離子交換膜的從細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物中去除雜質(zhì)的用圖
【專利說明】離子交換膜的從細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物中去除雜質(zhì) 的用途 相關(guān)申請的交叉引用 本專利申請要求2012年10月4日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 61/709, 871的權(quán)益， 所述專利通過引用并入。 通過引用并入電子方式提交的材料 隨同同時(shí)提交的且如下鑒定的計(jì)算機(jī)可讀的核苷酸/氨基酸序列表通過引用整體并 入本文：創(chuàng)建于2013年10月3日的名稱為"714288SequenceListing. TXT"的一個(gè)8, 279 個(gè)字節(jié)ASCII(文本）文件。 發(fā)明背景 可用于治療癌癥和其它疾病的抗體-藥物綴合物通常由三種不同的元件組成：細(xì)胞結(jié) 合劑；接頭；和細(xì)胞毒性劑。常用的制造方法之一包括：修飾步驟，其中細(xì)胞結(jié)合劑與雙官 能接頭反應(yīng)以形成共價(jià)連接于具有反應(yīng)性基團(tuán)的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑；純化步驟，其中修飾 的抗體從修飾反應(yīng)的其它組分中純化；綴合步驟，其中修飾的細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑反 應(yīng)以形成所述接頭（使用反應(yīng)性基團(tuán)）至細(xì)胞毒性劑的共價(jià)化學(xué)鍵，以及第二純化步驟，其 中所述綴合物從綴合反應(yīng)的其它組分中純化。 最近的臨床試驗(yàn)已經(jīng)示出抗體-藥物綴合物在治療許多不同類型的癌癥中的有希望 的作用。因此，需要生產(chǎn)可用于治療患者的高純度且高穩(wěn)定性的綴合物。盡管在制備抗 體-藥物綴合物中取得進(jìn)步，但當(dāng)前的方法受若干因素的限制。例如，由這些方法產(chǎn)生的綴 合物包含增加量的雜質(zhì)，所述雜質(zhì)包括游離細(xì)胞毒性劑（如，細(xì)胞毒性劑二聚體相關(guān)的物 質(zhì)）和/或高分子量物質(zhì)（如，二聚體和其它更高階聚集物）。在本領(lǐng)域中利用的當(dāng)前純 化方法，諸如正切流動過濾和吸附色譜法，不能高效地去除這些雜質(zhì)而未顯著降低產(chǎn)量和/ 或?qū)τ诖笠?guī)模生產(chǎn)工藝為難處理的。 因此，仍需要制備比由當(dāng)前方法產(chǎn)生的抗體-藥物綴合物更穩(wěn)定且純度更高的改善的 方法。本發(fā)明提供此類方法。本發(fā)明的這些和其它優(yōu)勢以及另外的發(fā)明特征將從本文提供 的發(fā)明描述中顯而易見。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于制備純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的方法，所述方法包括使包 含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜以從混 合物中去除至少部分所述雜質(zhì)，從而提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。本發(fā)明還 包括包含化學(xué)偶聯(lián)至根據(jù)本文所述的方法制備的細(xì)胞毒性劑的細(xì)胞結(jié)合劑的綴合物。 發(fā)明詳述 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解包含化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑的細(xì)胞結(jié)合劑（諸如抗體）的 綴合物（"抗體-細(xì)胞毒性劑綴合物"）通常通過以下制備：在低pH(S卩，pH7.0或以下） 下用雙官能交聯(lián)劑修飾抗體，純化具有結(jié)合至其的接頭的抗體，將細(xì)胞毒性劑綴合至具有 結(jié)合至其的接頭的抗體，以及純化所述抗體-細(xì)胞毒性劑綴合物。最近，已經(jīng)通過使穩(wěn)定結(jié) 合至細(xì)胞結(jié)合劑的接頭的量最大化并且使導(dǎo)致綴合物不穩(wěn)定的不期望的副反應(yīng)最小化開 發(fā)了產(chǎn)生增強(qiáng)穩(wěn)定性的綴合物的方法。例如，已經(jīng)開發(fā)了這樣的方法，其中用于制備綴合物 的方法在一個(gè)步驟中（參見，如，在美國專利申請公布No. 2012/0253021中所述的方法）和 /或在高的pH(如，pH7或以上）（參見，如，國際專利申請公布No.WO2012/135522中所 述的方法）下進(jìn)行以便增加具有穩(wěn)定結(jié)合至其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑的期望物質(zhì)的水平并 降低不期望的反應(yīng)產(chǎn)物（如，具有不穩(wěn)定結(jié)合至其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑）的水平。盡管此 類方法產(chǎn)生增強(qiáng)穩(wěn)定性的綴合物，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些方法產(chǎn)生具有增加水平的雜質(zhì)（諸如游 離細(xì)胞毒性劑（如，細(xì)胞毒性劑二聚體相關(guān)的物質(zhì)）和/或高分子量物質(zhì)（如，二聚體和其 它更高階聚集物））的綴合物。