專利名稱：使用高濃度糖混合物誘導基因表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于提高來自細胞培養(yǎng)物的蛋白的生產的方法。發(fā)明人已經發(fā)現了能顯著增加蛋白量的培養(yǎng)組分和條件，所述蛋白由在纖維素酶基因啟動子序列控制下的基因生成。該改進的方法可以用于生產由自然存在的纖維素酶基因編碼的蛋白和來自不同異源構建體的蛋白。
背景技術：
絲狀真菌和分解纖維素的細菌能生成胞外纖維素酶，這賦予該生物水解纖維素的 β_(1，4)_連接的糖苷鍵生成葡萄糖的能力。這些酶給生物提供了利用纖維素(最豐富的植物多糖)來生長的能力。絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是有效的纖維素酶生產者。所以，已經開發(fā)了里氏木霉生產這些酶的能力，這可以用于生產商品，例如燃料乙醇、布料、洗滌劑、纖維和其它產品。里氏木霉蛋白的分解纖維素的混合物屬于最佳表征的微生物分解纖維素的途徑。 將含有這些混合物的纖維素酶分成兩大類內切葡聚糖酶(EG)和纖維二糖水解酶(CBH)。 β-葡糖苷酶也是里氏木霉的纖維素酶混合物的一部分。還已經開發(fā)了里氏木霉生產異源蛋白的能力?？刹僮鞯剡B接到里氏木霉的可誘導的cbhl啟動子后，編碼目標蛋白的基因可以被調節(jié)。已經在里氏木霉中分泌了外源多肽， 它是作為與催化域的融合體，且?guī)в衏bhl的連接區(qū)(Nyyssonen等，Bio/technology 11 591-595，1993)。包含纖維素酶系統(tǒng)的基因的表達受到轉錄水平的調控和調節(jié)。該系統(tǒng)的成員協(xié)同作用，并且如上所述是有效地將纖維素水解成可溶寡糖所必須的。木霉中的主要纖維素酶基因cbhl、cbh2、egll和egl2的表達和生成取決于可獲得的用于生長的碳源。纖維素酶基因受到葡萄糖的嚴格抑制，并且能由纖維素或二糖槐糖誘導數千倍。實際上，與含有葡萄糖的培養(yǎng)基相比，在含有誘導碳源(例如纖維素或槐糖)的培養(yǎng)基上可以將主要的纖維二糖水解酶I (cbhl)的表達水平上調數千倍(Ilmen等，App. Environ. Microbio.，1298-1306,1997)。纖維素酶的商業(yè)規(guī)模的生產是通過固體培養(yǎng)或浸沒培養(yǎng)，包括分批式、補料分批式和連續(xù)流工藝。工業(yè)生產纖維素酶的最成問題的且昂貴的方面是給木霉提供合適的誘導物。跟實驗室規(guī)模的實驗的情況一樣，商業(yè)規(guī)模的纖維素酶的生產是通過使真菌在固體纖維素上生長來誘導，或通過在存在二糖誘導物(例如乳糖)的情況下培養(yǎng)生物來誘導。不幸的是，這兩種誘導方法在工業(yè)規(guī)模都有缺陷，它們會導致與纖維素酶的生產相伴隨的高成本。纖維素酶的合成受到纖維素的誘導和葡萄糖的抑制。這樣，影響在可誘導的啟動子控制下的纖維素酶或異源蛋白的產率的關鍵因素是維持纖維素底物和葡萄糖濃度之間的適當平衡；至關重要的是合理地商業(yè)化地生產受調節(jié)基因的產物。盡管纖維素是有效的且不昂貴的誘導物，但是當木霉在固體纖維素上生長時很難控制葡萄糖的濃度。在低濃度的纖維素時，葡萄糖的生成會很少，難以滿足有活性的細胞的生長和功能的代謝需要。另一方面，當葡萄糖的生成比消耗更快時，葡萄糖抑制會中止纖維素酶的合成。因而，需要昂貴的工藝控制方案來緩慢地添加底物并監(jiān)視葡萄糖濃度(Ju和Afolabi,Biotechnol. Prog.， 91-97,1999)。而且，由于纖維素物質的固體性質，難以實現連續(xù)輸送底物。Alien 和 Mortensen (Biotechnol. Bioeng. , 2641-45,1981)已經證實，當將 200IU/ ml的來自海率曲霉(Aspergillus phoenicis)的純β -葡糖苷酶與50%葡萄糖衆(zhòng)一起孵育時，生成的溶液在用作碳源時具有誘導生成纖維素酶的能力。β -葡糖苷酶的純化既耗時又昂貴。另外，與在本工作中所使用的相比，這些作者使用了超過20倍的β_葡糖苷酶量。通過使用可溶底物和誘導物(例如乳糖或槐糖)，可以克服與使用纖維素作為誘導底物相伴隨的一些問題。