本發(fā)明屬于乳品微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞桿菌的方法。

背景技術(shù)：

聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)將酸奶定義為乳與乳制品(殺菌乳或濃縮乳)在保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)的作用下經(jīng)乳酸發(fā)酵而得到的凝乳狀乳制品，在最終發(fā)酵產(chǎn)品中必須大量存在這些微生物。

保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)在酸奶中起著極為重要的作用，主要體現(xiàn)在以下兩個方面：

1)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)對酸奶質(zhì)量品質(zhì)有著重要的影響，直接影響到產(chǎn)品的風(fēng)味以及感官質(zhì)量；

2)酸奶對人類健康的有益作用已被科學(xué)研究所證實，而其中的活性乳酸菌起著極其重要的作用。

為此，國際乳品聯(lián)合會(IDF)制定的標(biāo)準(zhǔn)要求在酸奶中的活菌數(shù)必須達(dá)到一定數(shù)量(每g或mL產(chǎn)品中不低于10⁶cfu)，因此酸奶制品在生產(chǎn)和銷售過程中對其中的活菌數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確評估是至關(guān)重要的。

目前，選擇性計數(shù)保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基的研究主要集中在乳酸桿菌(LB)培養(yǎng)基和酸化的MRS培養(yǎng)基。乳酸桿菌(LB)培養(yǎng)基可以通過嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌在其培養(yǎng)基中的不同菌落形態(tài)而將它們分離，但因為兩種菌可以同時生長，僅依靠菌落形態(tài)差別很容易造成誤判。魯慧峰,王慧在酸奶中特征菌檢測計數(shù)方法的研究，中國乳業(yè)，2010,(7)：46-47中指出，用醋酸將MRS培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至5.40可以抑制嗜熱鏈球菌的生長；Van de Casteele等人在Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters，International Dairy Journal,2006,16(12):1470-1476中將MRS培養(yǎng)基的pH調(diào)為5.20，也能達(dá)到相同的目的。但利用酸化MRS培養(yǎng)基的方法不具有普遍適用性，在有些情況下，嗜熱鏈球菌也在其上生長。目前公認(rèn)的最有效的方法是Tharmaraj N,Shah N P.在Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus acidophilus,bifidobacteria,Lactobacillus casei,Lactobacillus rhamnosus,and propionibacteria[J].Journal of Dairy Science,2003,86(7):2288-2296中公開的方法，即MRS固體培養(yǎng)基pH值調(diào)整到4.58，在溫度45℃下厭氧培養(yǎng)72h，在這種條件下不適合嗜熱鏈球菌生長，而保加利亞乳桿菌生長受到的影響較小，而這種方法的缺點在于MRS固體培養(yǎng)基成分多，成本高，培養(yǎng)條件所要求的厭氧條件也很嚴(yán)格，培養(yǎng)時間為72h也較長，因此在實際應(yīng)用中存在一定的不足。

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量實驗工作與分析研究，終于完成了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

[要解決的技術(shù)問題]

本發(fā)明的目的是提供一種選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞桿菌的方法。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。

本發(fā)明涉及一種選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞桿菌的方法。

該方法包括選擇適于保加利亞乳桿菌生長的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基、往所述的培養(yǎng)基中加入抑制嗜熱鏈球菌生長的無水乙酸鈉、調(diào)整計數(shù)培養(yǎng)基pH與調(diào)整計數(shù)培養(yǎng)溫度的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中，無水乙酸鈉的添加量是23.0～27.0重量份。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中，無水乙酸鈉的添加量是24.2～25.8重量份。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的pH是6.6～7.0。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，保加利亞桿菌在所述的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中在溫度37℃下培養(yǎng)48h。

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及一種選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞桿菌的方法。

該方法包括選擇適于保加利亞乳桿菌生長的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基、往所述的培養(yǎng)基中加入抑制嗜熱鏈球菌生長的無水乙酸鈉、調(diào)整計數(shù)培養(yǎng)基pH與調(diào)整計數(shù)培養(yǎng)溫度的步驟。