本領(lǐng)域利用的當(dāng)前純化方法，諸如正切流動過濾和吸附色譜 法，不能高效地去除這些雜質(zhì)而未顯著降低產(chǎn)量和/或?qū)τ诖笠?guī)模生產(chǎn)工藝為難處理的。 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)離子交換色譜膜可用于從包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合 物中去除至少部分雜質(zhì)。特別地，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過使混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜，游 離細(xì)胞毒性劑（如，細(xì)胞毒性劑二聚體相關(guān)的物質(zhì)）可有效地且高效地從包含細(xì)胞結(jié)合劑 細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物中去除。因此，本發(fā)明提供用于制備增加純度和穩(wěn)定性的細(xì)胞 結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑綴合物的方法，其包括使包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或 多種雜質(zhì)的混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜。 本發(fā)明提供用于制備純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的方法，其包括使包含細(xì)胞 結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜以從混合物去 除至少部分雜質(zhì)，從而提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。離子交換色譜膜可用于 去除通常見于包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物的多種雜質(zhì)。例如，離子交換色 譜膜可用于去除一種或多種選自細(xì)胞毒性劑二聚體、細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的聚集 物、游離細(xì)胞毒性劑、未綴合接頭以及它們的混合物的雜質(zhì)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物包含呈雜質(zhì)的細(xì)胞毒 性劑二聚體，并且離子交換色譜膜從混合物中去除一些部分的細(xì)胞毒性劑二聚體以提供純 化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。在另一實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合 物的混合物包含呈雜質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的聚集物，并且離子交換色譜膜從 混合物中去除一些部分的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑的聚集物以提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞 毒性劑綴合物。在另一實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物包含呈雜 質(zhì)的游離細(xì)胞毒性劑，并且離子交換色譜膜從混合物中去除一些部分的游離細(xì)胞毒性劑以 提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。在另一實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性 劑綴合物的混合物包含呈雜質(zhì)的未綴合接頭，并且離子交換色譜膜從混合物中去除一些部 分的未綴合接頭以提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物包含呈雜質(zhì)的彼此通 過接頭（如，DM1-MCC-DM1 ;DM1-SPP-DM1 ;或DM1-CX1-1-DM1)化學(xué)偶聯(lián)的細(xì)胞毒性劑二聚 體，并且離子交換色譜膜從混合物中去除彼此通過接頭（如，DM1-MCC-DM1 ;DM1-SPP-DM1 ; 或DM1-CX1-1-DM1)化學(xué)偶聯(lián)的一些部分的細(xì)胞毒性劑二聚體以提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì) 胞毒性劑綴合物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的混合物包 含呈雜質(zhì)的彼此未通過接頭（如，DM1-DM1)化學(xué)偶聯(lián)的細(xì)胞毒性劑二聚體，并且離子交換 色譜膜從混合物中去除一些部分的彼此未通過接頭（如，DM1-DM1)化學(xué)偶聯(lián)的細(xì)胞毒性劑 二聚體以提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。 當(dāng)包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的混合物經(jīng)歷離子交換色譜 膜時(shí)，所得純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物包含的至少一種或多種雜質(zhì)水平與在使混 合物經(jīng)歷離子交換色譜膜之前的混合物中的一種或多種雜質(zhì)水平相比較有所降低。