本發(fā)明涉及口含煙的體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種口含煙浸提物體外細(xì)胞毒性測(cè)試方法。

背景技術(shù)：

口含煙是一種通過(guò)非燃燒途徑進(jìn)行煙草消費(fèi)的新型煙草制品。其不需要燃燒，有害成分明顯降低，并且不會(huì)產(chǎn)生“環(huán)境煙草煙氣”。消費(fèi)口含煙是許多國(guó)家的傳統(tǒng)。然而，研究報(bào)告表明，口含煙也可以導(dǎo)致人體健康的不良影響，可以引起口腔、消化道以及其他人體部位癌變，可致癮，有可能是導(dǎo)致心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。實(shí)際上口含煙種類(lèi)頗多，不同種類(lèi)間成分和致癌能力差異巨大。根據(jù)現(xiàn)有資料，口含煙中已知致癌物或潛在致癌物有28種，包括煙草特有亞硝胺、多環(huán)芳烴、重金屬等。有關(guān)口含煙健康影響的報(bào)道主要基于流行病學(xué)數(shù)據(jù)和單一化合物的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，而對(duì)于口含煙的體外毒性測(cè)試的文獻(xiàn)報(bào)道很少，還沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的體外毒性測(cè)試方法。

口含煙有不同類(lèi)型，如含化型、袋裝型等。不同類(lèi)型的口含煙進(jìn)行體外毒性測(cè)試時(shí)需要采用相應(yīng)的提取方法對(duì)口含煙進(jìn)行樣品浸提，獲得可進(jìn)行體外毒性試驗(yàn)的口含煙浸提物。

CCK-8是一種廣泛用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活率測(cè)試的快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度檢測(cè)試劑，在電子耦合試劑存在的情況下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。甲瓚產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色越深，細(xì)胞存活率越高。

口含煙毒性較低，在進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)時(shí)，需要靈敏度高的測(cè)試方法；同時(shí)在進(jìn)行批量樣品的毒性檢測(cè)時(shí)也要求試驗(yàn)方法快速、簡(jiǎn)便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述存在的問(wèn)題，建立了針對(duì)不同類(lèi)型口含煙的浸提物提取方法；并基于CCK-8試劑顏色反應(yīng)的原理，根據(jù)口含煙不同浸提物毒性的特點(diǎn)，建立的一種口含煙浸提物體外細(xì)胞毒性測(cè)定方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種口含煙浸提物體外細(xì)胞毒性測(cè)試方法，包括以下步驟：

（1）口含煙浸提物的制備：分別將口含煙樣品處理后用二甲基亞砜（DMSO）或去離子水進(jìn)行浸提，于37 ℃震蕩24±3 h后，1800 g離心30-60 min，吸取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，25000 g離心30-60 min，吸取上清經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后-80℃保存，即可獲得口含煙樣品的DMSO浸提物或水溶性浸提物儲(chǔ)存液；兩次離心的意義在于：第一次離心是去除口含煙樣品的基質(zhì)物質(zhì)，第二次離心的離心力大大增大，其目的是將粗提液中的化學(xué)成分與不溶性雜質(zhì)充分的分離，進(jìn)而獲得浸提充分的口含煙浸提物，以免粗提液中的雜質(zhì)干擾細(xì)胞毒性的測(cè)試結(jié)果。

（2）細(xì)胞接種培養(yǎng)：經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）或人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B細(xì)胞）進(jìn)行消化以后，制備細(xì)胞懸液(1×10⁵個(gè)/mL)，將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)24 h；

（3）口含煙浸提物染毒：使用細(xì)胞培養(yǎng)基將口含煙樣品浸提物儲(chǔ)存液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置5個(gè)非零濃度。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，96孔板(除最外周36孔)每孔加入100 μL的含有陰性對(duì)照、樣品浸提物或陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞培養(yǎng)基，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于37 ℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)24 h；

空白對(duì)照：細(xì)胞培養(yǎng)基，孔內(nèi)無(wú)細(xì)胞；

陰性對(duì)照：口含煙DMSO浸提物染毒試驗(yàn)的陰性對(duì)照為含有與最高劑量組的DMSO濃度一樣的DMSO細(xì)胞培養(yǎng)基；口含煙水溶性浸提物染毒試驗(yàn)的陰性對(duì)照為細(xì)胞培養(yǎng)基。

陽(yáng)性對(duì)照：十二烷基硫酸鈉（SDS），濃度100-200 μg/mL；

（4）CCK-8染色試驗(yàn)：

（5）結(jié)果與分析：

樣品浸提物孔吸光值：At

陰性對(duì)照孔吸光值：Ac

空白對(duì)照組吸光值：Ab

細(xì)胞存活率C（%）=×100%

公式中的分母表示的是平均值：吸光值的平均值。

所述口含煙樣品為含化型口含煙樣品或袋裝型口含煙樣品；

當(dāng)口含煙樣品為含化型口含煙樣品時(shí)，處理時(shí)先將其切碎并進(jìn)行稱(chēng)重，再用二甲基亞砜或去離子水浸提。根據(jù)稱(chēng)重的數(shù)據(jù)確定浸提溶劑的體積量，進(jìn)而得到合適濃度的浸提液

