec3.2.1.23)以及類似物；e)甘露聚糖酶(mannanase)，例如內(nèi)-1,4-β-d-甘露聚糖酶(ec3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(ec3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(ec3.2.1.24)以及類似物；f)木聚糖酶，例如內(nèi)-1,4-β-木聚糖酶(ec3.2.1.8)、β-d-木糖苷酶(ec3.2.1.37)、1,3-β-d-木聚糖酶以及類似物；以及g)其他酶，例如α-l-巖藻糖苷酶(ec3.2.1.51)、α-l-鼠李糖苷酶(ec3.2.1.40)、果聚糖酶(ec3.2.1.65)、菊粉酶(ec3.2.1.7)以及類似物。在一個(gè)實(shí)施例中，該α-淀粉酶是描述于美國專利號(hào)8,093,453中的合成α-淀粉酶amy797e，將該專利通過引用以其全文結(jié)合在此?？梢耘c本發(fā)明一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和細(xì)菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于從曲霉屬(aspergillus)、木霉屬(trichoderma)、毛霉屬(mucor)和根霉屬(rhizopus)，如黑曲 霉(a.niger)、泡盛曲霉(a.awamori)、米曲霉(a.oryzae)和米黑毛霉(m.miehei)獲得的那些。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽可以是纖維二糖水解酶(cbh)(ec3.2.1.91)。在一個(gè)實(shí)施例中，該纖維二糖水解酶可以是cbh1或cbh2。與本發(fā)明一起使用的其他酶包括但不限于半纖維素酶，如甘露聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)；木質(zhì)素酶；脂肪酶(例如，e.c.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶、果膠酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)葡糖苷酶、α1.6葡糖苷酶(例如，e.c.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)和乙?；揪厶酋ッ?ec3.1.1.72)；以及角質(zhì)酶(例如e.c.3.1.1.74)。與本發(fā)明一起使用的雙鏈rna分子包括但不限于抑制目標(biāo)昆蟲基因的那些。如在此使用的詞語“基因抑制”當(dāng)一起考慮時(shí)旨在是指用于減少作為基因轉(zhuǎn)錄為mrna和該mrna的后續(xù)翻譯的結(jié)果而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的水平的任何熟知的方法?；蛞种七€旨在意指減少從基因或編碼序列表達(dá)蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄后基因抑制和轉(zhuǎn)錄抑制。轉(zhuǎn)錄后基因抑制由從靶向抑制的基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄的mrna的全部或其一部分與用于抑制的相應(yīng)雙鏈rna之間的同源性介導(dǎo)，并且是指在細(xì)胞中可供被核糖體結(jié)合使用的可獲得的mrna的量的實(shí)質(zhì)且可測(cè)量的減少。經(jīng)轉(zhuǎn)錄的rna可以處于有義方向而發(fā)揮作用，稱為共抑制，處于反義方向而發(fā)揮作用，稱為反義抑制，或在兩個(gè)方向上產(chǎn)生dsrna而發(fā)揮作用，稱為rna干擾(rnai)。轉(zhuǎn)錄抑制由細(xì)胞中存在作為基因抑制劑的與啟動(dòng)子dna序列或其補(bǔ)體展示出實(shí)質(zhì)序列一致性而發(fā)揮作用的dsrna介導(dǎo)，稱為啟動(dòng)子反式抑制。針對(duì)與性狀相關(guān)的天然植物基因，基因抑制可以是有效的，例如，以提供具有減少水平的由該天然基因編碼的蛋白質(zhì)或具有增強(qiáng)或減少水平的受影響代謝物的植物。針對(duì)植物有害生物中的靶基因，基因抑制也可以是有效的，這些有害生物可以攝取或接觸包含基因抑制劑的植物材料，這些基因抑制劑專門設(shè)計(jì)用于阻抑或抑制一種或多種同源或互補(bǔ)序列在該有害生物的細(xì)胞中的表達(dá)。靶向抑制的此類基因可以編碼一種必需蛋白質(zhì)，其預(yù)測(cè)功能選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、消化酶合成、細(xì)胞膜電勢(shì)的維持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、外激素(pheromone)合成、外激素感測(cè)、觸角形成、翼形成、腿形成、發(fā) 育和分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸以及凋亡。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含本發(fā)明的多核苷酸、核酸分子、嵌合基因、表達(dá)盒或重組載體。該轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞可以包括但不限于植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種選自以下屬的細(xì)菌細(xì)胞：芽孢桿菌屬(bacillus)、短芽孢桿菌屬(brevibacillus)、梭菌屬(clostridium)、致病桿菌屬(xenorhabdus)、發(fā)光桿菌屬(photorhabdus)、巴斯德氏芽菌屬(pasteuria)、埃希氏菌屬(escherichia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、歐文氏菌屬(erwinia)、沙雷氏菌屬(serratia)、克雷伯桿菌屬(klebsiella)、沙門氏菌屬(salmonella)、巴氏桿菌屬(pasteurella)、黃單胞菌屬(xanthomonas)、鏈霉菌屬(streptomyces)、根瘤菌屬(rhizobium)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(methylophilius)、農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)、醋桿菌屬(acetobacter)、乳桿菌屬(lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、固氮菌屬(azotobacter)、明串珠菌屬(leuconostoc)或產(chǎn)堿桿菌屬(alcaligenes)。因此，例如，作為生物昆蟲控制劑，本發(fā)明的cry蛋白可以通過在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明的cry蛋白的嵌合基因而產(chǎn)生。例如，在一些實(shí)施例中，提供了一種包含本發(fā)明的嵌合基因的蘇云金桿菌細(xì)胞。在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種作為雙子葉植物細(xì)胞或單子葉植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。在另外的實(shí)施例中，該雙子葉植物細(xì)胞選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：大豆細(xì)胞、向日葵細(xì)胞、番茄細(xì)胞、蕓苔屬作物細(xì)胞、棉花細(xì)胞、糖用甜菜細(xì)胞以及煙草細(xì)胞。在另外的實(shí)施例中，該單子葉植物細(xì)胞選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：大麥細(xì)胞、玉蜀黍細(xì)胞、燕麥細(xì)胞、水稻細(xì)胞、高粱細(xì)胞、甘蔗細(xì)胞以及小麥細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了多個(gè)雙子葉植物細(xì)胞或單子葉植物細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)由本發(fā)明的嵌合基因編碼的本發(fā)明的cry蛋白。在其他實(shí)施例中，將該多個(gè)細(xì)胞并列以形成質(zhì)外體并且使其在自然光照中生長。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，在高等生物(例如，植物)中表達(dá)本發(fā)明的殺昆蟲cry蛋白。在這種情況下，表達(dá)有效量的殺昆蟲蛋白的 轉(zhuǎn)基因植物保護(hù)自身免受植物有害生物如昆蟲有害生物的傷害。當(dāng)昆蟲開始攝食這樣一種轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，它攝取了所表達(dá)的殺昆蟲cry蛋白。這可以妨礙昆蟲進(jìn)一步咬食植物組織或者甚至可以傷害或殺死昆蟲。本發(fā)明的多核苷酸被插入表達(dá)盒中，然后該表達(dá)盒被穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中。在其他實(shí)施例中，該多核苷酸被包含在非致病性自我復(fù)制病毒中。根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，并且包括但不限于玉米(玉蜀黍)、大豆、水稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、高粱、粟、向日葵、紅花、糖用甜菜、棉花、甘蔗、油菜、苜蓿、煙草、花生、蔬菜(包括甘薯、豆類、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、西蘭花、蕪菁、胡蘿卜、茄子、黃瓜、蘿卜、菠菜、馬鈴薯、番茄、蘆筍、洋蔥、大蒜、瓜類、胡椒、芹菜、南瓜、西葫蘆、綠皮西葫蘆)、水果(包括蘋果、梨、榅桲、李、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉)和特種植物如擬南芥以及木本植物如針葉樹和落葉樹。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是作物植物，如玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等。一旦令人希望的多核苷酸已經(jīng)被轉(zhuǎn)化進(jìn)特定的植物種類中，便可以使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)將其在該種類中繁殖或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到相同種類的其他品種中，特別是包括商業(yè)品種。在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，由此導(dǎo)致在這些轉(zhuǎn)基因植物中對(duì)處于原毒素或成熟毒素形式的相應(yīng)cry蛋白的生物合成。以此方式，產(chǎn)生在存在昆蟲壓力下具有增強(qiáng)的產(chǎn)量保護(hù)的轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)應(yīng)它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，本發(fā)明的核苷酸序列可能要求修飾和優(yōu)化。盡管在許多情況下，來自微生物生物體的基因能夠在植物中高水平表達(dá)而無需修飾，在轉(zhuǎn)基因植物中的低水平表達(dá)可能是由于微生物的核苷酸序列的緣故，這些序列具有在植物種并不優(yōu)選的密碼子。在本領(lǐng)域中已知，活生物具有特定的密碼子使用偏好，而且在本發(fā)明中所描述的這些核苷酸序列的密碼子可以被改變以符合植物偏好，同時(shí)維持由其編碼的氨基酸。此外，在植物(例如玉米植物)中高表達(dá)最好是由以下編碼序列實(shí)現(xiàn)的，這些編碼序列具有至少約35％、或至少約45％、或至少約50％、或至少約60％的gc含量。具有低gc 含量的微生物核苷酸序列在植物中也許表達(dá)欠佳，這是由于存在著可能使信息不穩(wěn)定的attta基序，以及可導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄腶ataaa基序。盡管某些基因序列可以在單子葉植物和雙子葉植物種類兩者中充分表達(dá)，但是可以對(duì)序列進(jìn)行修飾以便迎合單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好以及gc含量偏好，因?yàn)檫@些偏好已經(jīng)被證明是不同的(默里(murray)等人核酸研究(nucl.acidsres.)17:477-498(1989))。此外，針對(duì)不正常剪接位點(diǎn)的存在來對(duì)這些核苷酸序列篩選，這些位點(diǎn)可能導(dǎo)致信息平截(messagetruncation)。使用描述于例如美國專利號(hào)5,625,136；5,500,365和6,013,523中的方法，使用熟知的定點(diǎn)誘變、pcr以及合成基因構(gòu)建技術(shù)對(duì)在這些核苷酸序列之內(nèi)所有需要做出的變化(如以上所描述的那些)進(jìn)行改變。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了根據(jù)披露于美國專利號(hào)5,625,136中的程序制備的合成編碼序列或多核苷酸，將該專利通過引用結(jié)合在此。在這個(gè)操作中，使用了玉米偏愛的密碼子，即最頻繁地編碼玉米中的氨基酸的單一密碼子。針對(duì)一種特定的氨基酸的玉米偏愛的密碼子可源自(例如)來自玉米的已知基因序列。例如，針對(duì)來自玉蜀黍植物的28個(gè)基因的玉蜀黍密碼子使用發(fā)現(xiàn)于默里(murray)等人，核酸研究(nucleicacidsresearch)17:477-498(1989)中，將其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。本發(fā)明的確切示例的用玉蜀黍優(yōu)化密碼子制備的合成序列由seqidno:6-15中的任一項(xiàng)表示。以此方式，這些核苷酸序列可以針對(duì)在任何植物中表達(dá)被優(yōu)化。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，核苷酸序列的全部或任何部分可以是優(yōu)化的或合成的。也就是說，多核苷酸可以包括作為部分天然序列和部分密碼子優(yōu)化序列的核苷酸序列。為了有效的翻譯起始，可能需要修飾與起始甲硫氨酸相鄰的序列。例如，它們可以通過包含已知在植物中有效的序列而被修飾。joshi已經(jīng)提出了針對(duì)植物的一種合適的共有序列(nar15:6643-6653(1987))，并且clonetech提出了另一個(gè)共有翻譯起始子(1993/1994目錄，210頁)。這些共有序列適宜與本發(fā)明的核苷酸序列一起使用。