利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，設計包含目標位點的檢測引物，根據(jù)HRM分析技術(shù)對PCR擴增后的基因序列進行位點分型。本發(fā)明靈敏度高、特異性好，檢測速度快，可用于為華法林的臨床用藥劑量提供參考，從而達到合理有效地個體化用藥。
【專利說明】利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的檢測方法，屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]華法林是臨床上常用的抗凝藥物，通過抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的擴大和延展，抑制血栓脫落和栓塞的發(fā)生，有利于血栓的清除。臨床上主要用于治療房顫、心瓣膜修復術(shù)、再發(fā)性的中風、深靜脈血栓以及肺動脈栓塞。華法林藥理學作用比較復雜，即使很小的劑量-反應變化也可能導致血栓或出血。臨床用藥劑量可以相差20倍左右，如何正確使用華法林，合理監(jiān)測調(diào)整劑量，已成為困擾臨床醫(yī)生的難題。華法林主要由肝細胞微粒體細胞色素P450 2C9酶羥基化后，由腎臟排出體外。另一方面華法林通過抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶，阻止維生素K還原形式KH2的形成。KH2通過對維生素K依賴性凝血因子I1、Vn、IX、X氨基末端谷氨酸殘基的Y -羧化作用，使其具有生物活性，促進凝血因子結(jié)合于磷脂表面，加速凝血過程。研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9和VKORCl是華法林代謝個體差異最主要的兩個遺傳學方面的影響因素，其基因多態(tài)性變量約占香豆素類藥初始劑量和維持劑量的35%~50%。
[0003]細胞色素氧化酶Ρ450是一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的單加氧酶，與大部分藥物及毒物的代謝有關(guān)。甲CYP2C9在人肝臟微粒體中含量豐富，約占總CYP蛋白量的20%，有多種突變等位基因，構(gòu)成了藥物代謝個體差異的基礎。影響CYP2C9酶催化功能的突變體主要有兩種:CYP2C9*2和CYP2C9*3。研究發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2C9*2等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑量相比要降低14%~20%，攜帶CYP2C9*3等位基因的個體與野生型個體華法林的臨床用藥劑 量相比要降低21%~49%。突變型可以使華法林的代謝減慢，血藥濃度增高，引起出血等不良反應的發(fā)生。
[0004]維生素K環(huán)氧化物還原酶l(vitamin K epoxide reductase I, VK0RC1)可激活維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體，主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林主要作用靶點。VKORCl基因位于內(nèi)含子區(qū)的1173 C>T多態(tài)性能更多顯示華法林個體劑量的差異。一項研究發(fā)現(xiàn)攜帶VK0RC1(1173CC+CT)基因型的病人每天華法林的用藥劑量(3.33±1.04mg/d)比攜帶1173TT基因型所需要的華法林的用藥劑量(1.81 ±0.63 mg/d )高(P< 0.001)。
[0005]目前普遍應用的基因分型檢測方法為Taqman探針法和DNA直接測序法。Taqman熒光探針兩端分別標記報告基團和淬滅基團，探針在未與目標序列結(jié)合保持完整時，熒光報告基團和淬滅基團沒有分離，熒光信號被淬滅基團吸收，不能受激發(fā)出熒光；PCR擴增時，完全互補配對后由Taq酶所具有的5’_3’外切酶活性將探針酶切降解，熒光報告基團和淬滅基團分離，熒光檢測系統(tǒng)可以接到熒光信號，實現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如果探針與目標序列存在錯配堿基，就會大大減少探針與目標序列結(jié)合的緊密度及Taq酶5’端外切酶的活性，影響探針的熒光釋放量，使帶有不同堿基的DNA序列得以鑒定。這種方法步驟少，不易污染，便于對大樣本進行分型；但對引物設計有一定的限制，對于SNP附近的序列有一定要求，受突變堿基位點與類型局限。DNA直接測序法能直接提供準確的堿基信息，被當成突變檢測的金標準，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進行檢測等缺點。
[0006]本發(fā)明應用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線(High resolution melting, HRM)分析技術(shù)。通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA突光染料與PCR產(chǎn)物的結(jié)合情況，SNP位點堿基不同會使雙鏈DNA的TM值發(fā)生變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同的熔解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，能夠有效區(qū)分不同SNP位點與不同基因型。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術(shù)相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優(yōu)點，結(jié)果準確，且實現(xiàn)了真正的閉管操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行的華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的檢測方法。
[0008]為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因(細胞色素P450 2C9酶、維生素K環(huán)氧化物還原酶I)多態(tài)性的方法，其特征在于，具體步驟為:
第一步:采用硅膠吸附法抽 提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul。
[0009]第二步:采用在線軟件Primer 3設計HRM引物，確定最佳引物為18_25bp大小，PCR產(chǎn)物長度80-150bp。相關(guān)引物信息如下:
CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG
第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul(10umol/L)，檢測樣品2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環(huán)；HRM反應條件:92_97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監(jiān)測熒光信號，30-50次每秒。
