專利名稱：一種基于免疫pcr和dna熔解曲線分析的多重檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種多重檢測方法。其特點(diǎn)為可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測多種物質(zhì)。這里所指的物質(zhì)是可以通過特異性作用而相互識別的物質(zhì)，如抗體與抗原，受體與配體，酶與底物，凝集素與多糖。因原理相同，為方便敘述，這里以檢測蛋白質(zhì)為例對本發(fā)明的多重檢測方法進(jìn)行說明。
背景技術(shù)：
免疫檢測通常是指通過抗體與抗原的特異性識別而用抗體(或抗原)來檢測抗原(或抗體)的檢測方法。這種通過特異性相互識別的檢測方法也可以推廣到其它物質(zhì)的檢測，如受體與配體，酶與底物，凝集素與多糖。免疫檢測的最經(jīng)典方法是酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)。該方法簡單，經(jīng)濟(jì)，而且已廣泛采用自動(dòng)化操作。ELISA的局限一是靈敏度低，二是無法進(jìn)行多重檢測。為了增強(qiáng)ELISA的靈敏度，免疫PCR運(yùn)用而生。免疫PCR是ELISA和 PCR的結(jié)合。整個(gè)流程的前面步驟是ELISA，完成抗體抗原的專一性結(jié)合。與經(jīng)典的ELISA 不同的是，免疫PCR的檢測抗體不是用酶標(biāo)記的，而是用DNA標(biāo)記的。標(biāo)記的DNA隨后通過 PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并用生物素標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物通過標(biāo)記的生物素檢測。標(biāo)記的DNA也可通過實(shí)時(shí)熒光PCR直接定量。免疫PCR比ELISA靈敏度高10-10000倍，解決了 ELISA靈敏度低的問題。本發(fā)明通過巧妙設(shè)計(jì)標(biāo)記在檢測抗體或抗原的DNA序列，并將免疫PCR與DNA熔解曲線分析結(jié)合，組成一種新穎的多重免疫PCR檢測技術(shù)。這種新穎的多重免疫PCR技術(shù)具備以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。(I)DNA熔解曲線分析可以在PCR后極為方便的完成。如果使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，熔解曲線分析可以整合到PCR程序中，PCR和DNA熔解曲線分析一氣呵成，操作人員無需做任何事，達(dá)到PCR和熔解曲線分析的無痕結(jié)合。如果使用常規(guī)PCR儀，PCR擴(kuò)增后，也無需打開PCR反應(yīng)管蓋做任何事，僅僅需要把PCR管轉(zhuǎn)移至熔解曲線分析儀進(jìn)行熔解曲線分析即可。這不僅方便了操作，而且大大減少了 PCR污染。0)DNA熔解曲線分析是非破壞性，非消耗性檢測。分析結(jié)束，樣本恢復(fù)原樣。(3) DNA熔解曲線分析不需要在PCR時(shí)對 PCR產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)記，化學(xué)反應(yīng)簡單，也減少了成本。由此可見，這種基于DNA熔解曲線分析的多重免疫PCR比基于DNA固體芯片技術(shù)，液體芯片技術(shù)，或凝膠電泳分析的多重免疫PCR簡便，快速，經(jīng)濟(jì)，抗PCR污染能力強(qiáng)。本專利描述的多重免疫PCR特別適用于十種以內(nèi)物質(zhì)的高靈敏度多重檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過巧妙設(shè)計(jì)標(biāo)記DNA序列，并將免疫PCR與DNA熔解曲線分析結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對多種物質(zhì)的高靈敏度多重檢測。這里所指的物質(zhì)是可以通過特異性作用而相互識別的物質(zhì)，如抗體與抗原，受體與配體，酶與底物，凝集素與多糖。因原理相同，為方便敘述，下文以被檢測物均為抗原為例。圖一顯示同時(shí)檢測三種抗原的原理。1.設(shè)計(jì)一組互不相同的用于標(biāo)記檢測抗體的DNA序列，數(shù)目與需檢測的抗原數(shù)相同。如需要同時(shí)檢測三種抗原，設(shè)計(jì)三個(gè)DNA序列。如圖一中10，11，12。設(shè)計(jì)的DNA標(biāo)記具備如下特點(diǎn)(I)DNA長度在40個(gè)堿基以上；(2)設(shè)計(jì)的一組標(biāo)記DNA，每個(gè)標(biāo)記DNA都可以用PCR高效率擴(kuò)增。擴(kuò)增每個(gè)標(biāo)記 DNA的引物可以相同，也可以不同。如果不同，這些引物對必須能在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中在相同的循環(huán)條件下高效率的擴(kuò)增各自的模板。