本發(fā)明涉及多聚酶鏈反應(yīng)（PCR），特別是涉及一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種利用耐熱DNA聚合酶在體外進(jìn)行基因擴(kuò)增的技術(shù)，在基因克隆/疾病診斷/法醫(yī)鑒定等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。普通PCR技術(shù)需要在擴(kuò)增之后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，分析過程繁瑣費(fèi)時(shí)。隨著TaqMan^TM水解探針的發(fā)明，以及雙鏈DNA熒光染料的使用，PCR產(chǎn)物可以通過實(shí)時(shí)熒光的方法進(jìn)行分析檢測(cè)，這種新的PCR技術(shù)被稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。與普通PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有明顯的優(yōu)勢(shì)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增與結(jié)果檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，省去了反應(yīng)后的電泳分析，同時(shí)降低了污染的可能性。

現(xiàn)有技術(shù)中，應(yīng)用TaqMan^TM水解探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理是：在上游引物的下游增加一條識(shí)別靶標(biāo)序列的TaqMan^TM水解探針，探針的5’和3’端分別標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ fluorescence resonance energy transfer， FRET）吸收發(fā)光基團(tuán)的熒光能量，淬滅發(fā)光基團(tuán)的熒光信號(hào)，在PCR擴(kuò)增過程中，DNA聚合酶與上游引物一起從5’端往3’端延伸，延伸至TaqMan^TM水解探針處時(shí)，DNA聚合酶的5’外切核酸酶發(fā)揮作用，從5’端開始水解探針，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，發(fā)光基團(tuán)被激發(fā)并發(fā)射熒光。通過在同一反應(yīng)體系中，設(shè)置多條標(biāo)記不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)的TaqMan^TM水解探針，可實(shí)現(xiàn)多重PCR檢測(cè)。但是，基于TaqMan^TM水解探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的缺陷在于：一種顏色的熒光基團(tuán)只能標(biāo)記一條TaqMan^TM水解探針，檢測(cè)一個(gè)待測(cè)基因，因此，其多重檢測(cè)能力有限。

現(xiàn)有技術(shù)中，應(yīng)用雙鏈DNA熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理是：雙鏈DNA熒光染料在未嵌入DNA之前，不能被激發(fā)，一旦嵌入雙鏈DNA中，就可以被激發(fā)并發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光，在染料過量的情況下，檢測(cè)到的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與反應(yīng)物中雙鏈DNA的量呈正比，因此可以通過儀器記錄熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中DNA的濃度。在該技術(shù)的基礎(chǔ)之上，還發(fā)展出了熔解曲線分析法（Melting Curve analysis），熔解曲線分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值（DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度）的特征，在PCR反應(yīng)之后，通過逐漸提高反應(yīng)物的溫度，使具有不同Tm值的雙鏈DNA依次變性成為單鏈DNA，但是，由于熒光染料不能與單鏈DNA結(jié)合被激發(fā)，因此，在雙鏈DNA特定Tm值對(duì)應(yīng)的溫度下，熒光強(qiáng)度大幅度減弱，熔解曲線分析法利用這一原理可以對(duì)PCR產(chǎn)物中不同長(zhǎng)度DNA或相同長(zhǎng)度不同序列DNA進(jìn)行分析。

隨著對(duì)多重PCR檢測(cè)需求的提高，需要新技術(shù)對(duì)原有的技術(shù)進(jìn)行升級(jí)。但是，由于熒光基團(tuán)本身發(fā)射的不是單一波長(zhǎng)的熒光，且PCR儀對(duì)不同熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光區(qū)分度有限，因此，現(xiàn)有的PCR儀只能檢測(cè)4~6種熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)，這也使得應(yīng)用TaqMan^TM水解探針法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的多重檢測(cè)能力受到限制。而應(yīng)用雙鏈DNA熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，由于染料不具備特異序列的識(shí)別能力，因此，同一反應(yīng)體系中只能使用一種雙鏈DNA熒光染料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種成本低、多重檢測(cè)能力更強(qiáng)的多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法及采用該方法檢測(cè)待測(cè)基因的試劑盒。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