將這些序列添加至包含核苷酸序列的構(gòu)建體中，達(dá)到atg并且包括atg(同時(shí)保持不修飾第二個(gè)氨基酸)，或者可替代地達(dá)到atg后的gtc并且包括atg后的gtc(具有修飾該轉(zhuǎn)基因的第二個(gè)氨基酸的可能性)。本發(fā)明的新穎cry蛋白編碼序列(作為它們的天然序列抑或作為如上所述的合成序列)可以可操作地融合至用于在植物中表達(dá)的多種啟動(dòng)子(包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序性調(diào)節(jié)的、發(fā)育調(diào)節(jié)的、化學(xué)調(diào)節(jié)的、組織優(yōu)選的以及組織特異性啟動(dòng)子)以制備重組dna分子(即，嵌合基因)。啟動(dòng)子的選擇將依賴于表達(dá)的時(shí)間和空間需要而變化，并且還依賴于目標(biāo)種類而變化。因此，本發(fā)明的核苷酸序列在葉、在柄(stalk)或莖(stem)、在穗、在花序(例如穗狀花序、圓錐花序、穗軸等)、在根或籽苗中的表達(dá)是優(yōu)選的。然而在許多情況下，尋求針對(duì)多于一種類型蟲害的保護(hù)，并且因此在多個(gè)組織中的表達(dá)是令人希望的。盡管已經(jīng)顯示來自雙子葉植物的很多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于在雙子葉植物中的表達(dá)，并且選擇單子葉植物啟動(dòng)子用于在單子葉植物中的表達(dá)。然而，對(duì)所選擇的啟動(dòng)子的起源并沒有限制，足夠的是它們?cè)谕苿?dòng)核苷酸序列在所希望的細(xì)胞中的表達(dá)中是操作性的。適合的組成型啟動(dòng)子包括例如camv35s啟動(dòng)子(seqidno:1546；奧德爾(odell)等人，自然(nature)313:810-812，1985)；擬南芥at6669啟動(dòng)子(seqidno:1652；參見pct公開號(hào)wo04081173a2)；玉蜀黍ubi1(克里斯滕森(christensen)等人，植物分子生物學(xué)(plantmol.biol.)18:675-689，1992)；水稻肌動(dòng)蛋白(麥克爾羅伊(mcelroy)等人，植物細(xì)胞(plantcell)2:163-171，1990)；pemu(拉斯特(last)等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(theor.appl.genet.)81:581-588，1991)；camv19s(尼爾森(nilsson)等人，植物生理學(xué)(physiol.plant)100:456-462，1997)；gos2(德佩特(depater)等人，植物雜志(plantj)11月；2(6):837-44，1992)；泛素(克里斯滕森等人，植物分子生物學(xué)18:675-689，1992)；水稻親環(huán)蛋白(布霍爾茨(bucholz)等人，植物分子生物學(xué)25(5):837-43，1994)；玉蜀黍h3組蛋白(萊佩提(lepetit)等人，分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(mol.gen.genet.)231:276-285，1992)；肌動(dòng)蛋白2(安(an)等人，植物雜志10(1)；107-121，1996)、組成型根尖ct2啟動(dòng)子(seqidno:1535；還參見pct申請(qǐng)?zhí)杋l/2005/000627)以及syntheticsupermas(尼(ni)等人，植物雜志(theplantjournal)7:661-76，1995)。其他組成性啟動(dòng)子包括美國專利號(hào)5,659,026、 5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、以及5,608,142中的那些。對(duì)于在植物(特別是玉蜀黍)中表達(dá)本發(fā)明的新穎cry蛋白編碼序列有用的組織特異性或組織優(yōu)先啟動(dòng)子是指導(dǎo)在根、髓、葉或花粉中的表達(dá)的那些。適合的組織特異性啟動(dòng)子包括但不限于葉特異性啟動(dòng)子[如例如由山本(yamamoto)等人，植物雜志(plantj.)12:255-265，1997；權(quán)(kwon)等人，植物生理學(xué)(plantphysiol.)105:357-67，1994；山本等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(plantcellphysiol.)35:773-778，1994；戈托爾(gotor)等人，植物雜志3:509-18，1993；奧羅斯科(orozco)等人，植物分子生物學(xué)(plantmol.biol.)23:1129-1138，1993；以及松岡(matsuoka)等人，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)90:9586-9590，1993所描述]，種子優(yōu)選啟動(dòng)子[例如來自種子特異性基因(西蒙(simon)等人，植物分子生物學(xué)5.191，1985；斯科菲爾德(scofield)等人，生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)262:12202，1987；巴欽斯基(baszczynski)等人，植物分子生物學(xué)14:633，1990)、巴西堅(jiān)果白蛋白(皮爾森(pearson)等人，植物分子生物學(xué)18:235-245，1992)、豆球蛋白(艾利斯(ellis)等人，植物分子生物學(xué)10:203-214，1988)、谷蛋白(水稻)(高巖(takaiwa)等人，分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(mol.gen.genet.)208:15-22，1986；高巖等人，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(febsletts.)221:43-47，1987)、玉米蛋白(瑪特茲科(matzke)等人，植物分子生物學(xué)，143).323-321990)、napa(斯塔爾貝里(stalberg)等人，植物(planta)199:515-519，1996)、小麥spa(阿爾巴尼達(dá)(albanietal)，植物細(xì)胞(plantcell)，9:171-184，1997)、向日葵油體蛋白(oleosin)(康明斯(cummins)等人，植物分子生物學(xué)19:873-876，1992)]，胚乳特異性啟動(dòng)子[例如，小麥lmw和hmw、麥谷蛋白-1(分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)216:81-90，1989；nar17:461-2)、小麥a、b和g麥醇溶蛋白(emb03:1409-15，1984)、大麥ltrl啟動(dòng)子、大麥b1、c、d大麥醇溶蛋白(理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(theorapplgen)98:1253-62，1999；植物雜志4:343-55，1993；分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)250:750-60，1996)、大麥dof(米納(mena)等人，植物雜志(theplantjournal)，116(1):53-62，1998)、biz2(ep99106056.7)、合成啟動(dòng)子(維森特 -卡巴優(yōu)薩(vicente-carbajosa)等人，植物雜志13:629-640，1998)、水稻谷醇溶蛋白nrp33、水稻-球蛋白glb-1(吳(wu)等人，植物細(xì)胞生理學(xué)39(8)885-889，1998)、水稻α-球蛋白reb/ohp-1(中瀨(nakase)等人，植物分子生物學(xué)33:513-s22，1997)、水稻adp-葡萄糖pp(transres6:157-68，1997)、玉蜀黍esr基因家族(植物雜志12:235-46，1997)、高粱γ-高粱醇溶蛋白(植物分子生物學(xué)32:1029-35，1996)]，胚特異性啟動(dòng)子[例如，水稻osh1(佐藤(sato)等人，美國國家科學(xué)院院刊(proc.nati.acad.sci.usa)，93:8117-8122)、knox(波斯特瑪-哈斯瑪(postma-haarsma)等人，植物分子生物學(xué)39:257-71，1999)、水稻油體蛋白(吳等人，生物化學(xué)雜志(j.biochem.)，123:386，1998)]，花特異性啟動(dòng)子[例如，atprp4，查爾酮合酶(chalenesynthase；chsa)(凡德爾米爾(vandermeer)等人，植物分子生物學(xué)15，95-109，1990)，lat52(特維爾(twell)等人，分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)217:240-245；1989)，apetala-3，植物繁殖組織[例如，osmads啟動(dòng)子(美國專利申請(qǐng)2007/0006344)]。本發(fā)明的核苷酸序列也可以在被化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。這使得本發(fā)明的cry蛋白能夠僅在用誘導(dǎo)化學(xué)品對(duì)作物植物進(jìn)行處理時(shí)被合成。用于基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)的此類技術(shù)的實(shí)例詳述于公開申請(qǐng)ep0332104和美國專利號(hào)5,614,395中。在一個(gè)實(shí)施例中，該化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是煙草pr-1a啟動(dòng)子。另一類在本發(fā)明中有用的啟動(dòng)子是創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。已經(jīng)說明了數(shù)量眾多的在創(chuàng)傷部位并且還在植物病原菌感染的部位表達(dá)的啟動(dòng)子。理想的是，這樣一種啟動(dòng)子在昆蟲入侵的部位應(yīng)該僅有局部活性，并且以此方式這些殺昆蟲蛋白僅在需要合成這些殺昆蟲蛋白的細(xì)胞中積聚以殺死入侵的昆蟲有害生物。這類啟動(dòng)子的實(shí)例包括由斯坦福(stanford)等人分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(mol.gen.genet.)215:200-208(1989)、徐(xu)等人植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)22:573-588(1993)、洛格曼(logemann)等人植物細(xì)胞(plantcell)1:151-158(1989)、羅爾邁爾(rohrmeier)&萊勒(lehle)，植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)22:783-792(1993)、費(fèi)雷克(firek)等人植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)22:129-142(1993)以及華 納(warner)等人植物雜志(plantj.)3:191-201(1993)所描述的那些。導(dǎo)致在本發(fā)明中有用的組織特異性表達(dá)模式的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括綠色組織特異性的、根特異性的、莖特異性的或花特異性的。適用于在綠色組織中表達(dá)的啟動(dòng)子包括調(diào)節(jié)涉及光合作用的基因的許多啟動(dòng)子，并且這些中的許多已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物兩者中得以克隆。一個(gè)這樣的啟動(dòng)子是來自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米pepc啟動(dòng)子(赫茲佩思和格魯勒(hudspeth&grula)，《植物分子生物學(xué)》(plantmolec.biol.)12:579-589(1989))。另一種用于根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子是由德弗拉曼德(deframond)(febs290:103-106(1991)或美國專利號(hào)5,466,785)描述的啟動(dòng)子。另一種在本發(fā)明中有用的啟動(dòng)子是描述于美國專利號(hào)5,625,136中的莖特異性啟動(dòng)子，它天然地驅(qū)動(dòng)玉蜀黍trpa基因的表達(dá)。除了選擇一種適合的啟動(dòng)子之外，用于在植物中表達(dá)殺昆蟲毒素的構(gòu)建體還需要一種適當(dāng)?shù)目刹僮鞯剡B接在異源核苷酸序列下游的轉(zhuǎn)錄終止子。一些此類的終止子是可獲得的并且在本領(lǐng)域中是已知的(例如來自camv的tml，來自rbcs的e9)。任何一種已知在植物中發(fā)揮功能的可供使用的終止子均可以在本發(fā)明的背景下使用。可以將數(shù)量眾多的其他序列摻入本發(fā)明中所說明的表達(dá)盒中。這些序列包括已經(jīng)顯示出增強(qiáng)表達(dá)的序列，如內(nèi)含子序列(例如，來自adhl和bronzel)以及病毒的前導(dǎo)序列(例如，來自tmv、mcmv、以及amv)。本發(fā)明的核苷酸在植物中針對(duì)不同的細(xì)胞定位的靶向表達(dá)可能是更優(yōu)選的。在某些情況下，在胞質(zhì)溶膠中的定位可能是令人希望的，而在其他情況下，在某個(gè)亞細(xì)胞器中的定位可能是優(yōu)選的。用于靶向例如植物中的基因產(chǎn)物的任何機(jī)構(gòu)都可以用于實(shí)踐本發(fā)明，并且已知此類機(jī)構(gòu)存在于植物中并且已經(jīng)相當(dāng)詳細(xì)地表征了控制這些機(jī)構(gòu)的功能的序列。已經(jīng)表征了導(dǎo)致將基因產(chǎn)物靶向其他細(xì)胞區(qū)室的序列。氨基末端序列可以負(fù)責(zé)將感興趣的蛋白質(zhì)靶向任何細(xì)胞區(qū)室，如植物的液泡、線粒體、過氧化物酶體、蛋白體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、淀粉顆粒、淀粉體、質(zhì)外體或細(xì)胞壁(例如昂格爾(unger)等人植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)13:411-418(1989)；羅杰斯(rogers)等人 (1985)美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)82:6512-651；美國專利號(hào)7,102,057；wo2005/096704，將其全部通過引用而特此結(jié)合)。