(3)設(shè)計(jì)的一組標(biāo)記DNA，各個(gè)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物熔解溫度(即Tm值)不同，彼此差別至少0. 5攝氏度。具體差值可視反應(yīng)體系的多重度和熔解曲線的分析儀器的精度確定。 如只需對六種或少于六種蛋白質(zhì)同時(shí)檢測，可設(shè)計(jì)成DNA標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物彼此之間的熔解溫度差在2攝氏度以上。這樣，市場上的幾種主流實(shí)時(shí)熒光PCR儀能可靠的分辨每個(gè) DNA標(biāo)記的熔解曲線，反應(yīng)體系的微小波動(dòng)對熔解溫度的影響將不會對結(jié)果的判斷造成困難，體系抗干擾的能力強(qiáng)。這也為使用分辨率低但價(jià)格低廉的熔解曲線分析儀提供可能，為降低檢測成本創(chuàng)造空間。2.用合成的DNA(單鏈或雙鏈均可)分別標(biāo)記檢測抗體，一種檢測抗體標(biāo)記一種 DNA序列。3.將DNA標(biāo)記的檢測抗體混合在一起?；旌系臐舛扔煽贵w的滴度確定，要求是當(dāng)加入一定體積的混合檢測抗體時(shí)，每個(gè)抗體的濃度在其最佳工作濃度范圍。4.將每個(gè)被檢抗原的捕獲抗體混合，固定在反應(yīng)基質(zhì)表明，如酶聯(lián)免疫吸附板反應(yīng)孔或微球表面，如圖一中13。5.加入樣本(如樣本需預(yù)處理，先作預(yù)處理)，恒溫培育一定時(shí)間，讓抗原抗體充分結(jié)合。培育結(jié)束充分洗滌后，加入DNA標(biāo)記的檢測抗體混合物，恒溫培育。6.恒溫培育結(jié)束后，洗滌。如果采用了可同時(shí)做ELISA和PCR的管子，可直接加入PCR混合液進(jìn)行擴(kuò)增。否則需通過物理如加熱或化學(xué)的處理破壞抗原一抗體一DNA標(biāo)記復(fù)合物，然后將DNA或含有DNA的部分轉(zhuǎn)移至PCR管進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增混合液含有引物，DNA聚合酶，熒光染料STORI或其它用于高分辨率熔解曲線分析的熒光染料，和其它輔助成分。7. PCR擴(kuò)增后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。如果PCR時(shí)使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀， PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增后的熔解曲線分析在同一儀器上完成，完全達(dá)到PCR擴(kuò)增與PCR產(chǎn)物的融解曲線分析無痕連接。如果使用專門的熔解曲線分析儀，PCR可以在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行。PCR 結(jié)束后，不需要打開PCR反應(yīng)管，僅僅需要將PCR管從PCR儀轉(zhuǎn)移至DNA熔解曲線分析儀。 如果某一個(gè)DNA標(biāo)記的特征熔解曲線峰存在，表明該DNA所標(biāo)記的抗體或抗原所檢測的蛋白質(zhì)在樣本中存在。如圖2所示，融解曲線分析顯示三個(gè)峰，對應(yīng)的熔解溫度分別為Tml， Tm2, Tm3，表明熔解溫度為Tml，Tm2, Tm3的DNA所標(biāo)記的抗體所檢測的抗原在樣品中存在。 各個(gè)峰的面積可用來計(jì)算所檢測到的蛋白質(zhì)的相對含量。


圖1 基于DNA熔解曲線分析的多重免疫PCR原理圖。該圖以檢測三種抗原為例。 圖中，4，5，6分別代表三種需要檢測的抗原。1，2，3分別為抗原4，5，6的捕獲抗體。7,8,9 分別為4,5,6的檢測抗體。10，11，12為分別標(biāo)記在檢測抗體8,9,10上的標(biāo)記DNA0 13為捕獲抗體吸附的基質(zhì)。
圖2 基于DNA熔解曲線分析的多重免疫PCR熔解曲線分析示意圖。該圖以樣品中存在三種檢測抗原為例。圖中Tml，Tm2, Tm3分別為DNA標(biāo)記10，11，12的熔解溫度。
具體實(shí)施例方式下面以常檢致病性食品微生物沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的同時(shí)檢測為例說明具體實(shí)施方式
。需要特別強(qiáng)調(diào)的是本專利不是描述和尋求保護(hù)沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的同時(shí)檢測體系，而是以此例說明基于免疫PCR和DNA熔解曲線的多重分析方法。因而本專利不詳細(xì)描述沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌應(yīng)用本技術(shù)檢測的細(xì)節(jié)。設(shè)計(jì)4個(gè)DNA序列A，B, C，D，4對PCR引物a，b，c，d。引物a，b，c，d分別專一性擴(kuò)增A，B，C和D。A, B, C和D的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度互不相同，相臨的兩個(gè)熔解溫度相差約3攝氏度。