具體地，采用常規(guī)方法進(jìn)行菌株活化如下：

制備MRS液體培養(yǎng)基：將10g大豆蛋白胨、4g酵母粉、1g吐溫80、5g乙酸鈉、0.2g MgSO₄·7H₂O、5g牛肉膏、20g葡萄糖、2g K₂HPO₄、2g檸檬酸三銨與0.05g MnSO₄·4H₂O溶于1000mL蒸餾水中，再使用無機(jī)酸或無機(jī)堿將其pH值調(diào)節(jié)至6.80，然后在溫度121℃下滅菌15min，得到所述的MRS液體培養(yǎng)基。

按照MRS液體培養(yǎng)基質(zhì)量的1.5％，往所述MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂能夠得到MRS固體培養(yǎng)基。

制備AST液體培養(yǎng)基：將10g胰蛋白胨、10g蔗糖、5g酵母粉與2g K₂HPO₄蒸餾水溶于1000mL蒸餾水中，再使用無機(jī)酸或無機(jī)堿將其pH值調(diào)節(jié)至6.80，然后在溫度121℃下滅菌15min，得到所述的AST液體培養(yǎng)基。

按照AST液體培養(yǎng)基質(zhì)量的1.5％，往所述AST液體培養(yǎng)基中添加瓊脂能夠得到AST固體培養(yǎng)基。

以從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株嗜熱鏈球菌NM84-1、G80-1、G80-3與ND03、從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株保加利亞乳桿菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作為試驗菌株。在鏡檢為純菌后，按照常規(guī)方法分別將嗜熱鏈球菌接種于AST液體培養(yǎng)基中，保加利亞乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化兩代；培養(yǎng)物通過離心分離收集菌泥，接著用濃度以重量計0.85％的滅菌生理鹽水洗滌2次，然后重懸于2mL無菌水中得濃縮菌液，此濃縮菌液的菌密度經(jīng)常規(guī)平板計數(shù)為約10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基中在溫度37℃下培養(yǎng)48h計數(shù)得到活菌數(shù)為(1～2)×10⁹cfu/mL。

本發(fā)明保加利亞乳桿菌選擇性培養(yǎng)基研究結(jié)果描述如下。

首先，確定培養(yǎng)基基本成分。分別選用葡萄糖和胰蛋白胨、乳糖和胰蛋白胨、蔗糖和大豆蛋白胨、葡萄糖和大豆蛋白胨、乳糖和大豆蛋白胨作為保加利亞乳桿菌選擇性培養(yǎng)基中的碳、氮源，并添加酵母粉及K₂HPO₄成分，得到不同的固體培養(yǎng)基。

將前面制備的保加利亞乳桿菌菌體濃縮液分別接種于不同固體培養(yǎng)基上，并以MRS瓊脂培養(yǎng)基為對照組，觀測不同碳、氮源對保加利亞乳桿菌生長的影響，從中選出使保加利亞乳桿菌生長最好的碳、氮源組合作為其選擇性培養(yǎng)基的基本組成，然后進(jìn)行后續(xù)試驗。

該試驗使用培養(yǎng)基基本組成及培養(yǎng)條件如下：8.8-11.2g碳源、8.5-11.5g氮源、4.6-5.4g酵母粉、1.8-2.2g K₂HPO₄與1000mL蒸餾水；將培養(yǎng)基pH值調(diào)為6.60～7.00，在溫度121℃下滅菌15min，得到該試驗使用培養(yǎng)基。試驗結(jié)果列于表1中。

表1保加利亞乳桿菌在不同碳、氮源培養(yǎng)基上的活菌數(shù)[log(cfu/mL)]

注：相同字母表示無統(tǒng)計學(xué)差異；不同字母表示存在顯著性差異(p<0.05)，下同。

試驗結(jié)果表明當(dāng)碳、氮源組合為葡萄糖、大豆蛋白胨時，四株保加利亞乳桿菌生長良好，其活菌數(shù)與對照組MRS培養(yǎng)基的相比，無顯著性差異(P>0.05)。且在以葡萄糖、大豆蛋白胨為碳、氮源的培養(yǎng)基上的單菌落(直徑約為0.3～0.5mm)比其他組上的(直徑約為0.1～0.3mm)大，較容易觀察計數(shù)，具體參見附圖1。