任選地，該信號(hào)序列可以是來自waxy的n-末端信號(hào)序列、來自γ-玉米蛋白的n-末端信號(hào)序列、淀粉結(jié)合域、c-末端淀粉結(jié)合域、將成熟蛋白引入葉綠體的葉綠體靶向序列(措麥(comai)等人(1988)生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)263:15104-15109；范登布洛克(vandenbroeck)等人(1985)自然(nature)313:358-363；美國專利號(hào)5,639,949)或來自糊粉細(xì)胞的分泌信號(hào)序列(克勒(koehler)&霍(ho)，植物細(xì)胞(plantcell)2:769-783(1990))。另外，與羧基末端序列結(jié)合的氨基末端序列負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡靶向(神使(shinshi)等人(1990)植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)14:357-368)。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇的信號(hào)序列包括已知的切割位點(diǎn)，并且構(gòu)建的融合體考慮了在一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)之后的需要切割的任何氨基酸。在一些情況下，這個(gè)要求可以通過在切割位點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因atg之間添加小數(shù)目的氨基酸，或可替代地置換轉(zhuǎn)基因序列內(nèi)的一些氨基酸來滿足。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的并且同樣適用于任何細(xì)胞區(qū)室。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，用于細(xì)胞靶向的上述機(jī)構(gòu)不僅可以與其同源啟動(dòng)子結(jié)合使用，還可以與異源啟動(dòng)子結(jié)合使用，從而在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下實(shí)現(xiàn)特定的細(xì)胞靶向目標(biāo)，該啟動(dòng)子具有不同于自其衍生靶向信號(hào)的啟動(dòng)子的表達(dá)譜。植物轉(zhuǎn)化用于轉(zhuǎn)化植物的程序在本領(lǐng)域中是熟知且常規(guī)的并且普遍描述于文獻(xiàn)中。用于植物轉(zhuǎn)化的方法的非限制性實(shí)例包括通過以下各項(xiàng)的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌介導(dǎo)的核酸遞送(例如，經(jīng)由農(nóng)桿菌)、病毒介導(dǎo)的核酸遞送、碳化硅或核酸須晶介導(dǎo)的核酸遞送、脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送、微注射、微粒轟擊、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、環(huán)糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、納米粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、超聲處理、滲入、peg介導(dǎo)的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物細(xì)胞中的任何其他電學(xué)的、化學(xué)的、物理的(機(jī)械的)或生物的機(jī)制，包括其任何組合。對(duì)于本領(lǐng)域已知的不同植物轉(zhuǎn)化方法的一般指導(dǎo)包括今井(miki)等人(在格里克b.r.(glick,b.r.)和湯普遜j.e.(thompson,j.e.)編輯的《植物分子生物學(xué)與生 物技術(shù)方法》(methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology)中的“用于將外來dna引入植物中的程序(proceduresforintroducingforeigndnaintoplants)”(crc出版公司(crcpress,inc.)，波卡拉頓(bocaraton)，1993)，第67-88頁)和拉科沃奇-特羅揚(yáng)諾夫斯卡(rakowoczy-trojanowska)(《細(xì)胞與分子生物學(xué)快報(bào)》(cell.mol.biol.lett.)7:849-858(2002))。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，二元載體或攜帶至少一個(gè)t-dna邊界序列的載體是適合的，而對(duì)于直接基因轉(zhuǎn)移(例如，微粒轟擊等)，任何載體都是適合的，并且僅含有感興趣的構(gòu)建體的線性dna可以是優(yōu)選的。在直接基因轉(zhuǎn)移的情況下，可以使用以單個(gè)dna種類的轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化(斯科切爾(schocher)等人生物技術(shù)(biotechnology)4:1093-1096(1986))。對(duì)于直接基因轉(zhuǎn)移以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移二者，轉(zhuǎn)化通常(但不是必需的)用一種選擇性標(biāo)記進(jìn)行，該選擇性標(biāo)記可以是正向選擇(磷甘露糖異構(gòu)酶)，提供對(duì)抗生素(卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草劑(草甘膦或草丁膦)的抗性。然而，選擇性標(biāo)記的選擇對(duì)于本發(fā)明并不是至關(guān)重要的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種用于轉(zhuǎn)化植物的常用方法，因?yàn)樗母咿D(zhuǎn)化效率以及因?yàn)樗鼘?duì)于許多不同物種的廣泛實(shí)用性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化典型地涉及將攜帶感興趣的外來dna的二元載體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌菌株，這可能取決于由宿主農(nóng)桿菌菌株或者在共同存在的ti質(zhì)粒上或染色體地?cái)y帶的vir基因的互補(bǔ)體(烏肯斯(uknes)等人(1993)植物細(xì)胞(plantcell)5:159-169)。將該重組二元載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌可以使用攜帶該重組二元載體的大腸桿菌、一種輔助大腸桿菌菌株(該輔助菌株攜帶能夠?qū)⒃撝亟M二元載體移動(dòng)到目標(biāo)農(nóng)桿菌菌株中的質(zhì)粒)通過三親本交配程序?qū)崿F(xiàn)。可替代地，可以通過核酸轉(zhuǎn)化將該重組二元載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌中(霍夫根&威爾米策(willmitzer)(1988)核酸研究(nucleicacidsres.)16:9877)。可以使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物以及單子葉植物。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法包括熟知的水稻轉(zhuǎn)化方法，如任何以下文獻(xiàn)中描述的那些：歐洲專利申請(qǐng)ep1198985a1，阿爾德米塔(aldemita)&霍奇斯(hodges)(植物(planta)199:612-617，1996)；陳(chan)等人(植物分子生物學(xué)(plantmolbiol)22(3):491-506，1993)，日 江井(hiei)等人(植物雜志6(2):271-282，1994)，將這些披露通過引用結(jié)合在此，其引用程度如同完全闡明一樣。在玉米轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選方法是如石田(ishida)等人(自然生物技術(shù)(nat.biotechnol)14(6):745-50，1996)或弗雷姆(frame)等人(植物生理學(xué)(plantphysiol)129(1):13-22，2002)中所描述的，將這些披露通過引用結(jié)合在此，其引用程度如同完全闡明一樣。所述方法例如在b.jenes等人基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(techniquesforgenetransfer)，在：轉(zhuǎn)基因植物第1卷，工程化以及利用(transgenicplants,vol.1,engineeringandutilization)中，s.d.kung&r.wu編著，學(xué)術(shù)出版社(1993)128-143以及在potrykus植物生理學(xué)年評(píng)(annu.rev.plantphysiol.)植物分子生物學(xué)(plantmolec.biol.)42(1991)205-225)中進(jìn)一步描述。有待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選地克隆至適合于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的載體例如pbin19中(bevan等人，核酸研究12(1984)8711)。然后，能夠以已知的方式使用由這種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化植物，如用作模型的植物如擬南芥或作物植物如煙草植物，方法是例如通過將搗碎的葉或切碎的葉浸沒于農(nóng)桿菌溶液中，并且然后將其在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，借助于根癌農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化植物由哈根(hagen)和威爾米策(willmitzer)描述于核酸研究(nucl.acidres.)(1988)16,9877中或尤其自以下文獻(xiàn)已知：f.f.懷特(f.f.white)，用于高等植物中的基因轉(zhuǎn)移的載體(vectorsforgenetransferinhigherplants)；在轉(zhuǎn)基因植物第1卷，工程化以及利用(transgenicplants,vol.1,engineeringandutilization)中，s.d.孔(s.d.kung)&r.吳(r.wu)編著，學(xué)術(shù)出版社，1993，第15-38頁。通過重組農(nóng)桿菌進(jìn)行的植物轉(zhuǎn)化通常涉及該農(nóng)桿菌與來自該植物的外植體的共培養(yǎng)，并且遵循本領(lǐng)域熟知的方法。在攜帶位于這些二元質(zhì)粒t-dna邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化的組織進(jìn)行再生。如先前所討論的，另一種用于轉(zhuǎn)化植物、植物部分和植物細(xì)胞的方法涉及在植物組織和細(xì)胞上推進(jìn)惰性或生物活性的粒子。參見例如美國專利號(hào)4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，這種方法涉及在有效于穿透該細(xì)胞的外表面并提供在其內(nèi)部中的合并的條件下在植 物細(xì)胞處推進(jìn)惰性或生物活性的粒子。當(dāng)使用惰性粒子時(shí)，可以通過用含有感興趣的核酸的載體包被這些粒子而將該載體引入該細(xì)胞中?？商娲兀粋€(gè)或多個(gè)細(xì)胞可以被該載體圍繞使得該載體通過該粒子的激發(fā)而被帶入該細(xì)胞中。也可以將生物活性的粒子(例如，干酵母細(xì)胞、干細(xì)菌或噬菌體，各自含有一種或多種被試圖引入的核酸)推進(jìn)到植物組織中。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸可以被直接轉(zhuǎn)化進(jìn)質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的一種主要優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)體通常能夠表達(dá)細(xì)菌基因而無需實(shí)質(zhì)性的修飾，而且質(zhì)體能夠在一種單一啟動(dòng)子的控制下表達(dá)多個(gè)開放閱讀框。在美國專利號(hào)5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在pct申請(qǐng)?zhí)杦o95/16783中，以及在麥克布萊德(mcbride)等人(1994)美國國家科學(xué)院院刊(proc.nati.acad.sci.usa)91，7301-7305中廣泛描述了質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)?；镜娜~綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及將位于選擇性標(biāo)記側(cè)翼的克隆的質(zhì)體dna區(qū)連同感興趣的基因一起引入適合的靶組織中，這是(例如)使用生物射彈(biolistic)或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，氯化鈣或peg介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)來進(jìn)行的。這些1至1.5kb的側(cè)翼區(qū)(被命名為靶向序列)促進(jìn)了與質(zhì)體基因組的同源重組，并且因而允許置換或修飾該原質(zhì)體(plastome)的特定區(qū)域。最初，可以將葉綠體16srrna和rps12基因(賦予針對(duì)大觀霉素或鏈霉素的抗性)的點(diǎn)突變用作供轉(zhuǎn)化用的選擇性標(biāo)記(斯瓦布，z.(svab,z.)、海杜凱維奇，p.(hajdukiewicz,p.)和馬利加，p.(maliga,p.)(1990)美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)87，8526-8530)；斯托布，j.m.(staub,j.m.)和馬利加，p.(1992)植物細(xì)胞(plantcell)4，39-45)。在這些標(biāo)記之間克隆位點(diǎn)的存在允許建立質(zhì)體靶向載體用于外來基因的引入(斯托布，j.m.(staub,j.m.)和馬利加，p.(maliga,p.)(1993)歐洲分子生物學(xué)雜志(emboj.)12，601-606)。轉(zhuǎn)化效率的實(shí)質(zhì)性增加可以通過用顯性的選擇性標(biāo)記(對(duì)大觀霉素解毒酶氨基糖甙-3'-腺苷轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行編碼的細(xì)菌aada基因)置換隱性的rrna或r蛋白抗生素抗性基因而獲得(斯韋伯，z.(svab,z.)和馬利加，p.(maliga,p.)(1993)美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)90，913-917)。