本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的檢測方法及側(cè)翼序列。

背景技術(shù)：

我國是棉花生產(chǎn)大國，年種植棉花面積約470萬公頃，年產(chǎn)皮棉500萬噸，占世界產(chǎn)棉總量的25％左右。棉花生產(chǎn)的興衰對我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有舉足輕重的影響。然而，中國棉田生態(tài)型復(fù)雜，雜草危害較重，尤其是長江流域棉區(qū)，生長前期正值梅雨季節(jié)，雜草生長旺盛，加之陰雨連綿，不能及時除草，雜草危害極其嚴(yán)重，可造成14.0％-16.0％的損失，嚴(yán)重制約了棉花的優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)(馬小艷,馬艷,彭軍等.我國棉田雜草研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢.棉花學(xué)報,2010,22(4):372-380)。轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的培育對于穩(wěn)定棉花生產(chǎn)有著舉足輕重的作用。

草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型優(yōu)秀除草劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、不破壞土壤環(huán)境、對大多數(shù)植物具有滅生性等其它除草劑所不可比擬的優(yōu)點，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理。草甘膦是植物體內(nèi)5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshiki-mate-3-phosate，EPSP)的一種類似物，它的毒性機(jī)理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成EPSP，從而抑制EPSP合酶的活性導(dǎo)致分枝酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，從而擾亂了生物體正常的氮代謝而使其死亡(McDowell LM,Klug CA,Beusen DD.Ligand geometry of the ternary complex of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from rotational-echo double-resonance NMR.Biochem,1996,35(17):5395-5403；Sammons RD,Gruys KJ,Anderson KS et al.Reevaluating glyphosate as a transition-state inhibitor of EPSP synthase:identification of an EPSP synthase.EPSP.glyphosate ternary complex.Biochem,1995,34(19):6433-6440)。

基于草甘膦的毒性機(jī)理，研究者們通過三種途徑獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。一是EPSPS基因發(fā)生突變，產(chǎn)生與草甘膦親和性較低的EPSPS，突變后的EPSPS不能很好的甚至根本不能與草甘膦結(jié)合，從而使草甘膦喪失了對EPSPS的競爭性抑制作用。Comai等首先從鼠傷寒沙門氏菌中篩選出了抗草甘膦的突變菌株，隨后分離突變基因-aroA基因，此突變aroA基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌獲得了抗草甘膦表型(Comai L,Facciotti D,Hiattl WR et al.Expression in plants of a mutant aro A gene from Salmonella typhimurium Confers tolerance to glyphosate.Nature,1985,(317):741-744；Comai L,Sen LC,stalker DM.An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate.Sci,1983,(221):270-271)。其后，Duncan等克隆了抗草甘膦誘變的矮牽牛、土豆、擬南芥、大豆、油菜和大腸桿菌K-12的EPSP合酶基因(Duncan K,Coggins JR.The Serc aroA operon of Escherichia Coli.Biochem J,1986,(234):49-57；Duncan K,Lewendon A,Coggins JR.Mutant EPSP Synthase genes from tomato,Arabidopsis thaliana,Brassica napus,Glycine max E.Coli K12Confer folerance to glyphosate.FEBS lett,1984,(170):59-63)。二是過量表達(dá)產(chǎn)生具有較高酶活性的EPSP合酶：對百脈根屬9個草甘膦耐藥性水平不同的無性系植株(營養(yǎng)體無性系)草甘膦莖葉處理后藥液的滯留、吸收、輸導(dǎo)以及耐藥性水平與EPSP合酶活性關(guān)系進(jìn)行研究的結(jié)果表明，它們在藥劑的滯留、吸收、輸導(dǎo)等方面無明顯差異，而EPSP合酶的活性與無性系對草甘膦的耐藥性呈正相關(guān)(Boerboom CM,Wyse DL,Somers DA.Mechanism of glyphosate tolerance in birdsfoot trefoil(Lotus corniculatus L).Weed Sci,1990,38:463–467)。Shah等培育并篩選出了具有對草甘膦抗性的矮牽牛細(xì)胞系MP4-G，MP4-G細(xì)胞系中的EPSP合酶基因由于擴(kuò)增了20倍，過量產(chǎn)生EPSP合酶的mRNA，從而能超量產(chǎn)生EPSP合酶(Shah DM,Horsch RB,Klee HJ.Engineering Herbicide Tolerance in Transgenic plants.Sci,1986,(233)：478-491)。1987年，Mollenhauer等用35S啟動子驅(qū)動MP4-G細(xì)胞系中的EPSP合酶基因的表達(dá)，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化矮牽牛。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化過程中長出的愈傷組織能在含0.5M的草甘膦的培養(yǎng)基上生長，愈傷組織中EPSP合酶的活性提高了40倍，轉(zhuǎn)化植株在溫室中能抗0.18磅·公傾^-1的草甘膦(Mollenhauer C,Smart C,Amrhein N.Glyphosate toxicity in the shoot apical region of the tomato.Plant Pest Biochem Physiol,1987,(29):55-65)。三是表達(dá)天然來源的抗草甘膦EPSP合酶。美國孟山都公司在根癌農(nóng)桿菌CP4中發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的EPSP合酶。這類EPSP合酶與以往克隆的酶氨基酸序列差異很大，同源性低于50％，表現(xiàn)出了對草甘膦的高抗性和對底物(PEP)的高親和力(Padgette SR,Kolacz KH,Delannay X.Development,identification,and characterization of a glyphosatetolerant soybean line.Crop Sci,1995,35:1451-1461)，目前CP4-EPSPS已被廣泛用于商業(yè)化種植的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物中。

