本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測黃曲霉毒素的核酸適配體、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素，英文名稱為aflatoxin，是一類由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的二氫呋喃香豆素的衍生物，是一種常見的真菌毒素，具有致畸、致突變、致癌作用、被世界衛(wèi)生組織劃定為i類致癌物。黃曲霉毒素可污染玉米、谷物、花生等糧食、飼料和食品。人和動物食用黃曲霉毒素污染的食品后，黃曲霉毒素會進入生物體內(nèi)，對健康造成巨大威脅。黃曲霉毒素主要包括黃曲霉毒素b1(afb1)、黃曲霉毒素b2(afb2)、黃曲霉毒素g1(afg1)和黃曲霉毒素g2(afg2)，其中黃曲霉毒素b1污染廣泛，毒性強。afm1和afm2分別是黃曲霉毒素b1和黃曲霉毒素b2的羥基化代謝產(chǎn)物，在乳及乳制品的污染中常見?？焖佟⒏哽`敏度的檢測在食品安全和環(huán)境健康方面具有重要的意義。常用的一些檢測黃曲霉毒素的分析方法主要包括薄層色譜分析、液相色譜-熒光分析、液相色譜-質(zhì)譜分析、免疫分析等方法。液相色譜法往往需要昂貴的儀器，操作步驟繁瑣費時，運行維護成本高。免疫分析法則需要利用可識別黃曲霉毒素的免疫抗體作為親和配體，選擇性識別黃曲霉毒素分子，但是免疫抗體的制備成本高，制備的抗體不同批次間重現(xiàn)性較差，而且免疫抗體熱穩(wěn)定性差，貨架周期短，容易失活。免疫分析法往往需要制備黃曲霉毒素與蛋白質(zhì)或酶分子的偶聯(lián)物等，增加了檢測成本，檢測實驗往往需要多個步驟，操作復(fù)雜且費時。

因此，本領(lǐng)域亟需研究開發(fā)快速簡便且具有高靈敏度的檢測黃曲霉毒素分子的方法和產(chǎn)品，這將具有重要的理論意義和廣泛的實際應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種檢測黃曲霉毒素的核酸適配體、試劑盒及其檢測方法，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測黃曲霉毒素的核酸適配體，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr(tetramethylrhodamine，四甲基羅丹明)或fam(fluorescein，熒光素)標記得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr、fam或texasred(德克薩斯紅)標記得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素的試劑盒，其包括上述的核酸適配體。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素的方法，其是將上述核酸適配體與待測樣本混合后溫育，測定熒光強度值、熒光各向異性值或熒光偏振值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進步效果在于：

本發(fā)明利用熒光染料(四甲基羅丹明、熒光素或texasred)標記的dna核酸適配體實現(xiàn)熒光分析黃曲霉毒素。本發(fā)明利用核酸適配體與目標分子結(jié)合后引起構(gòu)象變化，進而影響標記的熒光染料的熒光特性如熒光強度和熒光各向異性(熒光偏振)，從而實現(xiàn)對黃曲霉毒素的靈敏檢測。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法在應(yīng)用時具有快速便捷、操作簡單以及檢測靈敏度高等優(yōu)勢，利用熒光染料的核酸適配體可以實現(xiàn)對afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2的檢測。

附圖說明

圖1顯示實施例1中采用tmr標記的核酸適配體a50-t26-tmr基于熒光各向異性檢測不同濃度的黃曲霉毒素b1(afb1)的結(jié)果，其中，橫坐標顯示黃曲霉毒素b1的濃度，縱坐標顯示熒光各向異性值r。

圖2顯示實施例2中采用tmr標記的核酸適配體a50-t26-tmr基于熒光強度變化檢測不同濃度的黃曲霉毒素b1(afb1)的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后探針的熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖3顯示實施例3中采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1(afb1)的結(jié)果。

圖4顯示實施例4中采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr基于熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1(afb1)的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后探針的熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖5顯示實施例5中采用fam標記的核酸適配體a34-t24-fam基于熒光各向異性分析檢測黃曲霉毒素b1(afb1)的結(jié)果，結(jié)果顯示熒光各向異性值r與afb1濃度的關(guān)系。