先前，這種標(biāo)記已經(jīng)被成功地用于萊茵衣藻這種綠藻的質(zhì)體基因組的高頻率轉(zhuǎn)化 (戈?duì)柕率┟芴?克萊蒙特，m.(goldschmidt-clermont,m.)(1991)核酸研究(nucl.acidsres.)19:4083-4089)。有用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其他選擇性標(biāo)記在本領(lǐng)域是已知的，并且被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。典型地，轉(zhuǎn)化之后需要大致15-20個(gè)細(xì)胞分裂循環(huán)以便達(dá)到一種同質(zhì)狀態(tài)。質(zhì)體表達(dá)(其中多種基因通過同源重組被插入到在每個(gè)植物細(xì)胞中存在的所有數(shù)千個(gè)環(huán)狀質(zhì)體基因組的拷貝中)利用了超過核表達(dá)的基因的龐大的拷貝數(shù)目的優(yōu)點(diǎn)，以便允許能夠很容易超過總的可溶性植物蛋白的10％的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將本發(fā)明的多核苷酸插入質(zhì)體靶向載體中并轉(zhuǎn)化進(jìn)所希望的植物宿主的質(zhì)體基因組中。因此，可以獲得與包含本發(fā)明的核苷酸序列的質(zhì)體基因組同型的植物，這些植物能夠高表達(dá)該多核苷酸。選擇轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物組織培養(yǎng)物的方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，并且可以用于在此提供的本發(fā)明的方法中。例如，本發(fā)明的重組載體還可以包括包含用于選擇性標(biāo)記的核苷酸序列的表達(dá)盒，該選擇性標(biāo)記可以用于選擇轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。如在此使用的，“選擇性標(biāo)記(selectablemarker)”意指一種核苷酸序列，當(dāng)該核苷酸序列表達(dá)時(shí)向表達(dá)該標(biāo)記的植物、植物部分或植物細(xì)胞賦予一種不同的表型，并且因此允許此類轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞與不具有該標(biāo)記的那些區(qū)別開來。這樣一個(gè)核苷酸序列可以編碼一種可選擇的抑或可篩選的標(biāo)記，這取決于該標(biāo)記是否賦予可以通過化學(xué)手段而被選擇的性狀，如通過使用選擇劑(例如，抗生素、除草劑等)，或者取決于該標(biāo)記是否僅是一種人們可以通過觀察或測(cè)試而鑒別的性狀，如通過篩選(例如，r座位性狀)。當(dāng)然，適合的選擇性標(biāo)記的許多實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的并且可以用于在此描述的表達(dá)盒中。選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于一種編碼neo或nptii的核苷酸序列，它賦予對(duì)卡那霉素、g418等的抗性(拍特里庫斯(potrykus)等人(1985)分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(mol.gen.genet.)199:183-188)；一種編碼bar的核苷酸序列，它賦予對(duì)草丁膦的抗性；一種編碼改變的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(epsp)合酶的核苷酸序列，它賦予對(duì)草甘膦的抗性(欣奇(hinchee)等人(1988)生物技術(shù)(biotech.)6:915-922)；一種編碼腈水解酶(如來自臭鼻克雷白氏 桿菌(klebsiellaozaenae)的bxn)的核苷酸序列，它賦予對(duì)溴草腈的抗性(斯托克爾(stalker)等人(1988)，科學(xué)(science)242:419-423)；-種編碼改變的乙酰乳酸合酶(als)的核苷酸序列，它賦予對(duì)咪唑啉酮、磺酰脲或其他als-抑制化學(xué)品的抗性(歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?54204)；一種編碼甲氨蝶呤-抗性的二氫葉酸還原酶(dhfr)的核苷酸序列(泰萊特(thillet)等人(1988)生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)263:12500-12508)；一種編碼茅草枯脫鹵素酶的核苷酸序列，它賦予對(duì)茅草枯的抗性；一種編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(也稱為磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi))的核苷酸序列，它賦予代謝甘露糖的能力(美國專利號(hào)5,767,378和5,994,629)；一種編碼改變的鄰氨基苯甲酸鹽合酶的核苷酸序列，它賦予對(duì)5-甲基色氨酸的抗性；或一種編碼hph的核苷酸序列，它賦予對(duì)潮霉素的抗性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇用于在本發(fā)明的表達(dá)盒中使用的適合的選擇性標(biāo)記。另外可選擇性標(biāo)志包括但不限于：一種編碼β-葡萄糖醛酸酶的核苷酸序列或編碼對(duì)于多種顯色底物已知的一種酶的uida(gus)；一種編碼在植物組織中對(duì)花色苷色素(紅色)進(jìn)行調(diào)節(jié)的產(chǎn)物的r基因座核苷酸序列(dellaporta(德拉普塔)等人，染色體結(jié)構(gòu)與功能：新概念的影響(chromosomestructureandfunction:impactofnewconcepts)中的263-282“通過ac轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)對(duì)玉米r-nj等位基因的分子克隆”(“molecularcloningofthemaizer-njallelebytransposon-taggingwithac”)，第18屆斯特德萊遺傳學(xué)專題討論會(huì)(18thstadlergeneticssymposium)(古斯塔夫森(gustafson)和阿佩爾斯(appels)編，plenum出版社(plenumpress)(1988))；一種編碼β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列，對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶而言多種顯色底物是已知的(例如，padac，一種顯色頭孢菌素)(蘇利夫(sutcliffe)(1978)美國科學(xué)院院刊75:3737-3741)；一種編碼xyle的核苷酸序列，xyle編碼一種兒茶酚雙加氧酶(茹科夫斯基(zukowsky)等人(1983)美國科學(xué)院院刊80:1101-1105)；一種編碼酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶能夠氧化酪氨酸成為dopa以及多巴醌，其進(jìn)而縮合形成黑色素(卡茨(katz)等人(1983)普通微生物學(xué)雜志(j.gen.microbiol.)129:2703-2714)；一種編碼β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，對(duì)于β-半乳糖苷酶而言存在顯色底物；一種編碼熒光素酶(lux)的核 苷酸序列，熒光素酶允許生物發(fā)光檢測(cè)(奧(ow)等人(1986)科學(xué)234:856-859)；一種編碼水母發(fā)光蛋白的核苷酸序列，水母發(fā)光蛋白可以在鈣敏感的生物發(fā)光檢測(cè)中采用(普魯切(prasher)等人(1985)生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(biochem.biophys.res.comm.)126:1259-1268)；或一種編碼綠色熒光蛋白的核苷酸序列(涅茨(niedz)等人(1995)植物細(xì)胞報(bào)道(plantcellreports)14:403-406)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇用于在本發(fā)明的表達(dá)盒中使用的適合的選擇性標(biāo)記。此外，如本領(lǐng)域中所熟知的，完整的轉(zhuǎn)基因植物可以使用多種已知技術(shù)中的任何技術(shù)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織培養(yǎng)物或培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生而來。在以下文獻(xiàn)中描述了從植物細(xì)胞、植物組織培養(yǎng)物或培養(yǎng)的原生質(zhì)體進(jìn)行的植物再生：例如，埃文斯(evans)等人(植物細(xì)胞培養(yǎng)物手冊(cè)(handbookofplantcellcultures)，第1卷，麥克米蘭出版公司(macmilanpublishingco.)，紐約(1983))；以及瓦西爾i.r.(vasili.r.)(編輯)(植物的細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué)(cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants)，學(xué)術(shù)出版社，奧蘭多(orlando)，第1卷(1984)和第ii卷(1986))。另外，工程化進(jìn)以上所述的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物、植物部分或植物細(xì)胞中的遺傳特性可以通過有性生殖或營養(yǎng)生長來傳遞，并且因此可以在子代植物中維持并傳代。通常，維持和傳代利用了被開發(fā)以適合特定目的(如收獲、播種或耕作)的已知農(nóng)業(yè)方法。因此，可以按本領(lǐng)域熟知的任何數(shù)目的方法(如上所述的)將多核苷酸引入該植物、植物部分或植物細(xì)胞中。因此，沒有依賴用于將一種或多種多核苷酸引入植物中的具體方法，相反可以使用允許將該一種或多種多核苷酸穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中的任何方法。在有待引入一種以上多核苷酸的情況下，這些對(duì)應(yīng)的多核苷酸可以作為單一核酸分子的部分、或者作為分開的核酸分子而進(jìn)行組裝，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在單一轉(zhuǎn)化事件中、在分開的轉(zhuǎn)化事件中、或者例如作為育種方案的一部分在植物中，將這些多核苷酸引入感興趣的細(xì)胞中。本發(fā)明的另外的實(shí)施例包括從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或其部分產(chǎn)生的收獲產(chǎn)物以及從所述收獲產(chǎn)物產(chǎn)生的加工產(chǎn)物。收獲產(chǎn)物可以是如 在此描述的全株或任何植物部分。因此，在一些實(shí)施例中，收獲的產(chǎn)物的非限制性實(shí)例包括種子、果實(shí)、花或其部分(例如，花藥、柱頭等)、葉、莖等。在其他實(shí)施例中，加工產(chǎn)物包括但不限于從收獲的本發(fā)明的種子或其他植物部分產(chǎn)生的細(xì)粉、粗粉、油、淀粉、谷物等，其中所述種子或其他植物部分包括本發(fā)明的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種來自本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子或轉(zhuǎn)基因植物的提取物，其中該提取物包括本發(fā)明的核酸分子、多核苷酸、核苷酸序列或毒性蛋白。可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的程序制備來自植物或植物部分的提取物(參見，德拉托雷(delatorre)等人，食品農(nóng)業(yè)與環(huán)境(food,agric.environ.)2(1):84-89(2004)；吉代(guidet)，核酸研究(nucleicacidsres.)22(9):1772-1773(1994)；利普頓(lipton)等人，食品農(nóng)業(yè)通訊(foodagric.immun.)12:153-164(2000))。殺昆蟲組合物在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種殺昆蟲組合物，該組合物包含農(nóng)業(yè)上可接受的載體中的本發(fā)明的cry蛋白。如在此使用的“農(nóng)業(yè)上可接受的載體”可以包括與活性cry蛋白組合以有助于它施用至植物或其部分或其中的天然或合成的有機(jī)或無機(jī)材料。農(nóng)業(yè)上可接受的載體的實(shí)例包括但不限于粉劑、塵劑、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體以及溶液。農(nóng)業(yè)上可接受的載體進(jìn)一步包括但不限于可用于農(nóng)業(yè)配制品中的惰性組分、分散劑、表面活性劑、佐劑、增粘劑、粘著劑、粘合劑或其組合。此類組合物可以按使殺昆蟲蛋白或其他有害生物控制劑與這些有害生物接觸的任何方式施用。因此，可以將這些組合物施用于植物或植物部分的表面，包括種子、葉、花、莖、塊莖、根等。在其他實(shí)施例中，在植物體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的cry蛋白的植物是被表達(dá)的cry蛋白的農(nóng)業(yè)載體。在另外的實(shí)施例中，該殺昆蟲組合物包括細(xì)菌細(xì)胞或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞，其中該細(xì)菌細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的cry蛋白。這樣一種殺昆蟲組合物可以通過脫水、冷凍干燥、均化、萃取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇云金桿菌(bt)的培養(yǎng)物而制備。此類bt培養(yǎng)物可以是下文實(shí)例中描述的天然存在的bt菌株yn171-1、 gx078-2和gx435-1或轉(zhuǎn)基因bt培養(yǎng)物。在另外的實(shí)施例中，該組合物包括按重量計(jì)從約1％至約99％的本發(fā)明的cry蛋白。本發(fā)明的cry蛋白可以與其他有害生物控制劑組合使用，以增加有害生物目標(biāo)范圍或用于預(yù)防或管理昆蟲抗性。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種控制一種或多種植物有害生物的組合物，其中該組合物包括本發(fā)明的第一cry蛋白和不同于該第一cry蛋白的第二有害生物控制劑。