近年來，我國對草甘膦抗性菌株和基因資源方面的研究取得了較大的進(jìn)步，克隆了一系列抗草甘膦的基因。G2-aroA為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林敏實驗室從草甘膦污染的極端環(huán)境中分離的新型高抗草甘膦EPSP合酶編碼基因(劉柱,陳明,徐玉泉等.一株草甘膦極端抗性菌株的分離和分子鑒定.高技術(shù)通訊,2002,12:25–28；朱玉,于中連,林敏.草甘膦生物抗性和生物降解及其轉(zhuǎn)基因研究.分子植物育種,2003,1(4):435-441)，具有我國自主的知識產(chǎn)權(quán)，與國外專利的EPSPS基因相比，氨基酸序列同源性很低(23％)，核苷酸序列同源性更低，但抗草甘膦的能力很強(qiáng)，目前已在煙 草、水稻和油菜上對其高抗草甘膦的能力進(jìn)行了驗證，因而具有明顯的應(yīng)用前景。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花在1996年就開始商業(yè)化種植，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。然而,我國目前尚未有轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花商業(yè)化應(yīng)用的相關(guān)報道，因此，將G2-aroA基因?qū)朊藁?，培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測待測棉花是否為耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7CGMCC No.10412的引物對。

在本發(fā)明中，所述陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412具體為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的保藏編號為CGMCC No.10412的棉花種質(zhì)。

本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成。

其中，所述序列1由18個核苷酸組成；序列2由27個核苷酸組成。

所述引物對在制備用于檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的試劑盒。

本發(fā)明所提供的用于檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的試劑盒，包含所述引物對。

所述試劑盒中還可含有PCR反應(yīng)所需的常規(guī)試劑，如DNA聚合酶、dNTP等。

所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下步驟：將所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝。

所述引物對或所述試劑盒在檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的方法。

本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的方法，可包括如下步驟：

(b1)以所述待測棉花的基因組DNA為模板，采用所述引物對(序列1和序列2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；

(b2)根據(jù)所述PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測棉花是否為陸地棉 (Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412：若所述PCR產(chǎn)物中含有644bp的DNA片段，則所述待測棉花為或候選為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412；若所述PCR產(chǎn)物中不含有644bp的DNA片段，則所述待測棉花不為或候選不為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412。

進(jìn)一步，所述644bp的DNA片段具體為序列表中序列5中第495-1138位序列所示DNA片段。

在所述方法中，以所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度為55℃。

更加具體的，在所述方法中，以所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，34個循環(huán)；72℃10min。

另外，在所述方法中，以所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，所述引物對中上下游引物為等摩爾使用(如上下游引物用量均為10pmol)。