當(dāng)口含煙樣品為袋裝型口含煙樣品時(shí)，取其內(nèi)容物干重，再用二甲基亞砜或去離子水浸提。

本發(fā)明的內(nèi)容是建立口含煙浸提物的制備和體外細(xì)胞毒性測(cè)定方法。本發(fā)明可以制備針對(duì)不同類(lèi)型口含煙的水溶性和更劇烈的有機(jī)溶劑浸提物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的不同測(cè)試不同浸提物的毒性。在進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試時(shí)，減少了多次洗滌細(xì)胞的步驟，使得實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)便；CCK-8試劑可在染毒后直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基，無(wú)需換液步驟，產(chǎn)生的水溶性甲臜產(chǎn)物可直接進(jìn)行吸光值檢測(cè)，減少了檢測(cè)前的溶解步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)省了時(shí)間更加快速；且可實(shí)現(xiàn)連續(xù)多次的吸光值檢測(cè)，無(wú)需增加額外的實(shí)驗(yàn)步驟，為尋找合適的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)提供了方便；CCK-8試劑本身對(duì)細(xì)胞毒性小，避免了本底的影響和實(shí)驗(yàn)誤差，測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高。

本發(fā)明是針對(duì)口含煙與卷煙和電子煙的不同而專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的，卷煙產(chǎn)生的煙氣需要進(jìn)行濾片捕集后提取進(jìn)行毒性測(cè)試，電子煙的毒性測(cè)試可直接將電子煙煙液用來(lái)染毒細(xì)胞，而口含煙在進(jìn)行毒性測(cè)試時(shí)，需要先對(duì)其進(jìn)行所含成分的提取即樣品前處理浸提。同時(shí)，不同的浸提方式對(duì)于毒性的測(cè)試目的和測(cè)試結(jié)果影響非常大，本發(fā)明建立了溫和方式的水溶性浸提方法和更劇烈的有機(jī)溶劑浸提方法（DMSO），兩種方法所獲得的提取液的化學(xué)成分不同，因此毒性測(cè)試結(jié)果也不同，使用者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的浸提方法。CCK-8是一種廣泛用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活率測(cè)試的檢測(cè)試劑，在本發(fā)明中作為口含煙提取物的細(xì)胞毒性測(cè)試的檢測(cè)試劑，方便易得、簡(jiǎn)便快速、靈敏度高。本發(fā)明建立的是口含煙體外細(xì)胞毒性測(cè)試的一套完整的實(shí)驗(yàn)方法，從樣品提取物的多種方式制備，到細(xì)胞毒性的快速檢測(cè)，是樣品前處理浸提方法的創(chuàng)新和與快速毒性檢測(cè)的方法組合的創(chuàng)新。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1口含煙DMSO浸提物染毒CHO細(xì)胞毒性測(cè)試圖。

圖2為實(shí)施例1口含煙水溶性浸提物染毒CHO細(xì)胞毒性測(cè)試圖。

圖3為實(shí)施例2口含煙DMSO浸提物染毒BEAS-2B細(xì)胞毒性測(cè)試圖。

圖4為實(shí)施例2口含煙水溶性浸提物染毒BEAS-2B細(xì)胞毒性測(cè)試圖。

從結(jié)果中可看出，口含煙樣品的水溶性浸提物的染毒劑量高于DMSO浸提物，在高濃度染毒劑量下引起細(xì)胞的存活率降低。口含煙的水溶性浸提物和DMSO浸提物均具有體外細(xì)胞毒性，DMSO浸提物的毒性效應(yīng)大于水溶性提取物，可能與口含煙所含的化學(xué)成分組成不同有關(guān)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例附圖做進(jìn)一步說(shuō)明：

具體實(shí)施一

選取去離子水和二甲基亞砜（DMSO）分別對(duì)某市售含化型口含煙樣品進(jìn)行萃取獲得水溶性浸提物和DMSO浸提物。采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)浸提液對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）存活率的影響。CHO細(xì)胞以1×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板中，于37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行染毒24 h。水溶性浸提物染毒劑量分別為：0（陰性對(duì)照）、2500、5000、10000、20000和40000 μg/mL；DMSO浸提物染毒劑量分別為：0（陰性對(duì)照）、250、500、1000、2000、和4000 μg/mL。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細(xì)胞于37 ℃、5% CO₂條件下孵育約3 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)圖1、圖2。

具體實(shí)施二

選取去離子水和二甲基亞砜（DMSO）分別對(duì)某市售袋裝型口含煙樣品進(jìn)行萃取獲得水溶性浸提物和DMSO浸提物。采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)浸提液對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B細(xì)胞）存活率的影響。BEAS-2B細(xì)胞以1×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板中，于37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行染毒24 h。水溶性浸提物染毒劑量分別為：0（陰性對(duì)照）、2500、5000、10000、20000和40000 μg/mL；DMSO浸提物染毒劑量分別為：0（陰性對(duì)照）、250、500、1000、2000、和4000 μg/mL。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細(xì)胞于37 ℃、5% CO₂條件下孵育約3 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。測(cè)試結(jié)果參見(jiàn)圖3、圖4。