提供的乳糖必須是高濃度的，以便起到誘導物和碳源的功能 (見 Seiboth,等,Mol. Genet. Genomics, 124-32, 2002.)。龍膽二糖也可以用作誘導物。槐糖是比纖維素更有效的誘導物，但是槐糖價格昂貴且難以生產。因此，在比固體纖維素更容易處理和控制的同時，槐糖仍然使生產纖維素酶的成本昂貴得難以接受，因此用于商業(yè)化生產纖維素酶是不切實際的。顯然，仍然需要方便的可溶的底物組合物，它還能提供低廉的在絲狀真菌(例如里氏木霉)中誘導纖維素酶的方法。另外，用低廉的誘導劑來調節(jié)可誘導的啟動子表達內源基因或外源基因的能力具有巨大的商業(yè)價值。發(fā)明概述現在已經發(fā)現，當把全纖維素酶制品(whole cellulasepreparation)加入到濃葡萄糖溶液中、并將組合物在約50°C至約65°C孵育至少2天時，會生成含有可觀量的纖維素酶基因表達的誘導物的糖混合物。令人驚奇的是，得到的復合混合物無需進一步純化即足以誘導纖維素酶的生成。該發(fā)現是令人驚奇的，因為葡萄糖是里氏木霉的纖維素酶基因的抑制劑。該發(fā)現提供了纖維素酶基因表達的誘導物，它是乳糖或純化的槐糖的低廉的替代品，也是比用于在里氏木霉中生產纖維素酶的固體纖維素更方便的替代品。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于誘導基因表達的組合物，所述基因的表達由纖維素酶基因啟動子序列控制，其包括(i)從約5%至約75% (重量/重量)的葡萄糖，優(yōu)選地50%-70%的葡萄糖，和(ii)從約2g/L至約10g/L全纖維素酶制品總蛋白，優(yōu)選地5g/L，其中在用于促進組合物中基因表達的誘導物的形成之前，將該組合物在約50°C 至約70°C孵育幾天。在另一個實施方案中，誘導性補料組合物在使用前在約50°C至約65°C、優(yōu)選地在約55°C孵育48小時。在另一個實施方案中，誘導性補料組合物在使用前在約50°C至約65°C、優(yōu)選地在約65°C孵育72小時。在一個優(yōu)選的實施方案中，從孵育濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品得到的孵育產物是含有槐糖的糖混合物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，孵育產物是含有龍膽二糖的糖混合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于生產蛋白的方法，所述蛋白的基因表達由可誘導的啟動子序列控制，其中提供了細胞培養(yǎng)物，并向培養(yǎng)物中加入了通過孵育濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品得到的誘導性補料組合物，其量能有效誘導由可誘導的啟動子序列控制的基因的表達。改進的方法可以用于生產自然存在的纖維素酶基因編碼的蛋白和來自不同異源構建體的蛋白。這樣的構建體包括表達載體，其中編碼目標蛋白的基因可操作地連接到可誘導的啟動子上。在一個實施方案中，可誘導的啟動子是纖維素酶基因啟動子。在第二個實施方案中，可誘導的啟動子是槐糖-可誘導的啟動子。在第三個實施方案中，可誘導的啟動子是龍膽二糖-可誘導的啟動子。在一個方面，可誘導的啟動子是cbhl啟動子。在一個實施方案中，用于生產目標蛋白的方法能生產選自下述的蛋白激素、酶、 生長因子、細胞因子和抗體。在一個方面，該方法用于生產的蛋白是天然存在的纖維素酶。 在另一個方面，該方法用于生產的蛋白的表達不是天然地由纖維素酶基因啟動子序列控制。在另一個實施方案中，生產蛋白的方法是使用絲狀真菌。在一個方面，該真菌是木霉屬。在一個方面，該真菌是里氏木霉。在另一個實施方案中，用于生產目標蛋白的方法使用誘導組合物，該誘導組合物是這樣制備的將全纖維素酶制品加入到纖維二糖溶液中，并將纖維素酶-纖維二糖溶液在50°C至約70°C孵育至少2天以形成誘導性補料組合物。在一個方面，該溶液是在50°C至約65°C孵育至少2天以形成誘導性補料組合物。該組合物是含有可觀量的纖維素酶基因表達的誘導物的糖混合物。