更加具體的，在所述方法中，以所述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2.5U Taq Polymerase、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、12.5nmol dNTP、上下游引物各10pmol、模板DNA 1μl，用滅菌ddH₂O補(bǔ)足體積至50μl。

本發(fā)明的還一個目的是提供陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412外源插入片段的側(cè)翼序列。

本發(fā)明所提供的陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412外源插入片段的側(cè)翼序列，為5’側(cè)翼序列；

所述5’側(cè)翼序列的核苷酸序列為序列表中序列5。

在本發(fā)明中，所述引物對是根據(jù)所述側(cè)翼序列設(shè)計的，因此，依據(jù)所述側(cè)翼序列設(shè)計獲得的引物序列應(yīng)該都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明根據(jù)陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的5’側(cè)翼序列設(shè)計得到由序列表中序列1和序列2所示的引物對。實驗證明，利用該引物對通過PCR的方法可檢測待測棉花是否為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412，且該方法準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高。

保藏說明

分類命名：陸地棉

拉丁名：(Gossypium hirsutum)

參椐的生物材料：BG2-7

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2015年3月19日

保藏中心登記入冊編號：CGMCC No.10412

附圖說明

圖1為植物表達(dá)載體pG2的基因表達(dá)盒示意圖。Rbs P：菊花Rubisco小亞基基因的啟動子；CTS：菊花Rubisco小亞基的葉綠體信號肽；Rbs T：菊花Rubisco小亞基基因的終止子。

圖2為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花的遺傳轉(zhuǎn)化體系。A：愈傷組織；B：Kan抗性愈傷組織；C：胚性愈傷組織；D：植株再生；E：生根培養(yǎng)；F：移栽。

圖3為轉(zhuǎn)G2-aroA基因棉花的PCR檢測。M：Marker 100bp；P：質(zhì)粒；CK1：空白對照(以等量水替代模板)；CK2：K312；1-8：轉(zhuǎn)基因棉花(BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)。

圖4為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的草甘膦抗性鑒定。A：受體K312，未噴施2000ppm草甘膦(將2ml有效成分為41％的草甘膦異丙胺鹽水劑(商品名為農(nóng)達(dá))加入到408ml水中即得到2000ppm的草甘膦溶液)；B：受體K312，噴施2000ppm草甘膦；C：BG2-7，噴施2000ppm草甘膦；D：BG2-7，未噴施2000ppm草甘膦。

圖5為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412中外源基因拷貝數(shù)分析。M：marker；1：K312DNA/EcoR I；2：K312DNA/Hind III；3：BG2-7/EcoR I；4：BG2-7/Hind III；5：植物表達(dá)載體pG2質(zhì)粒DNA。

圖6為獲得的5’端側(cè)翼序列Phytozome分析。

圖7為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412插入位點5’端特異性檢測。M：Trans2K DNA marker；1：水；2：海島棉7124；:3：陸地棉K312；4：BG2-7。

圖8為陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412插入位點3’端特異性檢測。M：Trans2K DNA marker；1：水；2：海島棉7124；:3：陸地棉K312；4：BG2-7。

圖9為檢測陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的側(cè)翼序列的靈敏度檢測結(jié)果。A為5’端側(cè)翼序列檢測結(jié)果；B為3’端側(cè)翼序列檢測結(jié)果。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中未詳細(xì)說明的操作步驟參照《分子克隆實驗指南》第三版相應(yīng)部分(J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社)或參閱所用試劑盒的說明書。

植物表達(dá)載體pG2：記載于“孔寧.基因拆分限控轉(zhuǎn)基因漂流的研究.中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院,碩士論文,2008”一文，公眾可以從申請人處獲得。

珂312：記載于“趙常燕.農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)phyA植株的獲得.河北農(nóng)業(yè)大學(xué),碩士論文,2008”一文，公眾可以從申請人處獲得。

海島棉7124：記載于“王旭靜，竇道龍，王志興，賈士榮.海島棉GbNPR1基因全長cDNA的克隆及其在煙草中的表達(dá).中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(5)：886-894”一文，公眾可以從申請人處獲得。

