本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定總?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)含量的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微生物細(xì)胞可以通過(guò)群體感應(yīng)(QS)調(diào)控基因表達(dá)以響應(yīng)細(xì)胞密度的增長(zhǎng)。其中，QS是指隨著微生物細(xì)胞密度的增長(zhǎng)，微生物細(xì)胞產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物濃度也增加，當(dāng)某種代謝產(chǎn)物濃度(也稱(chēng)為信號(hào)分子)達(dá)到閾值時(shí)，微生物則啟動(dòng)調(diào)控多種生理功能相關(guān)的基因表達(dá)，包括生物膜的形成、胞外多糖的產(chǎn)生、毒性因子及抗生素的合成等。QS是依賴于細(xì)胞密度的信號(hào)分子濃度為信號(hào)的細(xì)胞間的一種相互作用和交流方式，對(duì)于微生物的生活史起著十分重要的調(diào)控作用。

根據(jù)目前的研究，QS信號(hào)分子大致可分為三大類(lèi)：1)?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)化合物(AHL)，存在于革蘭氏陰性菌中；2)寡肽類(lèi)信號(hào)分子，存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中；3)呋喃硼酸二聚酯也即自誘導(dǎo)物，存在于革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌中。其中，研究最為熱門(mén)的信號(hào)分子為AHL。AHL由以高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)為母體，通過(guò)氨基化合與側(cè)鏈連接起來(lái)形成?；呓z氨酸內(nèi)酯。由于側(cè)鏈也即?；奶兼滈L(zhǎng)短以及3-碳位的取代的差異性，因此AHL種類(lèi)繁多。常見(jiàn)的?；鶄?cè)鏈長(zhǎng)度有C4至C14，其3-碳位取代有3-O及3-OH等。

由于細(xì)胞內(nèi)多種干擾物質(zhì)，細(xì)菌產(chǎn)生QS信號(hào)分子AHL的濃度一般較低。檢測(cè)AHL是否存在及測(cè)定AHL濃度是目前QS研究的核心之一。目前已經(jīng)報(bào)道了多種檢測(cè)AHL的方法，如基于氣相或液相與質(zhì)譜聯(lián)用的化學(xué)方法。常見(jiàn)的化學(xué)測(cè)定方法耗時(shí)且高成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度的方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度的方法是利用根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens A136遇到AHL時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色且其顯色距離與AHL濃度呈正相關(guān)這一原理，來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度。其中，顯色距離是指在平板點(diǎn)樣測(cè)定方法中，根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136隨著待測(cè)樣品AHL的擴(kuò)散遠(yuǎn)近而呈現(xiàn)出不同的藍(lán)色長(zhǎng)度。

本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度的方法包括如下步驟：

1)將不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品分別間隔點(diǎn)樣于涂有X-gal的培養(yǎng)基的同一高度的不同位置，得到加樣后培養(yǎng)基；所述加樣后培養(yǎng)基包括點(diǎn)有不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液區(qū)域和點(diǎn)有待測(cè)樣品區(qū)域；

2)將根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136分別點(diǎn)樣于所述加樣后培養(yǎng)基上的所述不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液和所述待測(cè)樣品的正下方，且自每個(gè)所述不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液或所述待測(cè)樣品的點(diǎn)樣處起，每間隔等距離點(diǎn)樣一次所述根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136，得到待培養(yǎng)培養(yǎng)基；

3)培養(yǎng)所述待培養(yǎng)培養(yǎng)基，分別測(cè)定每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離和所述待測(cè)樣品的顯色距離；

以所述AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度為縱坐標(biāo)，所述不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

所述待測(cè)樣品的顯色距離為所述點(diǎn)有待測(cè)樣品區(qū)域中所述待測(cè)樣品的點(diǎn)樣處與其正下方，且距其最遠(yuǎn)的藍(lán)斑之間的直線距離；

所述每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離為所述點(diǎn)有每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液區(qū)域中每個(gè)濃度AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣處與其正下方，且距其最遠(yuǎn)的藍(lán)斑之間的直線距離；

4)將所述待測(cè)樣品的顯色距離代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中AHL的濃度。

上述方法中，所述AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液為3OC6-HSL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

上述方法中，所述每間隔0.5cm點(diǎn)樣一次所述根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136。

上述方法中，所述每個(gè)不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液之間的直線距離及所述待測(cè)樣品與AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液之間的直線距離均為1.5cm。

上述方法中，所述培養(yǎng)的條件為30℃培養(yǎng)24-48h。

上述方法中，所述涂有X-gal的培養(yǎng)基為將X-gal與LB液體培養(yǎng)基混勻后得到的培養(yǎng)基，所述X-gal在所述涂有X-gal的培養(yǎng)基中的濃度為60μg/mL，所述LB液體培養(yǎng)基(1L)配方：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸餾水定容至1000mL。

上述方法在檢測(cè)丁香假單胞菌煙草致病變種P.syringae pv.tabaci 11528生長(zhǎng)過(guò)程中不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL濃度中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有AHL的方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有AHL的方法包括如下步驟：

