本發(fā)明涉及一種高通量檢測菌株耐有機溶劑氧化還原酶的方法，涉及酶檢測和高通量篩選篩選，屬于新型生物催化劑挖掘領域。

背景技術：

基于酶和微生物細胞的生物催化是生產重要化學品的高效、綠色路線，并正在取代傳統(tǒng)的化學合成路徑，廣泛應用于生產精細化學品和藥物的工藝中。氧化還原酶是六大酶內中所占比重最大的一類，可用于手性化合物的生物合成、醫(yī)療診斷試劑盒、輔酶再生體系、生物感應器以及污染物生物降解等。氧化還原酶被用于不對稱合成手性藥物、合成或修飾聚合物及構建生物感應器等各個方面。其中NADH或NADPH依賴型氧化還原酶在手性合成中有著重要的作用，例如催化醛、酮、羰基以及烯烴碳碳雙鍵的還原，使許多潛手性物質轉化為手性產品應用于醫(yī)藥、食品、精細化工等領域。

在生物催化過程中，為了克服底物或產物溶解度低等限制，添加有機溶劑是工業(yè)上疏水性化合物生物轉化工藝中普遍采用的方法。相比于水相生物催化，非水相生物催化有很多潛在的優(yōu)勢：如更高的底物溶解性、減少副反應以及可調節(jié)酶的特異性等。因此，非水相生物催化技術在手性中間體及藥物合成、精細化學品和生物能源生產等領域日益受到關注。但目前非水相體系酶催化的研究集中于脂肪酶以及酯酶等水解酶，對氧化還原酶的報道較少，因為大部分氧化還原酶在有機溶劑中容易失活。究其原因，主要是自然界耐受有機溶劑的氧化還原酶少，因此往往難以獲得新型的目標催化劑。因此，開發(fā)耐有機溶劑的氧化還原酶對推進非水相酶催化工藝的廣泛應用和深入發(fā)展具有重要的意義。

目前，非水相生物催化技術的研究一方面集中在發(fā)現和篩選溶劑耐受性生物催化劑，利用合理設計及定向進化等技術改造酶以提高熱穩(wěn)定性或選擇性；另一方面則致力于探索與構建生物相容且與生物催化劑性能匹配的非水相介質。如何高通量篩選獲得耐受有機溶劑的生物催化劑是該領域研究的前沿熱點。高通量耐有機溶劑氧化還原酶活檢測平臺的建立是目前急需解決的一個重要技術問題。每個酶都有其最佳反應條件，這包括反應緩沖液、溫度、離子濃度等。設計合理、高效的篩選方法是關鍵。另一方面，在篩選有實際應用價值的氧化還原酶時，大部分研究都只著眼于某一種酶的篩選，而在每個細胞中往往含有上百種酶類，這樣導致在篩選過程中可能無法充分挖掘所考察菌株的實際應用價值，在人力、資源及時間成本上都造成了極大的浪費。目前針對建立耐有機溶劑氧化還原酶的高通量檢測平臺，經檢索還未見有公開相關文獻報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了一種高通量檢測菌株耐有機溶劑氧化還原酶的方法，涉及酶檢測和生物催化劑高通量篩選，構建了多種酶體系多種有機溶劑耐受性的高通量檢測平臺，并通過這個平臺檢測巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)的胺脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸酶以及異檸檬酸脫氫酶等氧化還原酶的耐有機溶劑性能。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種高通量檢測菌株耐有機溶劑氧化還原酶的方法，包括：

1)菌株培養(yǎng)：將菌株以1～10％的接種量接種入216L培養(yǎng)基中培養(yǎng)；本發(fā)明所選用的菌株為巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)(CGMCC編號8967)，但本發(fā)明的方法不限于此菌株。

2)粗酶液的制備：將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，離心，洗滌，重懸，獲得的細胞用超聲破碎后離心，上清液即為粗酶液；

3)在步驟2)所得粗酶液中加入氯化鈉溶液使其終濃度為1～3M，和/或在步驟3)所得粗酶液中加入pH 8.0～11.0的分子量為2～500kDa的支鏈聚乙烯亞胺(PEI)溶液使其終濃度為1～10mg/mL；氯化鈉可促進耐鹽、嗜鹽氧化還原酶的正確折疊，減少假陰性，提高耐有機溶劑氧化還原酶的篩選效率；PEI能夠提高氧化還原酶的穩(wěn)定性，減少操作過程中酶失活，提高耐有機溶劑氧化還原酶的篩選效率；