提供一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a、根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)基因的特異性序列合成一對(duì)序列；

b、合成條形碼探針，條形碼探針的3’端為待測(cè)靶標(biāo)基因位于兩條引物之間的探針序列，5’端為標(biāo)記淬滅基團(tuán)的具有一定長(zhǎng)度的條形碼序列；

c、合成熒光檢測(cè)探針，熒光檢測(cè)探針為一條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，其3’端為與所述條形碼序列特異性結(jié)合的條形碼識(shí)別序列，5’端序列與3’端序列互補(bǔ)配對(duì)，中間為任意一段與待測(cè)靶標(biāo)基因不相關(guān)且與條形碼序列不相關(guān)的序列，3’端和5’端分別標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；

d、PCR擴(kuò)增：

1）每一輪PCR反應(yīng)中，經(jīng)過92-97℃變性步驟之后，在50-65℃退火步驟，探針序列與待測(cè)靶標(biāo)基因識(shí)別，上游引物和下游引物與待測(cè)靶標(biāo)基因識(shí)別；

2）在58-75℃延伸步驟中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物開始延伸，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解探針序列，使條形碼探針的條形碼序列被釋放；

3）進(jìn)入下一輪PCR反應(yīng)中，在92-97℃變性步驟中，熒光檢測(cè)探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，50-65℃退火步驟中，上一輪PCR循環(huán)中釋放的條形碼序列與熒光檢測(cè)探針的條形碼識(shí)別序列特異性結(jié)合；

4）進(jìn)入58-75℃延伸步驟，上一輪PCR循環(huán)中的條形碼序列以熒光檢測(cè)探針為模板合成雙鏈DNA產(chǎn)物；

e、多色熒光熔解曲線檢測(cè)分析PCR產(chǎn)物：

在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，以熒光檢測(cè)探針為模板合成的雙鏈DNA產(chǎn)物，隨著溫度的升高開始解鏈，發(fā)光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)與DNA鏈一起發(fā)生分離，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的不同波長(zhǎng)的熒光被PCR儀檢測(cè)，根據(jù)多色熒光融解曲線分析PCR產(chǎn)物。

熔解曲線分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值的特征，在PCR反應(yīng)之后，通過逐漸提高反應(yīng)物的溫度，使具有不同Tm值的雙鏈DNA依次變性成為單鏈DNA，根據(jù)這一原理可以對(duì)PCR產(chǎn)物中不同長(zhǎng)度DNA或相同長(zhǎng)度不同序列DNA進(jìn)行分析。

上述技術(shù)方案中，條形碼探針3’端的探針序列完全與待測(cè)靶標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)，不完全互補(bǔ)配對(duì)的條形碼探針不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解釋放條形碼序列。

上述技術(shù)方案中，所述熒光探針體系包括多個(gè)條形碼探針和多個(gè)熒光檢測(cè)探針，每個(gè)熒光檢測(cè)探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列長(zhǎng)度不同，從而使得不同的熒光檢測(cè)探針具有不同的Tm值，在PCR擴(kuò)增后形成標(biāo)記了不同熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性的不同長(zhǎng)度的DNA產(chǎn)物，并通過最終的多色熒光熔解曲線分析，在多個(gè)熒光通道產(chǎn)生不同Tm值DNA產(chǎn)物特異熔解曲線峰，從而實(shí)現(xiàn)基于熔解曲線分析的PCR多重檢測(cè)。

上述技術(shù)方案中，淬滅基團(tuán)的種類為Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一種，熒光基團(tuán)為Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一種。

本發(fā)明還提供采用多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法檢測(cè)待測(cè)基因的試劑盒，所述試劑盒包括：

a、條形碼探針，其3’端為待測(cè)靶標(biāo)基因位于兩條引物之間的探針序列，5’端為標(biāo)記淬滅基團(tuán)的具有一定長(zhǎng)度的條形碼序列；

b、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光檢測(cè)探針，其3’端為與所述條形碼序列特異性結(jié)合的條形碼識(shí)別序列，5’端序列與3’端序列互補(bǔ)配對(duì)，中間為任意一段與待測(cè)靶標(biāo)基因不相關(guān)且與條形碼序列不相關(guān)的序列，3’端和5’端分別標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；