圖I說明了補加本發(fā)明的誘導組合物(□，正方形)與補加葡萄糖組合物( ，菱形)相比對野生型里氏木霉(RLP-37)(見 Sheir-Neiss 和 Montenecourt, Appl. Microbio. Biotechnol. ,46-53,1984)生產纖維素酶的影響。圖2說明了用固定化酶(□，正方形)生產槐糖與用酶溶液( ，菱形)相比的不同。最終葡萄糖濃度是約40%。蛋白加料是10g/L。詳見實施例4。圖3說明了用固定化酶(■，正方形)生產槐糖與用酶溶液(Λ，三角形)相比的不同。最終葡萄糖濃度是約60%。蛋白加料是3. 2g/L。詳見實施例4。圖4對比了圖2和3中使用相同的固定化酶的第二批實驗和第一批實驗得到的結果。第一批實驗后回收的固定化酶在第二批實驗中保留了活性。標識是□(正方形)，第一批10g/L實驗； (菱形)，第二批10g/L實驗；Λ (三角形)，第一批3. 2g/L實驗；X， 第二批3. 2g/L實驗。圖5顯示了在25%纖維二糖中與在25%葡萄糖中相比的槐糖生產。在25%纖維二糖(口；正方形)或葡萄糖溶液(重量/重量)(·；圓點)中的槐糖生產。圖6顯示了在不同全纖維素酶加樣的情況下在60%葡萄糖溶液(重量/重量)中的槐糖生產。Λ (三角形)，2.5g/L，口(正方形)，5.0g/L，^ (菱形)，7.5g/L，X，10g/L 全纖維素酶。發(fā)明詳述絲狀真菌里氏木霉是被最廣泛地研究了的分解纖維素的生物之一(參見，例如 Nevalainen和Penttila, Mycota, 303-319,1995)。工業(yè)上,木霉屬的纖維素分解酶用于多種目的，包括生產燃料乙醇、紙、人造絲、玻璃紙、洗滌劑和纖維。纖維素酶還用于提高動物飼料的營養(yǎng)價值，促進從植物細胞中提取有價值的組分(Mandels, Biochem. Soc. Trans., 414-16. 1985)。因此，這些酶在許多有用產品的生產中起重要作用。木霉屬中的纖維素酶的生成取決于可獲得的碳源。纖維素、乳糖和二糖槐糖會誘導里氏木霉合成纖維素酶。相反地，葡萄糖的存在會嚴格抑制纖維素酶基因的表達。提供用于工業(yè)規(guī)模生產的合適的誘導物是造成纖維素酶的高生產成本的主要問題因素?，F在已經發(fā)現，當把全纖維素酶制品加入到濃葡萄糖溶液中、并將組合物在約 50°C至約75°C、優(yōu)選地在約50°C至約65°C孵育至少2天時，會生成含有可觀量的纖維素酶基因表達的誘導物的糖混合物，即誘導性補料組合物。該誘導性補料組合物含有約2 25g/L槐糖。另外，該誘導性補料組合物含有約35 60g/L龍膽二糖。令人驚奇的是，得到的混合物無需任何進一步純化。它原樣即可誘導纖維素酶的生成。該發(fā)現提供了工業(yè)上需要的乳糖或純化槐糖的低廉的替代品，和比用于在絲狀真菌中生產由可誘導的啟動子調控的蛋白的固體纖維素更方便的替代品。更具體的觀點是，本發(fā)明的組合物可用于木霉屬的纖維素酶生產。在生產誘導性補料組合物的一個替代方法中，可以將最終發(fā)酵液(全纖維素酶+ 細胞)加入到葡萄糖溶液(例如20%)中。細胞的存在不會影響槐糖的形成。這樣，就無需使用回收的纖維素酶(即從細胞中分離出的纖維素酶制品)?？梢允褂迷诎l(fā)酵結束時存在的酶混合物，盡管還存在細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含濃葡萄糖溶液和全纖維素酶制品的組合物，它可以用作通過絲狀真菌生產目標蛋白的誘導補料。在一個方面，目標蛋白是纖維素分解酶。在另一個方面，目標蛋白是異源蛋白。在一個實施方案中，該誘導補料會誘導里氏木霉生成纖維素酶。令人驚奇的是，該溶液能有效地誘導纖維素酶基因的表達，因為已知纖維素酶基因會被存在的葡萄糖所抑制。在一個實施方案中，誘導補料是通過制備無菌的5%-75% (重量/重量)葡萄糖溶液來制作的。將來自里氏木霉的全纖維素酶制品加入到無菌葡萄糖溶液中，至終濃度為 2g 20g總蛋白/L。最終的蛋白濃度可以是低至O. 5g/L,高至50g/L。在一個方面,葡萄糖溶液中的葡糖苷酶活性高于1.5IU/ml。在一個方面，葡萄糖溶液中的β-葡糖苷酶活性低于200IU/ml。在另一個方面，葡萄糖溶液中的β -葡糖苷酶活性是在I. 5IU/ml至