圖6顯示實施例6中采用fam標記的核酸適配體a34-t24-fam基于熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后探針的熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖7顯示實施例7中采用texasred熒光染料標記的核酸適配體a34-t29-txr基于熒光各向異性變化檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖8顯示實施例8中采用tmr標記的核酸適配體a26-t20-tmr基于熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后探針的熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖9顯示實施例9中采用tmr標記的核酸適配體a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖10顯示實施例10中采用tmr標記的核酸適配體a28-t21-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖11顯示實施例11中tmr標記的核酸適配體a28-t21-tmr基于熒光強度隨afb1濃度變化的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后的探針熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖12顯示實施例12中采用tmr標記的核酸適配體a30-t22-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖13顯示實施例13中采用tmr標記的核酸適配體a32-t23-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖14顯示實施例14中采用tmr標記的核酸適配體a32-t23-tmr基于熒光強度檢測afb1的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb1時的熒光強度值，i為afb1加入后探針的熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖15顯示實施例15中采用a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b2(afb2)的結(jié)果。

圖16顯示實施例16中采用a34-t24-tmr根據(jù)熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b2(afb2)的結(jié)果，其中，i0為樣品中無afb2時的熒光強度值，i為afb2加入后的探針熒光強度，i/i0為熒光強度的比值。

圖17顯示實施例17中采用a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測afm1或afm2的結(jié)果。

圖18顯示實施例18中采用a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測afg1或afg2的結(jié)果。

圖19顯示實施例19中采用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afb2的結(jié)果。

圖20顯示實施例20中采用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afm1或afm2的結(jié)果。

圖21顯示實施例21中采用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afg1或afg1的結(jié)果。

圖22顯示對比例1中采用a50-t26-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1方法的選擇性考察結(jié)果。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

核酸適配體是從寡聚核苷酸文庫中篩選得到的可高親和力高選擇性識別目標分子的單鏈核酸分子。核酸適配體的出現(xiàn)為檢測黃曲霉毒素提供了新的研究手段。作為核酸類的親和配體，核酸適配體在分析檢測領(lǐng)域的應(yīng)用具有很多優(yōu)點，如合成制備方便，熱穩(wěn)定性高，易于引入功能團如熒光染料標記等。核酸適配體在親和力和選擇性方面都可以和免疫抗體相媲美，核酸適配體的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗體的在穩(wěn)定性和制備等方面的一些局限，顯示出潛力，核酸適配體的應(yīng)用也受到廣泛的關(guān)注，在分析傳感領(lǐng)域顯示出很大的潛力和應(yīng)用前景。

本申請的發(fā)明人基于本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，經(jīng)過大量的實驗探究和反復(fù)的實踐驗證，終于得到了可與黃曲霉毒素結(jié)合同時可產(chǎn)生熒光信號變化的熒光染料標記的核酸適配體，所述核酸適配體可以與黃曲霉毒素選擇性作用，具有很強的親和力，利用所述核酸適配體可以發(fā)展檢測黃曲霉毒素的檢測方法。

本發(fā)明的原理是：利用熒光染料(四甲基羅丹明、熒光素或texasred)標記核酸適配體對黃曲霉毒素進行熒光分析檢測，通過熒光染料標記的核酸適配體與目標分子結(jié)合后引起熒光強度或熒光各向異性(熒光偏振)的變化來實現(xiàn)對目標分子的檢測分析。

本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素的核酸適配體，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr(tetramethylrhodamine，四甲基羅丹明)或fam(fluorescein，熒光素)標記得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr、fam或texasred(德克薩斯紅)標記得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的任一t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素的核酸適配體，其是如下的分子：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的第26位上的t堿基經(jīng)tmr或fam標記得到的分子；或

(2)序列如seqidno.2所示核酸分子的第24位上的t堿基經(jīng)tmr或fam標記得到的分子，或者序列如seqidno.2所示核酸分子的第29位上的t堿基經(jīng)texasred標記得到的分子；或