例如， 與在使混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜之前的混合物中的一種或多種雜質(zhì)水平相比較，離子交 換色譜膜去除混合物中的至少5 %、至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、 至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或甚至100 %的一種或多種雜質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與在使混合物經(jīng)歷離子交換色譜 膜之前的混合物中的一種或多種雜質(zhì)水平相比較，離子交換色譜膜去除混合物中的約10 % 至約100%、約10%至約90%、約20%至約100%、約20%至約90%、約20%至約80%、約 30%至約100%、約30%至約90%、約30%至約80%、約40%至約80%、約40%至約90%、 約40%至約100%、約50%至約80%、約50%至約90%、約50%至約100% (如，約60%至 約90%、約70%至約90% )、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約 90%至約100%或約95%至約100% (如，約96%至約100%、約97%至約100%、約98% 至約100%、約99%至約100%、約95%至約96%、約95%至約97%、約95%至約98%或約 95 %至約99% )的一種或多種雜質(zhì)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在使混合物經(jīng)歷離子交換色譜膜之前，調(diào)節(jié)包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞 毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的混合物的pH。包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一 種或多種雜質(zhì)的混合物的pH優(yōu)選為約4至約9 (如，pH為約4. 5至約8. 5、約5至約8、約 5. 5至約7. 5、約6至約7、約6. 5至約7. 5、約7至約8、約8至約9、約4. 5至約6或約4. 5 至約5)。在一些實(shí)施方案中，混合物的pH為約6至約6. 5 (如，pH為5. 5至7、pH為5. 7至 6. 8、pH為5. 8至6. 7、pH為5. 9至6. 6或pH為6至6. 5)，pH為約6或以下（如，pH為約4 至6、約4至約5. 5、約4至約4. 5、約4至約5、約5至6)或pH為約6. 5或以上（如，pH為 6. 5至約9、約6. 5至約7、約7至約9、約7. 5至約9或6. 5至約8)。在一個(gè)實(shí)施方案中，混 合物的pH大于7. 5 (如，pH為7. 6至約9、7. 7至約9、約7. 8至約9、約7. 9至約9、7. 6至 約8. 5、7. 6至約8、7. 7至約8. 5、7. 7至約8、約7. 8至約8. 4、約7. 8至約8. 2、約8至約9 或約 8 至約 8. 5)。例如，混合物的pH可為pH7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8、8. 1、8. 2、8. 3、8. 4、8. 5、 8. 6、8. 7、8. 8、8. 9或9。在另一實(shí)施方案中，混合物的pH為約4. 8 (如，約4. 5至約5、約4. 6 至約5或約4. 7至約4. 9)。 多種離子交換色譜膜為本領(lǐng)域已知的并且可根據(jù)本文所述的發(fā)明使用。在一個(gè)實(shí)施 方案中，離子交換色譜膜為陰離子交換膜，諸如Q膜。在另一實(shí)施方案中，離子交換色譜膜 為陽離子交換膜，諸如S膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，離子交換色譜膜為內(nèi)毒素去除交換膜。 Q、S和內(nèi)毒素（E)膜可商購獲得，例如，來自PallCorporationandSartoriusStedim Biotech0 在優(yōu)選實(shí)施方案中，離子交換色譜膜為陰離子交換膜（如，Q膜）。陰離子交換膜為帶正 電荷的微孔膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的陰離子交換部分為季銨基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，帶正電荷的微孔膜包含多孔基底和具有懸垂陽離子基團(tuán)的交聯(lián)的涂料（參見例如， 美國專利No. 6, 780, 327、6, 851，561、7, 094, 347、7, 223, 341、7, 396, 465 中描述的那些）。在 一個(gè)實(shí)施方案中，多孔基底為親水的（如，聚醚砜或交聯(lián)的纖維素基質(zhì)）。在另一實(shí)施方案 中，陽離子基團(tuán)為季銨基團(tuán)。在另一實(shí)施方案中，陰離子交換膜為包含多孔的聚醚砜基底和 具有懸垂季銨基團(tuán)的交聯(lián)的涂料的帶正電荷的微孔膜。 已經(jīng)描述了用于制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑綴合物的多種方法（參見，如，美國專利 申請公布No. 2012/0253021 ;國際專利申請公布No.WO2012/135522 ;美國專利5, 208, 020 ; 美國專利6, 441，163 ;美國專利7, 811，572 ;美國專利申請公布No. 