7200IU/ml之間。在另一個方面，葡萄糖溶液中的β -葡糖苷酶活性是在I. 9IU/ml至200IU/ ml之間。在另一個方面，葡萄糖溶液中的β -葡糖苷酶活性是在9. 3IU/ml至200IU/ml之間。在另一個方面，葡萄糖溶液中的β -葡糖苷酶活性是在I. 5IU/ml至180IU/ml之間。在另一個方面，葡萄糖溶液中的葡糖苷酶活性是在9. 3IU/ml至180IU/ml之間。該溶液是在50°C _75°C、優(yōu)選地在約50°C -65°C孵育。溶液是在攪拌下孵育8小時至7天。在一個實施方案中，孵育時間超過2天。在第二個實施方案中，孵育時間是2天。在第三個實施方案中，孵育時間是3天。收集最終無菌溶液，用于發(fā)酵補料。在一個實施方案中，誘導補料是用60% (重量/重量)葡萄糖溶液制備的。在另一個實施方案中，誘導補料是通過將全纖維素酶制品加入到葡萄糖溶液中至終濃度為2g總蛋白/L來制備的。在這里，本發(fā)明的另一個目的是使宿主絲狀真菌表達和分泌與所述宿主絲狀真菌異源的目標蛋白。通過誘導基因(其表達由可誘導的啟動子序列控制)生成的蛋白包括自然產生的纖維素酶蛋白以及多種異源蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，在可誘導的啟動子序列控制下表達的蛋白是激素、酶、生長因子、細胞因子或抗體。多種絲狀真菌可以用作表達宿主，包括下述的屬曲霉屬(Aspergillus), 木霉屬(Trichoderma),鏈抱霉屬(Neurospora)，青霉屬(Penicillium)，頭抱屬 (Cephalosporium),綿霉屬(Achlya),束柄霉屬(Podospora),疫病霉屬(Endothia),毛霉屬(Mucor),旋孢腔菌屬(Cochliobolus)和梨孢屬(Pyricularia)。具體的表達宿主包括:里氏木霉，例如 NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767，綠色木霉 (Trichoderma viride),例如 ATCC 32098 和 32086 構巢曲霉(Aspergillus nidulans), (Yelton，M·，等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,1470-1474 ;Mullaney，E. J.等(1985) Mol. Gen. Genet. 199, 37-45 ； John, M. A.和 J. F. Peberdy(1984)Enzyme Microb. Technol. 6， 386-389 ；Tilburn,等(1982)Gene 26，205-221 ;Ballance，D. J.等，(1983)Biochem. Biophys. Res. Comm. 112,284-289 Johnston, I. L.等(1985)EMBO J. 4，1307-1311)黑曲霉(A. niger), (KELLY, J. M.和 M. Hynes (1985)EMBO 4,475-479)泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，例如 NRRL 3112、ATCC 22342、ATCC 44733、ATCC 14331 和菌株 UVK 143f, 米曲霉(Aspergillusoryzae),例如 ATCC 11490,和粗糖脈抱霉(Neurospora crassa) (Case, Μ. Ε.等(1979) Proc. Natl. Acad. Scie. USA，76，5259-5263 ;Lambowitz 美國專利號 4, 486, 553 ；Kinsey, J. A.和 J. A. Rambosek(1984)Molecular and Cellular Biology 4, 117-122 ；Bull, J. H.和 J. C. Wooton(1984)Nature 310,701-704)。在一個優(yōu)選的實施方案中，微生物宿主是木霉屬、腐質霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、鏈霉屬、熱單孢屬、芽孢桿菌屬或纖維單孢菌屬的成員。I.定義“抗體”是指包含來自免疫球蛋白基因或其片段的構架區(qū)的多肽，它能特異性地結合和識別抗原。