4)氧化還原酶對有機溶劑耐受性測定：在平行條件下，向步驟3)所得溶液中分別添加不同的有機溶劑并使各有機溶劑的終濃度至10～30％(v/v)，于20～50℃、150～250rpm平行地震蕩0.5～1.5h，然后構建多種有機溶劑體系酶活性高通量檢測平臺，即利用酶標儀平行地同時測定加入有不同有機溶劑的體系中氧化還原酶在震蕩不同時間后的剩余酶活力，以同時測定不同有機溶劑對氧化還原酶活性和穩(wěn)定性的影響，從而同時得到該氧化還原酶對不同有機溶劑的耐受性。

上述方法統(tǒng)一了多種酶的反應條件，包括溫度、緩沖液、激活因子及有機溶劑種類濃度等，通過減少、消除不同酶之間檢測方式、儀器要求以及結果處理的差異性，利用酶標儀同時快速檢測菌株中的多種氧化還原酶耐對多種有機溶劑的耐受性，從而構建耐有機溶劑的氧化還原酶高通量檢測平臺，能夠迅速篩選獲得多種耐有機溶劑的氧化還原酶。

一實施例中：所述氧化還原酶為NADH或NADPH依賴型氧化還原酶。

一實施例中：所述氧化還原酶包括胺脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸酶、異檸檬酸脫氫酶。

一實施例中：所述有機溶劑為乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜。

一實施例中：所述步驟1)中，216L培養(yǎng)基組成為1～15.0g/L蛋白胨，1～10.0g/L酵母粉，0.1～1g/L牛肉膏，0.1～2g/L檸檬酸鈉，0.1～1g/L硝酸銨，0.1～2g/L乙酸鈉，用海水配置；所述的培養(yǎng)條件為：起始pH 6.5～8.0，裝液量體積分數為5％～15％，培養(yǎng)溫度20～40℃，搖床轉速150～250rpm，培養(yǎng)時間12～48h。

一實施例中：所述步驟2)中，將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液在4℃，8000rpm離心15min獲得細胞，棄上清液，沉淀用pH 6.5～8.0的Tris-鹽酸緩沖液重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次；配置成濃度為0.025～100g/L的細胞液用于超聲破碎。

本技術方案與背景技術相比，它具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明統(tǒng)一了多種酶的反應條件，包括溫度、緩沖液、激活因子及有機溶劑種類濃度等，通過減少、消除不同酶之間檢測方式、儀器要求以及結果處理的差異性，利用酶標儀同時快速檢測菌株中的多種氧化還原酶耐對多種有機溶劑的耐受性，從而構建耐有機溶劑的氧化還原酶高通量檢測平臺，能夠迅速篩選獲得耐有機溶劑的氧化還原酶。同時通過在粗酶液中加入不同濃度的氯化鈉，穩(wěn)定耐鹽、嗜鹽酶的結構，使其正確折疊，減少假陰性的結果；并通過加入聚乙烯亞胺，提高氧化還原酶的穩(wěn)定性，提高篩選效率，能夠對大量菌株同時進行多種氧化還原酶耐多種有機溶劑耐受性的檢測，有利于最大限度地同時挖掘所考察菌株的應用潛力，獲得工業(yè)生物催化應用所需的耐有機溶劑的氧化還原酶，并提高篩選效率，減少人力、物力及時間成本的投入。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

圖1為實施例1中胺脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對胺脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對胺脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖2為實施例2中丙酮酸脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對丙酮酸脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對丙酮酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖3為實施例2中蘋果酸酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對蘋果酸酶的影響；(B)有機溶劑對蘋果酸酶穩(wěn)定性的影響。

圖4為實施例2中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖5為實施例2中酮戊二酸脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對酮戊二酸脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對酮戊二酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖6為實施例2中異檸檬酸脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對異檸檬酸脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對異檸檬酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖7為實施例2中蘋果酸脫氫酶有機溶劑耐受性測試結果。(A)有機溶劑對蘋果酸脫氫酶的影響；(B)有機溶劑對蘋果酸脫氫酶穩(wěn)定性的影響。

