專利名稱：基于hrm基因分型技術(shù)的集成化基因檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤診斷中間信息相關(guān)的基因的快速 檢測(cè)，一次完成多個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)信息的快速檢測(cè)。也涉及到大量基因信息的檢測(cè)為相關(guān) 腫瘤的預(yù)查和監(jiān)控帶來了方便。
背景技術(shù)：
HRM技術(shù)是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲線分析技術(shù)，是 近年國(guó)外興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法?；诟咝Х€(wěn)健的PCR技 術(shù)，HRM不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分 辨熔解，即可完成對(duì)樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM的主 要原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì) 樣品進(jìn)行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。 HRM技術(shù)對(duì)DNA樣本的質(zhì)量要求很高，所以常用于研究細(xì)胞體系的研究。HRM技術(shù)應(yīng)用于基因突變檢測(cè)依據(jù)于飽和性熒光染料的，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度的微 妙變化來判斷基因類別，故HRM技術(shù)有著很高的靈敏度和準(zhǔn)確度?；蛑笇?dǎo)下個(gè)體化療與個(gè)體化分子靶向治療是近年興起的一種腫瘤藥物治療選 擇方式，目的是提高腫瘤藥物治療的精確性，減少預(yù)期無效的治療。美國(guó)食品和藥品管理局 (FDA)明確支持應(yīng)用靶向藥物前進(jìn)行如EGFR、K-raS、B-raf等基因突變檢測(cè)，以決定對(duì)應(yīng)藥 物是否有效，而先前歐洲藥品管理局(EMEA)已經(jīng)宣布了這個(gè)決定。作為世界上最權(quán)威和最 嚴(yán)格的藥品審批機(jī)構(gòu)，F(xiàn)DA這個(gè)決定無疑標(biāo)志著“個(gè)性化治療的時(shí)代”的來臨。靶向治療藥物與基因信息相關(guān)性如下(1)《09年NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出通常如EGFR 19外顯子 和21外顯子突變或缺失的患者對(duì)這些藥物治療有效，無突變者預(yù)后不良?！?9年NCCN非小 細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出當(dāng)K-ras基因如果發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅 凱(Tarceva/Erlotinib)進(jìn)行分子靶向治療。NSCLC患者使用易瑞沙或特羅凱時(shí)，應(yīng)同時(shí)檢測(cè)EGFR和K_ras突變。(2)K_raS是公認(rèn)的癌基因，參與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)過程，與EGFR 抑制劑類靶向藥物的療效密切相關(guān)?！睹绹?guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指 南》明確指出一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)；二是只有K-ras野 生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗(Cetuximab)和帕尼單抗(panitumumab) 的治療。(3)B-raf基因的突變檢測(cè)可協(xié)助醫(yī)生篩選西妥昔單抗(Cetuximab)和帕尼單抗 (panitumumab)等藥物治療的有效人群。建議B-raf野生型患者接受該類EGFR抑制劑的治療。(4)其他相關(guān)基因等。以上基因的檢測(cè)都是常規(guī)必檢的，甚至有時(shí)需要聯(lián)合檢測(cè)，例如對(duì)于非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因的檢測(cè)，需要同時(shí)檢測(cè)EGFR和KRAS基因的序列信息；對(duì)于結(jié)直腸癌，需要同時(shí) 檢測(cè)KRAS和BRAF基因的序列信息。以往常規(guī)檢測(cè)方法只能一對(duì)一的進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)重影響 操作時(shí)效性，所以對(duì)于多個(gè)基因多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)已是很有必要，以便更快速的提供出 待檢基因的位點(diǎn)信息，而且大量基因集成化檢測(cè)便于篩查相關(guān)腫瘤基因，為預(yù)查和監(jiān)控帶 來了方便。目前普遍應(yīng)用的基因突變檢測(cè)方法為限制小片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFIi^i)和 DNA直接測(cè)序法。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的方法。但是該方法存在以下缺點(diǎn) RFLP實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高昂，以及存在第一輪酶切不完全導(dǎo)致的假陽性DNA直接測(cè)序的原理是DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序，手工測(cè)序包括 Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序可使用美國(guó)PE ABI公 司已生產(chǎn)出310型等DNA測(cè)序儀，ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測(cè)序儀)，采用 毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的 ddNTP (標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測(cè)序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基 的3 ’末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在 一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。由于 分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè) 器窗口中的CCD (charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激 發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同 步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果 能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。該方法存在以下缺點(diǎn)在于花費(fèi)昂貴，所以對(duì)一些較大的，外顯子較多的基因不宜 用測(cè)序法直接檢測(cè)突變；另外不適用于臨床對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，而且多基因多位點(diǎn)的 檢測(cè)需要的多次反應(yīng)來完成。