識別出的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及無數的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε ,它們按順序分別定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗體或其功能等同物的抗原結合區(qū)對于結合的特異性和親合力是最重要的。見，Paul, Fundamental Immunology。示例性的免疫球蛋白(抗體)的結構單元包含四聚物。每個四聚物由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有一個“輕鏈”(約25kD)和一個“重鏈”(約50-70kD)。每條鏈的N-端定義了約100 110個或更多氨基酸的可變區(qū)，它主要負責抗原的識別。術語“可變輕鏈”(VL)和“可變重鏈”(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈?！袄w維素酶”或“纖維素分解酶”指細菌的或真菌的外切葡聚糖酶或外切纖維二糖水解酶，和/或內切葡聚糖酶，和/或葡糖苷酶。這三種不同類型的纖維素酶協(xié)同地將纖維素和其衍生物轉變?yōu)槠咸烟?。許多微生物能生成水解纖維素的酶，包括腐木真菌木霉屬、堆肥細菌熱單胞菌 (現在稱作Thermobifida)屬、芽孢桿菌屬和纖維單孢菌屬；鏈霉屬和真菌腐質霉屬；曲霉屬和鐮刀菌屬。這些微生物生成的酶是具有三類功能(用于將纖維素轉化成葡萄糖)的蛋白的混合物內切葡聚糖酶(EG)、纖維二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)。如這里所使用的，短語“全纖維素酶制品”和“全纖維素酶組合物”可互換地使用，指自然存在的和非自然存在的組合物?！白匀淮嬖诘摹苯M合物是通過自然存在的來源制備的，其包含一種或多種纖維二糖水解酶類、一種或多種內切葡聚糖酶類和一種或多種
葡糖苷酶組分，其中這些組分中的每一種都與在所述來源中的比例相同。自然存在的組合物是由未針對纖維素分解酶進行修飾的生物生成的，所以該組分酶的比例相對于天然生物生成的沒有變化。“非自然存在的”組合物包括通過下述方法生成的那些組合物(I)以自然比例或非自然(即改變的)比例將組分纖維素分解酶混合；或(2)修飾生物，使之過表達或次表達 (underexpress) 一種或多種纖維素分解酶；或(3)修飾生物,使之缺失至少一種纖維素分解酶。用于本發(fā)明的全纖維素酶混合物可以缺失各EG和/或CBH中的一種或多種。例如，可以單獨缺少EGl，或者與其它EG和/或CBH —起缺少。BG可以相對于天然水平過表達。本文中也包括BG的異源表達?！疤枷拗啤笔且环N狀態(tài)，其中微生物僅僅具有足夠的碳來生成目標蛋白產物，但是沒有足夠的碳來完全滿足生物的需要，例如支持生長。因此，最大量的碳用于蛋白生成。如這里所使用的，“啟動子”和“纖維素酶啟動子”是指核酸序列，其功能是指導下游基因的轉錄，它們在本文中可互換地使用。啟動子通常適用于要表達目標基因的宿主細胞。啟動子和其它轉錄和翻譯調節(jié)核酸序列(也稱作“調控序列”)是表達給定基因所必須的。通常，轉錄和翻譯調節(jié)序列包括但不限于啟動子序列、核糖體結合部位、轉錄起始序列和終止序列、翻譯起始序列和終止序列、和增強子或活化劑序列。在一個方面，啟動子是可誘導的啟動子。在另一個方面，啟動子是可以通過選自龍膽二糖、纖維素和槐糖的誘導物誘導的。在一個方面，啟動子是里氏木霉cbhl啟動子，它保藏在GenBank中，登記號為D86235。 在另一個方面，啟動子是來自里氏木霉的cbh II或木聚糖酶啟動子。如這里所使用的，“啟動子序列”是能被用于表達目的的特定絲狀真菌所識別的 DNA序列?！皢幼印倍x為一列核酸調控序列，它指導核酸的轉錄。如這里所使用的，啟動子包括臨近轉錄起始位點的必需核酸序列，例如，在聚合酶II類啟動子的情況下,是TATA 元件?！敖M成型”啟動子是在大多數環(huán)境條件和發(fā)育條件下有活性的啟動子?！翱烧T導的”啟動子是在環(huán)境的和發(fā)育的調節(jié)下有活性的啟動子。