1)將待測(cè)樣品點(diǎn)樣于涂有X-gal的培養(yǎng)基，得到加樣后培養(yǎng)基；

2)將根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136點(diǎn)樣于所述加樣后培養(yǎng)基上，且距離所述待測(cè)樣品點(diǎn)樣處0.5cm的位置，得到待培養(yǎng)培養(yǎng)基；

3)培養(yǎng)所述待培養(yǎng)培養(yǎng)基，得到培養(yǎng)后培養(yǎng)基；觀察培養(yǎng)后培養(yǎng)基是否出現(xiàn)藍(lán)斑；

若所述培養(yǎng)后培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)斑，則待測(cè)樣品中含有或候選含有AHL；反之，則待測(cè)樣品不含有或候選不含有AHL。

上述方法中，

所述將根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136點(diǎn)樣于所述待測(cè)樣品點(diǎn)樣處的正下方，且距離所述待測(cè)樣品點(diǎn)樣處0.5cm的位置。

上述方法中，

所述培養(yǎng)的條件為30℃培養(yǎng)24-48h。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供AHL報(bào)告菌株的新用途。

本發(fā)明提供了AHL報(bào)告菌株在如下(1)-(4)中任一種中的應(yīng)用：

(1)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有AHL；

(2)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有AHL的產(chǎn)品；

(3)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度；

(4)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中AHL濃度的產(chǎn)品。

上述應(yīng)用中，所述AHL報(bào)告菌株為根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)含量的方法，該方法根據(jù)AHL生物報(bào)告菌株根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens A136遇到AHL時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色現(xiàn)象且其顯色距離與AHL濃度呈正相關(guān)這一特點(diǎn)而建立，適用于檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有AHL及其濃度測(cè)定。本發(fā)明利用的AHL報(bào)告菌株根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136，可檢測(cè)廣譜的AHLs，對(duì)?；鶄?cè)鏈長(zhǎng)度為C6到C14的AHL具有不同程度的敏感性，且基于該菌株的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、直觀和精確等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于AHL檢測(cè)及其濃度的測(cè)定。

附圖說(shuō)明

圖1為AHL標(biāo)準(zhǔn)液的顯色情況。其中，從左到右的1-8個(gè)樣品依次為：空白、無(wú)水乙醇、0.5μM、5μM、25μM、100μM、300μM、500μM的3OC6-HSL標(biāo)準(zhǔn)液。

圖2為以顯色距離d為橫坐標(biāo)，以AHL標(biāo)準(zhǔn)濃度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3為各生長(zhǎng)時(shí)期P.syringae pv.tabaci 11528所產(chǎn)AHL濃度。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens A136在文獻(xiàn)“McLean RJ,Whiteley M,Stickler DJ et al.Evidence of autoinducer activity in naturally occurring biofilms.FEMS Microbiol Lett 1997；154:259-63.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心獲得。

下述實(shí)施例中的丁香假單胞菌煙草致病變種P.syringae pv.tabaci 11528(Pta)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，ATCC編號(hào)為11528。

下述實(shí)施例中的LB液體培養(yǎng)基(1L)配方：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)pH 7.2；LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入終濃度1.5％(W/V)的瓊脂。

下述實(shí)施例中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)是Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為B4252。

實(shí)施例1、一種測(cè)定酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)的方法

本實(shí)施例以根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens A136作為AHL報(bào)告菌株，根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136含有β-半乳糖苷酶lacZ報(bào)告基因。當(dāng)根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136接觸外源AHL時(shí)，其lacZ報(bào)告基因表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可以水解底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)，產(chǎn)生藍(lán)斑，AHL濃度不同、顯色距離也不同，且該顯色距離與AHL濃度呈正相關(guān)。利用根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136測(cè)定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)AHL配制液的顯色距離，得知顯色距離與AHL濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可通過(guò)測(cè)定待測(cè)樣品的顯色距離而計(jì)算出待測(cè)樣品中AHL的濃度。具體步驟如下：

1、活化AHL報(bào)告菌株根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136

將根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136接種于含有壯觀霉素(終濃度為50μg/mL)和四環(huán)素(終濃度為4.5μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，得到活化培養(yǎng)后的根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136。

2、LB平板準(zhǔn)備

在LB固體培養(yǎng)基上涂布濃度為60μg/mL的X-gal溶液(溶劑為二基甲酰胺)。

3、配制標(biāo)準(zhǔn)AHL溶液

選取3OC6-HSL(Simga，產(chǎn)品編號(hào)K3255)作為標(biāo)準(zhǔn)AHL，以無(wú)水乙醇為溶劑，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)3OC6-HSL溶液：0.5μM、5μM、25μM、100μM、300μM、500μM。