圖8為實施例3中鹽濃度對丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中活性的影響。

圖9為實施例3中鹽濃度對丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中穩(wěn)定性的影響。其中(A)為不同鹽濃度下丙酮酸脫氫酶耐30％異丙醇的穩(wěn)定性曲線；(B)為不同鹽濃度下丙酮酸脫氫酶耐30％環(huán)己烷的穩(wěn)定性曲線。

圖10為實施例4中PEI濃度對丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中活性的影響。

圖11為實施例4中PEI濃度對丙酮酸脫氫酶有機溶劑體系中穩(wěn)定性的影響。其中(A)為不同PEI濃度下丙酮酸脫氫酶耐30％異丙醇的穩(wěn)定性曲線；(B)為不同PEI濃度下丙酮酸脫氫酶耐30％環(huán)己烷的穩(wěn)定性曲線。

具體實施方式

下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內容：

實施例1

1)巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)的培養(yǎng)：以1％的接種量，將菌種接入500mL 216L培養(yǎng)基中。216L培養(yǎng)基的組成為10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L檸檬酸鈉，0.2g/L NH₄NO₃，1.0g/L NaAc，用海水配置。培養(yǎng)條件為：起始pH 7.0，裝液量體積分數為10％，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)時間24小時。

2)粗酶液的制備：將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次獲得細胞，配置成濃度為0.025～100g/L的細胞液用超聲細胞破碎機破碎，收集上清液即獲得粗酶液。

3)有機溶劑對酶活性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜等)，使各有機溶劑的終濃度至10～30％(v/v)，于25℃、200rpm的搖床中平行地震蕩1h，測定剩余酶活力，從而測定胺脫氫酶對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。

4)有機溶劑對胺脫氫酶穩(wěn)定性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜等)，使各有機溶劑的終濃度至10～30％(v/v)，于25℃、200rpm的搖床中平行地震蕩，間隔時間取樣測定酶活，測定剩余酶活力，從而測定胺脫氫酶對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。

5)胺脫氫酶酶活檢測方法：向96微孔板中加入反應體系，即180μL氯化銨緩沖液(pH 8.5)，10μL NADH，10μL苯氧基-2-丙酮，20μL粗酶液，在所統(tǒng)一檢測溫度下溫育5min。加入經適當稀釋的所需檢測酶液啟動反應。使用酶標儀在340nm下監(jiān)測一段時間內吸光度的變化，計算得到各酶的酶活。酶活定義為在規(guī)定條件下，每分鐘催化生成或者消耗1μmol NADH所耗酶量為1個酶活力單位。

結果如圖1所示，從結果上看，利用所檢測的高通量檢測平臺對多種氧化還原酶同時進行酶活檢測時，結果平行，同批次不同平行樣間誤差小，結果重現性好。利用統(tǒng)一平臺所測得的結果與各酶在各自最優(yōu)反應條件下所測得的結果相差無幾，說明經統(tǒng)一優(yōu)化各酶反應條件所建立的高通量檢測平臺的可靠性。發(fā)現巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)的胺脫氫酶，對有機溶劑乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜具有良好的耐受性。

實施例2

1)巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)培養(yǎng)：以1％的接種量，將菌種接入500mL 216L培養(yǎng)基中。216L培養(yǎng)基的組成為10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L檸檬酸鈉，0.2g/L NH₄NO₃，1.0g/L NaAc，用海水配置。培養(yǎng)條件為：起始pH 7.0，裝液量體積分數為10％，培養(yǎng)溫度40℃，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)時間24小時。

2)粗酶液的制備：將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次獲得細胞，配置成濃度為0.025～100g/L的細胞液用超聲細胞破碎機破碎，收集上清液即獲得粗酶液。

3)有機溶劑對海洋微生物中心碳代謝關鍵氧化還原酶酶活性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜等)，使各有機溶劑的終濃度至10～30％(v/v)，于50℃、200rpm的搖床中平行地震蕩1h，測定剩余酶活力，從而測定海洋微生物中心碳代謝關鍵氧化還原酶(丙酮酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶、2-酮戊二酸脫氫酶)對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。

4)有機溶劑對海洋微生物中心碳代謝關鍵氧化還原酶穩(wěn)定性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜)，使各有機溶劑的終濃度至10～30％(v/v)，于50℃、200rpm的搖床中震蕩，間隔時間取樣測定酶活，測定剩余酶活力，從而測定海洋微生物中心碳代謝關鍵氧化還原酶(丙酮酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶、2-酮戊二酸脫氫酶)對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。