用于本發(fā)明的可誘導的啟動子例子是里氏木霉cbbl啟動子。術語“可操作地連接”指核酸表達調控序列(例如啟動子或轉錄因子結合部位陣列)和第二種核酸序列之間的功能連接，其中表達調控序列指導與第二種序列相對應的核酸的轉錄。實例包括來自下述的啟動子泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg, J. H.等(1984)Mol. cell. Biol. 4,2306-2315 ；Boel, E.等(1984)EMBO J. 3，1581-1585)， 這里的米赫毛霉(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因，里氏木霉纖維二糖水解酶I基因 (Shoemaker, S. P.等(1984)歐洲專利申請?zhí)朎PO 0137280A1)，構巢曲霉trpC基因 (YeIton, Μ.等(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81,1470-1474 ；Mullaney, E. J.等(1985) Mol. Gen. genet. 199, 37-45),構巢曲霉 alcA 基因(Lockington, R. A.等(1986) Gene 33, 137-149)，構巢曲霉 tpiA 基因(McKnight, G. L.等(1986)Cell 46，143-147)，構巢曲霉 amdS 基因(Hynes, M. J.等(1983)Mol. cellBiol. 3，1430-1439)，里氏木霉 xlnl 基因，里氏木霉cbh2基因，里氏木霉egl基因，里氏木霉eg2基因，里氏木霉eg3基因，和高等真核生物啟動子，例如 SV40 早期啟動子(Barclay, S. L.和Ε· Meller (1983)Molecular and Cellular Biology 3,2117-2130)。當核酸與另一個核酸序列建立了功能關系時，它是“可操作地連接的”。例如，如果它能表達為參與多肽分泌的蛋白原(preprotein)，則編碼分泌前導序列(即信號肽)的 DNA是可操作地連接到了多肽的DNA ;如果能影響序列的轉錄，則啟動子或增強子是可操作地連接到了編碼序列；或者，如果能促進翻譯，則核糖體結合部位是可操作地連接到了編碼序列。通常，“可操作地連接”是指連接的DNA序列是鄰接的，在分泌前導序列的情況下，是鄰接的且處于閱讀相。但是，增強子不是必須鄰接的。連接是通過在方便的限制位點的拼接實現的。如果不存在這樣的位點，則根據常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接頭或連接物。如這里所使用的，術語“基因”指參與生成多肽鏈的DNA片段，它們包含或不包含在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如5'未翻譯的(5' UTR)或“前導”序列和3' UTR或“尾” 序列，以及在各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)?；蚩梢跃幋a治療上有意義的蛋白或肽，例如生長因子、細胞因子、配體、受體和抑制劑，以及疫苗和抗體?；蚩梢跃幋a商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白或肽，例如酶，例如蛋白酶、 甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶。目標基因可以是自然存在的基因、突變的基因或合成的基因。當提及(例如)細胞、核酸、蛋白或載體時使用的術語“重組的”表示，已經通過導入外源的核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白修飾了的細胞、核酸、蛋白或載體，或者該細胞是源自這樣修飾的細胞。因此，例如，重組細胞能表達在細胞的天然(非重組的)形式中不存在的基因，或者能表達否則會被異常表達、次表達或根本不表達的天然基因。術語“分泌信號序列”是指編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，它作為更大的多肽的組分，指導更大的多肽穿過細胞的分泌途徑(它是在其中合成的)。