本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其應(yīng)用于膠基型煙草制品對(duì)于人口腔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響的測(cè)定。
背景技術(shù)：
膠基型無煙氣煙草制品(Tobacco chewing gum)是一種在膠基中加入了一定量的煙草提取物、香料以及其他一些食用添加劑制成的一種口用無煙氣煙草制品。膠基型煙草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物會(huì)與唾液匯合聚集在口腔中，根據(jù)消費(fèi)習(xí)慣的不同吐出或者咽下。由于該產(chǎn)品主要作用于口腔，直接與口腔細(xì)胞進(jìn)行接觸，因此有必要建立一種檢測(cè)其對(duì)人口腔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響的方法，以對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)估。
現(xiàn)有的煙草制品安全性評(píng)價(jià)方法主要是針對(duì)傳統(tǒng)卷煙，通常是對(duì)傳統(tǒng)卷煙的煙氣進(jìn)行捕集再進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)測(cè)試。但是膠基型煙草制品并不產(chǎn)生煙氣，且直接作用于口腔，因此傳統(tǒng)卷煙的安全性評(píng)估方法并不適用于該產(chǎn)品。而袋裝口含煙制品一般采用貼在牙齦與唇部之間的方式使用，其內(nèi)含物采用普通浸泡法即可溶出，膠基型煙草制品由于膠基的存在，直接浸泡法大部分內(nèi)含物難以溶出，從而無法準(zhǔn)確進(jìn)行生物安全性測(cè)試。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)膠基型產(chǎn)品的特點(diǎn)，結(jié)合生物學(xué)檢測(cè)方法，建立了一種檢測(cè)膠基型煙草制品對(duì)人口腔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響的方法，為膠基型煙草制品的安全性評(píng)估提供參考。
本發(fā)明公開一種檢測(cè)膠基型煙草制品對(duì)人口腔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響的方法，包括以下步驟：
(1)將待測(cè)的所述膠基型煙草制品置于液氮中冷凍20-40min；
(2)將步驟(1)冷凍的所述膠基型煙草制品，立即用粉碎機(jī)將其粉碎，收集粉碎后的碎末膠基型煙草制品；
(3)再次將所述碎末膠基型煙草制品置于液氮中冷凍；
(4)將步驟(3)得到的所述碎末膠基型煙草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min攪動(dòng)一次；所述人工唾液的溫度為36-38℃；
(5)將步驟(4)得到的提取液離心分離5-10min；
(6)用滲透壓測(cè)定儀測(cè)定步驟(5)得到的上層清液，調(diào)節(jié)其滲透壓與細(xì)胞培養(yǎng)基一致，得到膠基型煙草制品提取液；
(7)測(cè)定提取液中的煙堿含量；
(8)培養(yǎng)人口腔黏膜上皮細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象；
(9)將步驟(6)中獲得的膠基型煙草制品提取液加入到步驟(8)中培養(yǎng)好的人口腔黏膜上皮細(xì)胞中；
(10)經(jīng)過7天的長(zhǎng)期培養(yǎng)，每天進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的檢測(cè)。
優(yōu)選地，步驟(8)中的培養(yǎng)方法包括以下詳細(xì)步驟：
(8-1)口腔黏膜組織的提?。喝?歲以下唇腭裂患者的口腔黏膜組織；
(8-2)用含青霉素的濃度為100ug/mL、鏈霉素為50ug/mL的磷酸緩沖液沖洗步驟(8-1)的口腔黏膜組織2-3次；
(8-3)組織塊的剪切：用眼科剪去除(8-2)中的黏膜下組織，并將修剪后的黏膜剪成約5mm×5mm的小塊，然后加入0.25％中性蛋白酶Ⅱ；
(8-4)將步驟(8-3)的口腔黏膜小塊在4℃下消化16-18h，然后將表層上皮與上皮下層分開；
(8-5)上皮細(xì)胞的分離：將步驟(8-4)得到的上皮層，加人0.25％胰蛋白酶在36℃下消化15min，每5min吹打振動(dòng)1次，然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，離心分離，用磷酸緩沖液沖洗1-2次，然后加入到提前加入了生長(zhǎng)因子的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中；