根據(jù)本發(fā)明，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

優(yōu)選地，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

更優(yōu)選地，所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分組成如下：以重量份計

其次，確定不同濃度乙酸鈉對嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌生長的影響。

在上述確定的碳源與氮源組合培養(yǎng)基中加入以所述培養(yǎng)基質(zhì)量計0.0％、1.8～2.2％、2.3～2.7％乙酸鈉，將前面得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌體濃縮液分別接種于含有不同濃度乙酸鈉的培養(yǎng)基中，觀察它們對菌株生長的影響。試驗結(jié)果列于表2中。

表2：ST和LB在不同濃度乙酸鈉的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)[log(cfu/mL)]

表2列出的試驗結(jié)果表明，添加2.3～2.7％的乙酸鈉可以抑制嗜熱鏈球菌的生長，而對保加利亞乳桿菌的生長沒有顯著影響。

因此，在所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中，無水乙酸鈉的添加量是23.0～27.0重量份。

優(yōu)選地，在所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中，無水乙酸鈉的添加量是24.2～25.8重量份。

第三，確定所述選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的不同pH值對嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌生長的影響。

在上述確定成分的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)不同的pH值，將前面得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌體濃縮液分別接種于不同pH值的培養(yǎng)基中，觀察它們對菌株生長的影響。試驗結(jié)果列于表3中。

表3：ST和LB在不同pH值培養(yǎng)基中的活菌數(shù)[log(cfu/mL)]

表3列出的試驗結(jié)果表明，與對照組MRS相比，選擇性計數(shù)培養(yǎng)基可以明顯地抑制四株嗜熱鏈球菌的生長；當(dāng)選擇性計數(shù)培養(yǎng)基pH調(diào)整為5.0～5.4時，會對保加利亞乳桿菌ND02和QH11-3的生長造成顯著影響，與對照組MRS及pH 6.6～7.0的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基相比，兩株桿菌活菌數(shù)顯著減少，而pH 6.6～7.0的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基與對照組MRS相比，四株保加利亞乳桿菌活菌數(shù)沒有顯著性差異。

表3的試驗結(jié)果表明，所述的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基的pH是6.6～7.0。

第四，確定培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間對嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌生長的影響。

將前面得到的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌體濃縮液分別接種于選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中，將其分別在不同培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響。試驗結(jié)果列于表4中。

表4：ST和LB在不同培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間下的活菌數(shù)[log(cfu/mL)]

表4列出的試驗結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)時間在24h時，保加利亞乳桿菌因為培養(yǎng)時間短，均未生長；當(dāng)培養(yǎng)時間在48h時及以上時，與對照組MRS相比，四株保加利亞乳桿菌活菌數(shù)沒有顯著性差異，在37℃及45℃不同培養(yǎng)溫度下，四株保加利亞乳桿菌活菌數(shù)沒有顯著差異。因此從縮短培養(yǎng)時間以及節(jié)省能源的角度出發(fā)，選擇37℃下培養(yǎng)48h。

試驗結(jié)果表明，保加利亞桿菌在所述的選擇性計數(shù)培養(yǎng)基中在溫度37℃下培養(yǎng)48h。

利用本發(fā)明選擇性計數(shù)培養(yǎng)基可以使嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)從10⁸cfu/mL降到10⁶cfu/mL以下，而保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。且保加利亞乳桿菌在培養(yǎng)基上菌落為白色，橢圓形，邊緣光滑，單菌落的直徑約為0.3～0.5mm，具體參見附圖2。

本發(fā)明培養(yǎng)基成分較少，成本較便宜，培養(yǎng)條件簡單易實現(xiàn)，克服了現(xiàn)有用于選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞乳桿菌的MRS固體培養(yǎng)基存在的技術(shù)缺陷。

[有益效果]

本發(fā)明的有益效果是：利用本發(fā)明選擇性計數(shù)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件可以使嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)從10⁸cfu/mL降到10⁶cfu/mL以下，而保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。本發(fā)明培養(yǎng)基成分較少，成本較便宜，培養(yǎng)條件簡單易實現(xiàn)，克服了現(xiàn)有用于選擇性計數(shù)酸奶中保加利亞乳桿菌的MRS固體培養(yǎng)基存在的技術(shù)缺陷。