通常在穿過分泌途徑的過程中，剪切更大的多肽除去該分泌肽?！罢T導”是指用存在的“誘導物”增強基因的轉錄，從而導致細胞或生物以顯著提高的速度合成目標蛋白。為了檢測對目標蛋白的誘導，將用潛在的誘導物處理的細胞與沒有誘導物的對照樣品相對比。將對照樣品(未用誘導物處理)指定了相對蛋白活性值100%。 當相對于對照組(未用誘導物處理)的活性值大于100%、大于110%、更優(yōu)選地150%、更優(yōu)選地200-500% (即相對于對照組高出了 2-5倍)或更優(yōu)選地高出了 1000-3000%時，SP 實現了多肽的誘導。
本發(fā)明的“絲狀真菌”是真核微生物，包括真菌門亞門的所有絲狀形式(見 Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, NewYork :Wiley)。這些真菌的特征在于營養(yǎng)菌絲體，其細胞壁由幾丁質、纖維素和其它復合多糖組成。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學上、生理學上和遺傳上與酵母區(qū)別開。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長，且碳分解代謝是好氧的。相反，酵母(例如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽，且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。釀酒酵母(s. cerevisiae)具有突出的非常穩(wěn)定的二倍期，然而二倍期僅僅在絲狀真菌(例如曲霉菌屬和鏈孢霉屬)的減數分裂前短時間地存在。釀酒酵母具有 17個染色體，這與構巢曲霉和粗糙鏈孢霉分別有8和7個染色體不同。關于釀酒酵母和絲狀真菌之間的區(qū)別的新的說明包括釀酒酵母不能處理曲霉和木霉的內含子，也不能識別絲狀真菌的許多轉錄調節(jié)子(Innis，MA.等(1985) Science，228，21-26)?！捌咸擒彰浮敝钙浣K產物是葡萄糖的任何酶。在提及核酸部分時使用的術語“異源的”是指，該核酸包含兩個或多個亞序列，它們在天然情況下通常彼此不存在這樣的關系。例如，該核酸典型地是重組生成的，其具有兩個或多個例如來自無關基因的序列以制作新的功能核酸，例如啟動子是來自一個來源，編碼區(qū)來自另一個來源。類似地，異源蛋白一般是指兩個或多個亞序列，它們在天然情況下通常彼此不存在這樣的關系(例如融合蛋白)?！胺跤a物”是指在高溫下保持或孵育特定時間段后的溶液?！罢T導物”是能使細胞比在沒有該誘導物存在時生成更大量的酶或其它物質的任何化合物?！罢T導補料”是指補充給微生物的溶液，它會造成或誘導目標蛋白產物的生成。如這里使用的術語“分離的”或“純化的”是指從至少一種天然地與其伴隨的組分中分離出的核酸或氨基酸。II.目標蛋白或所需蛋白術語“目標蛋白”和“所需蛋白”在這里可以互換地使用。本發(fā)明特別適用于增強蛋白的胞內和/或胞外生產。蛋白可以是同源的或異源的?？梢酝ㄟ^本發(fā)明生產的蛋白包括但不限于激素、酶、生長因子、細胞因子、抗體等。激素包括但不限于促卵泡激素、促黃體激素、促腎上腺皮質激素釋放因子、促生長素抑制素、促性腺激素、血管加壓素、催產素、促紅細胞生成素、胰島素等。生長因子是能結合到細胞表面受體上的蛋白，其主要結果是激活細胞的增殖和/ 或分化。生長因子包括但不限于血小板衍生生長因子、表皮生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、轉化生長因子等。細胞因子是一個獨特的生長因子家族。細胞因子主要從白細胞分泌，可以刺激體液的和細胞的免疫反應，以及激活吞噬細胞。細胞因子包括但不限于集落刺激因子、白細胞介素(IL-1 ( α和β )，IL-2至IL-13)和干擾素(α、β和γ)。人白細胞介素-3(IL_3)是15kDa的蛋白，含有133個氨基酸殘基。IL_3是種屬特異性的集落刺激因子，它能刺激來自骨髓培養(yǎng)物的巨核細胞、中性白細胞和巨噬細胞的菌落形成?？贵w包括但不限于來自任何種屬(要從中大量生產)的免疫球蛋白。特別優(yōu)選的抗體是人抗體。免疫球蛋白可以來自任何種類，即G、A、M、E*D。