2006/0182750 ;美國專 利申請公布No. 2008/0145374 ;和美國專利申請公布No. 2011/0003969)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑的細(xì)胞結(jié)合劑 的綴合物的方法，其中將修飾反應(yīng)和綴合反應(yīng)組合成單步驟，隨后為純化步驟（即，美國專 利申請公布No. 2012/0253021中描述的一步方法），并且其中所述方法包括使包含細(xì)胞結(jié) 合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的混合物在純化步驟之前或純化步驟之后經(jīng)歷 離子交換色譜膜。一步方法包括使細(xì)胞結(jié)合劑（如，抗體）與細(xì)胞毒性劑接觸以形成包含 細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的第一混合物，然后使包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的第一混合 物與包含接頭的雙官能交聯(lián)劑在pH為約4至約9的溶液中接觸以提供包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì) 胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)（如，游離細(xì)胞毒性劑和反應(yīng)副產(chǎn)物）的第二混合物，其 中細(xì)胞結(jié)合劑通過接頭化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑。然后第二混合物經(jīng)歷純化以提供純化的細(xì) 胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一種或多種雜質(zhì)的第二 混合物在純化步驟之前，純化步驟之后或純化步驟之前和純化步驟之后經(jīng)歷離子交換色譜 膜。 一步反應(yīng)優(yōu)選在pH為約4至約pH9 (如，pH為約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6至約7、約6至約8、約6至約9或約6. 5至約7. 5)下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案 中，反應(yīng)在pH為約6至約8 (如，pH為約6、約6. 5、約7、約7. 5或約8)下進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在pH為約7. 1、約7. 2、約7. 3、約7. 4、約7. 5、約7. 6、約7. 7、 約 7. 8、約 7. 9、約 8、約 8. 1、約 8. 2、約 8. 3、約 8. 4、約 8. 5、約 8. 6、約 8. 7、約 8. 8、約 8. 9 或 約9下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，反應(yīng)在pH為約7. 5至約9、約7. 5至約8. 5、約7. 5至約 8、約7. 8至約9、約7. 8至約8. 5、約7. 8至約8、約8至約9、約8至約8. 5或約8. 5至約9 下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，反應(yīng)在pH為約7. 8 (如，pH為7. 6至8. 0或pH為7. 7至7. 9) 下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH為約8 (如，pH為7. 8至8. 2或pH為7. 9至 8. 1)下進(jìn)行。 在另一實(shí)施方案中，反應(yīng)在pH大于7. 5 (如，pH為7. 6至約9、7. 7至約9、約7. 8至約 9、 約7. 9至約9、7. 6至約8. 5、7. 6至約8、7. 7至約8. 5、7. 7至約8、約7. 8至約8. 4、約7. 8 至約8. 2、約8至約9或約8至約8. 5)下進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方案中，接觸通過以下實(shí)現(xiàn)：提供細(xì)胞結(jié)合劑，然后使細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒 性劑接觸以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的第一混合物，然后使包含細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì) 胞毒性劑的第一混合物與雙官能交聯(lián)劑接觸。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在反應(yīng)容器中提供 細(xì)胞結(jié)合劑，將細(xì)胞毒性劑加入至反應(yīng)容器（從而接觸細(xì)胞結(jié)合劑），然后將雙官能交聯(lián)劑 加入至包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的混合物中（從而接觸包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性 劑的混合物）。在一個(gè)實(shí)施方案中，在反應(yīng)容器中提供細(xì)胞結(jié)合劑，并在向容器提供細(xì)胞結(jié) 合劑之后立即將細(xì)胞毒性劑加入至反應(yīng)容器中。