c、耐熱DNA聚合酶；

d、根據(jù)待測(cè)基因合成的一對(duì)引物；

e、dATP、dTTP、dCTP及dGTP；

f、PCR緩沖液。

上述技術(shù)方案中，所述耐熱DNA聚合酶為具有5’-3’外切核酸酶活性的耐熱DNA聚合酶。

上述技術(shù)方案中，所述PCR緩沖液為含鎂離子、Triton X-100、硫酸銨、氯化鉀、Tris-HCl的混合溶液。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法，采用能夠與待測(cè)靶標(biāo)基因特異性雜交的條形碼探針和能夠與條形碼探針特異性結(jié)合的熒光檢測(cè)探針，對(duì)待測(cè)樣品中的多個(gè)靶標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過在DNA擴(kuò)增過程中，生成與每一個(gè)待測(cè)靶標(biāo)基因?qū)?yīng)的特異條形碼序列，再由條形碼序列經(jīng)過DNA擴(kuò)增形成標(biāo)記了不同熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性的不同長(zhǎng)度的DNA產(chǎn)物，利用PCR儀檢測(cè)到的每一種波長(zhǎng)的熒光都可以區(qū)分多個(gè)不同Tm值的融解曲線峰，并通過最終的多色熒光熔解曲線分析，在多個(gè)熒光通道產(chǎn)生不同Tm值DNA產(chǎn)物特異熔解曲線峰來判讀是否檢出目標(biāo)基因，從而實(shí)現(xiàn)基于熔解曲線分析的PCR多重檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法的多重檢測(cè)能力更強(qiáng)，能夠同時(shí)檢測(cè)出更多的目的基因，而且成本較低，該方法用于檢測(cè)待測(cè)基因的試劑盒，適用于在各個(gè)醫(yī)療、科研等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。

附圖說明

利用附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但附圖中的內(nèi)容不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

圖1是本發(fā)明的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法的原理示意圖。

圖2是本發(fā)明的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法的實(shí)施例的FAM熒光基團(tuán)的熒光熔解曲線圖。

圖3是本發(fā)明的一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法的實(shí)施例的HEX熒光基團(tuán)的熒光熔解曲線圖。

附圖標(biāo)記：

1——條形碼探針、11——探針序列、12——條形碼序列；

2——熒光檢測(cè)探針、21——條形碼識(shí)別序列；

R——熒光基團(tuán)；

Q——淬滅基團(tuán)；

Pol——具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

本實(shí)施例通過多重檢測(cè)金黃色葡萄球菌FemA基因、單增李斯特氏菌Hly基因、志賀氏菌IpaH基因以及沙門氏菌InvA基因，對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法進(jìn)行說明。

1、待測(cè)靶標(biāo)基因特異性引物序列和探針序列的設(shè)計(jì)：

1） 從GeneBank中調(diào)出金黃色葡萄球菌常見株的FemA基因序列十三條：DQ352463，DQ352462，DQ352461，DQ352460，DQ352459，DQ352458，DQ352457，DQ352456，DQ352467，DQ352466，DQ352465，DQ352464，DQ352455，應(yīng)用ClustalW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選取高度保守的區(qū)段作為靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后將該序列輸入GeneBank，進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定該序列與除金黃色葡萄球菌外的其它物種基因同源性低，之后再應(yīng)用ABI primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物序列和探針序列，保證引物的Tm值為55±3℃，探針序列的Tm值為60-63℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為80-300 bp，最后對(duì)引物序列及探針序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確保引物及探針的特異性。引物序列及探針序列如下：

上游引物序列：5’-gccatacagtcatttcacgca（SEQ ID NO: 1）；

下游引物序列：5’-acagcagtaagtaagcaagctg（SEQ ID NO: 2）；

探針序列：5’-aactgttggccactatgagttaa；

2）從GeneBank中調(diào)出單增李斯特菌常見株的Hly基因序列五條：MLU25452，JF712527，JF712528，JF712529，JQ015301，參照FemA基因引物及探針設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)引物及探針。引物及探針序列如下：

上游引物序列：5’-gtgccgccaagaaaaggtta（SEQ ID NO: 3）；

下游引物序列：5’-tttcacgagagcacctggat（SEQ ID NO: 4）；

探針序列：5’-ccaagttgtgaatgcaatttcgagcc（SEQ ID NO: 5）；

3）從GeneBank中調(diào)出志賀氏菌不同株的IpaH基因序列，其中福氏志賀氏菌不同株IpaH基因序列四條：M76445，DQ448042，DQ448040，F(xiàn)J227542；痢疾志賀氏菌不同株IpaH基因一條：DQ132807；鮑氏志賀氏菌不同株IpaH基因一條：AKNA01000029；宋內(nèi)志賀氏菌不同株IpaH基因六條：DQ448041，DQ448039，KP116110，KP116109，KP116108，JQ638640，參照FemA基因引物及探針設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)引物及探針。引物及探針序列如下：