【附圖說明】

圖1是保加利亞乳桿菌ML12-2-2在葡萄糖與胰蛋白胨培養(yǎng)基上和在葡萄糖與大豆蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖；

圖中：

A、添加葡萄糖與胰蛋白胨的培養(yǎng)基

B、添加葡萄糖與大豆蛋白胨的培養(yǎng)基

圖2是保加利亞乳桿菌ML12-2-2和嗜熱鏈球菌G80-1在本發(fā)明選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。

【具體實施方式】

通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。

實施例1：

該實施例的實施步驟如下：

制備MRS液體培養(yǎng)基：將10g大豆蛋白胨、4g酵母粉、1g吐溫80、5g乙酸鈉、0.2g MgSO₄·7H₂O、5g牛肉膏、20g葡萄糖、2g K₂HPO₄、2g檸檬酸三銨與0.05g MnSO₄·4H₂O溶于1000mL蒸餾水中，再使用無機(jī)酸或無機(jī)堿將其pH值調(diào)節(jié)至6.80，然后在溫度121℃下滅菌15min，得到所述的MRS液體培養(yǎng)基。按照MRS液體培養(yǎng)基質(zhì)量的1.5％，往所述MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂能夠得到MRS固體培養(yǎng)基。

制備AST液體培養(yǎng)基：將10g胰蛋白胨、10g蔗糖、5g酵母粉與2g K₂HPO₄蒸餾水溶于1000mL蒸餾水中，再使用無機(jī)酸或無機(jī)堿將其pH值調(diào)節(jié)至6.80，然后在溫度121℃下滅菌15min，得到所述的AST液體培養(yǎng)基。按照AST液體培養(yǎng)基質(zhì)量的1.5％，往所述AST液體培養(yǎng)基中添加瓊脂能夠得到AST固體培養(yǎng)基。

菌株活化：以從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株嗜熱鏈球菌NM84-1、G80-1、G80-3與ND03、從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株保加利亞乳桿菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作為試驗菌株。在鏡檢為純菌后，按照常規(guī)方法分別將嗜熱鏈球菌接種于AST液體培養(yǎng)基中，保加利亞乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化兩代；培養(yǎng)物通過離心分離收集菌泥，接著用濃度以重量計0.85％的滅菌生理鹽水洗滌2次，然后重懸于2mL無菌水中得濃縮菌液，此濃縮菌液的菌密度經(jīng)常規(guī)平板計數(shù)為約10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基中在溫度37℃下培養(yǎng)48h計數(shù)得到活菌數(shù)為(1～2)×10⁹cfu/mL。

以從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株嗜熱鏈球菌NM84-1、G80-1、G80-3與ND03、從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供的分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳而獲得的4株保加利亞乳桿菌ND02、S21-4、QH11-3、ML12-2-2作為試驗菌株。在鏡檢為純菌后，按照常規(guī)方法按照1％～2％接種量將嗜熱鏈球菌接種于AST液體培養(yǎng)基中，按照1％～2％接種量將保加利亞乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化兩代；培養(yǎng)物通過離心分離收集菌泥，接著用濃度以重量計0.85％的滅菌生理鹽水洗滌2次，然后重懸于2mL無菌水中得濃縮菌液，此濃縮菌液的菌密度經(jīng)常規(guī)平板計數(shù)為約10⁹cfu/mL，所有的菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基中在溫度37℃下培養(yǎng)48h計數(shù)得到活菌數(shù)為(1～2)×10⁹cfu/mL。

凝乳的制備：將由恒天然有限公司以商品名skimmed milk powder銷售的脫脂乳粉溶解于蒸餾水中，配制成以質(zhì)量計10％的溶液，然后讓這種溶液在溫度121℃下滅菌7分鐘，再快速冷卻至室溫，接著往冷卻的脫脂乳溶液中分別接種在前面制備的菌體濃縮液，并在溫度37℃下培養(yǎng)至凝乳。