在其他實(shí)施例中，該組合物是一種用于局部施用至植物的配制品。在仍其他實(shí)施例中，該組合物是轉(zhuǎn)基因植物。在另外的實(shí)施例中，該組合物是局部施用至轉(zhuǎn)基因植物的配制品的組合。在一些實(shí)施例中，當(dāng)該轉(zhuǎn)基因植物包括該第二有害生物控制劑時(shí)，該配制品包括本發(fā)明的該第一cry蛋白。在其他實(shí)施例中，當(dāng)該轉(zhuǎn)基因植物包括本發(fā)明的該第一cry蛋白時(shí)，該配制品包括該第二有害生物控制劑。在一些實(shí)施例中，該第二有害生物控制劑可以是一種選自下組的試劑，該組由以下各項(xiàng)組成：化學(xué)殺有害生物劑如殺昆蟲劑、蘇云金桿菌(bt)殺昆蟲蛋白、致病桿菌屬殺昆蟲蛋白、發(fā)光桿菌屬殺昆蟲蛋白、側(cè)孢短芽孢桿菌(brevibacilluslaterosporus)殺昆蟲蛋白、球形芽孢桿菌(bacillussphaericus)殺昆蟲蛋白、蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類型兩者)、凝集素、α-淀粉酶、過氧化物酶、膽固醇氧化酶以及雙鏈rna(dsrna)分子。在其他實(shí)施例中，該第二有害生物控制劑是一種選自下組的化學(xué)殺有害生物劑，該組由以下各項(xiàng)組成：擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、新煙堿、神經(jīng)元鈉通道阻斷劑、殺昆蟲大環(huán)內(nèi)酯、γ-氨基丁酸(gaba)拮抗劑、殺昆蟲脲以及保幼激素模擬物。在其他實(shí)施例中，該化學(xué)殺有害生物劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：阿巴美丁、乙酰甲胺磷、啶蟲脒、磺胺螨酯(amidoflumet)(s-1955)、除蟲菌素(avermectin)、印楝素、甲基谷硫磷、聯(lián)苯菊酯、聯(lián)苯肼酯(binfenazate)、噻嗪酮、克百威、溴蟲腈、定蟲隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、環(huán)蟲酰肼、噻蟲胺、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、滅蠅胺、溴氰菊酯、殺螨隆、二嗪磷、除蟲脲、樂果、苯蟲醚、甲氨基阿維菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙蟲腈、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威、甲氰菊酯、唑螨酯、氰戊菊酯、氟蟲腈、氟啶蟲酰胺、氟氰 戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、嘧蟲胺(ur-50701)、氟蟲脲、地蟲硫磷、氯蟲酰肼、氟鈴脲、吡蟲啉、茚蟲威、異柳磷、虱螨脲、馬拉硫磷、聚乙醛、甲胺磷、殺撲磷、滅多威、烯蟲酯、甲氧氯、久效磷、甲氧蟲酰肼、噻蟲醛(nithiazin)、雙苯氟脲、多氟脲(xde-007)、殺線威、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏殺磷、亞胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶蟲丙醚、蚊蠅醚、魚藤酮、多殺菌素、螺甲螨酯(spiromesifin)(bsn2060)、硫丙磷、蟲酰肼、伏蟲隆、七氟菊酯、特丁硫磷、殺蟲畏、噻蟲啉、噻蟲嗪、硫雙威、殺蟲雙(thiosultap-sodium)、四溴菊酯、敵百蟲和殺鈴脲、涕滅威、殺線威、苯線磷、雙甲脒、滅螨猛、乙酯殺螨醇、三環(huán)錫、三氯殺螨醇、除螨靈、依殺螨、喹螨醚、苯丁錫、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、噠螨靈以及吡螨胺。在仍其他實(shí)施例中，該化學(xué)殺有害生物劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯和β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、氰戊菊酯、四溴菊酯、苯硫威、滅多威、殺線威、硫雙威、噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲啉、茚蟲威、多殺菌素、阿巴美丁、除蟲菌素(avermectin)、苯蟲醚、硫丹、乙蟲腈、氟蟲腈、氟蟲脲、殺鈴脲、苯蟲醚、蚊蠅醚、吡蚜酮以及雙甲脒。在另外的實(shí)施例中，該第二有害生物控制劑可以是任何數(shù)目的蘇云金桿菌殺昆蟲蛋白中的一種或多種，包括但不限于cry蛋白、營養(yǎng)期殺昆蟲蛋白(vip)以及任何前述殺昆蟲蛋白的殺昆蟲嵌合體。在其他實(shí)施例中，該第二有害生物控制劑是一種選自下組的cry蛋白，該組由以下各項(xiàng)組成：cry1aa、cry1ab、cry1ac、cry1ad、cry1ae、cry1af、cry1ag、cry1ah、cry1ai、cry1aj、cry1ba、cry1bb、cry1bc、cry1bd、cry1be、cry1bf、cry1bg、cry1bh、cry1bi、cry1ca、cry1cb、cry1da、cry1db、cry1dc、cry1dd、cry1ea、cry1eb、cry1fa、cry1fb、cry1ga、cry1gb、cry1gc、cry1ha、cry1hb、cry1hc、cry1ia、cry1ib、cry1ic、cry1id、cry1ie、cry1if、cry1ig、cry1ja、cry1jb、cry1jc、cry1jd、cry1ka、cry1la、cry1ma、cry1na、cry1nb、cry2aa、cry2ab、cry2ac、cry2ad、cry2ae、cry2af、cry2ag、cry2ah、cry2ai、cry2aj、cry2ak,cry2al、cry2ba、cry3aa、cry3ba、cry3bb、cry3ca、cry4aa、cry4ba、cry4ca、cry4cb、cry4cc、cry5aa、cry5ab、cry5ac、cry5ad、 cry5ba、cry5ca、cry5da、cry5ea、cry6aa、cry6ba、cry7aa、cry7ab、cry7ac、cry7ba、cry7bb、cry7ca、cry7cb、cry7da、cry7ea、cry7fa、cry7fb、cry7ga、cry7gb、cry7gc、cry7gd、cry7ha、cry7ia、cry7ja、cry7ka、cry7kb、cry7la、cry8aa、cry8ab、cry8ac、cry8ad、cry8ba、cry8bb、cry8bc、cry8ca、cry8da、cry8db、cry8ea、cry8fa、cry8ga、cry8ha、cry8ia、cry8ib、cry8ja、cry8ka、cry8kb、cry8la、cry8ma、cry8na、cry8pa、cry8qa、cry8ra、cry8sa、cry8ta、cry9aa、cry9ba、cry9bb、cry9ca、cry9da、cry9db、cry9dc、cry9ea、cry9eb、cry9ec、cry9ed、cry9ee、cry9fa、cry9ga、cry10aa、cry11aa、cry11ba、cry11bb、cry12aa,cry13aa、cry14aa、cry14ab、cry15aa、cry16aa、cry17aa、cry18aa、cry18ba、cry18ca、cry19aa、cry19ba、cry19ca、cry20aa、cry20ba、cry21aa、cry21ba、cry21ca、cry21da、cry21ea、cry21fa、cry21ga、cry21ha、cry22aa、cry22ab、cry22ba、cry22bb、cry23aa、cry24aa、cry24ba、cry24ca、cry25aa、cry26aa、cry27aa、cry28aa、cry29aa、cry29ba、cry30aa、cry30ba、cry30ca、cry30da、cry30db、cry30ea、cry30fa、cry30ga,cry31aa、cry31ab、cry31ac、cry31ad、cry32aa、cry32ab、cry32ba、cry32ca、cry32cb、cry32da、cry32ea、cry32eb、cry32fa、cry32ga、cry32ha、cry32hb、cry32ia、cry32ja、cry32ka、cry32la、cry32ma、cry32mb、cry32na、cry32oa、cry32pa、cry32qa、cry32ra、cry32sa、cry32ta、cry32ua、cry33aa、cry34aa、cry34ab、cry34ac、cry34ba、cry35aa、cry35ab、cry35ac、cry35ba、cry36aa、cry37aa、cry38aa、cry39aa、cry40aa、cry40ba、cry40ca、cry40da、cry41aa、cry41ab、cry41ba、cry42aa、cry43aa、cry43ba、cry43ca、cry43cb、cry43cc、cry44aa、cry45aa、cry46aa、cry46ab、cry47aa、cry48aa、cry48ab、cry49aa、cry49ab、cry50aa、cry50ba、cry51aa、cry52aa、cry52ba、cry53aa、cry53ab、cry54aa、cry54ab、cry54ba、cry55aa、cry56aa、cry57aa、cry57ab、cry58aa、cry59aa、cry59ba、cry60aa、cry60ba、cry61aa、 cry62aa、cry63aa、cry64aa、cry65aa、cry66aa、cry67aa、cry68aa、cry69aa、cry69ab、cry70aa、cry70ba、cry70bb、cry71aa、cry72aa以及cry73aa。在另外的實(shí)施例中，該第二有害生物控制試劑是一種選自下組的vip3營養(yǎng)期殺昆蟲蛋白，該組由以下各項(xiàng)組成：vip3aa1、vip3aa2、vip3aa3、vip3aa4、vip3aa5、vip3aa6、vip3aa7、vip3aa8、vip3aa9、vip3aa10、vip3aa11、vip3aa12、vip3aa13、vip3aa14、vip3aa15、vip3aa16、vip3aa17、vip3aa18、vip3aa19、vip3aa20、vip3aa21、vip3aa22、vip3aa2、vip3aa24、vip3aa25、vip3aa26、vip3aa27、vip3aa28、vip3aa29、vip3aa30、vip3aa31、vip3aa32、vip3aa33、vip3aa34、vip3aa35、vip3aa36、vip3aa37、vip3aa38、vip3aa39、vip3aa40、vip3aa41、vip3aa42、vip3aa43、vip3aa44、vip3ab1、vip3ab2、vip3ac1、vip3ad1、vip3ad2、vip3ae1、vip3af1、vip3af2、vip3af3、vip3ag1,vip3ag2、vip3ag3hm117633、vip3ag4、vip3ag5、vip3ah1、vip3ba1、vip3ba2、vip3bb1、vip3bb2以及vip3bb3。在仍另外的實(shí)施例中，在轉(zhuǎn)基因植物中共表達(dá)本發(fā)明的第一cry蛋白和該第二有害生物控制劑。可以通過將植物遺傳工程化以包含并表達(dá)所有的必需基因來實(shí)現(xiàn)一種以上殺有害生物成分在同一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中的共表達(dá)。可替代地，可以將植物(親本1)遺傳工程化，用于本發(fā)明的cry蛋白的表達(dá)?？梢詫⒌诙参?親本2)遺傳工程化，用于第二有害生物控制劑的表達(dá)。通過將親本1與親本2雜交，獲得了表達(dá)被引入至親本1和親本2中的所有基因的子代植物。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種對(duì)植物有害生物侵染有抗性的疊加性轉(zhuǎn)基因植物，該植物包含編碼用于在靶標(biāo)有害生物中抑制必需基因的dsrna的dna序列和編碼針對(duì)該靶標(biāo)有害生物展示出生物活性的本發(fā)明的cry蛋白的dna序列。已經(jīng)報(bào)道，dsrna對(duì)抗某些鱗翅目有害生物是無效的(拉亞格布勒(rajagopol)等人2002.生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)277:468-494)，這可能是由于中腸中的高ph使得dsrna不穩(wěn)定。因此，在一些靶標(biāo)有害生物是鱗翅目有害生物的實(shí)施例中，本發(fā)明的cry蛋白起作用以瞬時(shí)降低中腸ph，這用于穩(wěn)定共攝取的dsrna，從而使得該dsrna有效沉默靶基因。除了提供組合物之外，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生對(duì)鱗翅目有害生物有 毒的cry蛋白的方法。這樣一種方法包括在轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)鱗翅目有害生物有毒的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸或嵌合基因或核酸分子或重組載體。在一些實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。在一些其他實(shí)施例中，該植物細(xì)胞是玉蜀黍細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，植物細(xì)胞或玉蜀黍細(xì)胞在其下生長的條件包括自然光照。在其他實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在仍其他實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在該方法的其他實(shí)施例中，該鱗翅目有害生物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、黃色桃螟蟲(yellowpeachborer)(桃蛀螟(conogethespunctiferalis))、東方黏蟲(orientalarmyworm)(東方粘蟲(mythimnasepatate))、歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))、秋黏蟲(fallarmyworm)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))、玉米穗蛾(cornearworm)(玉米穗蟲(helicoverpazea))、甘蔗螟(sugarcaneborer)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))、絨毛豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis))、大豆夜蛾(soybeanlooper)(大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))、西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))、西部豆切根蟲(westernbeancutworm)(西部豆夜蛾(richiaalbicosta))、煙夜蛾(tobaccobudworm)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))、條紋蛀莖蟲(stripedstemborer)(二化螟(chilosuppressalis))、粉蛀莖蟲(pinkstemborer)(非洲大螟(sesamiacalamistis))以及水稻卷葉螟(riceleaffolder)(稻縱卷葉螟(cnaphalocrocismedinalis))及其任何組合。