41％草甘膦異丙胺鹽(商品名：農(nóng)達(dá))：美國孟山都公司產(chǎn)品，中化國際(控股)股份有限公司代理，農(nóng)藥登記號：PD73-88。

pMD-18T克隆載體：購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號：D102A。

DNA提取試劑盒：北京博邁德科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號：DN1501。

2×EasyTaq PCR SuperMix：北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號：AS111-01。

瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒：北京博邁德科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品目錄號：DR0101。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號：CD201-01。

核酸外切酶I ExoI：購自NEB公司，產(chǎn)品目錄號：M0293V。

所用培養(yǎng)基配方如下表：

實施例1、耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的獲得及性狀鑒定

一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有G2-aroA基因(ZL 03826892.2)的植物表達(dá)載體pG2(pG2的基因表達(dá)盒示意圖如圖1所示)導(dǎo)入受體材料珂312。具體如下：

(1)選取飽滿的珂312種子，用少量濃硫酸脫絨后用大量清水清沖。75％(體積分?jǐn)?shù))的酒精滅菌5min，滅菌水沖洗三遍。然后用1.8％(體積百分比)次氯酸鈉溶液消毒30分鐘，無菌水沖洗6遍。最后將滅過菌的種子置于37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行催芽。

(2)用鑷子輕輕的將種皮剝?nèi)?，置?00mg/ml頭孢塞污鈉溶液浸泡30-45分鐘后用大量的無菌水清洗6遍。用濾紙將種子表面的水分吸干后播種于I號培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)5-7天。

(3)將無菌苗的下胚軸切成5-6mm小段，置于含有pG2的農(nóng)桿菌菌液中28℃侵染30min；

(4)侵染結(jié)束后，將下胚軸放在無菌的濾紙上晾干并接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2-3天；

(5)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，28℃暗培養(yǎng)。

(6)將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的篩選，每半月繼代一次。

(7)將顆粒狀的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生，一個月繼代一次，直至再生苗出現(xiàn)。

(8)將3-4cm高的再生苗接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

(9)等植株長出3-4片真葉，主根和側(cè)根都生長良好時，去除封口膜，室溫?zé)捗?周左右。

(10)煉苗結(jié)束后移入田間生長結(jié)籽。

經(jīng)過大約1年的時間，獲得了T0代再生植株(圖2)，將所得各植株進(jìn)行編號。

二、轉(zhuǎn)基因棉花陽性植株的PCR檢測

(1)PCR鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒提取步驟一獲得的T0代再生植株(編號分別為BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)的基因組DNA。根據(jù)G2-aroA基因序列設(shè)計引物G2-F-1和G2-R-2。

G2-F-1：5’-GGCTCCAAATCCATTACCAACC-3’；

G2-R-2：5’-CGCAGGTTCGCCAGTTCA-3’。

以G2-F-1/G2-R-2為引物，以各T0代再生植株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為PCR擴(kuò)增程序：95℃5min；95℃45sec，57℃45sec，72℃1min，32次循環(huán)；72℃10min。

同時以未轉(zhuǎn)基因受體材料珂K312和植物表達(dá)載體pG2作為對照。

檢測結(jié)果如圖3所示，只有以T0代再生植株(編號分別為BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)的基因組DNA和植物表達(dá)載體pG2為模板時擴(kuò)增得到了大小約為896bp的目的條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ甄?12中沒有目的條帶的擴(kuò)增。

三、T1轉(zhuǎn)基因棉花的草甘膦抗性分析

T0代再生植株自交后獲得T1代植株。在棉花生長的3-5葉期，對T1代轉(zhuǎn)基因棉花(編號分別為BG2-1、BG2-2、BG2-3、BG2-7、BG2-12、BG2-14、BG2-17、BG2-20)噴施2000ppm的除草劑草甘膦(將2ml有效成分為41％的草甘膦異丙胺鹽水劑(商品名為農(nóng)達(dá))加入到408ml水中即得到2000ppm的草甘膦溶液)，以非轉(zhuǎn)基因受體材料珂312為對照。2周后進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噴施2000ppm的除草劑草甘膦的非轉(zhuǎn)基因受體材料珂312全部死亡，而不同的轉(zhuǎn)基因株系中都有植株存活，其中BG2-7株系中存活植株的生長沒有受到抑制，而其他幾個株系中的存活植株生長緩慢，最終影響了正常結(jié)實(圖4)。因此，選擇BG2-7進(jìn)行后續(xù)的研究工作。