(3)序列如seqidno.3所示核酸分子的第23位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(4)序列如seqidno.4所示核酸分子的第22位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(5)序列如seqidno.5所示核酸分子的第21位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子；或

(6)序列如seqidno.6所示核酸分子的第20位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子。

其中，以上序列中其他的t堿基上標記相應(yīng)熒光染料的核酸適配體也會對目標分子產(chǎn)生信號響應(yīng)，上述優(yōu)選的標記位點是能產(chǎn)生較大和更為靈敏的熒光信號變化的標記位點。

本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素的試劑盒，其包括上述的核酸適配體。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照，所述陽性對照包括afb1、afb2、afg1、afg2、afm1和afm2中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括ph為ph為6～10的緩沖液，更優(yōu)選地，所述緩沖液是ph為7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes緩沖液；或者是ph為7.5，包括20mmmgcl2和0.1％tween20的pbs磷酸鹽緩沖溶液；或者是ph為7.5，包括10mmtris-hcl、20mmmgcl2和0.1％tween20的tris-hcl緩沖液。本發(fā)明最優(yōu)選ph為7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes緩沖液。

本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素的方法，其是將上述核酸適配體與待測樣本混合后溫育，測定熒光強度值、熒光各向異性值或熒光偏振值。

其中，優(yōu)選地，所述核酸適配體的使用濃度為25nm。

優(yōu)選地，所述待測樣本進行預(yù)處理，即將待測樣本采用ph為6～10的緩沖液進行稀釋。

優(yōu)選地，所述溫育的溫度為20～30℃，更優(yōu)選地，所述溫育的溫度為25℃。

優(yōu)選地，所述溫育在ph為6～10的緩沖液中進行，更優(yōu)選地，所述緩沖液是ph為7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes緩沖液；或者是ph為7.5，包括20mmmgcl2和0.1％tween20的pbs磷酸鹽緩沖溶液；或者是ph為7.5，包括10mmtris-hcl、20mmmgcl2和0.1％tween20的tris-hcl緩沖液。本發(fā)明最優(yōu)選ph為7.5，包括10mmhepes、20mmmgcl2和0.1％tween20的hepes緩沖液。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

下面列舉一些具體實施例，以對本發(fā)明的實施和技術(shù)效果作更進一步的說明。

下述具體實施例中，當采用tmr標記的核酸適配體時，檢測所用的激發(fā)波長為555nm，發(fā)射波長為580nm，狹峰寬度均為5nm。當采用fam標記的核酸適配體時，檢測所用的激發(fā)波長為493nm，發(fā)射波長為520nm，狹峰寬度均為5nm。當采用texasred標記的核酸適配體時，檢測所用的激發(fā)波長為594nm，發(fā)射波長為609nm，狹峰寬度均為5nm。核酸適配體探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成純化。

實施例1：采用tmr標記的核酸適配體a50-t26-tmr根據(jù)熒光各向異性值的變化檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.1所示核酸分子(簡稱為a50)的第26位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccaca-3’，其中第26位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a50-t26-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a50-t26-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a50-t26-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)濃度的增加，a50-t26-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖1所示。

實施例2：采用tmr標記的核酸適配體a50-t26-tmr根據(jù)熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a50-t26-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a50-t26-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)濃度的增加，a50-t26-tmr的熒光強度逐漸升高，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖2所示。

實施例3：采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr根據(jù)熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.2所示核酸分子(簡稱為a34)的第24位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第24位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a34-t24-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為1nm，結(jié)果請參見圖3所示。

實施例4：采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr基于熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光強度逐漸升高，檢測限為1nm，結(jié)果請參見圖4所示。

實施例5：采用fam標記的核酸適配體a34-t24-fam熒光各向異性分析檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.2所示核酸分子的第24位上的t堿基經(jīng)fam標記得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第24位堿基t上標記fam熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a34-t24-fam。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-fam(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-fam的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a34-t24-fam的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖5所示。