在該方法的另外的實(shí)施例中，該嵌合基因包括seqidno:1-5中的任何項(xiàng)。在仍其他實(shí)施例中，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括seqidno:16-25中的任何項(xiàng)的氨基酸序列。在該方法的一些實(shí)施例中，該嵌合基因包括針對(duì)在植物中表達(dá)進(jìn) 行了密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。在其他實(shí)施例中，該嵌合基因包括seqidno:6-10中的任何項(xiàng)。在另外的實(shí)施例中，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括seqidno:16-25中的任何項(xiàng)的氨基酸序列。在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生抗有害生物(例如，抗昆蟲)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括向植物中引入包含編碼本發(fā)明的cry蛋白的核苷酸序列的本發(fā)明的多核苷酸、嵌合基因、重組載體、表達(dá)盒或核酸分子，其中該核苷酸序列被表達(dá)于該植物中，由此賦予該植物對(duì)鱗翅目有害生物的抗性，并且產(chǎn)生抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物。在一些實(shí)施例中，與缺乏本發(fā)明的多核苷酸、嵌合基因、重組載體、表達(dá)盒或核酸分子的對(duì)照植物相比，抗有害生物轉(zhuǎn)基因植物對(duì)桿野螟屬(ostrinia)的鱗翅目有害生物有抗性。在其他實(shí)施例中，桿野螟屬的該昆蟲是亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))或歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))。在一些實(shí)施例中，通過轉(zhuǎn)化植物實(shí)現(xiàn)引入。在其他實(shí)施例中，通過使包含本發(fā)明的嵌合基因、重組載體、表達(dá)盒或核酸分子的第一植物與不同的第二植物雜交來實(shí)現(xiàn)引入。在一些實(shí)施例中，至少對(duì)亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))或歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))有抗性的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物還對(duì)至少一種另外的鱗翅目有害生物有抗性，其中該另外的鱗翅目有害生物包括但不限于黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))、秋黏蟲(fallarmyworm)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))、玉米穗蛾(cornearworm)(玉米穗蟲(helicoverpazea))、甘蔗螟(sugarcaneborer)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))、絨毛豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsiagemmatalis))、大豆夜蛾(soybeanlooper)(大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))、西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))、西部豆切根蟲(westernbeancutworm)(西部豆夜蛾(richiaalbicosta))、煙夜蛾(tobaccobudworm)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))、棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、條紋蛀莖蟲(stripedstemborer)(二化螟(chilosuppressalis))、粉蛀莖蟲(pinkstem borer)(非洲大螟(sesamiacalamistis))或水稻卷葉螟(riceleaffolder)(稻縱卷葉螟(cnaphalocrocismedinalis))及其任何組合。在另外的實(shí)施例中，提供了一種控制鱗翅目有害生物如亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))或歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))的方法，該方法包括向這些昆蟲遞送有效量的本發(fā)明的cry蛋白。為了有效，該cry蛋白首先被昆蟲經(jīng)口攝取。然而，該cry蛋白可以按許多公認(rèn)的方式被遞送至該昆蟲。用于將蛋白質(zhì)經(jīng)口地遞送至昆蟲的方式包括但不限于將該蛋白質(zhì)提供于(1)轉(zhuǎn)基因植物中，其中該昆蟲取食(攝取)該轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)或多個(gè)部分，由此攝取在該轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的多肽；(2)一種或多種配制的蛋白組合物中，它們可以被施加至或摻入例如昆蟲生長介質(zhì)中；(3)一種或多種蛋白組合物中，它們可以被施加至表面，例如噴霧在植物部分的表面，然后當(dāng)該昆蟲取食噴霧的一個(gè)或多個(gè)植物部分時(shí)組合物被該昆蟲攝??；(4)餌基；或(5)任何其他本領(lǐng)域公認(rèn)的蛋白遞送系統(tǒng)。因此，可以使用經(jīng)口遞送至昆蟲的任何方法來遞送本發(fā)明的毒性cry蛋白。在一些具體實(shí)施例中，將本發(fā)明的cry蛋白經(jīng)口遞送至昆蟲，其中該昆蟲攝取轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)或多個(gè)部分。在其他實(shí)施例中，將本發(fā)明的cry蛋白經(jīng)口遞送至昆蟲，其中該昆蟲攝取用包含本發(fā)明的cry蛋白的組合物噴霧的植物的一個(gè)或多個(gè)部分?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于將化合物、組合物、配制品等施用于植物表面的任何方法將本發(fā)明的組合物遞送至植物表面。遞送至或接觸植物或其部分的一些非限制性實(shí)例包括噴霧、撒粉、噴灑、分散、下霧、霧化、撒播、浸泡、土壤注入、土壤摻入、浸透(例如，根、土壤處理)、浸漬、灌注、涂覆、葉或莖滲透、側(cè)施或種子處理等及其組合。用于使植物或其部分與一種或多種化合物、一種或多種組合物或一種或多種配制品接觸的這些和其他程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋一種為農(nóng)民提供控制鱗翅目有害生物的手段的方法，該方法包括向該農(nóng)民供應(yīng)或出售植物材料如種子，該植物材料包括能夠在由該種子生長的植物中表達(dá)本發(fā)明的cry蛋白的多核苷酸、嵌合基因、表達(dá)盒或重組載體，如上所述。本發(fā)明的實(shí)施例可以通過引用以下實(shí)例而被更好地理解。前述的和以下的本發(fā)明的實(shí)施例以及各種實(shí)施例的描述不是旨在限制權(quán)利要求書，而是對(duì)其具有說明性。因此，將理解的是權(quán)利要求書不旨在限制這些實(shí)例的具體細(xì)節(jié)。將由本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員理解的是本發(fā)明的其他實(shí)施例可以在不偏離本披露的精神和范圍的情況下進(jìn)行實(shí)踐，本披露的范圍是由所附權(quán)利要求書限定。實(shí)例實(shí)例1.活性bt菌株的鑒別從在中國收集的土壤樣品中分離蘇云金桿菌(bt)菌株。將土壤樣品懸浮于lb+2.5m乙酸鈉液體培養(yǎng)基中，隨后70℃熱處理20min。然后將一微升懸浮液涂布在t3+青霉素瓊脂平板上并且在28℃下孵育，直到形成菌落。將具有芽孢桿菌屬樣形態(tài)學(xué)的菌落從這些平板中挑出并且在t3+青霉素瓊脂平板上重新劃線直到它們已經(jīng)形成孢子，典型地持續(xù)大約三天。通過用考馬斯藍(lán)/乙酸將培養(yǎng)物染色并且用顯微鏡可視化來鑒別bt菌株。孢子形成之后，將培養(yǎng)物懸浮于堿性緩沖液中并且測(cè)試針對(duì)感興趣的鱗翅目種類的活性。在表面污染生物測(cè)定中測(cè)試懸浮液，在該生物測(cè)定中將液體覆蓋到多種類人工飼料上。針對(duì)至少三種鱗翅目有害生物種類(包括棉螟蛉(cottonbollworm)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))、黑色地老虎(blackcutworm)(小地老虎(agrotisipsilon))和亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis)))篩選每種分離物，其中樣本量為12只新生幼蟲。每個(gè)測(cè)定的持續(xù)時(shí)間為在27℃下約7天；針對(duì)死亡率以及幼蟲生長抑制對(duì)這些平板評(píng)分。將在相對(duì)于陰性對(duì)照觀察到的死亡率增加30％時(shí)認(rèn)為是有效的?；诔跏祭ハx測(cè)試，選擇三個(gè)bt菌株yn171-1、gx078-2和gx435-1用于進(jìn)一步分析。實(shí)例2.基因組組裝與分析使用全基因組測(cè)序方法從實(shí)例1中鑒別的菌株中鑒別本發(fā)明的bt cry基因。簡言之，使用covariss2超聲波裝置(covaris公司，沃本，馬薩諸塞州)剪切芽孢桿菌屬dna，其中將程序dna_400bp設(shè)置為工作循環(huán)：10％；強(qiáng)度：4；循環(huán)/脈沖：200。將dna用ultratmendrepair/da-加尾模塊(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(newenglandbiolabs,inc.)，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)處理。如由供應(yīng)商(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)所描述的，使用nebquickligationtm連接生物科技(biooscience)有索引的1-57個(gè)適配子(1-27巴西，28-57美國，英國和瑞士)。如由供應(yīng)商(貝克曼庫爾特公司(beckmancoulter,inc.)，印第安納波利斯，印第安納州)所描述的，使用agencourtampurexp珠粒清潔連接物。將文庫如下進(jìn)行大小分級(jí)：將50ul樣品與45ul75％珠?；旌衔?25％ampure珠粒加75％nacl/peg溶液teknova目錄號(hào)p4136)混合。攪拌混合物并置于磁性支架上。將所得上清液轉(zhuǎn)移至新孔中并且添加45ul50％珠?；旌衔?50％ampure珠粒加50％nacl/peg溶液teknova目錄號(hào)p4136)。攪拌該混合物并置于磁性支架上。除去所得上清液并且用80％乙醇洗滌珠粒。添加25ul的洗脫緩沖液(eb)并且將混合物置于磁性支架上。除去所得最終上清液并置于1.5ml管中。這個(gè)方法產(chǎn)生了525個(gè)dna堿基對(duì)(bp)(插入物加適配子)大小范圍內(nèi)的文庫。使用kapa生物系統(tǒng)高保真熱啟動(dòng)(kapabiosystemhifihotstart)(kapa生物系統(tǒng)公司(kapabiosystems，inc.)，威爾明頓，馬薩諸塞州)使用以下循環(huán)條件擴(kuò)增大小確定的dna文庫：[98℃，45s]；12x[98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s]；[72℃，1min]。每個(gè)反應(yīng)含有：5uldna文庫，1ul生物科技通用引物(25um)，18ul無菌水，1ul生物科技有索引的引物(25um)，25ul2xkapa高保真聚合酶。使用高靈敏度芯片在安捷倫(agilent)2100生物分析儀(安捷倫科技公司(agilenttechnologies)，圣克拉拉，加利福尼亞州)上跑文庫，以確定文庫大小范圍和平均插入物大小。使用標(biāo)準(zhǔn)的制造商測(cè)序方案(億明達(dá)公司(illumina,inc.)，圣地亞哥，加利福尼亞州)在hiseq2500測(cè)序系統(tǒng)上針對(duì)配對(duì)末端(pe)測(cè)序(100個(gè)循環(huán)/讀數(shù)；12-24個(gè)文庫/個(gè)泳道)加工所有文庫。使用被開發(fā)用于鑒別和表征可能的cry樣基因的芽孢桿菌屬計(jì)算分析工具來優(yōu)先化引導(dǎo)物，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室測(cè)試。上述基因組組裝與分析以及基因組文庫分析在bt菌株中鑒別出五個(gè)cry樣基因，它們對(duì)至少一種鱗翅目有害生物(例如亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis)))有毒性。這些cry基因和蛋白的鑒別特征示于表1中。表1.蘇云金桿菌菌株中鑒別的cry基因/蛋白。實(shí)例3.重組宿主細(xì)胞中的bt蛋白表達(dá)芽孢桿菌屬表達(dá)。經(jīng)由設(shè)計(jì)用于在大腸桿菌和bt兩者中表達(dá)的被指定為pcib5634`的穿梭載體在沒有可觀察到的背景殺昆蟲活性的無晶體(crystalminus)蘇云金桿菌(bt)菌株中表達(dá)實(shí)例2中描述的cry蛋白。載體pcib5634`包括驅(qū)動(dòng)經(jīng)克隆的btcry基因的表達(dá)的cry1ac啟動(dòng)子和紅霉素抗性標(biāo)記。經(jīng)由電穿孔將包含感興趣的cry編碼序列的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主bt菌株中并且在含有紅霉素的瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)基因bt菌株。使所選擇的轉(zhuǎn)基因bt菌株在t3培養(yǎng)基中于28℃下生長4-5天至孢子形成階段。收獲細(xì)胞沉淀并且在溶解于包含2mmdtt的高ph碳酸鹽緩沖液(50mm)中之前反復(fù)洗滌。大腸桿菌表達(dá)。使用pet28a或pet29a載體(默克公司(merckkgaa)，達(dá)姆施塔特，德國)在大腸桿菌菌株中表達(dá)cry蛋白。