四、轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7的拷貝數(shù)分析

選用的雜交試劑盒是Thermo公司的生物素探針標(biāo)記試劑盒Biotin Random Prime Labeling Kit(Number 17075)及化學(xué)發(fā)光雜交檢測試劑盒Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit(Number 17097)。

提取轉(zhuǎn)基因基因組DNA，利用EcoR I和HindIII分別進(jìn)行過夜單酶切，每組酶切反應(yīng)中基因組總量在200μg以上。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、洗膜和預(yù)雜交。以植物表達(dá)載體pG2質(zhì)粒為模板，以F-1(CAGAAAACCGTGACCGTTAC)和R-1(GATACGTACTGGCTGGACAA)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的大約515bp的DNA條帶回收測序后作為標(biāo)記探針。按照試劑盒說明對探針進(jìn)行標(biāo)記。為了計算標(biāo)記探針的產(chǎn)量，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000C測量該探針溶液的OD260、OD280的吸光值，獲得質(zhì)量濃度。預(yù)雜交結(jié)束后加入標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交，雜交條件為55 ℃過夜。過夜結(jié)束后用1×的嚴(yán)謹(jǐn)洗膜液200μl/cm²加入到雜交瓶中，55℃洗膜單次15～20min，共計3次。將膜至于發(fā)光檢測工作液(等體積混合Luminol Enhancer溶液和Peroxide(過氧化氫)溶液)中孵育5min(RT)，將濕潤的膜置于干凈的保鮮膜上，包好，趕走氣泡，不要有褶皺。將膜用膠帶固定于X光片夾的增感屏上，含有DNA的一面朝上；在暗室中壓上一張大小合適的X光片，用膠帶固定兩角，上面再放一張增感屏，扣緊X光片夾，-70℃曝光數(shù)小時至數(shù)天。最后將X光膠片浸沒與顯影液中直到看到清晰的目的條帶，然后浸沒與酸性定影液中定影5～10min，用清水沖洗膠片，晾干保存。

Southern檢測結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7基因組DNA經(jīng)EcoR I和HindIII單酶切后，都只能雜交得到1條DNA條帶，證明轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7中外源基因為單拷貝插入。

綜上，本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將耐除草劑基因G2-aroA導(dǎo)入受體材料珂312。獲得的再生植株通過PCR檢測、Southern雜交、Western雜交、耐草甘膦能力檢測等分析，最終篩選出外源基因單拷貝插入且耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花新種質(zhì)BG2-7，其表現(xiàn)出了極強(qiáng)的草甘膦抗性。本發(fā)明的發(fā)明人將該BG2-7，株系于2015年3月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，參椐的生物材料(株)為BG2-7，建議的分類命名為陸地棉(Gossypium hirsutum)，其保藏編號為CGMCC No.10412。

實施例2、陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的側(cè)翼序列的克隆

一、陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的5’端側(cè)翼序列的克隆

1、根據(jù)棉花轉(zhuǎn)化時所用植物表達(dá)載體中的已知序列設(shè)計如下引物F1、F2和F3。所有引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。引物用水溶解至終濃度為100μM。

F1：5’-aacacggcggcatcagagca-3’；

F2：5’-taccgaggggaatttatggaacg-3’；

F3：5’-gttgcggttctgtcagttccaa-3’；

2、利用植物基因組DNA提取試劑盒提取陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412葉片DNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA用水稀釋至終濃度100ng/μl。

3、根據(jù)Genome Walking Kit試劑盒(TaKaRa，北京，Code：D316)說明書，在PCR反應(yīng)管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F1(100pM)1μl，試劑盒所帶隨機(jī)引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，植物基因組DNA 2.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最 后加水至終體積為50μl。反應(yīng)液混合均勻后置于T-100PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃2分鐘；94℃30秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，5個循環(huán)；94℃30秒，25℃3分鐘，72℃3分鐘；94℃30秒，60-68℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)；94℃30秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)。