DNA直接測(cè)序也不能被當(dāng)成是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，雜合突變、 膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測(cè)序獲得精確的數(shù)據(jù)。所以為了提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，開發(fā)一種集成化檢測(cè)方法是很有必要的，這樣 就可以在很短的時(shí)間內(nèi)完成多基因多位點(diǎn)多樣本的快速檢測(cè)，以快速的操作方法獲得需要 的基因信息，以滿足臨床用藥和檢測(cè)診斷方面的時(shí)效性要求，也通過集成化檢測(cè)滿足相關(guān) 腫瘤診斷的篩查工作，為相關(guān)腫瘤的預(yù)判提供了一個(gè)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的在于提供一種基于HRM基因分型技術(shù)的集成化基因檢測(cè)方法，該 方法高通量，快速便捷，可以多個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)，解決了不同基因分批操作的麻煩；應(yīng)用本 發(fā)明的集成化程序后可以一次性完成對(duì)多個(gè)基因信息進(jìn)行全面的掃描。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種基于HRM基因分型技術(shù)的集成化基因檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包含以 下步驟(1)針對(duì)待檢目的基因的至少兩個(gè)靶向區(qū)域或若干個(gè)目的基因的靶向區(qū)域的連續(xù) 核苷酸序列設(shè)計(jì)篩選適合的引物對(duì)；(2)提取樣本DNA，利用步驟(1)篩選的若干基因擴(kuò)增引物，利用集成化反應(yīng)程序
5進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對(duì)擴(kuò)增后的所有目的基因或單個(gè)目的基因的若干個(gè) 突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。優(yōu)選的，所述目的基因選自EGFR，KRAS, BRAF, C-KIT，PI3K和PDGFRA的一種或一 種以上；所述引物對(duì)含有目的基因靶向序列中至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸 序列。優(yōu)選的，所述方法在PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，所述PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、 dNTPs、熒光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液 終濃度1 5X;dNTPs0. 1 ImM ；引物序列 終濃度為0. 1 1 μ M ；模板 DNA 0. 05 2ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2終濃度為 1 5mM ；熒光染料 1 3X。優(yōu)選的，所述用于集成化檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系終濃度組成為PCR緩沖液 終濃度1 3X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列 終濃度為0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA 0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2終濃度為 1 3mM ；熒光染料 1 2X。優(yōu)選的，所述熒光染料選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS 染料、ResoLight 染料、SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP的混合液；所述PCR緩沖液包括Tris · cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；_20°C TpH 值在 8. 0-9.0 間。優(yōu)選的，所述集成化反應(yīng)程序包括集成在一起形成程序化操作的進(jìn)行基因擴(kuò)增的 PCR擴(kuò)增程序和進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序。優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增程序中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為92 97°C預(yù)變性4 15min ；92 97°C變性 10 30s，50 65°C退火 10 30s，70 75°C延伸 10 30s，40-55 個(gè)循環(huán)；所述進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序中進(jìn)行產(chǎn)物溶解檢測(cè)的條件為92 97°C 變性1分鐘；40°C復(fù)性1分鐘；然后初始熔解溫度60 65°C開始程序升溫熔解至95°C，并 在熔解過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，25 45次每秒；然后40°C進(jìn)行冷卻10秒。優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增程序中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C 變性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50個(gè)循環(huán)；所述進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序 中進(jìn)行產(chǎn)物溶解檢測(cè)的條件為95°C變性1分鐘；40°C復(fù)性1分鐘；然后初始熔解溫度65°C 開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，40次每秒；然后40°C進(jìn)行 冷卻10秒。
優(yōu)選的，所述方法具體按照如下步驟進(jìn)行Al、設(shè)計(jì)所有待檢目的基因靶向區(qū)域連續(xù)核苷酸序列，篩選適合的弓I物對(duì)；A2、根據(jù)引物條件預(yù)選PCR條件，篩選最優(yōu)PCR擴(kuò)增條件，鎖定擴(kuò)增條件之后，再用 設(shè)定的擴(kuò)增條件篩選設(shè)計(jì)的引物；A3、提取樣本DNA，利用步驟A2篩選出來的若干基因擴(kuò)增引物，集體加樣后上機(jī) 后，利用集成化反應(yīng)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增；A4、根據(jù)高分辨率熔解曲線法對(duì)擴(kuò)增后的目的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)。優(yōu)選的，所述模板DNA從選自外周血血漿、外周血血清、體液、腔道的脫落物、病變 組織樣本中提取。本發(fā)明中，用于特異性擴(kuò)增目的基因靶向序列的引物對(duì)含有目的基因靶向序列中 至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列；所述集成化檢測(cè)條件包含PCR擴(kuò)增條件和 產(chǎn)物熔解條件。本發(fā)明進(jìn)行集成化檢測(cè)基因突變方法研究時(shí)，按照PCR反應(yīng)程序的預(yù)選范圍，優(yōu) 化基因擴(kuò)增程序的確定，產(chǎn)物熔解條件預(yù)選范圍以及優(yōu)化條件的篩選這些程序得到本發(fā) 明。所述PCR反應(yīng)程序預(yù)選范圍選自以下設(shè)置程序