將0.5mL凝乳移取到4.5mL濃度為以重量計0.85％的滅菌生理鹽水中，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，取1mL 10^-6、10^-7稀釋度的菌液移入平板中，采用傾注平板計數(shù)法，每個株菌分別用下面三組培養(yǎng)基計數(shù)，每種培養(yǎng)基計三次平行樣，活菌數(shù)以cfu/mL表示。

A、空白組是常規(guī)MRS瓊脂培養(yǎng)基，pH6.80，在溫度37℃下有氧培養(yǎng)48h；

B、驗證組是MRS瓊脂培養(yǎng)基，pH值4.58，在溫度45℃下厭氧培養(yǎng)72h；

C、試驗組是本發(fā)明選擇性保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基，pH6.60～7.00，在溫度37℃下有氧培養(yǎng)48h。

其試驗結(jié)果列于表5中。

表5：ST和LB分別在不同培養(yǎng)基中的活菌數(shù)[log(cfu/mL)]

表5的結(jié)果顯示，在P<0.05的水平下，(ST)四株嗜熱鏈球菌在乙酸鈉濃度為2.5％時，活菌數(shù)<10⁶cfu/mL。而四株保加利亞乳桿菌在不同濃度乙酸鈉下，其活菌數(shù)與空白組無顯著性差異(P>0.05)。因此，確定本發(fā)明選擇性計數(shù)保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基中乙酸鈉濃度為以質(zhì)量計2.5％。

實施例2：

該實施例的實施步驟如下：

按照實施例1描述的方式制備MRS液體培養(yǎng)基、AST液體培養(yǎng)基與菌株活化。

酸奶制備：將活化嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌兩兩組合，各取200μL共同接種于10mL脫脂乳中，在溫度42℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵3～4h至凝乳。取0.5mL凝乳轉(zhuǎn)移到4.5mL濃度為以重量計0.85％的滅菌生理鹽水中，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，取1mL稀釋度10^-6，10^-7的菌液移入平板中，采用傾注平板計數(shù)法，每株菌分別用下面的培養(yǎng)基計數(shù)，每種培養(yǎng)基計三次平行樣，活菌數(shù)以cfu/mL表示。

A、常規(guī)MRS瓊脂培養(yǎng)基，pH6.80，在溫度37℃下有氧培養(yǎng)48h，以此用來計酸奶中總活菌數(shù)；

B、常規(guī)AST瓊脂培養(yǎng)基，pH6.80，在溫度37℃下有氧培養(yǎng)18h，以此用來計酸奶中嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)；

C、驗證組為已被研究所證明的保加利亞乳桿菌選擇性計數(shù)MRS固體培養(yǎng)基，pH4.58，在溫度45℃下厭氧培養(yǎng)72h；

D、試驗組為本發(fā)明保加利亞乳桿菌選擇性計數(shù)培養(yǎng)基，pH6.60～7.00，在溫度37℃下有氧培養(yǎng)48h。

這些試驗的試驗結(jié)果列于表6與表7中。

酸奶中總活菌數(shù)和嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的試驗結(jié)果列于表6中。

表6：酸奶中ST和總菌的活菌數(shù)[lg(cfu/mL)]

表6的結(jié)果表明，使用MRS固體培養(yǎng)基的總活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AST固體培養(yǎng)基的嗜熱鏈球菌活菌數(shù)，說明有保加利亞乳桿菌的生長。

表7：酸奶中LB在不同選擇性計數(shù)組中的活菌數(shù)[lg(cfu/mL)]

表7的結(jié)果顯示，試驗組中的活菌數(shù)與驗證組的選擇性計數(shù)保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基的活菌數(shù)沒有發(fā)生顯著性變化(P>0.05)，證明本發(fā)明培養(yǎng)基并沒有影響保加利亞乳桿菌的正常生長，同時也表明嗜熱鏈球菌的生長明顯被抑制。

結(jié)合表6與表7的試驗結(jié)果可以知道嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分別在各自的選擇性培養(yǎng)基上的活菌數(shù)之和與在正常MRS培養(yǎng)基上的總菌數(shù)相近，表明酸奶中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌兩種菌都能正常生長。