通過電穿孔轉(zhuǎn)化構(gòu)建體并且在含有卡那霉素的瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)大腸桿菌克隆。使所選擇的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌菌株生長并且使用iptg誘導(dǎo)在28℃下誘導(dǎo)cry蛋白表達(dá)。將細(xì)胞再懸浮于含有2mmdtt的高ph碳酸鹽緩沖液(50mm)中并且然后使用microfluidicslv-1勻漿器 打碎。表達(dá)分析。然后經(jīng)由離心澄清來自轉(zhuǎn)基因bt或大腸桿菌菌株的所得細(xì)胞裂解物并且使用bioradexperion系統(tǒng)(伯樂公司(biorad)，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)經(jīng)由sds-page和電泳圖分析樣品的純度。經(jīng)由布雷福德(bradford)或賽默(thermo)660測(cè)定確定總蛋白濃度。然后在以下描述的生物測(cè)定中測(cè)試經(jīng)純化的cry蛋白。實(shí)例4.cry蛋白在生物測(cè)定中的活性使用本領(lǐng)域公認(rèn)的人工飼料生物測(cè)定方法針對(duì)以下鱗翅目有害生物種類中的一種或多種測(cè)試實(shí)例3中產(chǎn)生的cry蛋白：亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer；acb)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))；棉螟蛉(cottonbollworm；cbw)(棉鈴蟲(helicoverpaarmigera))；黑色地老虎(blackcutworm；bcw)(小地老虎(agrotisipsilon))；黃色桃螟蟲(yellowpeachborer；ypb)(桃蛀螟(conogethespunctiferalis))；東方黏蟲(orientalarmyworm；oaw)(東方粘蟲(mythimnasepatate))；條紋蛀莖蟲(stripedstemborer；ssb)(二化螟(chilosuppressalis))；歐洲玉米蛀蟲(europeancornborer；ecb)(歐洲玉米螟(ostrinianubilalis))；秋黏蟲(fallarmyworm；faw)(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))，玉米穗蛾(cornearworm；cew)(玉米穗蟲(helicoverpazea))，甘蔗螟(sugarcaneborer；scb)(小蔗螟(diatraeasaccharalis))，大豆夜蛾(soybeanlooper；sbl)(大豆尺蠖(chrysodeixisincludes))，西南玉米蛀蟲(southwestcornborer)(西南玉米螟(diatraeagrandiosella))以及煙夜蛾(tobaccobudworm；tbw)(煙芽夜蛾(heliothisvirescens))。向24孔平板中的人工昆蟲飼料(bioserv公司，弗倫奇敦，新澤西州)的表面施加等量的溶液中的蛋白質(zhì)。在飼料表面干燥之后，向每個(gè)孔中添加有待測(cè)試的昆蟲種類的幼蟲。將這些平板密封并且保持在就溫度、光照以及相對(duì)濕度而言的環(huán)境實(shí)驗(yàn)室條件下。陽性對(duì)照組由暴露于非常具活性且廣譜的野生型芽孢桿菌屬菌株的幼蟲組成。陰性對(duì)照組由暴露于僅用緩沖溶液處理的昆蟲飼料的幼蟲和未處理的昆 蟲飼料(即只有飼料)上的幼蟲組成。約120小時(shí)之后評(píng)估死亡率并且相對(duì)于對(duì)照評(píng)分。結(jié)果示于表2中，其中“-”意指與對(duì)照組相比無活性，“+/-”意指與對(duì)照相比0-10％的活性(此類別還包括具有強(qiáng)烈幼蟲生長抑制的0％死亡率)，“+”意指與對(duì)照相比10％-25％的活性，“++”意指與對(duì)照相比25％-75％的活性，并且“+++”意指與對(duì)照相比75％-100％的活性。括號(hào)指示如下觀察到的幼蟲生長遲緩(生長抑制)：“(l)”意指輕生長遲緩；“(m)”意指中生長遲緩并且“(s)”意指強(qiáng)生長遲緩。表2中的名稱“nt”意指沒有針對(duì)該具體有害生物測(cè)試所指示的蛋白質(zhì)。表2.cry蛋白的生物測(cè)定結(jié)果。令人驚訝地，與cry20家族的成員具有最接近的序列匹配的bt-0049具有針對(duì)某些鱗翅目有害生物特別是亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))的活性。據(jù)信這是具有針對(duì)鱗翅目有害生物的活性的cry20相關(guān)蛋白的首次報(bào)道。cry20蛋白在本領(lǐng)域中因針對(duì)雙翅目昆蟲(例如蚊)的活性而已知(參見例如，易卜拉欣(ibrahim)等人同上，柯納卡(konecka)等人2014.生物學(xué)快報(bào)(biol.lett.)5:83-92；以及伽馬(gama)&中越(nakagoshi)，2014.現(xiàn)代微生物學(xué)與應(yīng)用科學(xué)國際雜志(int.j.curr.microbiol.app.sci.)3:179-197)。被指定為bt-0211(seqidno: 26)的另一種如上所述分離的btcry蛋白也是cry20家族的一員，當(dāng)在如上所述的相同條件下測(cè)試時(shí)它對(duì)亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))沒有活性。這是bt-0049cry蛋白的獨(dú)特活性譜的進(jìn)一步指示。表3示出了bt-0049、bt-0211與已知cry20蛋白之間的百分比一致性矩陣。已知cry20蛋白的名稱后的括號(hào)中的數(shù)字是genbank登錄號(hào)?；谑居诰仃囍械囊恢滦砸约案鶕?jù)克里克莫爾(crickmore)等人(1998.微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論(microbiol.molec.biol.rev.)62:807-813)的命名新蛋白的方法，bt-0211可能是cry20bb2并且bt-0049可能是將被指定為cry20ca1的新cry20蛋白。表3.cry20家族成員的百分比一致性矩陣。具鱗翅目活性的bt-0049和不具鱗翅目活性的bt-0211蛋白之間的序列比對(duì)(圖1)指示在bt-0049蛋白中存在兩個(gè)明顯的氨基酸差異區(qū)域，它們可能完全或部分地是造成這兩種蛋白質(zhì)之間的活性譜差異的原因。第一區(qū)域是從bt-0049(seqidno:16)的氨基酸674至氨基酸709，由序列svyhpdandaydegddntynqnynsmynqnadntyd(seqidno:27)組成。第二區(qū)域是從seqidno:16的氨基酸730至氨基酸746，由序列g(shù)yeqnnydsddsdynnt(seqidno:28)組成。實(shí)例5.針對(duì)植物表達(dá)的基因定向在植物中表達(dá)之前，在自動(dòng)基因合成平臺(tái)(例如，金斯瑞公司(genscript、inc.)，皮斯卡塔韋，新澤西州)上合成編碼cry蛋白bt-0049(seqidno:16)、bt-0063(seqidno:17)、bt-0064(seqidno:18)、bt-0086(seqidno:19)或bt-0498(seqidno:20)或者突變的cry蛋白mbt-0049(seqidno:21)、mbt-0063(seqidno:22)、mbt-0064(seqidno:23)、mbt-0086(seqidno:24)或mbt-0498(seqidno:25)的多核苷酸。用于這個(gè)實(shí)例，制備包含可操作地連接至cry蛋白編碼序列(該編碼序列可操作地連接至終止子)的植物可表達(dá)型啟動(dòng)子的第一表達(dá)盒，并且制備包含可操作地連接至選擇性標(biāo)記(該選擇性標(biāo)記可操作地連接至終止子)的植物可表達(dá)型啟動(dòng)子的第二表達(dá)盒。選擇性標(biāo)記的表達(dá)允許在選擇培養(yǎng)基上鑒別轉(zhuǎn)基因植物。將兩個(gè)表達(dá)盒克隆進(jìn)適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻或玉蜀黍轉(zhuǎn)化的載體中。實(shí)例6.cry蛋白在玉蜀黍植物中的表達(dá)與活性未成熟的玉蜀黍胚的轉(zhuǎn)化基本上如在內(nèi)格羅托(negrotto)等人，2000，植物細(xì)胞報(bào)告(plantcellreports)19:798-803中描述的來進(jìn)行。簡言之，使包含描述于實(shí)例5中的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株lba4404(psb1)在28℃下在yep(酵母提取物(5g/l)、蛋白胨(10g/l)、nacl(5g/l)、15g/l瓊脂，ph6.8)固體培養(yǎng)基上生長2-4天。將大約0.8x109個(gè)農(nóng)桿菌細(xì)胞懸浮于補(bǔ)充有100μmas的ls-inf培養(yǎng)基中。在這個(gè)培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌預(yù)誘導(dǎo)大約30-60分鐘。將來自自交玉蜀黍系的未成熟胚從8-12天大的穗中切除到液體ls-inf+100μmas中。用新鮮的感染培養(yǎng)基漂洗這些胚。然后添加農(nóng)桿菌溶液，并且將這些胚渦旋30秒并且允許其與細(xì)菌一起沉降5分鐘。然后將這些胚盾片向上地轉(zhuǎn)移到lsa培養(yǎng)基中，并且在暗處培養(yǎng)兩到三天。隨后，將每皮氏板(petriplate)大約20與25個(gè)之間的胚轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有頭孢噻肟(250mg/l)和硝酸銀(1.6mg/l)的lsdc培養(yǎng)基中，并且在大約28℃下在黑暗中培養(yǎng)10天。將產(chǎn)生胚性愈傷組織的未成熟胚轉(zhuǎn)移至lsd1m0.5s培養(yǎng)基中。 在這種培養(yǎng)基上對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行持續(xù)大約6周的選擇，在約3周時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)步驟。將存活的愈傷組織轉(zhuǎn)移至添加有甘露糖的reg1培養(yǎng)基中。在光照中(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗方案)培養(yǎng)之后，然后將綠色組織轉(zhuǎn)移至沒有生長調(diào)節(jié)劑的reg2培養(yǎng)基中并且孵育約1-2周。將這些小植株轉(zhuǎn)移至含有reg3培養(yǎng)基的magentaga-7boxes(magentacorp,chicagoiii.)中并使其在光照中生長。約2-3周之后，通過pcr測(cè)試植物的選擇性標(biāo)記基因和btcry基因的存在。將來自pcr測(cè)定的陽性植物轉(zhuǎn)移至溫室用于進(jìn)一步評(píng)估。在葉切除生物測(cè)定中，針對(duì)拷貝數(shù)(通過taqman分析確定)、蛋白質(zhì)表達(dá)水平(通過elisa確定)和對(duì)抗感興趣的昆蟲種類的功效對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行評(píng)估。確切地說，從單拷貝事件(v3-v4階段)中切取植物組織(葉或花絲)并且用目標(biāo)有害生物的新生幼蟲侵染，然后在室溫下孵育5天。針對(duì)一種或多種鱗翅目有害生物如亞洲玉米蛀蟲(asiancornborer)(亞洲玉米螟(ostriniafurnacalis))測(cè)試來自表達(dá)bt-0049、bt-0063、bt-0064、bt-0086、bt-0498、mbt-0049、mbt-0063、mbt-0064、mbt-0086或mbt-0498的轉(zhuǎn)基因植物的葉圓片。轉(zhuǎn)基因植物組織生物測(cè)定的結(jié)果將證實(shí)當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)本發(fā)明的cry蛋白對(duì)于目標(biāo)鱗翅目有害生物中的一種或多種是有毒的。本發(fā)明的一些實(shí)施方案如下：1.一種核酸分子，其包含編碼對(duì)鱗翅目有害生物有毒的cry蛋白的核苷酸序列，其中該核苷酸序列(a)與seqidno:1-5中任一個(gè)或其毒素編碼片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)編碼包含如下氨基酸序列的cry蛋白，該氨基酸序列與seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)是(a)或(b)的合成序列，該合成序列具有針對(duì)在轉(zhuǎn)基因生物中的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子；或(d)在嚴(yán)格條件下與seqidno:1-5中任一個(gè)或其毒素編碼片段雜交，或與編碼包含seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段的氨基酸序列的cry蛋白的第二核苷酸序列雜交；或(e)編碼包含如下氨基酸序列的cry蛋白，該氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換(例如，保守置換)而不同于seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段的氨基酸序列；或(f)是(a)或(b)或(d)或(e)中所定義的核苷酸序列，其源自蘇云金桿菌菌株。2.如實(shí)施方案1所述的核酸分子，其中該核苷酸序列包含seqidno:1-5中任一個(gè)或其毒素編碼片段。3.如實(shí)施方案1所述的核酸分子，其中該cry蛋白包含seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段的氨基酸序列。4.如實(shí)施方案1所述的核酸分子，其中該合成核苷酸序列包含seqidno:6-15中任一個(gè)或其毒素編碼片段。5.一種嵌合基因，其包含可操作地連接至如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的核酸分子的異源啟動(dòng)子。6.如實(shí)施方案5所述的嵌合基因，其中該異源啟動(dòng)子是植物可表達(dá)型啟動(dòng)子。7.如實(shí)施方案6所述的嵌合基因，其中該植物可表達(dá)型啟動(dòng)子選自：泛素、夜香樹屬黃病毒、玉米trpa、osmads6、玉蜀黍h3組蛋白、噬菌體t3基因95'utr、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脫氫酶1、玉米捕光復(fù)合物、玉米熱休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亞基rubp羧化酶、水稻肌動(dòng)蛋白、水稻親環(huán)蛋白、ti質(zhì)粒甘露堿合酶、ti質(zhì)粒胭脂堿合酶、矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶、豆類富甘氨酸蛋白1、馬鈴薯糖 蛋白、凝集素、camv35s和s-e9小亞基rubp羧化酶啟動(dòng)子。