實施例6：采用fam標記的核酸適配體a34-t24-fam根據(jù)熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-fam(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-fam的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a34-t24-fam的熒光強度逐漸升高，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖6所示。

實施例7：采用txr標記的核酸適配體a34-t29-txr根據(jù)熒光各向異性變化檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.2所示核酸分子的第29位上的t堿基經(jīng)txr標記得到的分子，即5'-tgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccct-3’，其中第29位堿基t上標記txr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a34-t29-txr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t29-txr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t29-txr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a34-t29-txr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為4nm，結(jié)果請參見圖7所示。

實施例8：采用tmr標記的核酸適配體a26-t20-tmr根據(jù)熒光強度變化檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.6所示核酸分子(簡稱為a26)的第20位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-cacgtgttgtctctctgtgtctcgtg-3’，其中第20位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a26-t20-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a26-t20-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a26-t20-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a26-t20-tmr的熒光強度逐漸升高，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖8所示。

實施例9：采用tmr標記的核酸適配體a26-t20-tmr根據(jù)熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a26-t20-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a26-t20-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a26-t20-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖9所示。

實施例10：采用tmr標記的核酸適配體a28-t21-tmr根據(jù)熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.5所示核酸分子(簡稱為a28)的第21位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-gcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgc-3’，其中第21位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a28-t21-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a28-t21-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a28-t21-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a28-t21-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為1nm，結(jié)果請參見圖10所示。

實施例11：采用tmr標記的核酸適配體a28-t21-tmr基于熒光強度變化檢測afb1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a28-t21-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a28-t21-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a28-t21-tmr的熒光強度逐漸升高，檢測限為1nm，結(jié)果請參見圖11所示。

實施例12：采用tmr標記的核酸適配體a30-t22-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.4所示核酸分子(簡稱為a30)的第22位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-ggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3’，其中第22位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a30-t22-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a30-t22-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a30-t22-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a30-t22-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖12所示。

實施例13：采用tmr標記的核酸適配體a32-t23-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1

本實施例的核酸適配體為序列如seqidno.3所示核酸分子(簡稱為a32)的第23位上的t堿基經(jīng)tmr標記得到的分子，即5'-gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc-3’，其中第23位堿基t上標記tmr熒光染料，用下劃線標出，熒光染料標記的核酸適配體簡稱為a32-t23-tmr。

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a32-t23-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a32-t23-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a32-t23-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖13所示。

實施例14：采用tmr標記的核酸適配體a32-t23-tmr基于熒光強度檢測afb1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a32-t23-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b1混合，在25℃下溫育，然后測定a32-t23-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b1(afb1)的濃度的增加，a32-t23-tmr的熒光強度逐漸增加，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖14所示。

實施例15：采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b2混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光各向異性。隨著黃曲霉毒素b2(afb2)的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖15所示。

實施例16：采用tmr標記的核酸適配體a34-t24-tmr基于熒光強度檢測afb2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b2混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光強度。隨著黃曲霉毒素b2(afb2)的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光強度逐漸增加，結(jié)果請參見圖16所示。

實施例17：利用a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測afm1或afm2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素m1(afm1)或黃曲霉毒素m2(afm2)混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光各向異性。隨afm1或afm2的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為4nm，結(jié)果請參見圖17所示。

實施例18：利用a34-t24-tmr基于熒光各向異性檢測afg1或afg2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a34-t24-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素g1(afg1)或黃曲霉毒素g2(afg2)混合，在25℃下溫育，然后測定a34-t24-tmr的熒光各向異性。隨afg1或afg2的濃度的增加，a34-t24-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為16nm，結(jié)果請參見圖18所示。

實施例19：利用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afb2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a26-t20-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素b2(afb2)混合，在25℃下溫育，然后測定a26-t20-tmr的熒光各向異性。隨afb2的濃度的增加，a26-t20-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為2nm，結(jié)果請參見圖19所示。