權(quán)利要求
一種基于HRM基因分型技術(shù)的集成化基因檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包含以下步驟(1)針對(duì)待檢目的基因的至少兩個(gè)靶向區(qū)域或若干個(gè)目的基因的靶向區(qū)域的連續(xù)核苷酸序列設(shè)計(jì)篩選適合的引物對(duì)；(2)提取樣本DNA，利用步驟(1)篩選的若干基因擴(kuò)增引物，利用集成化反應(yīng)程序進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對(duì)擴(kuò)增后的所有目的基因或單個(gè)目的基因的若干個(gè)突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因選自EGFR，KRAS,BRAF, C-KIT，PI3K和PDGFRA的一種或一種以上；所述引物對(duì)含有目的基因靶向序列中至少15個(gè) 連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法在PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行，所述PCR 反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反應(yīng) 體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 5X;dNTPs0. 1 ImM ；引物序列終濃度為0. 1 ΙμΜ;模板 DNA0. 05 2ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2終濃度為1 5mM ；熒光染料1 3X。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述用于集成化檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系終濃 度組成為PCR緩沖液終濃度1 3X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列終濃度為0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2終濃度為1 3mM ；熒光染料1 2X。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述熒光染料選自DNA飽和性染料包 括EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液 包括 IOmM dATPUOmM dCTP、IOmMdTTP、IOmM dGTP 的混合液；所述PCR緩沖液包括Tris *cl， 氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；_20°C下pH值在8. 0-9. 0間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述集成化反應(yīng)程序包括集成在一起形成 程序化操作的進(jìn)行基因擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增程序和進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增程序中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的 條件為92 97°C預(yù)變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，50 65°C退火10 30s， 70 75°C延伸10 30s，40-55個(gè)循環(huán)；所述進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序中進(jìn)行產(chǎn)物溶解檢測(cè)的條件為92 97°C變性1分鐘；40°C復(fù)性1分鐘；然后初始熔解溫度60 65°C 開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，25 45次每秒；然后40°C 進(jìn)行冷卻10秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增程序中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的 條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50個(gè)循環(huán)；所述進(jìn)行 突變位點(diǎn)檢測(cè)的產(chǎn)物熔解程序中進(jìn)行產(chǎn)物溶解檢測(cè)的條件為95°C變性1分鐘；40°C復(fù)性1 分鐘；然后初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信 號(hào)，40次每秒；然后40°C進(jìn)行冷卻10秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法具體按照如下步驟進(jìn)行Al、設(shè)計(jì)所有待檢目的基因靶向區(qū)域連續(xù)核苷酸序列，篩選適合的引物對(duì)；A2、根據(jù)引物條件預(yù)選PCR條件，篩選最優(yōu)PCR擴(kuò)增條件，鎖定擴(kuò)增條件之后，再用設(shè)定 的擴(kuò)增條件篩選設(shè)計(jì)的引物；A3、提取樣本DNA，利用步驟A2篩選出來的若干基因擴(kuò)增引物，集體加樣后上機(jī)后，利 用集成化反應(yīng)條件進(jìn)行基因擴(kuò)增；A4、根據(jù)高分辨率熔解曲線法對(duì)擴(kuò)增后的目的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述模板DNA從選自外周血血漿、外周血 血清、體液、腔道的脫落物、病變組織樣本中提取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于HRM基因分型技術(shù)的集成化基因檢測(cè)方法，其特征在于所述方法包含以下步驟(1)針對(duì)待檢目的基因的至少兩個(gè)靶向區(qū)域或若干個(gè)目的基因的靶向區(qū)域的連續(xù)核苷酸序列設(shè)計(jì)篩選適合的引物對(duì)；(2)提取樣本DNA，利用步驟(1)篩選的若干基因擴(kuò)增引物，利用集成化反應(yīng)程序進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對(duì)擴(kuò)增后的所有目的基因或單個(gè)目的基因的若干個(gè)突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。該方法應(yīng)用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀分析，參照陰性對(duì)照，即可完成對(duì)樣本多種基因型的判斷，可以用于聯(lián)合篩查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101955989SQ201010134218
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者時(shí)凱, 王弢, 秦勇, 陳菲 申請(qǐng)人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司