4、點(diǎn)樣

用無(wú)菌小刀將步驟2制備的LB平板(涂x-gal)隔成約1cm寬的長(zhǎng)條，每個(gè)長(zhǎng)條間隔0.5mm；在每個(gè)長(zhǎng)條的一端點(diǎn)一個(gè)3μL的標(biāo)準(zhǔn)3OC6-HSL配制液；然后分別在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)3OC6-HSL配制液的正下方，且每間隔0.5cm處點(diǎn)0.3μL的步驟1獲得的活化培養(yǎng)后的根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136，待自然晾干后，30℃培養(yǎng)48h，觀察顯色情況并測(cè)定顯色距離d(顯色距離是指待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)樣處與距其正下方且距其最遠(yuǎn)的藍(lán)斑之間的直線距離)。其中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)3OC6-HSL溶液濃度進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)定，最終選取平均顯色距離d。

AHL標(biāo)準(zhǔn)液的顯色情況如圖1所示。其中，從左到右的1-8個(gè)樣品依次為：空白對(duì)照、無(wú)水乙醇、0.5μM、5μM、25μM、100μM、300μM、500μM的3OC6-HSL標(biāo)準(zhǔn)液。

從圖中可以看出，隨著AHL溶液濃度的增大，顯色距離也隨著增大。

5、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)步驟4測(cè)定的顯色距離及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)AHL濃度，繪制顯色距離d與AHL濃度C關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。從圖中可以看出，顯色距離d與AHL濃度C之間的關(guān)系為C＝0.023e^2.789d，R²＝0.9999，表明該方法測(cè)定AHL濃度的可行性較好。

因此，可以通過(guò)如下方法測(cè)定待測(cè)樣品中AHL濃度：

1)將不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品分別間隔點(diǎn)樣于涂有X-gal的培養(yǎng)基的同一高度的不同位置，得到加樣后培養(yǎng)基；加樣后培養(yǎng)基包括點(diǎn)有不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液區(qū)域和點(diǎn)有待測(cè)樣品區(qū)域；

2)將AHL報(bào)告菌株分別點(diǎn)樣于加樣后培養(yǎng)基上的不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品的正下方，且自每個(gè)不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品的點(diǎn)樣處起，每間隔0.5cm點(diǎn)樣一次AHL報(bào)告菌株，得到待培養(yǎng)培養(yǎng)基；

3)培養(yǎng)待培養(yǎng)培養(yǎng)基，分別測(cè)定每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離和待測(cè)樣品的顯色距離；并以AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度為縱坐標(biāo)，不同濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

待測(cè)樣品的顯色距離為點(diǎn)有待測(cè)樣品區(qū)域中待測(cè)樣品的點(diǎn)樣處與距其最遠(yuǎn)的藍(lán)斑之間的直線距離；

每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的顯色距離為點(diǎn)有每個(gè)濃度的AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液區(qū)域中每個(gè)濃度AHL標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣處與其正下方，且距其最遠(yuǎn)的藍(lán)斑之間的直線距離；

4)將待測(cè)樣品的顯色距離代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中AHL的濃度。

實(shí)施例2、AHL報(bào)告菌株在檢測(cè)丁香假單胞菌煙草致病變種P.syringae pv.tabaci11528(Pta)生長(zhǎng)過(guò)程中不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL濃度中的應(yīng)用

1、提取AHL

分別提取不同生長(zhǎng)時(shí)期(對(duì)數(shù)期、早穩(wěn)定期和后穩(wěn)定期)的Pta培養(yǎng)液中的AHL。具體步驟如下：分別向不同生長(zhǎng)時(shí)期(對(duì)數(shù)期、早穩(wěn)定期和后穩(wěn)定期)的Pta培養(yǎng)液中加入等體積的酸化的乙酸乙酯(含0.2％的冰醋酸)抽提三次；取有機(jī)相(上層)，合并有機(jī)相；氮?dú)獯蹈?，用色譜級(jí)的乙腈(honeywell，產(chǎn)品編號(hào)AH015-4)溶解；有機(jī)濾膜過(guò)濾，分別得到不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、測(cè)定顯色距離

按照實(shí)施例1的步驟4中的方法分別將不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液點(diǎn)樣于涂有X-gal的LB平板上(此處不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液與實(shí)施例1中的AHL標(biāo)準(zhǔn)品在同一個(gè)培養(yǎng)基)，并以乙腈為對(duì)照；然后分別在不同生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液正下方，且每間隔0.5cm處點(diǎn)0.3μL的實(shí)施1中的步驟1獲得的活化培養(yǎng)后的根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens A136。30℃培養(yǎng)48h，測(cè)定其顯色距離d，分別得到各生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液的顯色距離。

3、計(jì)算AHL濃度

分別將步驟2中測(cè)定的各生長(zhǎng)時(shí)期的AHL提取液的顯色距離代入實(shí)施例1獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，分別計(jì)算出Pta在生長(zhǎng)過(guò)程中各時(shí)期的AHL濃度大小。

結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出：對(duì)數(shù)期(OD₆₀₀＝0.6-0.8)時(shí)AHL濃度為0.6μM，早穩(wěn)定期(OD₆₀₀＝0.8-1.6)時(shí)其濃度約為2.43μM，后穩(wěn)定期(OD₆₀₀＞1.6)時(shí)其濃度小于0.6μM。說(shuō)明本發(fā)明的方法可以用于測(cè)定AHL濃度，且測(cè)定方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確。