在另一實(shí)施方案中，在反應(yīng)容器中提供細(xì) 胞結(jié)合劑，并在向容器提供細(xì)胞結(jié)合劑之后的時(shí)間間隔（如，在向空間提供細(xì)胞結(jié)合劑之 后約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約1小時(shí)、約1天或 更久）后將細(xì)胞毒性劑加入至反應(yīng)容器中?？裳杆俚兀矗痰臅r(shí)間間隔內(nèi)，諸如約5分鐘， 約10分鐘）或緩慢地（諸如通過使用栗）加入細(xì)胞毒性劑。 然后，包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的混合物可與雙官能交聯(lián)劑在細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì) 胞毒性劑接觸之后立即接觸或在細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑接觸之后某個(gè)較遲點(diǎn)（later point)(如，約5分鐘至約8小時(shí)或更久）接觸。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在將細(xì)胞毒性劑 加入至包含細(xì)胞結(jié)合劑的反應(yīng)容器中之后立即將雙官能交聯(lián)劑加入至包含細(xì)胞結(jié)合劑和 細(xì)胞毒性劑的混合物中。或者，在細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑接觸之后約5分鐘、約10分鐘、 約20分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約7 小時(shí)、約8小時(shí)或更久，包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的混合物可與雙官能交聯(lián)劑接觸。 在另一實(shí)施方案中，通過多個(gè)循環(huán)（如，1、2、3、4、5或更多個(gè)循環(huán)）加入細(xì)胞毒性劑和 雙官能劑。例如，本發(fā)明提供了包括以下步驟的方法：a)使細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑接觸 以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的第一混合物；然后使第一混合物與包含接頭的雙官 能交聯(lián)劑在pH為約4至約9的溶液中接觸以提供包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物和一 種或多種雜質(zhì)（如，游離細(xì)胞毒性劑和反應(yīng)副產(chǎn)物）的第二混合物，其中細(xì)胞結(jié)合劑通過接 頭化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑；b)使第二混合物與細(xì)胞毒性劑接觸以形成第三混合物；然后使 第三混合物與雙官能交聯(lián)劑在pH為約4至約9下接觸以提供第四混合物；以及c)純化第 四混合物以提供純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟a)之后 的時(shí)間間隔（如，約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)或更久）后進(jìn)行步驟b)。在另一實(shí)施方案 中，在進(jìn)行步驟c)之前，可將步驟b)重復(fù)若干次（如，1、2、3、4或更多次）?？稍谄鹗疾襟E b)之后的時(shí)間間隔（如，約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)或更久）后進(jìn)行另外的步驟b)。 在另一實(shí)施方案中，在完成加入細(xì)胞毒性劑之前加入雙官能交聯(lián)劑。例如，在一個(gè)實(shí)施 方案中，在時(shí)間間隔（如，經(jīng)約5分鐘、約10分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小 時(shí)或更久）內(nèi)將細(xì)胞毒性劑連續(xù)地加入至細(xì)胞結(jié)合劑中以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒 性劑的混合物。在結(jié)束加入細(xì)胞毒性劑之前，將雙官能交聯(lián)劑加入至包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì) 胞毒性劑的混合物中，條件是任何時(shí)間，細(xì)胞毒性劑摩爾過量于雙官能交聯(lián)劑。在一個(gè)實(shí)施 方案中，在時(shí)間間隔內(nèi)（如，經(jīng)約5分鐘、約10分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3 小時(shí)或更久）連續(xù)地加入雙官能交聯(lián)劑。 在包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒性劑的混合物與雙官能交聯(lián)劑接觸之后，使反應(yīng)進(jìn)行約1 小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約6小時(shí)、約7小時(shí)、約8小時(shí)、約9小時(shí)、 約10小時(shí)、約11小時(shí)、約12小時(shí)、約13小時(shí)、約14小時(shí)、約15小時(shí)、約16小時(shí)、約17小 時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23小時(shí)、約24小時(shí)或更久 (如，約30小時(shí)、約35小時(shí)、約40小時(shí)、約45小時(shí)或約48小時(shí)）。 