用A，B, C，D分別通過化學(xué)共價(jià)連接標(biāo)記抗沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌特異抗原的檢測抗體。將標(biāo)記的四個(gè)抗體混合組成混合檢測抗體。將沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌各自特異性抗原的捕獲抗體混合成一個(gè)混合捕獲抗體，通過表面吸附固定在酶聯(lián)免疫和PCR兩用反應(yīng)管中。用屏蔽緩沖液屏蔽非專一性結(jié)合位點(diǎn)后，加入處理過的樣本，培育。培育結(jié)束，充分洗滌，加入混合檢測抗體，培育。培育結(jié)束，充分洗滌。加入含有STOR I的PCR擴(kuò)增混合液， 將PCR管轉(zhuǎn)移至一實(shí)時(shí)熒光PCR儀(如LightCycler 480)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增后DNA熔解曲線分析。根據(jù)熔解曲線分析出現(xiàn)的峰和每個(gè)峰的面積判定四種致病微生物是否存在和相對定量。
權(quán)利要求
1.一種多重免疫PCR檢測方法，其特征是將免疫PCR與DNA熔解曲線分析有機(jī)的結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)在單管內(nèi)對多種物質(zhì)的高靈敏度檢測。
2.如權(quán)利要求書1所述的物質(zhì)，其特征是可以通過物質(zhì)與物質(zhì)的特異性作用而相互識別的物質(zhì)，如抗體與抗原，受體與配體，酶與底物，凝集素與多糖。
3.如權(quán)利要求書1所述的多重免疫PCR檢測方法，其特征是固定在反應(yīng)基質(zhì)(如酶聯(lián)免疫吸附板反應(yīng)孔或微球表面)的捕獲試劑為被檢測的各物質(zhì)的特異性識別物質(zhì)的混合物。
4.如權(quán)利要求書1所述的多重免疫PCR檢測方法，其特征是在樣品中的被檢測物質(zhì)被權(quán)利要求書3所述的捕獲試劑捕獲后，加入的檢測試劑為被檢測的各物質(zhì)的特異性識別物質(zhì)的混合物。
5.如權(quán)利要求書4所述的檢測試劑，其特征是每個(gè)被檢測物質(zhì)的特異性識別物質(zhì)用不同序列的DNA分子通過化學(xué)共價(jià)鍵直接標(biāo)記或通過其它橋接分子(如親和素)間接標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求書5所述的標(biāo)記DNA分子，其特征是它們是長度在40個(gè)堿基以上的DNA 單鏈或雙鏈。
7.如權(quán)利要求書5所述的標(biāo)記DNA分子，其特征是所有標(biāo)記DNA可以用PCR高效擴(kuò)增，而且它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度(即Tm值)不同，彼此差別至少0.5攝氏度。
8.如權(quán)利要求書1所述的多重免疫PCR，其特征是PCR擴(kuò)增后再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析來鑒別PCR產(chǎn)物中存在哪些標(biāo)記DNA以及它們的相對量，進(jìn)而推斷樣品中存在哪些被檢物質(zhì)以及它們的相對量。
9.如權(quán)利要求書8所述的PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析可以在實(shí)時(shí)熒光PCR中進(jìn)行，也可以在常規(guī)PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后在專門的熔解曲線分析儀中進(jìn)行熔解曲線分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于免疫PCR和DNA熔解曲線分析的多重檢測方法。其原理是用一組可通過PCR高效擴(kuò)增且擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度相差較大的DNA分子分別標(biāo)記免疫PCR檢測中使用的檢測物質(zhì)如抗體或抗原。將DNA標(biāo)記的檢測物質(zhì)混合成一個(gè)檢測試劑進(jìn)行免疫PCR。PCR產(chǎn)物再通過熔解曲線分析來分辨擴(kuò)增產(chǎn)物中包含哪幾種標(biāo)記DNA。如果某一個(gè)DNA標(biāo)記的特征熔解曲線峰存在，表明該DNA所標(biāo)記的檢測物質(zhì)所檢測的對象在樣本中存在。各個(gè)峰的面積可用來計(jì)算所檢測到的物質(zhì)的相對含量。該方法特別適合10種以內(nèi)病原體或其它抗原抗體的多重高靈敏度檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102269759SQ20101019250
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者雷向東 申請人:常州楚天生物科技有限公司