4、在PCR反應(yīng)管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F2(100pM)1μl，試劑盒所帶隨機(jī)引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步驟3的擴(kuò)增產(chǎn)物0.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最后加水至終體積為50μl。反應(yīng)液混合均勻后置于T-100PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃2分鐘；94℃30秒，60-68℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)；94℃30秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)。

5、在PCR反應(yīng)管中依次加入10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺plus)5μl，dNTP混合物(2.5mM each)5μl，上游引物F3(100pM)1μl，試劑盒所帶隨機(jī)引物AP1或AP2或AP3或AP4(100pM)1μl，步驟4的擴(kuò)增產(chǎn)物0.5μl，TaKaRa LA(5U/μl)0.5μl，最后加水至終體積為50μl。反應(yīng)液混合均勻后置于T-100PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃2分鐘；94℃30秒，65℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)；94℃30秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，15個循環(huán)。

6、步驟5的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，回收大于已知片段的DNA條帶。回收的DNA條帶連接pMD-18T載體，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

7、通過DNAman軟件和Phytozome分析，發(fā)現(xiàn)獲得的DNA序列1-734bp為棉花基因組序列，與棉花第11染色體上61253333-61253972間的序列同源性為94.2％(圖6)，735-1138為已知轉(zhuǎn)化載體上的DNA序列。比對結(jié)果證明獲得了轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因組插入位點的5’端側(cè)翼序列。

5’端側(cè)翼序列的核苷酸序列如序列表中序列5所示。該5'端側(cè)翼序列由棉花基因組序列片段和轉(zhuǎn)化載體pG2上的片段兩部分組成。具體的，序列5的第1-734位為棉花基因組序列片段，第735-1138位為轉(zhuǎn)化載體pG2上的序列片段。

二、陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的3’端側(cè)翼序列的克隆

1、根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上公布的雷蒙德氏棉第十一號染色體上61,252,000到61,253,333之間的DNA序列和已知植物表達(dá)載體序列設(shè)計引物F(5’-CTGGCGTAATAGCGAAGAG-3’)和R(5’–ACAAGCGGAGGCGGTATT-3’)。

2、利用植物基因組DNA提取試劑盒提取陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412葉片DNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA用水稀釋至終濃度100ng/μl。

3、以提取的基因組DNA為模板，以F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃5min；95℃45sec，55℃30sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃擴(kuò)增10min。

4、PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，回收DNA條帶?；厥盏腄NA條帶連接pMD-18T克隆載體，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

5、通過DNAman軟件和Phytozome分析，發(fā)現(xiàn)獲得的DNA序列1-190bp為已知轉(zhuǎn)化載體上的序列，191-859為棉花基因組序列，與棉花第11染色體上61252920-61253302間的序列同源性為100％。比對結(jié)果證明我們獲得了轉(zhuǎn)基因棉花BG2-7中外源基因在棉花基因組插入位點的3’端側(cè)翼序列，并造成了棉花基因組30bp和T-DNA右邊界298bp的缺失。

3’端側(cè)翼序列的核苷酸序列如序列表中序列6所示。該3'端側(cè)翼序列由轉(zhuǎn)化載體pBG2-G2-aroA上的片段和棉花基因組序列片段兩部分組成。具體的，序列6的第1-190位為轉(zhuǎn)化載體pG2上的序列片段，第191-859位為棉花基因組序列片段。

實施例3、耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的側(cè)翼序列的特異性PCR檢測

一、5’端側(cè)翼序列特異性PCR檢測

1、根據(jù)陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7外源基因插入位點5’端的側(cè)翼序列(序列5)，設(shè)計外源基因位點特異性PCR檢測的引物BG2-7-5-F和BG2-7-5-R。

BG2-7-5-F：5’-CCTATTACACGGCTATGC-3’(序列1，為序列5的第495-512位)；

BG2-7-5-R：5’-GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC-3’(序列2，為序列5的第1112-1138位的反向互補(bǔ)序列)。

2、利用植物基因組DNA提取試劑盒提取陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7、非轉(zhuǎn)基因受體棉花珂312、海島棉7124的葉片DNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA用水稀釋至終濃度100ng/μl。