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備純化的細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合 物的方法，所述方法包括使細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑接觸以形成包含細(xì)胞結(jié)合劑和細(xì)胞毒 性劑的第一混合物，然后使第一混合物與包含接頭的雙官能交聯(lián)劑在pH為約4至約9的溶 液中接觸以提供包含細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的第二混合物，所述綴合物包含通過接 頭化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑和一種或多種雜質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合劑；(b)使第二混合物經(jīng)歷離子交 換色譜膜以去除至少部分雜質(zhì)，從而提供細(xì)胞結(jié)合劑細(xì)胞毒性劑綴合物的純化的第二混合 物；以及（C)在步驟（b)之后使純化的第二混合物經(jīng)歷正切流動過濾、選擇性沉淀、非吸附 色譜法、吸附過濾、吸附色譜法或它們的組合以從雜質(zhì)中進(jìn)一步純化細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒 性劑綴合物并且從而制備細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑綴合物的純化的第三混合物，其中與純 化的第二混合物相比，純化的第三混合物包含雜質(zhì)的量有所減少。本文所述的任何純化方 法可用于發(fā)明方法中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用正切流動過濾、吸附色譜法或非吸附色譜法 作為純化步驟。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)劑（即，修飾反應(yīng)）接觸產(chǎn)生 包含具有結(jié)合至其的接頭的細(xì)胞結(jié)合劑和一種或多種雜質(zhì)（如，反應(yīng)物和其它副產(chǎn)物）的 第一混合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，第一混合物包含具有穩(wěn)定和不穩(wěn)定結(jié)合至其的 接頭的細(xì)胞結(jié)合劑和一種或多種雜質(zhì)（如，反應(yīng)物和其它副產(chǎn)物）。在一段時(shí)間內(nèi)于正常儲 存條件（范圍可為幾個(gè)月至幾年）下當(dāng)接頭和細(xì)胞結(jié)合劑之間的共價(jià)鍵大體上未變?nèi)趸驍?裂時(shí)，接頭"穩(wěn)定地"結(jié)合至細(xì)胞結(jié)合劑。相比之下，在一段時(shí)間內(nèi)于正常儲存條件（范圍 可為幾個(gè)月至幾年）下當(dāng)接頭和細(xì)胞結(jié)合劑之間的共價(jià)鍵大體上變?nèi)趸驍嗔褧r(shí)，接頭"不 穩(wěn)定地"結(jié)合至細(xì)胞結(jié)合劑。 修飾反應(yīng)優(yōu)選在pH為約4至約pH9 (如，pH為約4. 5至約8. 5、約5至約8、約5. 5至 約7. 5、約6至約7、約6至約8、約6至約9或約6. 5至約7. 5)下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案 中，修飾反應(yīng)在pH為約6至約8 (如，pH為約6、約6. 5、約7、約7. 5或約8)下進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH為約7. 1、約7. 2、約7. 3、約7. 4、約7. 5、約7. 6、約 7. 7、約 7. 8、約 7. 9、約 8、約 8. 1、約 8. 2、約 8. 3、約 8. 4、約 8. 5、約 8. 6、約 8. 7、約 8. 8、約 8. 9 或約9下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH為約7. 5至約9、約7. 5至約8. 5、約7. 5 至約8、約7. 8至約9、約7. 8至約8. 5、約7. 8至約8、約8至約9、約8至約8. 5或約8. 5 至約9下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH為約7. 8 (如，pH為7. 6至8.O或pH為 7. 7至7. 9)下進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH為約8 (如，pH為7. 8至8. 2或pH 為7. 9至8. 1)下進(jìn)行。 在另一實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)在pH大于7. 5 (如，pH為7. 6至約9、7. 7至約9、約7. 8 至約9、約7. 9至約9、7. 6至約8. 5、7. 6至約8、7. 7至約8. 5、7. 7至約8、約7. 8至約8. 4、 約7. 8至約8. 2、約8至約9或約8至約8. 5)下進(jìn)行。例如，發(fā)明方法包括使細(xì)胞結(jié)合劑 與雙官能交聯(lián)劑在pH為 7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、8、8. 1、8. 2、8. 3、8. 4、8. 5、8. 6、8.