上游引物序列：5’-aggacattgcccgggataaa（SEQ ID NO: 6）；

下游引物序列：5’-gacacgccatagaaacgcat（SEQ ID NO: 7）；

探針序列：5’-agagaaacttcagctctccactgcc（SEQ ID NO: 8）；

4）從GeneBank中調(diào)出常見沙門氏菌不同株的InvA基因序列九條：DQ644630，DQ644631，DQ644632，DQ644633，M90846，DQ644629，DQ644625，DQ644627，DQ644628，參照FemA基因引物及探針設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)引物及探針。引物及探針序列如下：

上游引物序列：5’-caacgtttcctgcggtactg（SEQ ID NO: 9）；

下游引物序列：5’-taacgaattgcccgaacgtg（SEQ ID NO: 10）；

探針序列：5’-ccacgctctttcgtctggcattatc（SEQ ID NO: 11）。

2、條形碼探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)四條長(zhǎng)度為26 nt 的核苷酸序列，將其命名為“條形碼序列”，然后分別在這四個(gè)條形碼序列的3’端連接上述步驟1中設(shè)計(jì)的與待測(cè)靶標(biāo)基因特異結(jié)合的探針序列，從而設(shè)計(jì)好四個(gè)條形碼探針并分別編號(hào)為1、2、3、4；這四個(gè)條形碼探針的3’端的探針序列分別能夠識(shí)別金黃色葡萄球菌FemA基因、單增李斯特氏菌Hly基因、志賀氏菌IpaH基因和沙門氏菌InvA基因，其5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)的種類為Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一種。

分別與待測(cè)基因金黃色葡萄球菌FemA基因?qū)?yīng)的編號(hào)1的條形碼探針序列、與單增李斯特氏菌Hly基因?qū)?yīng)的編號(hào)2的條形碼探針序列、與志賀氏菌IpaH基因?qū)?yīng)的編號(hào)3的條形碼探針序列以及與沙門氏菌InvA基因?qū)?yīng)的編號(hào)4的條形碼探針序列分別如下：

1：5’-淬滅基團(tuán)-AGAGTCATGACTGTATGAGAGCACTC-aactgttggccactatgagttaa（SEQ ID NO: 12）；

2：5’-淬滅基團(tuán)-AGAATACAGACAGACATGTCTGACAC-ccaagttgtgaatgcaatttcgagcc（SEQ ID NO: 13）；

3：5’-淬滅基團(tuán)-AGTAGATCTGCATCTATAGAGTCGTC-agagaaacttcagctctccactgcc（SEQ ID NO: 14）；

4：5’-淬滅基團(tuán)-AGGATTACACTCACTGACATCTCCAC-ccacgctctttcgtctggcattatc（SEQ ID NO: 15）。

、熒光檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)：

以上述步驟2中設(shè)計(jì)的條形碼序列的5’端的11 nt 核苷酸序列作為對(duì)應(yīng)的熒光檢測(cè)探針的5’端，以條形碼序列的反向重復(fù)序列作為3’端，中間為一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)且長(zhǎng)度不等的核苷酸序列，使得不同的熒光檢測(cè)探針具有不同的Tm值。熒光檢測(cè)探針的5’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)的種類為Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一種；熒光檢測(cè)探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)為Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一種。

（1）與FemA基因?qū)?yīng)的熒光檢測(cè)探針序列（SEQ ID NO: 16）：

5’-淬滅基團(tuán)-AGAGTCATGAC-ctgcacgct-GAGTGCTCTCATACAGTCATGACTCT-FAM；

（2）與Hly基因?qū)?yīng)的熒光檢測(cè)探針序列（SEQ ID NO: 17）：

5’-淬滅基團(tuán)-AGAATACAGAC-ctgtgcactcgcacgcggctaac-GTGTCAGACATGTCTGTCTGTATTCT-FAM；

（3）與IpaH基因?qū)?yīng)的熒光檢測(cè)探針序列（SEQ ID NO: 18）：

5’-淬滅基團(tuán)-AGTAGATCTGC-ctgcacgct-GACGACTCTATAGATGCAGATCTACT-HEX；

（4）與InvA基因?qū)?yīng)的熒光檢測(cè)探針序列（SEQ ID NO: 19）：

5’-淬滅基團(tuán)-AGGATTACACT-ctgtgcactcgcacgcggctaac-GTGGAGATGTCAGTGAGTGTAATCCT-HEX。

4、樣品的準(zhǔn)備及處理：

分別取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌200μl至離心管中，混勻后用生理鹽水10倍梯度稀釋，稀釋10000倍；取1 ml稀釋后的菌液至1.5ml離心管中，14000g離心1分鐘，棄上清，加入100μl DNA 提取液（ 10mM Tris-HCl （pH 7.5）、1% Triton X-100、2% Chelex-100、0.1mM EDTA），充分混勻后，95℃加熱裂解15分鐘，20000g離心2分鐘，提取所得DNA溶液-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