(8-6)上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將步驟(8-5)得到的上皮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后用細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1-2×105個(gè)/mL細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3d后首次更換培養(yǎng)液，以后每2d更換培養(yǎng)液一次；
(8-7)上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待步驟(8-6)的上皮細(xì)胞達(dá)到覆蓋瓶底的80％時(shí)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰蛋白酶消化，待上皮細(xì)胞變成圓形，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心分離，加入提前加入了生長(zhǎng)因子的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，使上皮細(xì)胞濃度達(dá)到3×104個(gè)/mL；將單細(xì)胞懸浮液種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種量為100μL/孔，將種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；
優(yōu)選地，步驟(10)中包括以下詳細(xì)步驟：
(10-1)受試物的孵育：將步驟(6)中獲得的膠基型煙草制品提取液加入步驟(8-7)得到的上皮細(xì)胞中，以樣品煙堿量作為檢測(cè)劑量劃分指標(biāo)；空白對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組加入人工唾液；
(10-2)CCK-8孵育：將步驟(10-1)中的細(xì)胞與受試物的孵育24h后加入溶解的CCK-8溶液20μL/孔，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4h；
(10-3)吸光值測(cè)定：在酶標(biāo)儀上讀取OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm，每個(gè)點(diǎn)為3個(gè)平行樣品的平均值；
(10-4)每隔24h選取(10-1)中的不同細(xì)胞與受試物培養(yǎng)孔重復(fù)(10-2)及(10-3)步驟，共檢測(cè)7d。
本發(fā)明有益效果
1、本發(fā)明考慮到膠基型煙草制品難以采用直接浸泡法進(jìn)行提取的特點(diǎn)，采用超低溫(約-196℃)冷凍后粉碎，這可以將膠基這種黏黏糊糊的物質(zhì)有效粉碎成粉末，然后將粉末再次用液氮超低溫冷凍后，快速加入到常溫(36-38℃)人工唾液中，利用從深冷迅速到常溫的這種驟熱效應(yīng)，促使粉末因急劇熱脹冷縮而進(jìn)一步破碎，提高粉末與提取液的接觸面積，從而提高從粉末中萃取化學(xué)物質(zhì)的效率。
2、由于膠基型煙草制品通常為了增強(qiáng)口腔舒適感加入較多的糖分或者鹽分等影響液體滲透壓的物質(zhì)，如果直接將提取液加入細(xì)胞中易導(dǎo)致由于滲透壓的問題而引起細(xì)胞死亡，因此本發(fā)明在處理細(xì)胞之前調(diào)節(jié)了提取液的滲透壓，從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
3、為了盡量模擬實(shí)際情況，本發(fā)明在提取時(shí)采用了人工唾液，并模擬了接近人口腔的溫度和食用時(shí)間，在檢測(cè)對(duì)象上選擇了人口腔細(xì)胞，且為了盡量接近人口腔細(xì)胞的實(shí)際情況，本發(fā)明采用原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)了正常人口腔黏膜上皮細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，相比較傳統(tǒng)采用動(dòng)物細(xì)胞或者癌細(xì)胞的檢測(cè)，提高了試驗(yàn)的可靠性。
4、考慮到膠基型煙草制品對(duì)人口腔的長(zhǎng)期影響，本實(shí)驗(yàn)采用了7天連續(xù)培養(yǎng)的方法，一方面可以對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)行繪制，另一方面可以對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)做一個(gè)連續(xù)性的長(zhǎng)期觀察，從而保證結(jié)果的穩(wěn)定性。
附圖說明
圖1為不同濃度(濃度用尼古丁濃度標(biāo)識(shí)，分別為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL)的提取液處理人口腔細(xì)胞，測(cè)定提取液對(duì)人口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。
具體實(shí)施方式
1.隨機(jī)挑選一種膠基型煙草制品(N-2，尼古丁含量2mg/顆)，隨機(jī)挑選2顆放入樣品管中，將樣品管置于液氮中冷凍30min。