[0010]第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果，通過標準曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現(xiàn)不同的基因型。定義已知樣本基因型后，軟件會自動調(diào)出所有檢測樣本的基因型。
[0011]本發(fā)明對細胞色素P450 2C9酶及維生素K環(huán)氧化物還原酶I的三個位點的基因型進行檢測，為華法林的臨床用藥劑量提供參考，從而達到合理有效地個體化用藥。
[0012]本發(fā)明基于HRM分析技術(shù)，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料，操作簡單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測速度快、高通量等優(yōu)點，而且分辨率高，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實施例大樣本的HRM標準曲線圖；
圖2為本發(fā)明實施例大樣本的HRM差異曲線圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例
[0015]1、采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到lOng/ul ；
陰性對照DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CC ;
陽性對照I DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CT ；
陽性對照2 DNA符合以下條件時視為合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之間；電泳條帶清晰；測序鑒定CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為TT。
[0016]2、采用在線軟件Primer 3設計引物，確定最佳引物為18_24bp大小，PCR產(chǎn)物長度70-150bp，目標位點周邊位置避免其他SNP位點(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配制濃度為10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)正向引物溶液以及濃度為10umol/L的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)反向引物溶液；正向引物的序列為:5' - AATTTTGGGATGGGGAAGAG -3'，反向引物的序列為:5' - CCACCCTTGGTTTTTCTCAA_3' ο
[0017]3、在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產(chǎn)，包括2 X HRM PCR Master ]\^1、10\?0?緩沖液、0-801111:;[0114￥36代611 Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)基因正向引物溶液0.5ul、反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟I得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul,用滅菌重蒸懼水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應,PCR反應條件為95°C變性10分鐘，95°C變性10秒，57°C退火10秒，72°C延伸10秒，40個循環(huán)；HRM反應條件:95°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監(jiān)測熒光信號，40次每秒。
[0018]4、應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果，如圖1、圖2所示，在8例口腔粘膜上皮細胞提取的DNA檢測中，有6例CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)位點基因型為CC，I例基因型為CT，I例基因型為TT。
【權(quán)利要求】
1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測華法林個體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特征在于，具體步驟為: 第一步:采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul; 第二步:采用在線軟件Primer 3設計HRM引物，確定最佳引物為18_25bp大小，PCR產(chǎn)物長度80-150bp，相關(guān)引物信息如下: CYP2C9 Argl44Cys (rsl799853)引物序列: rsl799853-F:AATTTTGGGATGGGGAAGAG rsl799853-R:CCACCCTTGGTTTTTCTCAA CYP2C9 A1075C (rsl057910)引物序列: rsl057910-F:CCACATGCCCTACACAGATG rsl057910-R:TGTCACAGGTCACTGCATGG VKORCl C1173T (rs9934438)引物序列: rs9934438-F:CCGAGAAAGGTGATTTCCAA rs9934438-R:TGACATGGAATCCTGACGTG 第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0. 5ul(10umol/L)，檢測樣品2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92-97°C變性5-15分鐘，92_97°C變性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸10-30秒，30-50個循環(huán)；HRM反應條件:92_97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65 °C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監(jiān)測熒光信號，30-50次每秒； 第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結(jié)果，通過標準曲線基于曲線偏移(純合子)和曲線形狀變化(雜合子)展現(xiàn)不同的基因型；定義已知樣本基因型后，軟件會自動調(diào)出所有檢測樣本的基因型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525911SQ201310431123
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】吳迪, 傅詠南, 張奕, 王校, 毛丹丹, 卞雪蓮 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司