5、PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析：

PCR反應(yīng)液含：1-3 mmol/l MgSO4，20~60 mmol/l (NH4)₂SO₄，5~40 mmol/l KCl，10~30 mmol/l Tris-HCl（pH8.1~8.8），0.01~0.1% Triton X-100（v/v），0.1~0.4 mmol/l dNTPs，單條引物2.5~15 μmol/l，具有5’-3’外切核酸酶活性的耐熱DNA聚合酶0.01~0.2U/μl，UNG酶0.01~0.05U/μl，條形碼探針2.5~5μmol/l，熒光檢測(cè)探針2.5~5μmol/l，反應(yīng)液總體積20~50 μl，每人份加入核酸模版1~10μl，或加入1~10μl無菌水作為空白對(duì)照。

本檢測(cè)在Bio-Rad公司的CFX 96儀器中進(jìn)行，反應(yīng)程序是：

（1）50℃ 5min——95℃ 10min；

（2）95℃ 15s——54℃ 15s——72℃ 20s，50循環(huán)；

（3）95℃ 1min——35℃ 1min——60℃~95℃，其中60℃~95℃以0.4℃/5s的升溫速度進(jìn)行熔解曲線分析，并采集FAM及HEX熒光信號(hào)。

6、結(jié)果判讀：

上述步驟“1，2，3”中，分別與金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌對(duì)應(yīng)的熒光檢測(cè)探針標(biāo)記了FAM熒光基團(tuán)，分別與志賀氏菌、沙門氏菌對(duì)應(yīng)的熒光檢測(cè)探針標(biāo)記了HEX熒光基團(tuán)，熔解曲線如圖2和圖3所示，由于四條熒光檢測(cè)探針的長(zhǎng)度不同，對(duì)應(yīng)的Tm值特征不同，空白對(duì)照無熔解曲線檢測(cè)信號(hào)，根據(jù)相應(yīng)的熒光通道下特異熔解曲線峰的出現(xiàn)情況判斷是否檢出四種待檢微生物。四種待測(cè)微生物對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)及Tm值關(guān)系如表1所示：

表1. 四種待測(cè)微生物對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)及Tm值關(guān)系

如圖2和圖3所示，本發(fā)明的方法對(duì)待測(cè)樣品中的金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌的特異性基因進(jìn)行了多重檢測(cè)，可通過在多個(gè)熒光通道下的熔解曲線峰來判讀是否檢出目標(biāo)基因，從而判斷是否檢出目標(biāo)菌。本發(fā)明采用的熒光檢測(cè)探針只需要標(biāo)記兩種熒光基團(tuán)就可以同時(shí)檢測(cè)四種目的基因，相比TaqMan^TM水解探針法的多重檢測(cè)能力更強(qiáng)，而且成本較低。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

<110> Steve Jia Chang Yu；埃捷思生物科技有限公司；奧健生物科技（廣州）有限公司

<120> 一種多色熒光熔解曲線PCR檢測(cè)方法

<160> 19

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 1

gccatacagt catttcacgc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 2

acagcagtaa gtaagcaagc tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 3

gtgccgccaa gaaaaggtta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 4

tttcacgaga gcacctggat 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 5

ccaagttgtg aatgcaattt cgagcc 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 6

aggacattgc ccgggataaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 7

gacacgccat agaaacgcat 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 8

agagaaactt cagctctcca ctgcc 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 9

caacgtttcc tgcggtactg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 10

taacgaattg cccgaacgtg 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 11

ccacgctctt tcgtctggca ttatc 25

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 12

agagtcatga ctgtatgaga gcactcaact gttggccact atgagttaa 49

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 13

agaatacaga cagacatgtc tgacacccaa gttgtgaatg caatttcgag cc 52

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 14

agtagatctg catctataga gtcgtcagag aaacttcagc tctccactgc c 51

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 15

aggattacac tcactgacat ctccacccac gctctttcgt ctggcattat c 51

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 16

agagtcatga cctgcacgct gagtgctctc atacagtcat gactct 46

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 17

agaatacaga cctgtgcact cgcacgcggc taacgtgtca gacatgtctg tctgtattct 60

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 18

agtagatctg cctgcacgct gacgactcta tagatgcaga tctact 46

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 19

aggattacac tctgtgcact cgcacgcggc taacgtggag atgtcagtga gtgtaatcct 60