5)海洋微生物中心碳代謝關鍵氧化還原酶酶活檢測方法：向96微孔板中加入六種酶的反應體系，在所統(tǒng)一檢測溫度下溫育5min。加入經適當稀釋的所需檢測酶液啟動反應。使用酶標儀在340nm下監(jiān)測一段時間內吸光度的變化，計算得到各酶的酶活。酶活定義為在規(guī)定條件下，每分鐘催化生成或者消耗1μmol NADH所耗酶量為1個酶活力單位。

結果如圖2至圖7所示，從結果上看，利用所檢測的高通量檢測平臺對多種氧化還原酶同時進行酶活檢測時，結果平行，同批次不同平行樣間誤差小，結果重現性好。利用統(tǒng)一平臺所測得的結果與各酶在各自最優(yōu)反應條件下所測得的結果相差無幾，說明經統(tǒng)一優(yōu)化各酶反應條件所建立的高通量檢測平臺的可靠性。發(fā)現巴利阿里假單胞桿菌(Pseudomonas balearica)的中心碳代謝關鍵氧化還原酶，對有機溶劑乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜具有良好的耐受性。

實施例3

1)菌株培養(yǎng)：同實施例1步驟1)；

2)粗酶液的制備：將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗滌3次并重懸，配置成濃度為0.025～100g/L的細胞液用超聲細胞破碎機破碎，收集上清液即獲得粗酶液。

3)調節(jié)粗酶液的鹽濃度：在粗酶液中加入氯化鈉溶液，使其終濃度為1～3M。

4)有機溶劑對丙酮酸脫氫酶(不同鹽濃度下)酶活性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜等)，使各有機溶劑的終濃度至30％(v/v)，于35℃、200rpm的搖床中平行地震蕩1h，測定剩余酶活力，從而測不同鹽濃度下丙酮酸脫氫酶對有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。結果見圖8，說明不同濃度的氯化鈉可以促進酶的正確折疊，不同程度上增強丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中的活性。

5)鹽濃度對丙酮酸脫氫酶有機溶劑體系中穩(wěn)定性的影響：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(異丙醇和環(huán)己烷)，使各有機溶劑的終濃度至30％(v/v),于35℃、200rpm的搖床中平行地震蕩，間隔時間取樣測定酶活，測定剩余酶活力，從而測定丙酮酸脫氫酶對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。結果見圖9，說明不同濃度的氯化鈉可以不同程度上增強丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中的穩(wěn)定性，因而能夠減少操作過程中酶失活，提高耐有機溶劑氧化還原酶的篩選效率。

實施例4

1)菌株培養(yǎng)：同實施例1步驟1)；

2)粗酶液的制備：將步驟1)培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗滌3次并重懸，配置成濃度為0.025～100g/L的細胞液用超聲細胞破碎機破碎，收集上清液即獲得粗酶液。

3)在粗酶液中加入分子量為2000Da的支鏈PEI溶液(pH 8.0)，使其終濃度為1～10mg/mL。

4)PEI濃度對有機溶劑對丙酮酸脫氫酶酶活性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(乙醇、丙酮、異丙醇、乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷、二甲基亞砜等)，使各有機溶劑的終濃度至30％(v/v)，于40℃、200rpm的搖床中平行地震蕩1h，測定剩余酶活力，從而測不同鹽濃度下丙酮酸脫氫酶對有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。結果如圖10，說明不同濃度的PEI對酶活性喲輕微的抑制作用。

5)PEI濃度對丙酮酸脫氫酶耐有機溶劑穩(wěn)定性影響測定：在平行條件下，在粗酶液中分別添加不同有機溶劑(異丙醇和環(huán)己烷)，使各有機溶劑的終濃度至30％(v/v),于40℃、200rpm的搖床中平行地震蕩，間隔時間取樣測定酶活，測定剩余酶活力，從而測定丙酮酸脫氫酶對不同有機溶劑的耐受性，以添加等量的0.1mol/L Tris-HC1(pH 8.0)作為對照。結果如圖11，說明不同濃度的PEI溶液可以不同程度上增強丙酮酸脫氫酶在有機溶劑體系中的穩(wěn)定性，因而能夠減少操作過程中酶失活，提高耐有機溶劑氧化還原酶的篩選效率。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。