3、以上述提取的DNA為模板，以BG2-7-5-F和BG2-7-5-R為引物進(jìn)行5’端側(cè)翼序列特異性PCR檢測。反應(yīng)體系為：0.5μl Taq Polymerase(5U/μl)、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、5.0μl dNTP(2.5mM)、BG2-7-5-F和BG2-7-5-R各1μl(10.0μM)、模板DNA1μl，用滅菌ddH₂O補(bǔ)足體積至50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸1min，34個循環(huán)，72℃擴(kuò)增10min。

4、PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果得到只有以陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7的基因組DNA為模板時能擴(kuò)增到644bp左右的目標(biāo)DNA條帶，而其它樣品中未能擴(kuò)增到相應(yīng)的目標(biāo)條帶(圖7)。將644bp的目標(biāo)DNA條帶回收測序，其序列為序列表中序列5的第495-1138位。

二、3’端側(cè)翼序列特異性PCR檢測

1、根據(jù)陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7外源基因插入位點3’端的側(cè)翼序列 (序列6)，設(shè)計外源基因位點特異性PCR檢測的引物BG2-7-3-F和BG2-7-3-R。

BG2-7-3-F：5’-TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT-3’(序列3，為序列6的第71-90位)；

BG2-7-3-R：5’-ACACTTACATGGCGTCTTCT-3’(序列4，為序列6的第662-681位的反向互補(bǔ)序列)。

2、利用植物基因組DNA提取試劑盒提取陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7、非轉(zhuǎn)基因受體棉花珂312、海島棉7124的葉片DNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。提取的DNA用水稀釋至終濃度100ng/μl。

3、以上述提取的DNA為模板，以BG2-7-3-F和BG2-7-3-R為引物進(jìn)行3’端側(cè)翼序列特異性PCR檢測。反應(yīng)體系為：0.5μl Taq Polymerase(5U/μl)、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)、5.0μl dNTP(2.5mM)、BG2-7-3-F和BG2-7-3-R各1μl(10.0μM)、模板DNA1μl，用滅菌ddH₂O補(bǔ)足體積至50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，95℃變性45sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，34個循環(huán)，72℃擴(kuò)增5min。

4、PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果得到只有以陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7基因組DNA為模板時能擴(kuò)增到611bp左右的目標(biāo)DNA條帶，而其它樣品中未能擴(kuò)增到相應(yīng)的目標(biāo)條帶(圖8)。將611bp的目標(biāo)DNA條帶回收測序，其序列為序列表中序列6的第71-681位。

實施例4、檢測耐草甘膦轉(zhuǎn)基因陸地棉BG2-7的側(cè)翼序列的靈敏度檢測

分別提取陸地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7和受體材料珂312的基因組DNA，將珂312和BG2-7的基因組DNA按按質(zhì)量百分含量成比例混合，依次配制成BG2-7的基因組DNA含量為10.00％、1.00％、0.50％、0.10％、0.05％和0％的系列樣品(拷貝數(shù)分別為8800，880，440，88，44和0)，作為靈敏度檢測的模板使用。

分別以如上系列拷貝數(shù)的基因組DNA樣品作為模板，采用實施例3得到的兩個特異性引物對(引物對BG2-7-5-F/BG2-7-5-R和引物對BG2-7-3-F/BG2-7-3-R)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩個引物對所采用的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參見實施例3進(jìn)行。

實驗同時設(shè)置以水代替模板DNA的陰性對照。

結(jié)果如圖9所示，以引物對BG2-7-5-F/BG2-7-5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，44(0.05％)個拷貝數(shù)的基因組DNA樣品即可擴(kuò)增出大小為644bp的目的條帶(圖9中A)，以引物對BG2-7-3-F/BG2-7-3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，88(0.1％)個拷貝數(shù)的基因組DNA樣品即可擴(kuò)增出大小為611bp的目的條帶(圖9中B)。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步將擴(kuò)增得到的大小為644bp的目的條帶和大小為611bp的目的條帶膠回收后送樣測序，結(jié)果表明644bp的目的條帶確實為序列表中序列5所示的第495-1138位序列，611bp的目的條帶確實如序列表中序列6所示的第71-681位序列。以上結(jié)果表明實施例3得到的引 物對BG2-7-5-F/BG2-7-5-R和引物對BG2-7-3-F/BG2-7-3-R具有較強(qiáng)的靈敏度。