實施例20：利用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afm1或afm2

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a26-t20-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素m1(afm1)或黃曲霉毒素m2(afm2)混合，在25℃下溫育，然后測定a26-t20-tmr的熒光各向異性。隨著afm1或afm2的濃度的增加，a26-t20-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為4nm，結(jié)果請參見圖20所示。

實施例21：利用a26-t20-tmr基于熒光各向異性檢測afg1或afg1

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a26-t20-tmr(濃度為25nm)與不同濃度的黃曲霉毒素g1(afg1)或黃曲霉毒素g2(afg2)混合，在25℃下溫育，然后測定a26-t20-tmr的熒光各向異性。隨著afg1或afg2的濃度的增加，a26-t20-tmr的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為16nm，結(jié)果請參見圖21所示。

對比例1利用a50-t26-tmr根據(jù)熒光各向異性檢測黃曲霉毒素b1方法的選擇性考察

在緩沖溶液(10mmhepes,20mmmgcl2,0.1％tween20，ph7.5)中將a50-t26-tmr(濃度為25nm)與待測樣品混合，在25℃下溫育，然后測定a50-t26-tmr的熒光各向異性，結(jié)果如圖22所示，其中，熒光各向異性值變化δr由測得的熒光各向異性值減去空白樣品對應(yīng)的熒光各向異性值得到。

其中，a為空白樣品組，b是赭曲霉毒素a組，c是赭曲霉毒素b組，d是伏馬毒素b1組，e是伏馬毒素b2組，e是玉米赤霉烯酮(f)組，從圖22中可見a～e組中a50-t26-tmr的熒光各向異性無明顯變化，而黃曲霉毒素b1組(g組)中，熒光各向異性明顯下降。

上述實施例和對比例的結(jié)果說明，本發(fā)明檢測所用的核酸適配體和檢測方法對目標分子的響應(yīng)特異性強，檢測精度高，檢測限低。

綜上所述，本發(fā)明提供的熒光染料標記的核酸適配體用于熒光強度變化或熒光各向異性變化檢測afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2，包括四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine，簡稱tmr)標記的核酸適配體、熒光素(fluorescein,簡稱fam)標記的核酸適配體、texasred標記的核酸適配體，熒光染料tmr、fam或texasred被標記到核酸適配體的特定的t堿基位置上。本發(fā)明利用熒光染料標記的核酸適配體可以實現(xiàn)對黃曲霉毒素(afb1、afb2、afm1、afm2、afg1或afg2)的直接檢測。本發(fā)明充分利用了核酸適配體在篩選、制備、穩(wěn)定性和易引入熒光染料標記等優(yōu)點，同時結(jié)合熒光各向異性(熒光偏振)和熒光強度分析技術(shù)具有的操作簡單、靈敏、無需分離等優(yōu)點，使得本發(fā)明整個操作步驟簡單，檢測快速，只需要將待測物與熒光標記的探針混合溫育，利用熒光分析檢測就可以實現(xiàn)對黃曲霉毒素的檢測。本發(fā)明的檢測方法具有高靈敏度，可以實現(xiàn)對nm水平黃曲霉毒素b1或黃曲霉毒素b2的檢測，采用最靈敏的熒光染料標記的核酸適配體探針，最低檢測限可以達到1nm；檢測afm1或afm2的檢測限達到4nm；而檢測afg1或afg2的檢測限可達到16nm。本發(fā)明的檢測方法樣品用量少，熒光標記的適配體具有很好的穩(wěn)定性，貨架穩(wěn)定性高。

需要指出的是，熒光偏振和熒光各向異性的基本原理是相同的，只是計算公式會略有不同。本發(fā)明相應(yīng)實施例中的熒光各向異性值數(shù)據(jù)都有對應(yīng)的熒光偏振值，因此也均能夠通過計算其熒光偏振值來實現(xiàn)對目標待測物濃度的檢測。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心

<120>檢測黃曲霉毒素的核酸適配體、試劑盒及其檢測方法

<130>ib177055

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>a50

<400>1

gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccaca50

<210>2

<211>34

<212>dna

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<220>

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<210>4

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<212>dna

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<213>人工序列

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