2.將樣品管從液氮中取出，再取出膠基型煙草制品(N-2)，立即用樣品粉碎機(jī)將其粉碎，用樣品管收集粉碎后的碎末。
3.將裝有膠基型煙草制品碎末的樣品管再次置于液氮中冷凍30min；
4.從液氮中取出樣品管，立即加入10mL預(yù)熱至37℃的人工唾液，浸泡粉碎后的膠基型煙草制品碎末(N-2)，采用37℃、30min的提取條件，并在浸泡過程中每隔2min攪動(dòng)提取液以使樣品與提取液充分接觸從而利于內(nèi)含物的溶出。
5.將提取液置于15mL離心管中，離心10min以沉淀固體物。
6.用移液器吸取上清置于新的離心管中，并使用滲透壓測(cè)定儀測(cè)定提取液的滲透壓，調(diào)節(jié)其滲透壓與細(xì)胞培養(yǎng)基一致。
7.測(cè)定提取液中的尼古丁的濃度，以驗(yàn)證提取效率。
8.人正?？谇火つそM織的取材：選擇6歲以下唇腭裂患者，在唇裂整復(fù)術(shù)中保留切除的多余口腔黏膜組織，立即放入盛放DMEM/F12培養(yǎng)基的無菌管中，送往實(shí)驗(yàn)室處理。
9.組織塊的沖洗：在超凈工作臺(tái)上用含雙抗(青霉素的終濃度為100ug/mL,鏈霉素為50ug/mL)的PBS(磷酸緩沖液)反復(fù)沖洗3次，去除組織塊上附著的血污和細(xì)菌。
10.組織塊的剪切：用眼科剪除去黏膜下組織，剪成約5mm×5mm的小塊，加入0.25％DispaseⅡ(中性蛋白酶Ⅱ)。
11.組織塊的消化：將小塊放入冰箱4℃消化16-18h，用眼科鑷將表層上皮與上皮下層分開。
12.上皮細(xì)胞的分離：修剪上皮層成1mm3的小塊，加人0.25％胰蛋白酶36℃消化15min(5min吹打振動(dòng)1次)，去除未消化完全的細(xì)胞塊，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液。1000r/min離心5min，棄上清，用PBS沖洗一次，加入提前加入生長(zhǎng)因子的KSFM培養(yǎng)基(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)。
13.上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：人口腔黏膜上皮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后用細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1-2×105個(gè)/mL細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，以后每2d換液一次。
14.上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待細(xì)胞達(dá)到覆蓋瓶底的80％時(shí)傳代培養(yǎng)，用0.25％的胰蛋白酶消化，鏡下觀察細(xì)胞回縮情況，待細(xì)胞變成圓形，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄上清，加入提前加入生長(zhǎng)因子的KSFM培養(yǎng)基(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)，使細(xì)胞濃度達(dá)到3×104個(gè)/mL。將單細(xì)胞懸浮液種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種量為100μL/孔，將種好的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
15.試驗(yàn)分組：試驗(yàn)分為三組，分別為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和測(cè)試樣品組，每個(gè)試驗(yàn)組做3個(gè)平行。
16.受試物的孵育：將(6)中獲得的膠基型煙草制品提取液加入(14)中的人口腔黏膜上皮細(xì)胞中，以樣品煙堿量作為檢測(cè)劑量劃分指標(biāo)；空白對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組加入人工唾液。
17.CCK-8孵育：將步驟(16)中的細(xì)胞與受試物的孵育24h后加入溶解的CCK-8溶液20μL/孔，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4h。；
18.吸光值測(cè)定：在酶標(biāo)儀上讀取OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm。每個(gè)點(diǎn)為3個(gè)平行樣品的平均值。
19.每隔24h選取(16)中的不同細(xì)胞與受試物培養(yǎng)孔重復(fù)(17)及(18)步驟，共檢測(cè)7d。
20.繪出不同濃度提取液對(duì)人口腔黏膜上皮細(xì)胞的的影響曲線圖，見圖1。
由圖1可以看出，三個(gè)濃度組的N-2均對(duì)人口腔黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯影響。