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另外，“目標蛋白”或“目標多肽”是指要由宿主細胞表達和分泌的蛋白。目標蛋白可以是直到現在已知能在原核生物中表達的任何蛋白。在一個實施方案中，表達和分泌的目標蛋白包括含有信號肽的蛋白。目標蛋白可以是與宿主同源的或異源的。因此，目標蛋白可以是分泌的多肽，更具體地是選自下述的酶淀粉分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物壁降解酶。這些酶的實例包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質酶(cutinase)、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化酶、過氧化氫酶、 葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、葡糖苷酶、異構酶、轉移酶、半乳糖苷酶和幾丁質酶。分泌的多肽還可以是激素、生長因子、受體、疫苗、抗體等。在一個實施方案中，分泌的多肽是纖維素分解酶。III.分子生物學在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在里氏木霉的纖維素酶基因啟動子控制下的異源基因的表達。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳學領域的常規(guī)技術。公開了在本發(fā)明中使用的一般方法的基礎文章包括Sambrook 等，Molecular cloning, A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A LaboratoryManual (1990);和 Ausubel 等，編，Current Protocols inMolecular Biology (1994))。在轉化至里氏木霉細胞中進行復制和/或表達之前，典型地將含有絲狀真菌的纖維素酶基因啟動子序列的異源基因克隆到中間載體中。這些中間載體典型地是原核生物載體，例如質?；虼┧筝d體。為了高水平地表達克隆的基因，異源基因離啟動子的距離優(yōu)選地與在自然存在的纖維素酶基因中的大致相同。但是，如本領域已知的，可以對該距離作一些變化而不損害啟動子的功能。本領域的技術人員能夠認識到，可以通過替換、取代、添加或消除一個或多個核苷酸來修飾天然啟動子而不改變其功能。本發(fā)明的實踐包括但不限于啟動子的這些改變。表達載體/構建體典型地含有轉錄單元或表達盒，其含有表達異源序列所需的所有其它元件。因而，典型的表達盒含有可操作地連接到異源核酸序列和有效地進行轉錄產物的聚腺苷酸化作用所需的信號上的啟動子、核糖體結合部位和翻譯終止區(qū)。該盒的其它元件可以包括增強子，在將基因組DNA用作結構基因時，還包括具有功能拼接供體和受體位點的內含子。本發(fā)明的實踐不受在遺傳重構體中選擇的啟動子的限制。但是，示例性的啟動子是里氏木霉 cbhl、cbh2、egl、eg2、eg3、eg5、xlnl 和 xln2 啟動子除了啟動子序列外，表達盒還應當包含位于結構基因下游的轉錄終止區(qū)，以提供有效的終止。終止區(qū)可以與啟動子序列得自相同的基因，或者從不同的基因得到。盡管似乎所有真菌終止子都可以在本發(fā)明中起作用，優(yōu)選的終止子包括來自構巢曲霉 trpC 基因(Ye I ton, Μ.等(1984) PNAS USA 81 :1470-1474, Mullaney, E. J.等 (1985)MGG 199 :37-45)、泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg, J. H.等(1984)Mol. CellBiol. 4 :2306, Boel, E.等(1984)EMBO J. 3 :1581-1585)和米赫毛霉羧基蛋白酶基因 (歐洲專利局
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