8.如實(shí)施方案5所述的嵌合基因，其中該鱗翅目有害生物選自：亞洲玉米蛀蟲(亞洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉鈴蟲)、黃色桃螟蟲(桃蛀螟)、東方黏蟲(東方粘蟲)、歐洲玉米蛀蟲(歐洲玉米螟)、秋黏蟲(草地貪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗蟲)、甘蔗螟(小蔗螟)、絨毛豆毛蟲(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀蟲(西南玉米螟)、西部豆切根蟲(西部豆夜蛾)、煙夜蛾(煙芽夜蛾)、條紋蛀莖蟲(二化螟)、粉蛀莖蟲(非洲大螟)和水稻卷葉螟(稻縱卷葉螟)。9.如實(shí)施方案5所述的嵌合基因，其中該轉(zhuǎn)基因生物是細(xì)菌。10.一種對(duì)鱗翅目有害生物有毒的分離的cry蛋白，其中該cry蛋白包含：(a)氨基酸序列，該氨基酸序列與seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(b)由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該核苷酸序列與seqidno:6-15中任一個(gè)或其毒素編碼片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列一致性；或(c)氨基酸序列，該氨基酸序列由于1-50、1-20或1-10個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換(例如，保守置換)而不同于(a)或(b)的氨基酸序列；或(d)(a)或(b)或(c)的氨基酸序列，其源自蘇云金桿菌菌株。11.如實(shí)施方案10所述的cry蛋白，其中該氨基酸序列包含seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段。12.如實(shí)施方案10所述的cry蛋白，其中該氨基酸序列由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列包含seqidno:6-15中任一個(gè)或其毒素編碼片段。13.如實(shí)施方案10-12中任一項(xiàng)所述的cry蛋白，其中該鱗翅目有害生物選自：亞洲玉米蛀蟲(亞洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉鈴蟲)、黃色桃螟蟲(桃蛀螟)、東方黏蟲(東方粘蟲)、歐洲玉米蛀蟲(歐洲玉米螟)、秋黏蟲(草地貪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗蟲)、甘蔗螟(小蔗螟)、絨毛豆毛蟲(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀蟲(西南玉米螟)、西部豆切根蟲(西部豆夜蛾)、煙夜蛾(煙芽夜蛾)、條紋蛀莖蟲(二化螟)、粉蛀莖蟲(非洲大螟)和水稻卷葉螟(稻縱卷葉螟)。14.一種分離的蘇云金桿菌菌株，其產(chǎn)生如實(shí)施方案10-13中任一項(xiàng)所述的cry蛋白。15.一種殺昆蟲組合物，其包含如實(shí)施方案10-13中任一項(xiàng)所述的cry蛋白和農(nóng)業(yè)上可接受的載體。16.如實(shí)施方案15所述的組合物，其中該農(nóng)業(yè)上可接受的載體選自：粉劑、塵劑、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體和溶液。17.如實(shí)施方案15所述的組合物，其中該組合物通過脫水、冷凍干燥、均化、萃取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇云金桿菌菌株的培養(yǎng)物來制備。18.如實(shí)施方案17所述的組合物，其中該蘇云金桿菌菌株是如實(shí)施方案14所述的蘇云金桿菌菌株。19.如實(shí)施方案15所述的組合物，其中該組合物包含產(chǎn)生該cry蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞。20.如實(shí)施方案15所述的組合物，其包含按重量計(jì)從約1％至約99％的cry蛋白。21.一種重組載體，其包含如實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的核酸分子或如實(shí)施方案5-9中任一項(xiàng)所述的嵌合基因。22.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案21所述的重組載體。23.如實(shí)施方案22所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其是轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞，其中該細(xì)菌細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬、致病桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、巴斯德氏芽菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯桿菌屬、沙門氏菌屬、巴氏桿菌屬、黃單胞菌屬、鏈霉菌屬、根瘤菌屬、紅假單胞菌屬、嗜甲基菌屬、農(nóng)桿菌屬、醋桿菌屬、乳桿菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、明串珠菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬。24.如實(shí)施方案23所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該芽孢桿菌屬細(xì)胞是蘇云金桿菌細(xì)胞。25.如實(shí)施方案22所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞或單子葉植物細(xì)胞。26.如實(shí)施方案25所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞，并且其中該雙子葉植物細(xì)胞選自：大豆細(xì)胞、向日葵細(xì)胞、番茄細(xì)胞、蕓苔屬作物細(xì)胞、棉花細(xì)胞、糖用甜菜細(xì)胞和煙草細(xì)胞。27.如實(shí)施方案25所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞，并且其中該單子葉植物細(xì)胞選自：大麥細(xì)胞、玉蜀黍細(xì)胞、燕麥細(xì)胞、水稻細(xì)胞、高粱細(xì)胞、甘蔗細(xì)胞和小麥細(xì)胞。28.一種衍生自如實(shí)施方案25-27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的收獲產(chǎn)物，其中該收獲產(chǎn)物包含該蛋白質(zhì)。29.一種衍生自如實(shí)施方案28所述的收獲產(chǎn)物的加工產(chǎn)物，其中該加工產(chǎn)物選自：細(xì)粉、粗粉、油和淀粉，或者從其衍生的產(chǎn)物。30.一種收獲產(chǎn)物，其衍生自包含如實(shí)施方案25-27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中該收獲產(chǎn)物包含該蛋白質(zhì)。31.一種衍生自如實(shí)施方案30所述的收獲產(chǎn)物的加工產(chǎn)物，其中該加工產(chǎn)物選自：細(xì)粉、粗粉、油和淀粉，或者從其衍生的產(chǎn)物。32.一種產(chǎn)生對(duì)鱗翅目有害生物有毒的cry蛋白的方法，該方法包括：在如實(shí)施方案22-27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生該cry蛋白的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。33.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該鱗翅目有害生物選自：亞洲玉米蛀蟲(亞洲玉米螟)、黑色地老虎(小地老虎)、棉螟蛉(棉鈴蟲)、黃色桃螟蟲(桃蛀螟)、東方黏蟲(東方粘蟲)、歐洲玉米蛀蟲(歐洲玉米螟)、秋黏蟲(草地貪夜蛾)、玉米穗蛾(玉米穗蟲)、甘蔗螟(小蔗螟)、絨毛豆毛蟲(黎豆夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺蠖)、西南玉米蛀蟲(西南玉米螟)、西部豆切根蟲(西部豆夜蛾)、煙夜蛾(煙芽夜蛾)、條紋蛀莖蟲(二化螟)、粉蛀莖蟲(非洲大螟)和水稻卷葉螟(稻縱卷葉螟)，或其任何組合。34.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該核苷酸序列針對(duì)在植物中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。35.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該核酸分子或該嵌合基因包含seqidno:1-15中任一個(gè)或其毒素編碼片段。36.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該cry蛋白包含seqidno:16-25中任一個(gè)或其毒素片段的氨基酸序列。37.一種產(chǎn)生抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括：向植物中引入如實(shí)施方案6或7所述的嵌合基因，其中該cry蛋白在該植物中表達(dá)，由此產(chǎn)生抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物。38.如實(shí)施方案37所述的方法，其中通過轉(zhuǎn)化該植物來實(shí)現(xiàn)該引 入步驟。39.如實(shí)施方案37所述的方法，其中通過使包含該嵌合基因的第一植物與不同的第二植物雜交來實(shí)現(xiàn)該引入步驟。40.如實(shí)施方案37-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中該植物是水稻植物或玉蜀黍植物。41.一種控制鱗翅目有害生物的方法，該方法包括向該鱗翅目有害生物或其環(huán)境遞送組合物，該組合物包含有效量的如實(shí)施方案10-13中任一項(xiàng)所述的cry蛋白或如實(shí)施方案15-20中任一項(xiàng)所述的殺昆蟲組合物。42.一種控制亞洲玉米蛀蟲(亞洲玉米螟)的方法，該方法包括向該亞洲玉米蛀蟲或其環(huán)境遞送殺昆蟲蛋白，該殺昆蟲蛋白與seqidno:16或其毒素片段具有至少80％一致性。43.如實(shí)施方案42所述的方法，其中該殺昆蟲蛋白包含由svyhpdandaydegddntynqnynsmynqnadntyd(seqidno:27)或gyeqnnydsddsdynnt(seqidno:28)組成的連續(xù)氨基酸序列。44.一種核酸構(gòu)建體，其包含實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)之中所定義的核苷酸序列。45.一種融合蛋白，其包含實(shí)施方案10-13中任一項(xiàng)之中所定義的氨基酸序列。46.一種植物(例如，種子)或者其部分或細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的核酸分子，或如實(shí)施方案5-9中任一項(xiàng)所述的嵌合基因，或如實(shí)施方案10-13中任一項(xiàng)所述的cry蛋白，或如實(shí)施方案44所述的核酸構(gòu)建體，或如實(shí)施方案45所述的融合蛋白。47.如實(shí)施方案46所述的植物或者其部分或細(xì)胞，其中該植物是雙子葉植物或單子葉植物，并且該雙子葉植物可以選自大豆、向日葵、番茄、蕓苔屬作物、棉花、糖用甜菜和煙草，和該單子葉植物可以選自大麥、玉蜀黍、燕麥、水稻、高粱、甘蔗和小麥。48.如實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的核酸分子用于產(chǎn)生抗鱗翅目的植物或植物細(xì)胞/部分或者其子代的用途。49.如實(shí)施方案5-9中任一項(xiàng)所述的嵌合基因用于產(chǎn)生抗鱗翅目的植物或植物細(xì)胞/部分或者其子代的用途。50.如實(shí)施方案21所述的重組載體用于產(chǎn)生抗鱗翅目的植物或植物細(xì)胞/部分或者其子代的用途。51.如實(shí)施方案25-27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于產(chǎn)生抗鱗翅目的植物或植物細(xì)胞/部分或者其子代的用途。52.通過如實(shí)施方案37-40中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者如實(shí)施方案46或47所述的植物或者其部分或細(xì)胞用于產(chǎn)生抗鱗翅目的植物或植物細(xì)胞/部分或者其子代的用途。53.一種產(chǎn)生抗鱗翅目的植物的方法，該方法包括：a)使一種植物與通過如實(shí)施方案37-40中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物雜交；b)獲得子代；和c)從所述子代中選擇出抗鱗翅目的植物。54.一種產(chǎn)生抗鱗翅目的植物的方法，該方法包括：a)使通過如實(shí)施方案37-40中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物自交；b)獲得子代；和c)從所述子代中選擇出抗鱗翅目的植物。55.一種產(chǎn)生種子的方法，該方法包括：a)使通過如實(shí)施方案37-40、53和54中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物生長；和b)收集所述植物的種子。56.一種使用通過如實(shí)施方案37-40、53和54中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物來產(chǎn)生植物的方法。57.一種生長出植物的方法，該方法包括：a)種植通過如實(shí)施方案37-40、53和54中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物的種子或者實(shí)施方案46或47中所定義的種子；和b)使通過a)獲得的植物生長。58.一種產(chǎn)生植物的方法，該方法包括使通過如實(shí)施方案37-40、53和54中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物生長。59.一種產(chǎn)生收獲產(chǎn)物的方法，該方法包括使通過如實(shí)施方案37-40、53和54中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物或者實(shí)施方案46或47中所定義的植物生長，并且收獲該產(chǎn)物。60.一種通過如實(shí)施方案37-40和53-58中任一項(xiàng)所述的方法獲得的植物。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12